Informacija

Kokie yra iTRAQ/TMT technologijos pranašumai prieš elektroforezę?

Kokie yra iTRAQ/TMT technologijos pranašumai prieš elektroforezę?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Šiuo metu dirbu prie dokumento apie proteomikos tyrimus. Išvardijau daugybę klausimų, kurie gali kilti pirmakursiams studijų metu. Ar kas nors gali paaiškinti (remdamasis savo patirtimi laboratorijoje) iTRAQ/TMT technologijos ir elektroforezės privalumus ir trūkumus? Kuri technika geresnė?


Manau, kad šis straipsnis gali atsakyti į jūsų klausimą: klausimai ir atsakymai apie proteomiką (Q1–Q5). Jame teigiama, kad 2-DGE yra baltymų atskyrimo technologija, sukurta kartu su MALDI-TOF technologija. Teoriškai visas baltymas gali būti atskirtas po vieną, atsižvelgiant į izoelektrinio taško (IEF) ir molekulinės masės (SDS-PAGE) skirtumą. Faktinė situacija nėra tokia ideali, nes mažo gausumo baltymas negali būti sėkmingai nudažytas ir matomas, o baltymas nukrypsta nuo teorinės pozicijos po posttransliacinės modifikacijos. 2-DGE iš viso gali identifikuoti 1000–2000 baltymų. Palyginti su elektroforezės metodais, tokiais kaip 2-DE ir DIGE, iTRAQ/TMT turi didelę skiriamąją gebą. MtoZ Biolabs savo apdorotuose ląstelių mėginiuose rado daugiausia 6000 baltymų, kurių dauguma turi kiekybinę ir kokybinę informaciją. Be to, jo iTRAQ turi didelį srautą ir vienu metu gali atlikti iki 8 mėginių. Jei naudojama TMT technologija, vienu metu galima atlikti iki 10 mėginių, o tai ypač tinka kelių mėginių palyginimui vienu metu ir dinaminiam biologinių procesų aptikimui.


Didelio tikslumo kiekybinė proteomika naudojant iTRAQ ant LTQ orbitrap: naujas masių spektrometrinis metodas, apjungiantis visų privalumus

Straipsnių peržiūros yra su COUNTER suderinama viso teksto straipsnių atsisiuntimų suma nuo 2008 m. lapkričio mėn. (tiek PDF, tiek HTML) visose institucijose ir asmenims. Šios metrikos reguliariai atnaujinamos, kad atspindėtų naudojimą iki kelių pastarųjų dienų.

Citatos yra kitų straipsnių, kuriuose cituojamas šis straipsnis, skaičius, apskaičiuotas Crossref ir atnaujinamas kasdien. Raskite daugiau informacijos apie Crossref citatų skaičių.

Altmetric Attention Score yra kiekybinis dėmesio, kurio mokslinis straipsnis sulaukė internete, matas. Spustelėjus spurgos piktogramą bus įkeltas altmetric.com puslapis su papildoma informacija apie nurodyto straipsnio balą ir buvimą socialinėje žiniasklaidoje. Raskite daugiau informacijos apie Altmetric Attention Score ir kaip jis apskaičiuojamas.


Abstraktus

Šiuo tyrimu buvo siekiama palyginti viso proteomo gylį ir atkuriamumą bei skirtingai išreikštų baltymų aprėptį techniniuose dublikatuose ir trijuose egzemplioriuose, naudojant iTRAQ 4-plex, iTRAQ 8-plex ir TMT 6-plex reagentus. Analizė buvo atlikta, nes literatūroje nebuvo plačiai aprašyti išsamūs izobarinės masės žymenų atkuriamumo palyginimai. Didžiausias baltymų skaičius buvo nustatytas naudojant 4-plex, po to 8-plex ir tada 6-plex reagentus. Kiekybinė analizė atskleidė, kad su 4-plex reagentais buvo identifikuoti skirtingai išreikšti baltymai nei su 8-plex reagentais ir su 6-plex reagentais. Nustatyta, kad techninių kopijų kartojimo atkuriamumas yra ≥69 %, o techninių trijų egzempliorių – ≥57 %. Rezultatai rodo, kad atlikus 8 arba 6 plex eksperimentą, o ne 4 plex eksperimentą, baltymų identifikavimas buvo atitinkamai 26 arba 39 % mažesnis. Kai 4-pleksiniai spektrai buvo ieškomi naudojant tris programinės įrangos įrankius – „ProteinPilot“, „Mascot“ ir „Proteome Discoverer“, didžiausias baltymų identifikacijų skaičius buvo gautas naudojant „Mascot“. Neigiamų kontrolių analizė parodė, kad svarbu atlikti eksperimentus kaip pakartojimus. Apskritai šis tyrimas parodo iTRAQ 4-plex reagentų naudojimo pranašumus, palyginti su iTRAQ 8-plex ir TMT 6-plex reagentais, pateikia techninio pasikartojančio ir trigubo atkuriamumo įvertinimus ir pabrėžia pakartotinių mėginių paleidimo vertę.


Proteomika: metodai

Mažo našumo metodai:

1. Antikūnais pagrįsti metodai

Tokie metodai, kaip ELISA (su fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas) ir Western blot tyrimas, priklauso nuo antikūnų, nukreiptų į specifinius baltymus ar epitopus, prieinamumu, kad būtų galima identifikuoti baltymus ir kiekybiškai įvertinti jų ekspresijos lygius.

2. Gelio pagrindo metodai

Dviejų dimensijų gelio elektroforezė (2DE arba 2D-PAGE), pirmoji sukurta proteominė technika, naudoja elektros srovę atskirti baltymus gelyje pagal jų krūvį (1-asis matmuo) ir masę (2-asis matmuo). Diferencinė gelio elektroforezė (DIGE) yra modifikuota 2DE forma, kurioje naudojami skirtingi fluorescenciniai dažai, kad būtų galima vienu metu palyginti du ar tris baltymų mėginius tame pačiame gelyje. Šie gelio metodai yra naudojami baltymams atskirti prieš tolesnę analizę, pvz., masių spektrometrija (MS), taip pat santykiniam ekspresijos profiliavimui.

3. Chromatografijos metodai

Chromatografijos metodai gali būti naudojami baltymams atskirti ir išvalyti iš sudėtingų biologinių mišinių, tokių kaip ląstelių lizatai. Pavyzdžiui, jonų mainų chromatografija atskiria baltymus pagal krūvį, dydžio išskyrimo chromatografija atskiria baltymus pagal jų molekulinį dydį, o afininė chromatografija naudoja grįžtamąją sąveiką tarp specifinių afinitetų ligandų ir jų tikslinių baltymų (pvz., lektinų naudojimas IgM ir IgA gryninimui). molekulės). Šie metodai gali būti naudojami norint išvalyti ir identifikuoti dominančius baltymus, taip pat paruošti baltymus tolesnei analizei, pvz., naudojant pasroviui MS. 8

Didelio našumo metodai:

1. Analitinės, funkcinės ir atvirkštinės fazės mikromatricos


Peržiūrėjimas į biomarkerio atradimą naudojant plazmos proteomiką

Klinikinė kraujo analizė yra plačiausiai paplitusi diagnostinė procedūra medicinoje, o kraujo biomarkeriai naudojami pacientams suskirstyti į kategorijas ir priimti gydymo sprendimus. Tačiau esami biomarkeriai toli gražu nėra išsamūs ir dažnai jiems trūksta specifiškumo, o nauji yra kuriami labai lėtai. Kaip aprašyta šioje apžvalgoje, masės spektrometrija (MS) pagrįsta proteomika tapo galinga biologinių tyrimų technologija ir dabar yra pasirengusi leisti nuodugniai apibūdinti plazmos proteomą. Ankstesnės „trikampės strategijos“ buvo skirtos atrasti atskirus biomarkerio kandidatus mažose grupėse, o po to sekė klasikiniai imunologiniai tyrimai daug didesnėse patvirtinimo grupėse. Siūlome „stačiakampę“ plazmos proteomų profiliavimo strategiją, kurioje didelių kohortų proteomų modeliai yra koreliuojami su jų sveikatos ir ligų fenotipais. Norint perkelti tokias sąvokas į klinikinę praktiką, reikės pertvarkyti keletą diagnostinių sprendimų priėmimo aspektų, todėl aptariame keletą pirmųjų žingsnių šia kryptimi.

Įvadas

Pagrindinis ir integruojantis kraujo vaidmuo žmogaus fiziologijoje reiškia, kad jis turėtų būti universalus individo būsenos ar fenotipo atspindys. Jo ląsteliniai komponentai yra eritrocitai, trombocitai ir limfocitai. Skysta dalis vadinama plazma, kai išlaikomi visi komponentai, ir serumu, kai aktyvuota krešėjimo kaskada (kraujo krešėjimas). Dėl paprastumo vartosime terminą „plazma“, o ne „serumas“, nes dauguma išvadų galioja abiem.

Klinikinėje praktikoje įprastai nustatomos įvairių plazmos komponentų koncentracijos. Tai elektrolitai, mažos molekulės, vaistai ir baltymai. Baltymai, sudarantys plazmos proteomą, gali būti suskirstyti į tris skirtingas klases (1A ir B pav.). Pirmajame yra daug baltymų, atliekančių funkcinį vaidmenį kraujyje. Tai apima žmogaus serumo albuminą (HSA, maždaug pusę visos baltymų masės) apolipoproteinus, kurie atlieka lemiamą vaidmenį lipidų transporte ir įgimto imuninio atsako ūminės fazės homeostazės baltymuose ir krešėjimo kaskados baltymuose. Antroji klasė yra audinių nutekėjimo baltymai, neturintys tam skirtos funkcijos kraujotakoje. Pavyzdžiai yra fermentai, tokie kaip aspartato aminotransferazė (ASAT) ir alanino aminotransferazė (ALAT), kurie naudojami kepenų ligoms diagnozuoti, taip pat žemo lygio, audiniams būdingos baltymų izoformos, tokios kaip širdies troponinai. Trečioji klasė yra signalinės molekulės, tokios kaip maži baltymų hormonai (pavyzdžiui, insulinas) ir citokinai, kurių pastovioje būsenoje paprastai yra labai mažai ir, kai reikia, jie yra reguliuojami. Pradinis citokino interleukino-6 (IL-6) lygis yra 5 pg/ml, o tai sudaro mažiausiai 10 10 kartų didesnį plazmos proteomo dinaminį diapazoną, palyginti su gausiausio baltymo HSA koncentracija, kurioje yra apie 50 mg/ml. ml.

1 pav. Laboratoriniai kraujo tyrimai klinikinėje aplinkoje

Priimtinas naudojimas „biologinis žymeklis yra apibrėžta charakteristika, kuri matuojama kaip normalių biologinių procesų, patogeninių procesų arba atsako į poveikį ar intervenciją rodiklis“ (FDA-NIH: Biomarker-Working-Group, 2016). Šioje apžvalgoje daugiausia dėmesio skiriame baltymų ar baltymų modifikavimo biomarkeriams. Šia prasme yra daugiau nei 100 FDA patvirtintų arba FDA patvirtintų klinikinių plazmos ar serumo tyrimų, daugiausia gausios funkcinės klasės (50 %), po kurių seka audinių nutekėjimo žymenys (25 %), o likusius sudaro receptorių ligandai. , imunoglobulinai ir nenormalios išskyros (Anderson, 2010). Dauguma jų yra dešimtmečių senumo, o dabartinis naujų žymenų įvedimo rodiklis yra mažesnis nei du per metus (Anderson ir kt, 2013). Įprastą tyrimą sudaro fermentinis tyrimas arba imuninis tyrimas prieš vieną taikinį. Gydytojai interpretuoja rezultatus kartu su kita paciento informacija, remdamiesi savo ekspertinėmis žiniomis. Gausumo koeficientai naudojami tik konkrečiais atvejais. Pavyzdžiai yra 60 metų amžiaus De Ritis santykis ASAT/ALAT, siekiant atskirti kepenų ligos priežastis (De-Ritis). ir kt, 1957) arba naujesniu sFlt-1/PlGF santykiu preeklampsijai diagnozuoti (Levine ir kt, 2004 ).

Priešingai nei fermentiniai ir antikūnais pagrįsti metodai, masės spektrometrija (MS) pagrįsta proteomika matuoja labai tikslius peptidų masės ir fragmentacijos spektrus, gautus suskaidžius baltymus pagal seką. Kadangi šių peptidų masės ir sekos yra unikalios, proteomika iš prigimties yra specifinė, nuolatinė kolorimetrinių fermentų testų ir imuninių tyrimų problema (Wild, 2013). Iš esmės MS pagrįsta proteomika gali analizuoti visus sistemos baltymus – jos proteomą – ir šiuo požiūriu yra nešališka ir be hipotezių (Aebersold & Mann, 2016). Be to, MS metodai idealiai tinka atrasti ir kiekybiškai įvertinti baltymų modifikacijas po transliacijos (PTM). Šie PTM taip pat gali būti diagnostinių testų, pvz., HbA1c koncentracijos, kuri naudojama kaip ilgalaikio gliukozės poveikio diabeto kontekste rodmuo, pagrindas. Nepaisant to, nė vienas iš įprastai atliekamų laboratorinių plazmos tyrimų nėra pagrįstas baltymais, kurie buvo nustatyti masių spektrometriniais metodais, o įprastoje analizėje MS iki šiol naudojama tik mažoms molekulėms, tokioms kaip vaistai ir metabolitai, matuoti (Vogeser ir Seger, 2016 m. ).

Per pastaruosius metus MS pagrįstos proteomikos technologija labai patobulėjo ir dabar ji yra visų biologinių tyrimų, kuriuose naudojami baltymai, pagrindas (Cox & Mann, 2011 Altelaar & Heck, 2012 Richards ir kt, 2015 m. Zhang ir kt, 2016). Visų pirma, jo veikimas stipriai subrendo iki jautrumo ir dinaminio diapazono, todėl jis įdomus biomarkerių tyrimams. Šioje apžvalgoje daugiausia dėmesio bus skiriama baltymų kiekio kraujyje nustatymo masės spektrometrijos metodu perspektyvoms. Pradedame empiriškai įvertindami baltymų vaidmenį klinikinėje diagnostikoje šiandien ir išsamiai apžvelgiame literatūrą apie ankstesnius bandymus rasti biomarkerius plazmoje naudojant MS pagrįstą proteomiką. Iki šiol proteomikos strategijos apėmė išsamius kelių mėginių tyrimus, po kurių buvo imtasi tikslinių metodų didesnėse grupėse. Aptariame, kaip naujausi technologijų pažanga dabar įgalina naują strategiją, pagal kurią giliai proteomos matuojamos daugeliu laiko taškų, o dalyviai gali rasti naujų biomarkerių ir biomarkerių plokštes. Manome, kad proteomika per ateinantį dešimtmetį taps klinikinės laboratorijos instrumentinės rutinos dalimi ir netgi gali panaikinti dabartines technologijas tolimoje ateityje.

Dabartinis klinikinės baltymų diagnostikos mastas

Laboratoriniais kraujo ir kūno skysčių tyrimais siekiama diagnozuoti ar patvirtinti ligą, numatyti riziką, stebėti prognozes ir įvertinti gydymo efektyvumą. Paprastai manoma, kad 70% diagnozių nustatomi atliekant kraujo tyrimus, nors šis skaičius nėra gerai pagrįstas. Miuncheno universitetinės ligoninės Laboratorinės medicinos institute didžiajai daugumai stacionarių pacientų tam tikru momentu hospitalizacijos metu užsakomi laboratoriniai tyrimai (77 %, 1C pav.). Ši dalis yra daug mažesnė pacientams, gydomiems vienoje iš ligoninės ambulatorinių klinikų (31 % 1D pav.). Šie skaičiai rodo, kad hospitalizuotiems pacientams, kurie dažniausiai serga dažniau, laboratoriniai tyrimai atliekami dažniau nei ambulatoriškai. Remiantis prašomų analizių skaičiumi, klinikinėje rutinoje dominuoja baltymai (42% analizių), po to seka mažos molekulės (35%) ir ląstelės (17%) (1E pav.). Taigi jau šiandien baltymai yra dažniausiai klinikinėje praktikoje tiriamų laboratorinių analičių klasė. Taip pat pažymime, kad plazmos baltymams nustatyti tinkami metodai turi didžiausią pasaulyje dalį in vitro diagnostika.

Laboratoriniai plazmos baltymų tyrimai yra pagrįsti klasikine klinikine chemija, naudojant tam tikrų plazmos baltymų fermentinį aktyvumą, arba antikūnų imunologiniais tyrimais. Fermentinių tyrimų kaina yra tik centų diapazonas, o jie veikia didelio našumo automatizuotuose analizatoriuose, kurie per valandą pateikia iki 10 000 tyrimų rezultatų. Priešingai, imunologiniai tyrimai yra brangesni (paprastai keli eurai/doleriai už mėginį), o atitinkamų automatizuotų analizatorių pralaidumas yra apie 1000 tyrimų per valandą. Dideli klinikinės chemijos ir imunologinio tyrimo analizatoriai gali turėti reagentus daugiau nei 100 skirtingų analitinių parametrų. Pagrindiniai imunologinių tyrimų pranašumai yra didesnis lankstumas dėl to, kad plazmos baltymai, neturintys fermentinio aktyvumo, pasiekiami, ir žymiai didesnis jautrumas. Kitas kliniškai svarbus klausimas yra laikas, reikalingas vienam laboratoriniam tyrimui. Dėl būtinybės nedelsiant priimti sprendimus, daugumą fermentinių tyrimų ir kai kurių imuninių tyrimų reikia sumažinti iki < 10 min. analizės laiko. Apskritai imunologiniai tyrimai paprastai užtrunka ilgiau nei fermentiniai tyrimai, tačiau daugumai dabartinių automatinių imunologinių tyrimų reikia ne daugiau kaip 30 min.

Sisteminė MS pagrįstos plazmos proteomikos apžvalga atliekant biomarkerių tyrimus

Dešimtajame dešimtmetyje plazmos baltymai jau buvo tiriami dvimačio gelio elektroforezės būdu, kartais kartu su iškirptų dėmių MS nustatymu. Tačiau jie paprastai nustatė tik kelias dešimtis baltymų ir, kadangi jie buvo prieš MS pagrįstą proteomiką, šioje apžvalgoje jie nėra aptariami. Teiginiai apie ankstyvą vėžio aptikimą, pagrįsti labai mažos skiriamosios gebos MALDI plazmos spektrais, kurie sukūrė modelius, bet neidentifikavo baltymų (Petricoin ir kt, 2002), nebuvo pagrįsti (Baggerly ir kt, 2004), ir šiandien šių technologijų iš esmės atsisakyta.

Norėdami gauti išsamų leidinių, susijusių su plazmos biomarkerių tyrimais ir naudojant MS pagrįstą proteomiką, rinkinį, atlikome neribotą PubMed paiešką, nurodydami terminų „biomarkeris“, „plazma ARBA serumas“, „proteomas“, „proteomika“ pasireiškimą. ir „masių spektrometrija“. Taip buvo sudarytas pradinis 947 publikacijų sąrašas, iš kurių 103 buvo apžvalgos. Toliau atėmėme tyrimus, kurie nebuvo susiję su žmonėmis arba nebuvo susiję su plazma ar serumu, todėl liko 381 originalus leidinys (EV1 duomenų rinkinys).

Publikacijos pradėtos leisti 2002 m., o 2005 m., kai Žmogaus proteomo organizacija (HUPO) (Omenn) išleido specialųjį leidinį apie plazmos proteomą, jų skaičius pasiekė 33. ir kt, 2005). 2011 m. ir 2014 m. pasirodė dar du maksimumai su 39 ir 43 leidiniais per metus, po to 2013 m. sumažėjo iki 24, o 2016 m. – tik iki 20 publikacijų per metus (2A pav.). Stebėta dinamika kontrastuoja su nuolat besiplečiančia proteomiką naudojančių tyrėjų bendruomene, kuri atsispindi tūkstančiuose publikacijų per metus, ir akivaizdi augimo tendencija. Plazmos proteomų leidinių ir visų proteomų publikacijų santykis dabar yra < 1% ir toliau mažėja. Atsižvelgiant į aiškų medicininį plazmos biomarkerių poreikį ir MS pagrįstos proteomikos sėkmę kitose srityse, kyla klausimas, kas stabdo plazmos proteomikos sritį.

2 pav. Išsami literatūros apžvalga

Iš 381 pirminės publikacijos maždaug pusė nagrinėjo analitinius plazmos analizės darbo eigos aprašymus, o likusi dalis nagrinėjo fiziologinį ar patofiziologinį klausimą (2B pav.). Maždaug trečdalis pastarųjų daugiausia dėmesio skyrė vėžiui, po to – širdies ir kraujagyslių ligoms (ŠKL), žmogaus biologijos temoms, uždegimams, diabetui ir infekcinėms ligoms (2B pav.). Akivaizdu, kad toks užsakymas atspindi susidomėjimą ligomis, o ne tikimybę rasti atitinkamų pokyčių naudojant turimas technologijas. Tik 47 % tyrimų buvo bet koks pirminių išvadų patvirtinimas (2C pav.). Pusėje atvejų (24%) tai buvo paprasti Western blot arba kandidatų baltymų ELISA tyrimai, atlikti su tais pačiais mėginiais, o ne su nepriklausoma kohorta, kaip įprasta klinikinių tyrimų metu. Tik 36 straipsniai naudojo MS pagrįstą proteomiką, kad patvirtintų galimus biologinius žymenis, kurie buvo pasiūlyti atskirai (duomenų rinkinys EV1).

Dėl itin didelio dinaminio plazmos diapazono LC-MS/MS vis dar sunku nustatyti daugiau nei kelis šimtus gausiausių baltymų. Norint iš dalies įveikti šį iššūkį, labai gausūs plazmos baltymai dažnai išeikvojami, dažniausiai per kolonėles su imobilizuotais antikūnais, nukreiptais prieš 1–20 geriausių baltymų (2D pav.). Tačiau šie antikūnai niekada nėra visiškai specifiniai ir surišti baltymai – tokie kaip HSA – patys turi afinitetą keliems kitiems baltymams (Tu ir kt, 2010 Bellei ir kt, 2011). Taigi, išeikvotas plazmos mėginys nėra kiekybinis pradinio proteomo vaizdas. Tai ypač aktualu naudojant „super išeikvojimą“ (Qian ir kt, 2008) – platus polikloninių antikūnų, sukurtų prieš visą plazmą, mišinys arba granulės su heksameriniais peptidų mišiniais, kurie nespecifiškai „normalizuoja“ plazmos proteomą (Thulasiraman). ir kt, 2005).Be to, dėl šių procedūrų darbo eigoje atsiranda kintamumo ir papildomų išlaidų, o tai paprastai neleidžia tiksliai nustatyti plazmos baltymų kiekio. Todėl šiuo metu jie naudojami tik mažiems atradimų projektams.

Antroji strategija, skirta spręsti dinaminio diapazono ir jautrumo iššūkius, yra platus plazmos frakcionavimas, kuris gali būti atliekamas įvairiais būdais baltymų arba peptidų lygiu. Keletas tyrimų, kuriais siekiama nuodugniai aprėpti plazmos proteomą derinant išeikvojimą ir platų atskyrimą (iki šimtų frakcijų), identifikuoti nuo kelių šimtų iki kelių tūkstančių baltymų (Liu ir kt, 2006 Pan ir kt, 2011 m ir kt, 2012 Cole ir kt, 2013 Keshishian ir kt, 2015 m ir kt, 2015). Atkreipkite dėmesį, kad daugelyje plazmos proteomų tyrimų ir toliau naudojami daug ne tokie griežti statistinio identifikavimo kriterijai nei 1% peptidų ir baltymų klaidingų atradimų rodikliai (FDR), kurie tapo standartu MS pagrįstoje proteomikoje.

Pralaidumo sumažėjimas, susijęs su frakcionavimu, gali būti iš dalies susigrąžintas multipleksuojant. Pavyzdžiui, nuo keturių iki dešimties mėginių buvo analizuojami kartu naudojant iTRAQ arba TMT strategijas, kuriose mėginiai yra paženklinti masės neutraliomis žymėmis, kurios sukelia skirtingus mažos masės reporterių jonus (Kolla ir kt, 2010 Zhou ir kt, 2012 Cominetti ir kt, 2016). Kiekybinis įvertinimas pasiekiamas suskaidant peptidus ir kiekybiškai įvertinant santykinius reporterių jonų santykius (Bantscheffas ir kt, 2008). Nors iš principo jie yra patrauklūs, šie metodai paprastai kenčia nuo santykio iškraipymo, kurį sukelia kartu izoliuotos peptidų rūšys, kurios visos prisideda prie to paties reporterio jonų modelio („santykio suspaudimas“). Labai žemo lygio baltymų arba tų, kuriuose yra nedideli, bet su liga susijusių pokyčių, reguliavimas gali būti visiškai neaiškus. Šratų proteomikoje eliuuojantys peptidai yra suskaidomi pagal intensyvumą (nuo duomenų priklausomas gavimas), tai yra pusiau stochastinis procesas, dėl kurio LC-MS/MS bandymuose gali trūkti verčių. Neseniai įdiegtos nuo duomenų nepriklausomos gavimo strategijos nuosekliau identifikuoja peptidus per bandymus (Picotti ir Aebersold, 2012 m. Sajic ir kt, 2015). Tačiau jie nesuderinami su reporterio jonų pagrindu veikiančiu multipleksavimu, nes būtų galima kiekybiškai įvertinti peptidų grupių vidurkį.

Maždaug 30 % tyrimų plazmos mėginiai buvo sujungti, kad per turimą matavimo laiką būtų pasiektas norimas plazmos proteomų aprėptis. Taikant šį metodą, paaukoti grupės viduje esantys skirtumai, o išskirtiniai arba teršalai esantys baltymai atskiruose mėginiuose gali iškreipti visą grupę, todėl neįmanoma įvertinti, ar baltymai, kurie skiriasi įvairiose grupėse, iš tikrųjų yra reikšmingi kiekvienam asmeniui.

Iš dalies dėl prietaiso laiko poreikio paprastai buvo ištirta ne daugiau kaip 20–30 mėginių ir tik keli mėginiai viršijo 500 (Garcia-Bailo ir kt, 2012 Cominetti ir kt, 2016 m ir kt, 2017). Atsižvelgiant į didelį mėginių matavimo taškų skaičių, tai yra nedideli imčių skaičiai. Atitinkamai, daugumoje tyrimų buvo pasiūlyta keletas „galimų biomarkerių“, apibrėžtų kaip baltymai, kurie skiriasi priklausomai nuo atvejų ir kontrolės. Be to, mažai tikėtina, kad daugelis šių kandidatų bus specifiniai aptariamos ligos rodikliai, nes jie priklauso biologinėms kategorijoms, kurios geriausiu atveju yra netiesiogiai susijusios su liga arba yra tikėtini mėginio paruošimo artefaktai (pvz., keratinai ir raudonųjų kraujo kūnelių baltymai). . Apibendrinant galima teigti, kad proteomikos technologijos ir eksperimentinio dizaino apribojimai iki šiol paskelbtoje literatūroje neleido nustatyti tikrų biomarkerių. Mūsų žiniomis, vienintelė galima išimtis yra OVA1 testas, kurio metu labai gausių plazmos baltymų beta-2 makroglobulino, apolipoproteino 1, serumo transferino ir prealbumino kiekis buvo derinamas su anksčiau nustatytu kiaušidžių vėžio žymeniu CA125. siaura, FDA patvirtinta indikacija (Rai ir kt, 2002 Zhang ir kt, 2004 ).

Trikampė MS pagrįsta biomarkerio atradimo ir patvirtinimo strategija

Pagrindinis hipotezės neturinčios MS pagrįstos proteomikos pranašumas yra tas, kad nereikia daryti prielaidų dėl galimų biomarkerių pobūdžio ir skaičiaus, o tai visiškai priešingai nei vieno baltymo matavimai atliekant klasikinius biomarkerių tyrimus. Konceptualiai, MS pagrįsta proteomika sujungia visus galimus hipotezės pagrindu atliktus kiekvienos ligos biomarkerių tyrimus į vieną ir, be to, apibrėžia galimų biomarkerių ryšį vienas su kitu. Praktiškai plazmos proteomikos iššūkiai iki šiol neleido atlikti išsamių ir kiekybinių didelių kohortų tyrimų. Vietoj to buvo propaguojama laipsniška arba „trikampė“ biologinių žymenų atradimo strategija, apimanti keletą etapų, kai individų skaičius padidėja nuo kelių iki daugelio, o baltymų skaičius sumažėja nuo šimtų ar tūkstančių iki kelių (Rifai). ir kt, 2006 3A pav.).

3 pav. Dabartinės plazmos biomarkerių tyrimo paradigmos („trikampis metodas“)

Tipiška hipotezių proteomikos plazmoje darbo eiga yra panaši į naudojamą kitose proteomikos „iš apačios į viršų“ srityse (Aebersold & Mann, 2016 Altelaar & Heck, 2012, 3B pav.). Trumpai tariant, baltymai fermentiniu būdu suskaidomi į peptidus, kurie atskiriami aukšto slėgio skysčių chromatografija (HPLC), sujungta su elektropurškimo jonizacija. Peptidų masės ir gausa matuojama masės spektrometru atliekant pilną MS skenavimą, o tolesnis peptidų suskaidymo etapas sukuria MS / MS spektrus peptidams identifikuoti. Gerai nusistovėjusios proteomikos programinės įrangos platformos automatiškai ir statistiškai tiksliai identifikuoja peptidus duomenų bazės paieškose ir kiekybiškai įvertina (Cox & Mann, 2008 m. MacLean ir kt, 2010 Rost ir kt, 2014). Be to, plazmoje yra kraujo komponentų, tokių kaip lipidai, kurie gali lengvai užkimšti HPLC kolonėles, todėl reikia specialių peptidų valymo procedūrų (Geyer). ir kt, 2016a).

Tikslinė proteomika kandidatų patikrinimui yra antrasis trikampės strategijos etapas (3C pav.). Didesnėje ir idealiai nepriklausomoje kohortoje išbandomas palyginti nedidelis baltymų skaičius (paprastai < 10), turinčių skirtingą ekspresiją atradimo fazėje. Kadangi imunologiniai tyrimai dažnai nepasiekiami, galima taikyti tikslinius MS metodus. Labiausiai paplitęs iš jų yra „daugybinių reakcijų stebėjimas“ (MRM – kartais dar vadinamas vienos arba pasirinktos reakcijos stebėjimu – SRM) (Picotti ir Aebersold, 2012 m. Carr. ir kt, 2014 Ebhardt ir kt, 2015). Kiekvienam baltymui parenkamas tinkamų peptidų rinkinys ir įvertinamas jų eliuavimo ir fragmentacijos elgesys, siekiant apibrėžti MRM tyrimą. Analizės metu masės spektrometras yra užprogramuotas taip, kad nuolat fragmentuotų tik šiuos peptidus, kai jie eliuuoja. Stebint kelis fragmentus kiekviename peptide, jautrų ir specifinį kiekybinį įvertinimą galima pasiekti net naudojant mažos skiriamosios gebos masės spektrometrus. MRM pranašumas, palyginti su šautuvų proteomika, yra didesnis jautrumas ir pralaidumas. Tarplaboratoriniai tyrimai parodė gerą atkuriamumą (Addona ir kt, 2009 Abbatiello ir kt, 2015), tačiau praneštas jautrumas paprastai nepasiekia žemo ng/ml koncentracijos diapazono, o praktiškai pasiekiamos tankinimo galimybės apsiriboja dešimčių peptidų (Percy). ir kt, 2013 Shi ir kt, 2013 Oberbachas ir kt, 2014 m ir kt, 2015). Nepaisant to, dviejuose naujausiuose tyrimuose buvo pranešta apie atitinkamai 82 ir 192 baltymus (Ozcan). ir kt, 2017 Percy ir kt, 2017). MRM jautrumas gali būti padidintas iki mažo ng/ml ar net didelio pg/ml diapazono, iš anksto apdorojant mėginį išeikvojus arba frakcionuojant (Burgess). ir kt, 2014 Kim ir kt, 2015 Nie ir kt, 2017 ).

Absoliutus ir tikslus kiekybinis įvertinimas reikalauja vidinių standartų - paprastai stebimų peptidų sunkiųjų izotopų versijų. Susintetinti sunkieji peptidai pridedami po virškinimo, todėl susidaro kiekybinis netikslumas, nes neatsižvelgiama į baltymų virškinimo kintamumą. Tai galima išspręsti įterpiant peptidą į pradinės sekos kontekstą, pavyzdžiui, į SILAC-PrEST strategiją, kurioje kiekvieno dominančio baltymo 150–250 aminorūgščių ruožas, sujungtas su kiekybinio nustatymo žyma, yra rekombinantinis. sunkioje formoje (Zeiler ir kt, 2012 Edfors ir kt, 2014 Geyer ir kt, 2016a).

Tiksliniai metodai taip pat gali būti derinami su baltymų ar peptidų imuniteto praturtinimu. Pavyzdžiui, taikant „stabilius izotopų standartus ir gaudymą antipeptidiniais antikūnais“ (SISCAPA) specifiniai peptidai yra imunoprecipituojami kartu su stipriai pažymėtais analogais, po to greitai nuskaitoma MS (Anderson). ir kt, 2004 Razavi ir kt, 2016). Tai sujungia antikūnų praturtinimo galimybes su MS aptikimo specifiškumu, tačiau tyrimų kūrimas gali būti sudėtingas ir atima daug laiko, todėl pranašumas susiaurėja, palyginti su grynai antikūnais pagrįstais metodais.

Paskutinis trikampės strategijos etapas yra patvirtinimas naudojant imunologinius tyrimus, o ši sritis subrendo dešimtmečius. Siekiant maksimalaus specifiškumo, dažniausiai pirmenybė teikiama sumuštinių tyrimams (3D pav.). Nors juos sukurti brangu ir sunku, jie gali pasiekti didelį jautrumą ir didelį pralaidumą. Netgi kohortos, kuriose dalyvauja tūkstančiai dalyvių, gali būti išbandytos naudojant šią technologiją, tačiau tik vienam ar keliems kandidatams į biomarkerius. Tokių didelių skaičių gali prireikti norint nustatyti specifiškumą ne tik kontrolės, bet ir kitų ligų atžvilgiu. Standartiniai reikalavimai apima pakankamos statistinės galios ir replikacijos nepriklausomoje populiacijoje užtikrinimą. Šiandien tokie klinikiniai tyrimai gali būti brangūs kelerius metus trunkantys darbai, iš dalies paaiškinantys naujų biomarkerių trūkumą.

Imunologiniai tyrimai turi tam tikrų būdingų apribojimų, daugiausia susijusių su antigeno antikūnų atpažinimu. Tai apima kryžminį reaktyvumą, foninių molekulių, tokių kaip trigliceridai, trukdymą ir nelinijinį atsaką („kablio efektas“) (Hoofnagle & Wener, 2009 Wild, 2013). Be to, ne visi kliniškai svarbūs baltymų variantai yra lengvai atpažįstami atliekant antikūnų tyrimus. Atsižvelgiant į šiuos apribojimus, MS pagrįsti metodai būtų patraukli alternatyva bent jau kai kuriuose didelio masto klinikiniuose tyrimuose, tačiau tam reikia daug tvirtesnių, jautresnių ir didesnio pralaidumo technologijų nei šiandien.

Per pastarąjį dešimtmetį proteomikos bendruomenė parengė tinkamo biomarkerių kūrimo gaires, kuriose aptariami kokybės standartai ir pabrėžiama tinkamų grupių atrankos svarba, užtikrinanti statistinį išvadų reikšmingumą, galimų biomarkerių specifiškumą ir galimą klinikinį pritaikymą (Luque- Garcia ir Neubertas, 2007 Paulovičius ir kt, 2008 Mischak ir kt, 2010 Surinova ir kt, 2011 Pačiūžos ir kt, 2013 m. „Parker & Borchers“, 2014 m. „Hoofnagle“. ir kt, 2016 ).

Nenuostabu, kad atsižvelgiant į griežtus trikampės strategijos reikalavimus, yra nedaug ataskaitų, kuriose ji buvo visiškai ir sėkmingai pritaikyta, jei tokių yra. Taip pat iš dalies gali būti dėl to, kad naudojamos trys skirtingos technologijos – šautuvų proteomika, tikslinė proteomika ir imunologinio tyrimo kūrimas. Daugelyje publikacijų tik aprašoma pirmoji fazė arba ji derinama tik su imunologiniu patikrinimu toje pačioje grupėje (EV1 duomenų rinkinys).

Iš tyrimų, kuriuose dalyvavo daugiau nei keli dalyviai ir kai kurie patikrinimai, dauguma atrinko dominančius kandidatus ir atliko Western blot, ELISA arba MRM tyrimus. Tipiškas pavyzdys yra Zhang tyrimas ir kt (2012), kuriame išeikvota 10 gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu sergančių pacientų plazma, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, buvo paženklinta iTRAQ ir frakcionuota, todėl buvo nustatyti 72 baltymai. Tarp kelių aukštyn arba žemyn reguliuojamų baltymų ORM2 buvo atliktas ELISA tyrimu 419 asmenų. Kadangi šis baltymas yra įgimtos imuninės sistemos dalis (kaip ir kiti du sureguliuoti kandidatai), mažai tikėtina, kad jis bus specifinis vėžio žymuo. Kitame tyrime super išeikvojimas, iTRAQ žymėjimas ir frakcionavimas nustatė 830 baltymų iš 751 paciento, sergančio širdies ir kraujagyslių reiškiniais, ir kontrolinių grupių, kurių skaičius buvo sumažintas iki 50 jungtinių mėginių, grupėje (Juhasz). ir kt, 2011). Žinomi žymenys CRP ir fibronektinas buvo atrinkti iš kandidatų sąrašo ir nustatyta, kad pradinėje kohortoje imunologiniais tyrimais prieš šiuos baltymus jie buvo žymiai padidinti. Atliekant širdies transplantacijos tyrimą, išeikvotos ir iTRAQ žymėtos plazmos iš 26 pacientų analizė penkiais laiko momentais prieš ir po operacijos nustatyta daugiau nei 900 baltymų (273 vienam Cohenui. ir kt, 2013). MRM tyrimai ir ELISA tyrimai prieš penkis vidutiniškai gausius baltymus iš dalies nepriklausomoje 43 asmenų grupėje padėjo sukurti organų atmetimo rizikos žymenų skaičiavimo sistemą. Pagal galimą klinikinį naudą, išeikvota plazma iš krūties vėžio modelio pelių leido identifikuoti daugiau nei 1000 plazmos baltymų, iš kurių 88 buvo atrinkti MRM tyrimams nepriklausomoje 80 gyvūnų tikrinimo grupėje (Whiteaker). ir kt, 2011 ).

Stačiakampio biomarkerio strategija ir plazmos proteomų profiliavimas

Per pastaruosius kelerius metus bendruomenė iš esmės patobulino visus MS pagrįstos proteomikos darbo eigos aspektus. Ruošiant mėginius, daug pastangų reikalaujančios, kelių etapų paruošimo darbo eigos buvo pakeistos tvirtu, vieno buteliuko apdorojimu, atliekant minimalius manipuliavimo veiksmus. Tai taip pat padeda automatizuoti ir padidina pralaidumą. MS instrumentų jautrumas ir sekos greitis pagerėjo kelis kartus. Visa LC-MS / MS sistema tapo daug tvirtesnė, nors tai vis dar toli nuo to, ko reikės įprastiniam klinikiniam naudojimui. Galiausiai, bioinformatinė rezultatų analizė dabar yra statistiškai pagrįsta ir nesudėtinga naudoti ir vis labiau leidžia koreliuoti MS rezultatus su daugybe kitų klasikinių klinikinių ir papildomų „omikos“ duomenų. Iliustruojant pažangiausios MS pagrįstos proteomikos galią, dabar ląstelių linijas galima reguliariai kiekybiškai įvertinti daugiau nei 10 000 skirtingų baltymų gylyje per gana trumpą laiką, kartais net be jokios frakcionavimo (Mann ir kt, 2013 Richardsas ir kt, 2015 Sharma ir kt, 2015 Bekker-Jensen ir kt, 2017 ).

Atsižvelgdami į šią technologinę proteomikos pažangą ląstelių linijose ir audinių mėginiuose, paklausėme, ar taip pat būtų galima sukurti greitą ir automatizuotą darbo eigą, kuri leistų kiekybiškai įvertinti plazmos proteomą daugelyje mėginių (Geyer). ir kt, 2016a). Mes samprotavome, kad tai įgalintų „stačiakampę strategiją“, pagal kurią būtų išmatuojama kuo daugiau baltymų kiek įmanoma daugiau asmenų ir sąlygų. Priešingai nei trikampio darbo eiga, pradinė atradimų grupė būtų daug didesnė, idealiu atveju apimtų šimtus ar tūkstančius dalyvių, todėl būtų didesnė tikimybė atskleisti bet kokius modelius, galinčius atskirti tiriamas grupes ar sąlygas. Šie didesni pradiniai plazmos proteomų skaičiai leistų atrasti statistiškai reikšmingus, bet nedidelius skirtumus ir pokyčius, susijusius su baltymų grupe. Siūlomoje stačiakampėje strategijoje tiek atradimų, tiek patvirtinimo grupės būtų išmatuotos šautuvų proteomika labai giliai. Tai pašalina patvirtinimo priklausomybę nuo atradimo, o tai reiškia, kad abi kohortos gali būti analizuojamos kartu (4A pav.). Be to, atskirų grupių turėjimas leidžia atskleisti konkrečias studijoms būdingus painiavos. Kitas stačiakampės strategijos privalumas yra jos gebėjimas atrasti ir patvirtinti baltymų modelius, būdingus tam tikroms sveikatos ar ligos būsenoms, be atskirų biomarkerio kandidatų, o tai nepasiekiama taikant trikampį metodą.

4 pav. Stačiakampė darbo eiga

Įdomu tai, kad analogiškas koncepcijos pokytis jau įvyko prieš keletą metų genomo masto asociacijos tyrimams (GWAS). Šios srities tyrėjai nustatė, kad bendra kuo daugiau mėginių analizė buvo pranašesnė už nuoseklų vamzdyną (Skol ir kt, 2006). Proteomikos srityje akivaizdus iššūkis yra pasiekti pakankamą proteomikos gylį per trumpą laiką, idealiu atveju be išeikvojimo ir esant tvirtai darbo eigai. Šis tikslas nebuvo pasiektas šio straipsnio rašymo metu, tačiau dabartinis technologinių patobulinimų tempas žada, kad tai bus įmanoma artimiausiu metu. Žemiau aptariame keturis šio naujo požiūrio pavyzdžius.

Pirmajame iš jų buvo tiriama 36 monozigotinių ir 22 dizigotinių dvynių porų grupė, siekiant nustatyti genetinio fono įtaką plazmos baltymų kiekiui (Liu ir kt, 2015). Autoriai sukūrė spektrinę biblioteką, naudodami išeikvotus, frakcionuotus ir sujungtus mėginius, ir išmatavo jų mėginius naudodami nuo duomenų nepriklausomą gavimą (DIA). Iš viso 232 plazmos mėginiai buvo išmatuoti 35 minučių gradientais nuo duomenų nepriklausomu režimu, todėl buvo nuosekliai įvertinti 1904 peptidai ir 342 baltymai. Įdomu tai, kad baltymų lygis tarp individų dažnai buvo gana stabilus, palyginti su tarp individų. Be to, buvo aiškių požymių, kad kai kurių baltymų kiekis yra genetiškai kontroliuojamas. Pavyzdžiui, procesai, susiję su „imuniniu atsaku“ ir „kraujo krešėjimu“, dažniausiai buvo paveldimi, o su „hormoniniu atsaku“ susiję procesai – ne. Nors tyrimas buvo novatoriškas, analizuotų plazmos proteomų skaičius buvo palyginti mažas, atsižvelgiant į pateikto tyrimo klausimo bendrumą. Paprastai genetikos tyrimais nuolat tiriami tūkstančiai dalyvių, siekiant išsiaiškinti subtilų paveldimą poveikį, iliustruojantį daug didesnio klinikinės proteomikos našumo poreikį.

Malmström ir kt (2016) sukėlė sepsį pelėms injekcijomis S. pyogenes ir sekė jų plazmos proteomas per tris laiko taškus neišeikvotuose, nefrakcionuotuose mėginiuose. Įvairių pelių audinių biblioteka buvo naudojama siekiant palaikyti nepriklausomą nuo duomenų identifikavimą ir nustatyti audinių pažeidimo baltymų kilmę. Tokiu būdu 2 valandų trukmės važiavimai kiekybiškai įvertino vidutiniškai 786 pelių baltymus, nors reikia pažymėti, kad vis dar aptariami tinkami FDR kriterijai, leidžiantys nustatyti peptidų tapatumą kompleksiniuose DIA MS/MS spektruose (Nesvizhskii ir kt, 2007 Bruderer ir kt, 2017 Rosenberger ir kt, 2017). Sepsio metu padidėjo keletas numatomų plazmos baltymų kategorijų, taip pat kai kurie žymenys, susiję su kraujagyslių sistemos pažeidimu. Kai kurie pokyčiai buvo susiję su imuninės sistemos mobilizavimu prieš patogeną, o kiti buvo susiję su sunkiai paveiktų gyvūnų nekroze.

Atlikdami darbo eigą, vadinamą „plazmos proteomų profiliavimu“, mes sutelkėme dėmesį į greitą ir patikimą tik 1 μl neišeikvotos plazmos analizę iš vieno piršto (Geyer) ir kt, 2016a). Bendras gradiento laikas buvo tik 20 minučių, todėl buvo galima išsamiai ištirti plazmos proteomo analitinius, vidinius tyrimus, individualius ir individualius pokyčius. Remiantis 300 plazmos baltymų kiekybiniu įvertinimu, apie 50 FDA patvirtintų biologinių žymenų buvo padengti be etikečių (CV < 20%). Greita įvairių mėginių analizė taip pat atskleidė skirtingus kokybės žymenų rinkinius, kurie aiškiai suskirstė mėginius su raudonųjų kraujo kūnelių lizės požymiais, tuos, kurių krešėjimo kaskada buvo iš dalies suaktyvinta dėl netinkamo mėginių tvarkymo, ir tuos, kuriuose yra išorinių užteršimų, tokių kaip keratinas. Nors šis tyrimas pateikė naudingą plazmos proteomo informacijos turinio apžvalgą, aprėpties gylis dar nebuvo pakankamas, kad būtų galima spręsti žemo lygio reguliuojančius plazmos baltymus. Vienu frakcionavimo žingsniu gautas kiekybinis plazmos proteomas, sudarytas iš maždaug 1000 baltymų, įskaitant 183 baltymus, kurių koncentracija buvo < 10 ng/ml, tačiau už ilgesnį vieno mėginio matavimo laiką.

Patobulinta plazmos proteomų profiliavimo darbo eigos versija leido robotu paruošti ir išmatuoti beveik 1300 plazmos proteomų mėginių svorio metimo tyrime (Geyer). ir kt, 2016b). Keturis kartus atlikta asmenų analizė užfiksavo vidutiniškai 437 baltymų dinamiką metant svorį ir per metus palaikant svorį. Pats svorio netekimas turėjo platų poveikį žmogaus plazmos proteomui su 93 reikšmingai pakeistais baltymais. Kiekybiniai skirtumai dažnai buvo nedideli, bet fiziologiškai reikšmingi, pavyzdžiui, 16% sumažėjo adipocitų išskiriamo faktoriaus SERPINF1. Išilginio tyrimo planas, kurio metu asmenys vidutiniškai numetė 12% svorio 1 metus, leido užfiksuoti ilgalaikę plazmos proteomo dinamiką ir suskirstyti ją į baltymus, stabilius viduje, palyginti su tarp individų. Daugelio baltymų modeliai atspindėjo lipidų homeostazės sistemą (apolipoproteinų šeimą), žemo lygio uždegimą ir atsparumą insulinui. Šie modeliai kiekybiškai įvertino svorio metimo naudą asmens lygmeniu, galbūt atveriant individualias gydymo ir gyvenimo būdo rekomendacijas.

Kartu šie tyrimai taip pat išryškina išilginio tyrimo pranašumus, palyginti su skerspjūvio tyrimo planais, nes plazmos proteomas žmogui bėgant laikui yra daug pastovesnis nei tarp skirtingų asmenų. Be to, jie yra panašūs tuo, kad naudoja mažiau į šališkumą linkusios neišeikvotos plazmos ir identifikuoja daug baltymų per tam tikrą analizės laiką (iki 20 baltymų per minutę).

Kalbant apie klausimą, kiek baltymų turėtų būti padengta, mes nustatėme, kad daugiau nei 1 500 baltymų proteominis gylis neišeikvotoje plazmoje leidžia padengti audinių nutekėjimo baltymus, tokius kaip lipoproteinų receptoriai kepenyse, ir yra pasiekiamas technologinėmis galimybėmis, kurios šiuo metu yra kuriamos. išvystyta. Tarp pirmųjų 300 daugiausiai gausių baltymų kas ketvirtas baltymas yra biomarkeris, o kituose 1200 baltymų – tik kas 25-asis baltymas (5 pav.). Kaip ir nėra a priori Priežastis, kad biomarkerių gausos pasiskirstymas turėtų būti iškreiptas, tai rodo, kad daug biologinių žymenų vis dar reikia rasti. Manome, kad tikrasis plazmos proteomų profiliavimo pažadas naudojant stačiakampę strategiją yra tas, kad jis gali atrasti baltymus ir baltymų modelius, kurie dar nebuvo laikomi biomarkeriais. Eksponentinis pagrindinės LC-MS / MS technologijos padidėjimas paskatins atitinkamą plazmos proteomų duomenų rinkinių, užregistruotų laboratorijose visame pasaulyje, skaičiaus padidėjimą. Taip bus sukurta plati plazmos proteomų ir jų dinamikos duomenų bazė, apimanti daugybę klinikinių tyrimų ir asmenų. Tokius duomenis būtų galima apibendrinti, kad būtų sukurta žinių bazė, jungianti proteomų būsenas su daugybe „trikimų“, įskaitant ligas, riziką, gydymą ir gyvenimo būdą. Šis metodas bent jau atskleis visas skirtingas sąlygas, kuriomis dalyvauja tam tikras biologinių žymenų rinkinys, be konkretaus konteksto, kuriame jie buvo aptikti. Proteomų sutapimas tarp ligos sąlygų gali atskleisti jų bendrumą (4B pav., Viršutinė plokštė). Asmens plazmos proteomo profilis ir jo dinamika gali būti interpretuojami lyginant jį su pasauline žinių baze. Tai galėtų būti naudojama gretutinių ligų išskaidymui ir gydymui bei veiksmingumo stebėjimui (4B pav., apatinis skydelis).

5 pav. Biomarkerio pasiskirstymas gausos diapazone

Proteominių biomarkerių atradimo vamzdyno standartizavimas

Buvo pasiūlyta, kad dabartinis į rinką patenkančių biožymenų trūkumas gali būti įvairių techninių, mokslinių ir politinių aspektų, įskaitant nepakankamą įvertinimą, atsirandantį dėl nenuoseklių reguliavimo standartų, ir analitinės pagrįstumo bei klinikinio naudingumo įrodymų trūkumo (Hayesas). ir kt, 2013). Siekiant įveikti šiuos iššūkius, buvo propaguojami sistemingi biomarkerių kūrimo vamzdynai (Pavlou ir kt, 2013 Duffy ir kt, 2015). Pereinant nuo trikampio prie stačiakampio biomarkerio atradimo strategijos, bus ypač svarbu atsižvelgti į šiuos principus.

(1) Analitinės veiklos charakteristikos: Analitinis pagrįstumas – tai bandymo gebėjimas tiksliai ir patikimai išmatuoti biologinį žymenį. Plazmos proteomikos metodologijos analitinio pagrįstumo nustatymas bus labai svarbus, nes tas pats metodas dažnai bus taikomas nuo atradimo iki taikymo. Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas (CLSI) (www.clsi.org) sukūrė išsamius analitinio pagrįstumo nustatymo standartus. Apžvalgą galite rasti Grant ir Hoofnagle (2014) ir Jennings ir kt (2009). Kai kuriuos iš šių standartų pripažino JAV maisto ir vaistų administracija (FDA) ir jie yra priimti. in vitro diagnostinį testą į rinką (https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfstandards/search.cfm). Nors pradedant nuo visiško analitinio patvirtinimo, atitinkančio FDA standartus, biomarkerio atradimas gali būti pernelyg sudėtingas, reikėtų išbandyti bent kai kuriuos pagrindinius kriterijus, tokius kaip perkėlimas, tikslumas, tikslumas, analitinis jautrumas, analizės specifiškumas ir kiekybinio nustatymo riba. anksti. Tai atitinka tai, ką mes pasisakome stačiakampės strategijos kontekste, taip pat siekiama taupyti išteklius, nes žingsnis po biomarkerio atradimo yra biomarkerio patvirtinimas, kai analitinis pagrįstumas bus privalomas.

(2) Klinikinės veiklos charakteristikos. Klinikinis pagrįstumas yra susijęs su susijusiomis ligomis ir pacientų klinikinėmis būklėmis ir skiriasi nuo analitinio pagrįstumo, kuriame pagrindinis dėmesys skiriamas teisingam analičių, kurioms taikomas tyrimas, matavimas. Pagal Tarptautinę standartų organizaciją (ISO) 15189 ir ISO 17025, patvirtinimas yra „patvirtinimas pateikiant objektyvius įrodymus, kad buvo įvykdyti konkretaus numatomo naudojimo ar taikymo reikalavimai“. Todėl pagrindinis biomarkerio patvirtinimo etapo tikslas yra nustatyti klinikinį efektyvumą. Klinikinės veiklos charakteristikos apima i) normalių atskaitos diapazonų nustatymą, matuojant iš pažiūros sveikų asmenų grupes, ii) klinikinio jautrumo nustatymą, kuris apibrėžiamas kaip asmenų, sergančių šia liga ir kurių testas buvo teigiamas, dalis, ir iii) nustatyti klinikinį specifiškumą. , kuri apibrėžiama kaip nesergančių asmenų, kurių testas buvo neigiamas, dalis. Išvestinė statistika, pvz., imtuvo veikimo charakteristikų (ROC) diagramos, yra ypač naudinga vertinant biologinių žymenų klinikinį veikimą (Zweig ir Campbell, 1993 Obuchowski ir kt, 2004 ).

(3) Tyrimo planas ir išankstinė analizė: kruopštus tyrimo planas ir gerai kontroliuojamos išankstinės analizės sąlygos yra pagrindiniai reikalavimai bet kuriuo biologinių žymenų tyrimo metu. Kalbant apie tyrimo planą, privaloma aiškiai apibrėžti klinikinį klausimą ir medicininį poreikį, į kurį turėtų atsižvelgti biomarkeris. Dažna biologinių žymenų tyrimų problema yra ta, kad mėginiai iš atvejų ir kontrolinių grupių buvo paimti nepriklausomai ir neatitinka amžiaus, etninės priklausomybės, lyties ir kitų veiksnių, galinčių sukelti netyčinį šališkumą (Duffy). ir kt, 2015). Metodai, skirti kovoti su šališkumu, apima tinkamą tyrimo planavimą, taip pat tikslų ir gilų klinikinį dalyvių fenotipų nustatymą, naudojant sistemines klasifikacijas, pvz., Tarptautinę statistinę ligų klasifikaciją (http://apps.who.int/classifications/icd10/browse/2016/en) arba žmogaus fenomeno ontologija (Kohler ir kt, 2017). Tokiu būdu, jei asmuo serga keliomis ligomis, į tai galima tinkamai atsižvelgti. Mėginių paėmimas taip pat yra svarbus, todėl būtina, kad visi mėginiai (įskaitant atvejus ir kontrolinius mėginius) būtų traktuojami vienodai nuo kraujo paėmimo iki analizės fazės. Kitas svarbus daugelio biologinių žymenų tyrimų žingsnis yra biobankininkystė. Taikydami ELISA nustatėme, kad baltymų pagrindu pagamintų biologinių žymenų saugojimui 3 mėnesius reikalinga –80 °C arba žemesnė temperatūra (Zander ir kt, 2014). Mėginio stabilumas ilgesnį laiką yra menkai ištirtas. Tačiau, remiantis mūsų patirtimi, šratų proteomika labai toleruoja mėginio istorijos pokyčius, nes nėra baltymų epitopų, kuriuos reikia išsaugoti, ir net dalinis baltymų skilimas gali būti toleruojamas tol, kol dauguma vėliau sukurtų proteolitinių peptidų lieka nepakitę.

Kelias į klinikinį pritaikymą

Dabartinė plazmos proteomikos pažanga atveria įdomių naujų būdų tyrimams ir klinikai. Kiek tikėtina, kad, atsižvelgiant į visas pirmiau minėtas atsargumo priemones, aprašyti metodai padės atrasti naujus baltymų pagrindu pagamintus biomarkerius? O kaip atrodys ateities proteominis biomarkeris? Pagrindinė tema šiame kontekste yra skiriamoji biomarkerio galia atskirti tam tikros ligos būsenos ar rizikos buvimą ir nebuvimą, kitaip tariant, jo klinikinį veikimą. Šiuo metu naudojamų didelio specifiškumo ir didelio jautrumo biomarkerių pavyzdžiai yra širdies troponinai, kurie yra struktūriniai baltymai, specifiškai ekspresuojami kardiomiocituose ir todėl labai specifiški miokardo pažeidimams. Dėl šios priežasties širdies troponinai netgi buvo įtraukti į visuotinį miokardo infarkto apibrėžimą (Roffi ir kt, 2016 ).

Tikėtina, kad proteomikos metodais pavyks nustatyti papildomus biomarkerius, kurių veikimas panašus, bent jau esant tam tikroms ligoms. Tiesą sakant, turime žinoti, kad dauguma šiandien naudojamų biomarkerių yra labai gausūs arba kilę iš žinomo patofiziologinio konteksto. Kaip minties eksperimentą, mes ekstrapoliavome biologinių žymenų skaičiaus santykį su baltymų skaičiumi didelio gausumo diapazone ir mažesnio gausumo baltymų diapazone, o tai rodo kelių šimtų naujų biomarkerių, kuriuos būtų galima pasiekti naudojant atitinkamą technologiją, santykį. 5 pav.). Analogiškai su GWAS, kai paaiškėjo, kad nemaža dalis pataikymų buvo susiję su anksčiau nežinoma tiriamos ligos patofiziologija (Holdt & Teupser, 2013 Manolio, 2013), gana tikėtina, kad nauji žymekliai, pasislėpę po radaru. ankstesnės strategijos, bus identifikuotos taikant naujus sisteminius proteomikos metodus. Šie biomarkeriai taip pat gali pagerinti mūsų supratimą apie ligos patofiziologiją ne tik diagnostikos, bet ir gydymo srityse. Tačiau atminkite, kad nustatyti biomarkeriai ne visada gali būti tiesiogiai susiję su ligos patofiziologija, bet gali būti susiję tik su ja.

Žmogaus genomas koduoja apie 20 000 baltymus koduojančių genų, o tai prieštarauja daugiau nei 14 500 ligų, klasifikuojamų pagal TLK kodą. Dėl to net konceptualiai sunku įsivaizduoti, kad vienas genas ar baltymas yra susijęs su kiekviena ligos būkle, kaip dažnai numanoma dabartinėse pastangose ​​rasti biomarkerius. Priešingai, stačiakampė strategija, leidžianti patikrinti dideles grupes dėl kelių žymenų, turi didelį pažadą atrasti ir patvirtinti baltymų modelius, būdingus tam tikroms sveikatos ar ligos būsenoms. Iš tiesų, kelių žymenų deriniai gali pasiekti didesnį specifiškumą ir jautrumą, lyginant su pavieniais žymenimis, ir buvo sukurtos pirmosios priemonės tikslioms žymeklių deriniams iš omikos duomenų parinkti (Mazzara ir kt, 2017). Tačiau bendra problema, susijusi su naujais biologiniais žymenimis kartu su esamais, yra ta, kad jie dažnai lemia tik nedidelius klasifikavimo patobulinimus, ypač kai jie pridedami prie gerai veikiančių (Pencina). ir kt, 2010). Priešingai įprastoms ir intuityvioms prielaidoms, buvo įrodyta, kad koreliacija (ypač neigiama koreliacija) tarp prognozių gali būti naudinga diskriminacijai (Demleris). ir kt, 2013). Būtina atlikti daugiau šios srities tyrimų, o naujos proteomikos technologijos suteiks duomenų, reikalingų tinkamiems statistiniams metodams patvirtinti.

Galiausiai, kaip šie žymenys bus taikomi klinikinėje aplinkoje? Mes teikiame pirmenybę nuodugniam viso plazmos proteomo matavimui, nepaisant progos, nes tai suteikia išsamiausią informaciją. Laikui bėgant, jis papildo išilginį plazmos proteomo profilį, kurį būtų naudinga gauti net sveikiems asmenims. Kaip minėta pirmiau, plazmos baltymų kiekis paprastai būna stabilus, bet būdingas asmeniui, todėl galima interpretuoti individualiai, o ne populiacija pagrįstas ribines vertes. Be to, daugelyje pacientų grupių gretutinės ligos yra taisyklė, o ne išimtis. Jas daug lengviau ir ekonomiškiau galima išspręsti atliekant bendrąjį diagnostinį testą, pvz., plazmos proteominį profiliavimą, o ne atliekant atskirus ELISA testus. Nepaisant to, akivaizdu, kad yra daug situacijų, kai universalus testas nebus tinkamas, nes jis gali netyčia atskleisti kitas sąlygas. Panašios problemos kyla ir su kitomis technologijomis, tokiomis kaip genomo sekos nustatymas ar įsivaizdavimo metodai, kai asmenys gali nenorėti sužinoti apie polinkius, dėl kurių jie mažai ką gali padaryti. Tokiais atvejais ir apskritai siekdami išvengti per didelės diagnozės pavojaus (Hofmann & Welch, 2017), gydytojai gali teikti pirmenybę labiau nukreiptiems plazmos proteomikos tyrimams, kuriuose dėmesys sutelkiamas į tam tikrą ligos kontekstą. Tai galima pasiekti naudojant aukščiau paminėtus MS metodus, nukreiptus į baltymų grupę, o ne į visą proteomą.

Atliekant viso proteomo diagnostikos testus arba skydinius testus, kyla klausimas, kaip gydytojai elgtųsi su gautais daugiamačiais duomenimis. 6A paveiksle parodyta dabartinė vieno / oligo biomarkerio diagnostika, kuri yra integruota į sprendimų priėmimą daugiausia remiantis klinikinėmis žiniomis ir intuicija. Nauji biomarkeriai aiškiai žada geriau informuotus klinikinius sprendimus, bet taip pat reiškia riziką, kad susidarys modeliai, viršijantys žmogaus pažinimo gebėjimus interpretuoti (6B pav.). Šios problemos sprendimas galėtų būti kelių biomarkerių algoritminis sujungimas į kiekybinę grupę, galbūt kartu su klinikiniais metaduomenimis, kurie galėtų iš esmės padėti priimti klinikinius sprendimus (6C pav.). Atsižvelgiant į sparčią „gilaus mokymosi“ ir „didžiųjų duomenų“ raidą, bus labai įdomu pamatyti, ar šis derinys gali suteikti galingų ir precedento neturinčių asociacijų. Atkreipiame dėmesį, kad šiandien klinikinėje praktikoje jau yra kelių parametrų balai. Pavyzdžiui, Child-Pugh balas ir Framinghamo rizikos balas sujungė kelias kraujo vertes su paciento duomenimis, kad padėtų gydytojui priimti sprendimą atitinkamai gydyti kepenų ligas ir gydyti širdies ir kraujagyslių ligas dešimtmečius. Tai taip pat rodo, kaip plazmos proteomika galėtų būti priimta į įrodymais pagrįstą medicinos praktiką, o tai yra didžiulis iššūkis, atsižvelgiant į daugybę parametrų ir parametrų derinių, kurių visų negalima patvirtinti atskirais klinikiniais tyrimais. Pragmatiška alternatyva galėtų būti bandymų, kurių metu gydytojai atsitiktinai gautų proteominę informaciją ir susijusią sprendimų palaikymą, kūrimas. Tada būtų nesudėtinga nustatyti, ar yra didelės naudos pacientų rezultatams.

6 pav. Proteominių duomenų įgyvendinimas priimant klinikinius sprendimus

Išvados

Dabartinės laboratorinės medicinos praktikos apžvalga rodo, kad dauguma gydymo sprendimų priimami remiantis kraujo tyrimais ir kad baltymų matavimai ir šiandien yra ryškiausi tarp jų. Nepaisant to, kad juos kasmet sėkmingai atlieka milijonai, šie tyrimai beveik visada yra nukreipti prieš atskirus baltymus, o naujų baltymų testų diegimo tempas sulėtėjo.

MS pagrįsta proteomika aiškiai gali atlikti multipleksinius ir labai specifinius matavimus, kuriuose baltymų modeliai, o ne pavieniai biomarkeriai galėtų būti svarbūs rodmenys. Literatūros apžvalga atskleidė, kad ankstesnes pastangas stabdė dideli plazmos proteomo analitiniai iššūkiai, o tai tik dabar užleidžia vietą įdomiems technologiniams pokyčiams. Mes teigiame, kad daugelio sąlygų ir dalyvių analizė visuose atradimo ir patvirtinimo proceso etapuose gali sukurti biomarkerių plokštes, kurios gali turėti klinikinę vertę. Sujungus su didelėmis žinių bazėmis apie baltymų modelių pokyčius apibrėžtomis sąlygomis, tokia plazmos proteomų profiliavimo strategija iš esmės galėtų išnaudoti visą šio kūno skysčio informacijos turinį.

Kad ši vizija taptų realybe, labai svarbu toliau tobulinti pralaidumą, proteomų aprėpties gylį, patikimumą ir pagrindinės darbo eigos prieinamumą. Be to, plazmos proteomika taip pat gali būti išplėsta į modifikacijų po vertimo analizę. Be to, plazmos metabolomika taip pat naudoja MS pagrįstas darbo eigas ir ateityje galėtų būti reguliariai integruota su plazmos proteomika. Esame įsitikinę, kad reikiamos technologinės pažangos gali būti ir bus pasiektos laikui bėgant. Bent jau toks pat iššūkis bus konceptualus ir „politinis“, nes proteominės informacijos antplūdis turi būti paverstas veiksmingais duomenimis gydytojui ir sveikatos priežiūros sistemai. Tam reikės visų dalyvaujančių partnerių atsidavimo ir nenuilstamo įsipareigojimo. Tikime, kad daug tikslesnės ir konkretesnės diagnostikos pažadas už tokias pastangas puikiai atlygins.


Rezultatai

Augalų augimo analizė

Morkų šaknys atitinkamai nuskintos sėjinukų stadijoje (20 DAS, S1), laužymo stadijoje (40 DAS, S2) ir subrendusios stadijos (90 DAS, S3) (1A𠄼 pav.). 20 DAS morkų šaknis buvo balta, o šviežios šaknies svoris buvo akivaizdžiai mažesnis nei ūglio svoris (1D pav.). Pertrūkimo stadijoje morkų šaknų paviršius pradėjo matytis oranžine spalva, o šviežio ūglio svoris labai pagerėjo. Šiame etape nei šviežios šaknies svoris, nei skersmuo reikšmingų pokyčių neparodė (1E pav.). Vėlesniu laikotarpiu šaknis greitai augo, o šviežios liemeninės šaknies svoris buvo didesnis nei ūglio (1D pav.). Tuo tarpu šaknų skersmuo žymiai padidėjo morkų šaknų augimo metu (1E pav.).

Figūra 1. Morfologinės morkų savybės trimis vystymosi tarpsniais. (A𠄼) Morkų augimo būklė ‘Karodagosun’ 20 DAS (A), 40 DAS (B)ir 90 DAS (C). Juodos linijos dešiniajame apatiniame kampe kiekviename paveikslėlyje reiškia 5 cm. (D) Šviežias morkų šaknų svoris trimis vystymosi etapais. (E) Morkų šaknų skersmuo trimis vystymosi stadijomis. Skirtingos mažosios raidės rodo reikšmingus skirtumus P < 0,05.

Norėdami toliau tirti anatominius pokyčius morkų šaknų vystymosi metu, Safranin-OSkirtingų augalų audinių struktūrai parodyti buvo naudojamas greitas žalias dažymas (2 pav.). Esant dėmėms, sudegintos ląstelių sienelės gali parausti. Kaip parodyta 2A paveiksle, sodinimo stadijoje buvo daug didelių kraštinių ląstelių. Šiame etape floemas ir protoksilemas buvo maži, o lignifikacija nebuvo akivaizdi (2B pav.). Didėjant šių ląstelių skaičiui ir dydžiui, morkų šaknys pradėjo tirštėti. Antrajame etape kraujagyslių kambis nuolat dalijasi. Ksileme buvo glaudžiai išdėstyti daug kraujagyslių, o ląstelės sienelės lignifikacija žymiai padidėjo (2C, D paveikslai). Vėliau, vėlesniame šaknų vystymosi etape (2E–G pav.), ksilemo indų pasiskirstymas labai pasikeitė, o ne glaudžiai išsidėsčiusios, o pradėjo plisti į grupes. Tuo tarpu per šį laikotarpį sparčiai susikaupė daug krakmolo granulių.

2 pav. Anatominė morkų šaknų struktūra nuo 1 etapo (A, B), 2 etapas (C, D) ir 3 etapas (E–G). BC, kraštinės ląstelės EP, epidermio PC, parenchiminė ląstelė Ph, felogenas PP, pirminis floemas Px, protoksilemas SG, krakmolo granulė VC, kraujagyslių kambis Ve, kraujagyslė. Didinimas yra 200 kartų didesnis už pradinį dydį (A𠄽) kadangi padidinimas yra 400 kartų (E–G).

Baltymų identifikavimas ir kiekybinis nustatymas

iTRAQ technologija buvo naudojama analizuojant baltymus, gautus iš morkų šaknų gretimose stadijose. Iš viso buvo aptikti 2845 baltymai. Per morkų šaknų augimo laikotarpį iš viso buvo nustatyti atitinkamai 226 ir 418 DEP pertraukimo stadijoje (S2) ir brandžioje stadijoje (S3) (papildoma medžiaga S2). Be to, abiejuose etapuose vienu metu buvo 118 DEP (3A pav.).

3 pav. Bendri baltymų lygio pokyčiai morkų šaknų vystymosi metu. (A) Venno diagrama, rodanti baltymų, paprastai ir unikaliai išreikštų skirtinguose vystymosi etapuose, skaičių. Skaičiai ovale žymi fazei būdingus baltymus, o skaičius dviejuose susikertančiuose ovaluose reiškia persidengiančius baltymus. (B) Skirtingai išreikštų baltymų skaičius tarp dviejų iš eilės einančių vystymosi stadijų. (C) Vidutinis ir maksimalus/min diferencijuotai išreikšto baltymo log2 karto pokytis tarp dviejų iš eilės einančių vystymosi stadijų.

3B paveiksle parodytas aukštyn ir žemyn reguliuojamų baltymų skaičius morkų šaknų augimo metu. Kiekvienoje fazėje aukštyn ir žemyn reguliuojamų baltymų skaičius buvo panašus. Tačiau brandaus etapo DEP skaičius buvo beveik dvigubai didesnis nei pertraukimo etape. Tuo tarpu vidutinė ir mažiausia / didžiausia DEP vertė buvo parodyta 3C paveiksle. Brandžios stadijos metu besikeičianti DEP amplitudė buvo santykinai ryškesnė.

Metabolizmo procesams būdingų baltymų klasifikacija

Remdamiesi GO duomenų baze, atlikome funkcinę visų DEP anotaciją tarp dviejų iš eilės einančių vystymosi etapų. 20 geriausių GO terminų iš trijų kategorijų „biologinis procesas“, 2019 m., 2018 m. ląstelių komponentai, 2019 m. ir 2018 m. molekulinė funkcija, P- vertės buvo rodomos papildomame S1 paveiksle, papildomoje medžiagoje S1. Dauguma DEP buvo praturtinti grupe ‘ląsteliniai komponentai’ abiejuose rinkiniuose (S2/S1, S3/S2). Tuo tarpu didžioji dalis GO terminų šioje grupėje buvo gana artimi. Pavyzdžiui, ‘nucleus’ ir ‘nucleolus’ buvo labiausiai atstovaujami GO terminai tiek S2/S1 (atitinkamai 63 ir 55 DEP), tiek S3/S2 (atitinkamai 91 ir 79 DEP). Tas pats reiškinys įvyko ‘molekulinėje funkcijoje’. Kalbant apie „Biologinį procesą“, 2019 m. buvo tam tikrų skirtumų tarp dviejų rinkinių GO sąlygos. Daugiausia DEP buvo atitinkamai S2/S1 (19 DEP) ir S3/S2 (28 DEP).

Biologiniai keliai taip pat buvo analizuojami naudojant KEGG duomenų bazę (4 pav.). Iš viso dviejuose rinkiniuose buvo nuoseklūs dvylika būdų. Tarp jų didžiausią dalį iš visų S2/S1 kelių užėmė ‘genetinės informacijos apdorojimas,’‘ląstelinis procesas,’𠆎nergijos apykaita’ ir ‘organizmo sistemos’. atitinkamai 22,3, 9,7 ir 7,6 proc.) ir S3/S2 (atitinkamai 31,6, 17,9, 10,4 ir 10,2 proc.). S3/S2 buvo specialiai aptikti ‘lipidų apykaitos’, ‘terpenoidų ir poliketidų metabolizmo’ ir ‘glikanų biosintezės ir metabolizmo’ keliai.

4 pav. KEGG DEP klasifikacija, nustatyta iš morkų šaknų skirtinguose vystymosi etapuose. (A) KEGG DEP klasifikacija, nustatyta tarp S1 ir S2. (B) KEGG DEP klasifikacija, nustatyta tarp S2 ir S3.

2019 m. baltymų funkcinių grupių profiliai morkų šaknų vystymosi metu

Morkų audinio proteomas lemia mėsingos šaknies augimą ir vystymąsi. Skirtingi įvairių baltymų ekspresijos lygiai morkų šaknų vystymosi metu pabrėžia ypatingą funkciją ir svarbą skirtingose ​​fazėse. Kaip parodyta 5 paveiksle, kai kurie DEP buvo suskirstyti pagal jų numatomas biologines funkcijas. Vystantis morkų šaknims, toliau gerėjo kelių su patogenais susijusių (5B pav.), su stresu (5C pav.), su baltymų skilimu susijusių (5K pav.) ir signalinių baltymų (5L pav.) ekspresijos lygiai. Kalbant apie baltymus, dalyvaujančius organinių rūgščių metabolizme (5D pav.), dauguma šių DEP buvo sumažintos S2. Priešingai, raiškos lygiai padidėjo brandos metu. Rezultatai taip pat parodė, kad sumažėjo pailgėjimo faktorių (5G pav.), antioksidantų fermentų (5H pav.), fotosintezės ir su energija susijusių baltymų (5N pav.) ir transportavimo baltymų (5O pav.) ekspresija. Žiūrėkite kaip visumą, skirtingi baltymai, turintys tą pačią funkciją, išreiškė skirtingas tendencijas.

5 pav. Baltymų ekspresijos hierarchinė klasterinė analizė skirtinguose vystymosi etapuose. Šilumos žemėlapiai buvo sukurti pagal log2 santykinį baltymų gausą. Buvo parodytas kiekvieno baltymo prisijungimo numeris ir baltymų aprašymas. Baltymai buvo sugrupuoti pagal jų vaidmenį medžiagų apykaitos keliuose. (A–O) Atstovauja įvairioms baltymų funkcijoms.

Expansin baltymų identifikavimas morkose

Remiantis baltymų anotacija, iš morkų šaknų proteomikos duomenų skirtingais vystymosi etapais buvo gauti du ekspansino baltymai. Informacija, įskaitant pI, baltymo Mw ir tt buvo išvardyti 1 lentelėje. Šių dviejų ekspansino baltymų ekspresijos lygiai buvo panašūs, kurie pirmiausia padidėjo, o vėliau sumažėjo.

1 lentelė. Identifikuotų ekspansino baltymų anotacija ir ekspresija.

Siekiant identifikuoti šių dviejų ekspansino baltymų genus, klonavimo pradmenys buvo sukurti pagal baltymų sekas. Du DcEXP genai, DcEXP20 ir DcEXP22 buvo klonuoti RT-PCR, o jų atviri skaitymo rėmeliai (ORF) buvo 786 bp ir 789 bp, koduojantys atitinkamai 261 ir 262 aminorūgštis (papildomas paveikslas S2, papildoma medžiaga S1).

Norėdami atlikti išsamų ekspansinų svarbos tyrimą, morkų genome patikrinome skirtingus ekspansino genus. Remiantis morkų genomo sprogdinimo rezultatais, iš viso buvo nustatyta 30 morkų ekspansino genų. Šie ekspansino genai buvo pavadinti kaip DcEXP1-DcEXP30 atsižvelgiant į ankstesnę nomenklatūrą (Kende ir kt., 2004). Genai, atitinkantys du skirtingai išreikštus ekspansino baltymus, buvo pažymėti kaip DcEXP20 (Prisijungimo Nr.: g13058) ir DcEXP22 (Prisijungimo Nr.: g63815), atitinkamai. Siekiant ištirti evoliucinį ryšį tarp morkų ekspansinų, buvo naudojamas kaimynų sujungimo (NJ) metodas, siekiant sukurti filogenetinį medį, pagrįstą visomis Arabidopsis ir morkų ekspansino baltymai (6 pav. ir papildomas S3 paveikslas, papildoma medžiaga S1). Visi DcEXP buvo suskirstyti į keturis pošeimius: EXPA, EXPB, EXLA ir EXLB. Didžiausias buvo EXPA pošeimas, kurį sudarė 24 morkų ekspansinai. Tačiau EXLA ir EXLB pošeimyje buvo atitinkamai tik vienas narys. Tuo tarpu abu du identifikuoti skirtingai išreikšti ekspansino baltymai priklausė EXPB šeimai. Morkose esančių 30 ekspansinų ilgis buvo 206� aminorūgštys. Fizikinių ir cheminių savybių analizės rezultatai parodė, kad Mw buvo 22,4�,2 kDa diapazone. Jų pI svyravo nuo 5, 3 iki 10, 2 (papildoma lentelė S2, papildoma medžiaga S1). Išskyrus EXLB pošeimį, turėjo dauguma ekspansinių pI vertės viršija 7,0.

6 pav. Morkų ekspansino genų filogenetinės medžio ir motyvų kompozicijos.

Expansin aminorūgščių sekų morkose struktūrinė analizė

30 ekspansinų aminorūgščių sekos morkose buvo suderintos (papildomas S4 paveikslas, papildoma medžiaga S1). Tam pačiam pošeimiui priklausančių baltymų aminorūgščių seka buvo daug labiau panaši. Išlyginta tapatybė tarp DcEXP20 ir DcEXP22, kurie abu priklauso EXPB pošeimiui, buvo 74, 6%. Dauguma ekspansino baltymų turėjo 16� aminorūgščių signalinį peptidą. Tačiau keturiems baltymams, DcEXP26, DcEXP29, DcEXP16 ir DcEXP19, trūko signalinio peptido (papildoma lentelė S2, papildoma medžiaga S1). Po signalinio peptido buvo nustatytos kelios konservuotos aminorūgščių liekanos. EXPA ir EXPB pošeimyje visuose ekspansinuose buvo HFD motyvas, išskyrus DcEXP11 ir DcEXP10, kuriuose buvo atitinkamai HFV ir QFD motyvai. Paprastai aštuonios konservuotos cisteino (Cys) liekanos buvo nustatytos tiek DcEXPA, tiek DcEXPB, ir tarp DcEXLA ir DcEXLB šešių. Tuo tarpu 11, 21 ir 14 glicino (Gly) taip pat buvo išsaugoti atitinkamai (papildomas paveikslas S4, papildoma medžiaga S1).

Baltymų motyvai ir detalios jų motyvų sekos buvo schematiškai išdėstytos 6 paveiksle. Dešimt EXPA pošeimos baltymų dalijasi visais dešimt motyvų komponentų, o kitiems trūko vieno ar dviejų motyvų. Kitų trijų pošeimių motyvai labai skyrėsi nuo EXPA. EXPB pošeimos nariai turėjo 4𠄷 motyvą, išskyrus DcEXP19. Tačiau EXLA ir EXLB pošeimyje yra atitinkamai tik vienas arba du motyvai. Apskritai 4 motyvas buvo visuose plėtiniuose.

Transkriptu pagrįstas ekspansino genų identifikavimas morkų šaknų augimo metu

Naudodamiesi mūsų laboratorijoje atlikto preliminaraus tyrimo transkripto duomenimis (Wang ir kt., 2015a), mes ištyrėme ekspansino genų transkripto lygius morkų šaknų augimo metu. Iš viso 26 ekspansino genai buvo patikrinti pagal transkripto duomenis. Remdamiesi kilobazės milijonui (RPKM) reikšmėmis, nubrėžėme šilumos žemėlapį, kad nurodytume jų išraiškos profilius (7 pav.). Beveik pusė ekspansino genų turėjo aukščiausią ekspresiją antrajame etape. Tačiau mes neradome, kad egzistuoja DcEXP17 ir DcEXP24 S2. Priešingai, DcEXP25 egzistavo tik S2, o ne S1 ir S3.

7 pav. Morkų ekspansino genų ekspresijos profiliai.

Expansin genų ekspresijos profilio analizė morkų šaknų vystymosi metu

Siekiant ištirti molekulinį mechanizmą, reguliuojantį morkų šaknų vystymąsi, dešimt skirtingų ekspansino genų, įskaitant DcEXP20 ir DcEXP22 ekspresijos analizei buvo atsitiktinai atrinkti iš kiekvieno ekspansinų pošeimos (8 pav.). Santykinis kiekvieno geno ekspresijos lygis buvo apskaičiuotas remiantis ekspresija DcEXP24 esant S1, kurie turi žemiausią išraiškos lygį. Su išimtimi DcEXP9, visi ekspansino genai parodė aukščiausią ekspresijos lygį S2. Tarp šių genų ekspresijos lygis DcEXP29 S2 buvo daugiau nei 30 kartų daugiau nei S1. Brandžiame etape ekspansino genų ekspresijos profiliai paprastai buvo sumažinti, kai kurie buvo net mažesni nei pirmojoje stadijoje. Įvairių ekspansino genų palyginimų rezultatai parodė, kad DcEXP20, DcEXP30, DcEXP13, ir DcEXP22 reiškė aukštesnius išraiškos lygius. Palyginti su iTRAQ rezultatais, du skirtingai išreikšti ekspansinai, DcEXP20 ir DcEXP22, parodė nuoseklų ryšį tarp mRNR ekspresijos tendencijų ir baltymų gausos. Koreliacijos koeficientas tarp išraiškos lygio DcEXP20, DcEXP22 ir kiti ekspansino genai buvo analizuojami pagal Pearsono analizę (2 lentelė). Išraiškos profiliai DcEXP20 ir DcEXP22 buvo teigiamai koreliuojami su aštuoniais ir šešiais ekspansino genais.

8 pav. Santykiniai 10 morkų ekspansino genų ekspresijos lygiai. Skirtingos mažosios raidės rodo reikšmingus skirtumus P < 0,05.

2 lentelė. Koreliacijos tarp išraiškos lygių DcEXP20, DcEXP22, ir kiti ekspansino genai.


Kaip galiu nustatyti savo baltymų kiekį?

Galimi kiekybinio LC-MS metodai iš esmės skirstomi į dvi kategorijas: (i) santykinis kiekybinis nustatymas ir (ii) peptidų gausos nustatymas kalibruojant pagal sintetinį stabilų izotopais pažymėtą standartą (1 pav.). Šiuo metu dauguma mokslo bendruomenės taiko ankstesnį požiūrį į tyrimo klausimus. Tačiau pastarasis pradeda vaidinti vis svarbesnį vaidmenį, ypač klinikinėse srityse.

Atradimais pagrįstas santykinis kiekybinis LC-MS nustatymas leido tyrėjams vienu metu nustatyti baltymų gausos pokyčius keliuose mėginiuose. Kaip sako Bernhardas Kusteris: „LC-MS yra ypač stiprus ta prasme, kad gali lygiagrečiai nustatyti daug baltymų ir nieko nežinodamas. a priori kokius baltymus galbūt norėsite analizuoti“. Norint iš tikrųjų suvokti atskiro baltymo funkciją ir baltymų santykį su kitais sudėtingos biologinės sistemos kontekste, reikia išmatuoti baltymų gausos pokyčius, palyginti su pradinės arba standartinės sistemos pokyčiais. Kaip rodo pavadinimas, santykinis kiekybinis nustatymas apima baltymų kiekio palyginimą su tam tikra būkle, t.y., kiek peptido (ir ekstrapoliuojant baltymo) yra B, C, D sąlygomis ir tt lyginant su to paties peptido kiekiu tokioje būklėje, A. Kusteris taip pat pažymi, kad „LC-MS taip pat yra galingas ta prasme, kad galima sukurti kiekybinius tyrimus baltymams, kuriems nėra antikūnų arba kurie yra prastos kokybės“.

Kalbant plačiau, iš esmės yra du būdai santykiniam baltymų kiekiui nustatyti naudojant LC-MS. Jie yra: (i) paženklinti ir (ii) be etikečių. Pirmoji kategorija yra suskirstyta į dvi peptidų / baltymų žymėjimo proteomoje priemones. Būtent dėl ​​metabolinio ženklinimo, kuris iš pradžių buvo pradėtas 1999 m. 3 ir vėliau plačiau pritaikytas mokslininkų bendruomenės SILAC pavidalu.sstalo isotopas labeling su amino rūgštys cell kultūra) 4 . Baltymai taip pat gali būti modifikuoti cheminiu dariniu, ir tokie metodai apėmė isotopas-coded abaigtumas tags (ICAT) 5 , 18 O ženklinimas 6 , dimetilo ženklinimas 7 ir izobarinės masės žymės, t.y., tandem masilas tag (TMT) ir isobariškas tag už relatyvinis ir aabsoliutus quantitacija (iTRAQ) 8,9 .

Naudojant SILAC, biologiniai mėginiai yra paženklinti in vitro su tikslinės aminorūgšties sunkiuoju izotopiniu variantu. Baltymų sintezės metu natūraliai atsirandanti aminorūgštis pakeičiama sunkesnėmis etiketėmis. Ląstelės, veikiamos skirtingomis eksperimentinėmis sąlygomis (kultivuojamos lengvoje, vidutinėje arba sunkioje terpėje), gali būti sumaišytos ir visi apdorojimo etapai atlikti su kombinuotu mėginiu (1 pav., metabolinis ženklinimas). Ši strategija žymiai sumažina bet kokį kintamumą, kuris gali atsirasti ruošiant mėginį, ir turi aiškų pranašumą – tikslesnį kiekybinį nustatymą. Su pvz., TMT reagentai 8 , gali būti pasiektas didelio našumo multipleksinis baltymų kiekis. Sujungus su LC-MS ir proteominių duomenų programine įranga, šiuo metu galima vienu metu analizuoti iki 16 skirtingų mėginių, paimtų iš ląstelių, audinių ar biologinių skysčių, identifikuoti peptidus/baltymus ir apskaičiuoti santykinius peptidų/baltymų kiekius (1 pav. , cheminis ženklinimas).

LC-MS be etikečių kiekybinis nustatymas pastaruoju metu išpopuliarėjo. Šis atnaujintas bendruomenės susidomėjimas pirmiausia atsirado dėl pagerėjusios dabartinių masių spektrometrų masės skiriamosios gebos, pagerėjusio sulaikymo laiko stabilumo naudojant naujas HPLC sistemas ir patobulintus duomenų analizės algoritmus, kurie ne tik suderina kelis chromatografinius pėdsakus, bet ir gali išgauti daugybę savybių iš pėdsakų. . Tuo pačiu metu nuo duomenų nepriklausomas gavimas (DIA) taip pat pasirodė kaip galingas metodas giliam santykiniam baltymų kiekiui be etiketės nustatyti visame proteome. Apskritai, kiekybinis metodas be etikečių yra labai ekonomiška alternatyva tiek SILAC, tiek TMT, o pagrindinis pranašumas yra lyginant baltymų gausos pokyčius keliuose mėginiuose nenaudojant jokių izotopinių etikečių. Mėginiai yra individualiai analizuojami LC-MS, o tai labai naudinga analizuojant grupes, sudarytas iš šimtų ar net tūkstančių pacientų mėginių.Naudojant sudėtingus programinės įrangos algoritmus, dabar daug paprasčiau integruoti signalus, atitinkančius unikalius peptidų jonus per visą LC laiko skalę. Gavus duomenis po LC-MS, galima palyginti atskiras analizes ir suderinti visiems mėginiams būdingas chromatografines savybes (1 pav., be etiketės). Pagrindiniai proteomų kiekybinio nustatymo be etikečių LC-MS pranašumai yra galimybė palyginti neribotą skaičių mėginių ir brangių ženklinimo strategijų pasenimas. Tačiau pagrindinis trūkumas yra tai, kad pailgėja LC-MS gavimo laikas (kadangi kiekvienas mėginys vykdomas iš eilės). Nepaisant to, rinkoje atsiranda naujų sistemų, kurios gali užtikrinti labai greitus ir trumpus LC gradientus, kad sutrumpėtų laikas, reikalingas tūkstančiams klinikinių mėginių analizei.

Stabilių izotopų susintetintų peptidų, kaip vidinių baltymų kiekybinio nustatymo LC-MS standartų, naudojimo koncepciją pirmą kartą sukūrė Desiderio ir Kai 10 (1 pav., smailūs standartai). Tai yra sintetiniai triptiniai peptidai, kurių aminorūgščių seka yra tokia pati kaip ir natūraliai atsirandantys dominantys peptidai. Tačiau susintetintuose peptiduose yra bent viena stabili izotopu pažymėta aminorūgštis, dėl kurios šiek tiek padidėja (6-10 Da) molekulinė masė. „Žinomas“ sintetinio peptido ekvivalento kiekis įdedamas į proteominį skaidymą ir visas mėginys analizuojamas LC-MS. Natūralus peptidas ir spygliuoto peptido standartas masės spektrometre chromatografiškai išsiliuos ir jonizuosis. The m/z Tačiau iš dviejų peptidų galima lengvai atskirti. Iš išskirtų jonų chromatogramų ir abiejų peptidų ploto po kreive apskaičiavimo galima apskaičiuoti natūralaus peptido kiekį, lyginant smailių santykius. Visuotinai priimta rekomendacija yra susintetinti mažiausiai tris triptinius peptidus viename baltyme. Tačiau jei vienam eksperimentui reikalingas kelių baltymų kiekis, kaina greitai išaugs. Be to, nors peptidų standartų padidinimas yra gana paprastas metodas, peptidų gausos kalibravimas, kad būtų atspindėtas baltymų kiekis, išlieka iššūkiu 11 . Šiems sunkumams išspręsti buvo pasiūlyti alternatyvūs kalibravimo metodai, įskaitant: pvz., vieno taško bendro atskaitos fondo naudojimas 12,13 .


3. NEATSITIKTINIAI TRŪKUMAI

Luo ir kt. [17] įveikia ANOVA modelių apribojimus per Bajeso sistemą, į kurią įtrauktas neatsitiktinis iTRAQ duomenų rinkinių trūkumas. Jų modelis daro prielaidą, kad išmatuotą peptidų intensyvumą veikia ir baltymų ekspresijos lygiai, ir specifinis peptido poveikis. Šių dviejų efektų reikšmės keliuose eksperimentuose modeliuojamos kaip atsitiktiniai efektai. Kai mėginys ženklinamas keliomis žymomis viename eksperimente, skirtingų izobarinių žymų variacijos taip pat modeliuojamos kaip atsitiktiniai efektai. Neatsitiktinis peptidų duomenų trūkumas modeliuojamas naudojant logistinę regresiją, kuri susieja peptido nebuvimo tikimybę su baltymo, kuris gamina šį peptidą, ekspresijos lygiu. Šiam modeliui pritaikytas Markovo grandinės Monte Karlo metodas buvo sukurtas norint nustatyti santykinius ekspresijos lygius skirtinguose mėginiuose.

3.1 Modelis

Mes sutelkiame dėmesį į kelių eksperimentų iTRAQ duomenų modelio apibūdinimą ir santykinių baltymų ekspresijos lygių įvertinimą. Kai iTRAQ duomenys gaunami iš kelių eksperimentų, [17] naudojamas Bajeso hierarchinis modelis ta prasme, kad modelis turi stebėjimo komponentą, kuris modeliuoja stebimus peptidų intensyvumus kaip atsitiktinius efektus, kurių sąlyginis pasiskirstymas priklauso nuo numatomų baltymų ekspresijos lygių ir peptidų efektų. , ir antrasis (hierarchinis) komponentas, apibrėžiantis šių laukiamų reikšmių skirstinius.

Luo ir kt. [17], daroma prielaida, kad žymėjimo efektai pašalinami taikant normalizavimo metodus, tokius kaip kvantinis normalizavimas. Tarkime, kad yra S (𢙒) biologiniai mėginiai, tirti K (𢙒) eksperimentai. Kadangi viename eksperimente tą patį pavyzdį gali pažymėti kelios izobarinės žymės, leiskite Ls ≥ 1 žymi žymų skaičių s-tas pavyzdys. Tada ∑s Ls = M yra izobarinių žymenų, naudojamų viename eksperimente, skaičius, kuris yra 4, kai naudojame 4 plex izobarinius reagentus, ir 8 8 plex versijoje. Tarkime, kad yra baltymų mėginyje ir Ji peptidai, skirti ith baltymas. Už letiketė spavyzdyje keksperimentas, tegul ykijsln žymi išmatuoto stebimo intensyvumo log transformuotą vertę jpeptidas ith baltymų iš nspektras. Prisimink tai j reikėtų tiksliau pažymėti kaip j(i) aiškiai nurodyti, kad peptidai yra įterpti į baltymus, ir l turėtų būti žymimas kaip l(s) nurodyti lpažymėta žyma sasis pavyzdys. Siekdami supaprastinti žymėjimą, skliaustus praleidžiame. Išmatuotas peptido intensyvumas priklauso nuo baltymo ekspresijos lygio ir peptido poveikio. Leisti xkisl žymi log transformuotos išraiškos lygį ith baltymas spavyzdys su lženklinimo žyma keksperimentas. Leisti zkij žymi log transformuoto peptido efektą jpeptidas ith baltymų keksperimentas. Luo ir kt. [17] laikomas priedu modeliu ykijsln (k = 1, …, K i = 1, …, j = 1, …, Ji s = 1, …, S l = 1, …, Ls n = 1, …, Nkijsl):

kuris atitinka dauginamąjį modelį pradinėje skalėje. (3), εkijsln daroma prielaida, kad yra nepriklausomai normaliai pasiskirstęs su vidurkiu 0 ir dispersija σ ε 2 : ε k i j s l n

3.1.1 Trūksta duomenų mechanizmas

Statistinis peptidų trūkumo modelis [17] buvo pagrįstas duomenų rinkiniu, gautu tiriant Caveolae vaidmenį širdies ir kraujagyslių funkcijoms postnatalinei širdies ir kraujagyslių funkcijai. Šiame tyrime buvo atlikti trys eksperimentai, kurių metu iTRAQ analizavo dviejų laukinio tipo pelių ir dviejų išmuštų Cav-1 pelių baltymų profilius su keturiomis izobarinėmis žymėmis kiekviename eksperimente. Luo ir kt. [17] ištyrė peptidų, pastebėtų viename eksperimente, bet trūkstamų kitame eksperimente, dalį ir nustatė, kad yra neigiama koreliacija tarp trūkstamos tikimybės ir peptido intensyvumo. Kitaip tariant, labiau tikėtina, kad trūksta mažiau gausių peptidų, nes juos sunkiau aptikti, nes analizės procesas priklauso nuo duomenų. Stebėdami, kad tarp peptido trūkumo tikimybės ir stebimo intensyvumo logit skalėje buvo apytikslis tiesinis ryšys, Luo ir kt. [17] sumodeliavo trūkstamą tikimybę naudodamas paprastą logistinės regresijos modelį:

kur kijsln = 1 reiškia, kad jpeptidas ith baltymas matuojamas keksperimentas, lkopiją spavyzdį ir nspektras. (4) formulė reiškia, kad peptido trūkumo tikimybės logitas tiesiškai priklauso nuo jo intensyvumo. Tikimasi, kad b > 0, nes labiau tikėtina, kad trūksta mažesnio intensyvumo peptidų.

3.1.2 Ankstesni

Bajeso hierarchinėje sistemoje [17] atsižvelgiama į eksperimentų ir pavyzdžių skirtumus ir daroma prielaida, kad xkisl ir zkij yra nepriklausomai normaliai pasiskirstę įvairiuose eksperimentuose, ty:

kur xsala ir zij reiškia baltymų ir peptidų poveikį, atitinkamai suvidurkintą per kelis eksperimentus. Taip pat manoma, kad baltymų ekspresijos lygiai skirtinguose to paties mėginio pakartojimuose (pažymėtuose skirtingomis žymėmis) yra normaliai pasiskirstę:

kur xyra reiškia išraiškos lygį ith baltymų sasis pavyzdys. Prielaidos (5)–(7) lemia lygiavertę (3) formą:

N ( 0 , σ x 2 ) ir e k i j z

N ( 0 , σ z 2 ) žymi atsitiktinius eksperimentų efektus, o e i s l t

N ( 0 , σ δ 2 ) reiškia kelių to paties mėginio pakartojimų kitimą. Kai mėginys eksperimento metu pažymėtas unikalia izobarine žyma, pavyzdyje nėra pasikartojančio varianto komponento. Formulė (8) yra mišraus poveikio modelis. Siekiant užtikrinti modelio identifikuojamumą, apribojimas xi1 = 0 pridedama. Tada xyra reiškia išraiškos lygį ith baltymų simtį, palyginti su pirmuoju mėginiu.

Antrasis priorų lygis yra normalūs skirstiniai xyra ir zij:

Hierarchinis modelis užbaigiamas darant prielaidą, kad atvirkštiniai gama skirstiniai yra pirmieji dispersijos hiperparametrams: σ x − 2

Gama ( γ 7 , γ 8 ), kur γ1 ir γ2 reiškia atitinkamai gama skirstinio formą ir mastelio parametrus ir darant prielaidą a

N(0, ν 2). Atitinkamų parametrų užpakalinis pasiskirstymas yra imituojamas MCMC modeliavimu, o skirtingai išreikšti baltymai identifikuojami analizuojant užpakalinį pasiskirstymą. xyra.

3.2 Palyginimas su ANOVA analize

Svarbiausias skirtumas tarp šio Bayeso modelio [17] ir ANOVA modelio, kurį pasiūlė Hill ir kt. [7] ir Oberg ir kt. [19] yra tai, kad [17] aiškiai sumodeliavo nepastebimą iTRAQ duomenų trūkumą. Oberg ir kt. [19] savo darbo pabaigoje pažymėjo, kad cenzūros mechanizmo naudojimas modeliui pritaikyti būtų natūralus kitas žingsnis. Užuot cenzūravęs duomenis nežinoma ribine verte, [17] modeliavo didesnę peptidų trūkumo tikimybę esant mažesniam peptidų intensyvumui. Šie du metodai taip pat skiriasi pagal modelio variantus. Eksperimentinis efektas ir replikacinis efektas (kai mėginį žymi kelios žymės) laikomi visų baltymų konstantomis ANOVA modelyje. Priešingai, [17] modeliavo juos kaip atsitiktinius efektus, būdingus peptidams ir (arba) baltymams. Be to, ANOVA analizė apima papildomus efektus, tokius kaip ženklinimo efektas ir ženklinimo bei eksperimentinio poveikio sąveika gj(i),s, kurie nėra modeliuojami [17]. Ženklinimo efekto įtraukimas nustatomas pagal eksperimento planą. Kai identiškos žymos naudojamos tiems patiems mėginiams ženklinti keliuose eksperimentuose, ženklinimo efekto negalima nustatyti, nes jis painiojamas su mėginių ėmimo efektu. Ženklinimo efektą prasminga įtraukti tik tada, kai keliuose eksperimentuose tiems patiems pavyzdžiams žymėti naudojamos skirtingos žymos. Dėl ženklinimo ir eksperimentinio efekto sąveikos gj(i),s, nors teoriškai tikslinga jį įtraukti į modelį, yra didelis neapibrėžtumas vertinant gj(i),s dėl nedidelio kiekvieno mėginio pakartojimų skaičiaus (arba nebuvimo).

Bendra prielaida tiek taikant Bayeso metodą, tiek atliekant ANOVA analizę yra ta, kad visi peptidais pagrįsti stebėjimai tiksliai atspindi nepažeistus baltymus. Mes neatsižvelgiame į galimybę, kad homologiniai genai gali sudaryti du ar daugiau baltymų, turinčių identiškus ir neidentiškus peptidus, taip pat potranskripcijos modifikacijų galimybę. Nors (1) apima peptidų poveikio ir gydymo sąveiką (gj(i),s), jis pašalintas analizuojant [19]. Šis terminas neįtrauktas ir į [17]. Taigi ir [17], ir [19] daroma prielaida, kad tam tikri baltymai skirtingai apdorojant mėginius turės skirtingą ekspresiją, tačiau bet koks baltymų ekspresijos pokytis vienodai paveiks visus to baltymo peptidus.

3.3 Neatsitiktinis masės spektrometrijos duomenų trūkumas

Šiame poskyryje aprašytas modelis (pasiūlytas Wang ir kt. [31]), skirtas masių spektrometrijos duomenims, nėra pritaikytas iTRAQ duomenims. Tačiau kadangi iTRAQ duomenys gaunami paleidžiant išskirtus peptidus per MS/MS, šis tikimybės modelis yra alternatyvus būdas tirti iTRAQ trūkumą. Wang ir kt. [31] pasiūlė pirmiausia pašalinti sisteminio MS profilių svyravimų šaltinius visuotiniu normalizavimu, o tada ištirti nuo intensyvumo priklausomą trūkumą ir priskirti praleistus peptidų intensyvumus.

3.3.1 Visuotinis normalizavimas

Atliekant visuotinį normalizavimą, [31] buvo daroma prielaida, kad imties intensyvumas yra susijęs su pastoviu koeficientu, kurį reikia pasirinkti. Siekiant išvengti galimo šališkumo, atsirandančio dėl neatsitiktinių masės spektrometrijos duomenų trūkumo, Wang ir kt. pasiūlė naudoti viršutinę dalį L užsakyta statistika (pvz., mediana) apie peptidų intensyvumą kiekviename mėginyje, kad būtų galima pakeisti skalę, kur L yra vartotojo nurodytas parametras. Leisti K (K > 2) yra MS profilių skaičius. Pažymėkite stebimus intensyvumus k-tas profilis kaip Y ( k ) = ( y 1 ( k ) , y 2 ( k ) , … , y n k ( k ) ), kur nk yra identifikuotų peptidų skaičius k-tas profilis. Už nurodytą skaičių L ( L < min ( < n k >k = 1 K ) ), populiacijos mediana apibrėžiama kaip

ir mastelio koeficientas normalizuojant k- profilis yra

3.3.2 Neatsitiktinis trūkumas ir priskyrimas

Norėdami atsižvelgti į neatsitiktinį trūkumą, Wang ir kt. [31] pasiūlė priskirti praleistą peptido intensyvumą viename mėginyje stebimo intensyvumo santykiu kitame mėginyje, padalijus iš skalės koeficiento, apskaičiuoto pagal kitų peptidų intensyvumą, pastebėtą abiejuose mėginiuose. Tarkime, kad minimalus aptinkamas instrumento lygis yra d. Tegul x j ( k ) yra tikroji gausa j-asis peptidas k-tasis profilis, atitinkantis stebimą reikšmę y j ( k ). Peptidas profilyje gali egzistuoti arba nebūti. Tegul z j ( k ) yra latentinis kintamasis, rodantis, kad yra j-asis peptidas k-tasis profilis, kai z j ( k ) = 1, jei j-tas peptidas egzistuoja k-tas profilis, o z j ( k ) = 0 kitu atveju. Tada x j ( k ) = 0 , jei z j ( k ) = 0 . Tegu f j ( k ) yra x i ( k ) tankio funkcija , kai z i ( k ) = 1 , turime

I 0 ( · ) P ( z j ( k ) = 0 ) + f j ( k ) ( · ) P ( z j ( k ) = 1 ),

kur 0(·) nurodo taškinę masę ties nuliu. Su (12), Wang ir kt. [31] padarė prielaidą, kad tikroji peptido gausa turi mišinio pasiskirstymą. Su tikimybe P ( z j ( k ) = 0 ) peptidas neegzistuoja k-th profilis, o gausa lygi nuliui. Su tikimybe P ( z j ( k ) = 1 ), peptidas egzistuoja, o gausos pasiskirstymas apibūdinamas f j ( k ).

Praleista intensyvumo lygio reikšmė j-asis peptidas, esantis k-tasis profilis yra priskiriamas numatomai reikšmei E ( x j ( k ) | y j ( k ) = 0 ) , kuri apskaičiuojama kaip

kur pirmoji lygybė yra dėl to, kad E(xj(k)|yj(k) = 0, z j(k) = 0) = 0, o antroji lygybė yra dėl to, kad kai j-tas peptidas egzistuoja k-tas profilis ( z j ( k ) = 1 ) , joks signalo aptikimas ( y j ( k ) = 0 ) yra lygiavertis mažam intensyvumui ( x j ( k ) < d ) . Terminas E ( x j ( k ) | x j ( k ) < d , z j ( k ) = 1 ) (13) gali būti nustatytas, kai f j ( k ) ir d yra nurodyti, o P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ), tikimybė, kad j-tas peptidas egzistuoja k-tas profilis, kai neaptinkamas signalas, gali būti skaičiuojamas kaip

kur galioja trečioji lygybė, nes P d ( yj ( k ) = 0 | zj ( k ) = 1 ) = P d ( xj ( k ) < d | zj ( k ) = 1 ) ir P d ( yj ( k ) ) = 0 | zj ( k ) = 0 ) = 1 . Terminą P d ( x j ( k ) < d | z j ( k ) = 1 ) (14) galima gauti iš tankio funkcijos f j ( k ), kai nurodyta pastaroji, ir

Taigi kai sąlyginis tankis f j ( k ) ir d yra nurodyti, praleistas peptido intensyvumas gali būti priskirtas (13)–(15).

Mažiausias prietaiso aptinkamo lygio parametras d yra įvertintas pagal fono triukšmo lygį visuose MS neapdorotuose profiliuose iš to paties prietaiso, pažymėto kaip d ̂ . Tada aptinkamas lygis k-tas profilis d ̃ (k) = d ̂ /λ (k), kur λ (k) yra normalizavimo skalės koeficientas (11). Wang ir kt. [31] Tarkime, kad

savarankiškai už k = 1, 2, …, K. Tai atitinka prielaidą, kad x j(k) tankio funkcija, kai z j(k) = 1, f j(k), yra N(λ (k) μj, (λ (k) σj) 2). Ypatingu atveju, jei σj ≪ | d ̃ (k) − μj| ir biologinės replikacijos yra prieinamos, Wang ir kt. [31] pateikė trūkstamos tikimybės P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ) ir sąlyginės vertės E ( X j ( k ) | y j ( k ) = 0 ) įverčius, kaip nurodyta toliau:

Priskirti duomenys naudojami tolesnei analizei, pavyzdžiui, įvertinimui, baltymų grupavimui ir diferenciniam baltymų identifikavimui.

Wang ir kt. pasiūlytas modelis. [31] skiriasi nuo Bayeso modelio, kurį pasiūlė Luo ir kt. [17] šiais trimis būdais. Pirma, [31], intensyvumas, mažesnis nei tam tikras lygis, yra cenzūruojamas, o cenzūravimo parametras įvertinamas pagal foninio triukšmo lygius [17], sukurtas logistinės regresijos modelis, susiejantis trūkstamą tikimybę su galimu tikruoju intensyvumu. Pastebėjus, kad labiau tikėtina, kad trūksta mažiau peptidų, modeliu pagrįstas trūkumo mechanizmas [17], kuris susieja trūkumo tikimybę su peptido intensyvumu, yra pagrįstesnis nei cenzūros mechanizmas [31]. Antra, [31] atlieka vienos vertės imputaciją ir priskiria praleistus intensyvumus laukiamomis reikšmėmis, o [17] atlieka daugybinį priskyrimą ir imituoja praleistų reikšmių paskirstymą. Trečia, [31] nėra pritaikytas iTRAQ analizei, todėl variacijų šaltiniai turėtų būti pašalinti, kai [31] idėją pritaikėte iTRAQ duomenims. [31] pranašumas yra mažesnė skaičiavimo našta. Kai nurodomas tankis f j ( k ), praleistą peptido intensyvumą galima lengvai priskirti laukiama verte, gauta iš (13) formulės.


2. Proteomika

Prieš apibendrindami skirtingas proteomines strategijas (figūra 1), reikėtų pabrėžti keletą punktų 4 :

Jokia proteominė technologija šiuo metu negali išspręsti viso žinduolių proteomo sudėtingumo.

Naudojant bet kokią proteominę techniką, yra linkstama į gausesnius baltymus.

Apskritai, yra kompromisas tarp to, kiek baltymų galima identifikuoti ir kaip tiksliai juos galima kiekybiškai įvertinti.

Neišvengiamai informacija prarandama dėl kiekybinės peptidų informacijos plitimo į baltymų pokyčius.

Proteomikos metodų palyginimas

Santrumpa . Pilnas vardas ir paaiškinimas. Privalumai . Trūkumai .
DIGE Skirtumų gelio elektroforezė Kiekybinis nustatymas baltymų lygiu Mažas jautrumas
Posttransliacinių modifikacijų ir baltymų izoformų vizualizacija MS / MS linkę identifikuoti tik skirtingai išreikštus baltymus
Geras kiekybinis tikslumas Baltymai, kurių pI arba Mw labai aukštas arba mažas, ant gelio neišsiskiria
Gelis-LC-MS/MS Atskyrimas SDS-PAGE prieš LC-MS/MS analizę Naudojimo paprastumas Išankstinis frakcionavimas padidina MS/MS analizės laiko poreikį
Išankstinis frakcionavimas prieš LC-MS/MS analizę padidina jautrumą Prastas kiekybinis tikslumas sudėtinguose mišiniuose be peptidų ženklinimo
„kopėčios“ kaip proteolitinio skilimo požymis Labai didelio arba mažo Mw baltymai ant gelio neišsiskiria
SILAKAS Stabilus izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje Minimali eksperimentinė variacija Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Puikus kiekybinis tikslumas Netinka ląstelėms, kurios nesidaugina kultūroje, t. y. kardiomiocitams
Lengva naudoti ląsteles kultūroje, kurios dauginasi ir toleruoja filtruoto serumo papildus Metabolinis gyvūnų ženklinimas yra brangus
iTRAQ, TMT žymos Peptidų izotopinis žymėjimas Geras kiekybinis tikslumas Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Galima naudoti su audiniais ir ląstelių kultūromis Mišriuose MS/MS spektruose bus reporterio jonai iš skirtingų peptidų
Santrumpa . Pilnas vardas ir paaiškinimas. Privalumai . Trūkumai .
DIGE Skirtumų gelio elektroforezė Kiekybinis nustatymas baltymų lygiu Mažas jautrumas
Posttransliacinių modifikacijų ir baltymų izoformų vizualizacija MS / MS paprastai atpažįstami tik skirtingai išreikšti baltymai
Geras kiekybinis tikslumas Baltymai, kurių pI arba Mw labai aukštas arba mažas, ant gelio neišsiskiria
Gelis-LC-MS/MS Atskyrimas SDS-PAGE prieš LC-MS/MS analizę Naudojimo paprastumas Išankstinis frakcionavimas padidina MS/MS analizės laiko poreikį
Išankstinis frakcionavimas prieš LC-MS/MS analizę padidina jautrumą Prastas kiekybinis tikslumas sudėtinguose mišiniuose be peptidų ženklinimo
„kopėčios“ kaip proteolitinio skilimo požymis Labai didelio arba mažo Mw baltymai ant gelio neišsiskiria
SILAKAS Stabilus izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje Minimali eksperimentinė variacija Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Puikus kiekybinis tikslumas Netinka ląstelėms, kurios nesidaugina kultūroje, t. y. kardiomiocitams
Lengva naudoti ląsteles kultūrose, kurios dauginasi ir toleruoja filtruoto serumo papildus Metabolinis gyvūnų ženklinimas yra brangus
iTRAQ, TMT žymos Peptidų izotopinis žymėjimas Geras kiekybinis tikslumas Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Galima naudoti su audiniais ir ląstelių kultūromis Mišriuose MS/MS spektruose bus reporterių jonai iš skirtingų peptidų

Proteomikos metodų palyginimas

Santrumpa . Pilnas vardas ir paaiškinimas. Privalumai . Trūkumai .
DIGE Skirtumų gelio elektroforezė Kiekybinis nustatymas baltymų lygiu Mažas jautrumas
Posttransliacinių modifikacijų ir baltymų izoformų vizualizacija MS / MS paprastai atpažįstami tik skirtingai išreikšti baltymai
Geras kiekybinis tikslumas Baltymai, kurių pI arba Mw labai aukštas arba mažas, ant gelio neišsiskiria
Gelis-LC-MS/MS Atskyrimas SDS-PAGE prieš LC-MS/MS analizę Naudojimo paprastumas Išankstinis frakcionavimas padidina MS/MS analizės laiko poreikį
Išankstinis frakcionavimas prieš LC-MS/MS analizę padidina jautrumą Prastas kiekybinis tikslumas sudėtinguose mišiniuose be peptidų ženklinimo
„kopėčios“ kaip proteolitinio skilimo požymis Labai didelio arba mažo Mw baltymai ant gelio neišsiskiria
SILAKAS Stabilus izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje Minimali eksperimentinė variacija Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Puikus kiekybinis tikslumas Netinka ląstelėms, kurios nesidaugina kultūroje, t. y. kardiomiocitams
Lengva naudoti ląsteles kultūrose, kurios dauginasi ir toleruoja filtruoto serumo papildus Metabolinis gyvūnų ženklinimas yra brangus
iTRAQ, TMT žymos Peptidų izotopinis žymėjimas Geras kiekybinis tikslumas Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Galima naudoti su audiniais ir ląstelių kultūromis Mišriuose MS/MS spektruose bus reporterių jonai iš skirtingų peptidų
Santrumpa . Pilnas vardas ir paaiškinimas. Privalumai . Trūkumai .
DIGE Skirtumų gelio elektroforezė Kiekybinis nustatymas baltymų lygiu Mažas jautrumas
Posttransliacinių modifikacijų ir baltymų izoformų vizualizacija MS / MS linkę identifikuoti tik skirtingai išreikštus baltymus
Geras kiekybinis tikslumas Baltymai, kurių pI arba Mw labai aukštas arba mažas, ant gelio neišsiskiria
Gelis-LC-MS/MS Atskyrimas SDS-PAGE prieš LC-MS/MS analizę Naudojimo paprastumas Išankstinis frakcionavimas padidina MS/MS analizės laiko poreikį
Išankstinis frakcionavimas prieš LC-MS/MS analizę padidina jautrumą Prastas kiekybinis tikslumas sudėtinguose mišiniuose be peptidų ženklinimo
„kopėčios“ kaip proteolitinio skilimo požymis Labai didelio arba mažo Mw baltymai ant gelio neišsiskiria
SILAKAS Stabilus izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje Minimali eksperimentinė variacija Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Puikus kiekybinis tikslumas Netinka ląstelėms, kurios nesidaugina kultūroje, t. y. kardiomiocitams
Lengva naudoti ląsteles kultūroje, kurios dauginasi ir toleruoja filtruoto serumo papildus Metabolinis gyvūnų ženklinimas yra brangus
iTRAQ, TMT žymos Peptidų izotopinis žymėjimas Geras kiekybinis tikslumas Kiekybinis nustatymas peptidų lygiu
Galima naudoti su audiniais ir ląstelių kultūromis Mišriuose MS/MS spektruose bus reporterio jonai iš skirtingų peptidų

Proteominiai metodai. Baltymų ekstraktai gali būti frakcionuojami baltymų lygiu prieš virškinimą arba po baltymų virškinimo peptidų lygiu. DIGE baltymų ekstraktai yra paženklinti skirtingais fluorescenciniais dažais prieš juos atskiriant 2-DE. SILAC ląstelės yra metaboliškai ženklinamos kultūroje, įtraukiant sunkiųjų arba lengvųjų aminorūgščių. Arba ženklinimas atliekamas peptidų lygiu, naudojant iTRAQ arba TMT izobarines žymes. Tada peptidai analizuojami MS/MS. 2-DE, dvimatė gelio elektroforezė DIGE, diferencinė gelio elektroforezė 1-DE, vienmatė gelio elektroforezė SILAC, stabilus izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje AA, aminorūgštis iTRAQ, izobarinė žyma santykiniam ir absoliučiam kiekiui TMT, tandemas masinė žyma.

Proteominiai metodai. Baltymų ekstraktai gali būti frakcionuojami baltymų lygiu prieš virškinimą arba po baltymų virškinimo peptidų lygiu. DIGE baltymų ekstraktai yra paženklinti skirtingais fluorescenciniais dažais prieš juos atskiriant 2-DE. SILAC ląstelės yra metaboliškai ženklinamos kultūroje, įtraukiant sunkiųjų arba lengvųjų aminorūgščių. Arba ženklinimas atliekamas peptidų lygiu, naudojant iTRAQ arba TMT izobarines žymes. Tada peptidai analizuojami MS/MS. 2-DE, dvimatė gelio elektroforezė DIGE, diferencinė gelio elektroforezė 1-DE, vienmatė gelio elektroforezė SILAC, stabilus izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje AA, aminorūgštis iTRAQ, izobarinė žyma santykiniam ir absoliučiam kiekiui TMT, tandemas masinė žyma.

2.1 Dvimatė gelio elektroforezė

Dvimatė gelio elektroforezė (2-DE) leidžia atskirti baltymus pagal jų izoelektrinį tašką (pI) ir molekulinę masę (Mw). 5 Pirmoji dimensija apima baltymų atskyrimą pagal jų pI. Baltymų mišinys dedamas ant juostelės su imobilizuotu pH gradientu. Kai veikia elektrinis laukas, baltymai migruoja į savo pI, kur jie tampa cviterioniniais, ty praranda grynąjį krūvį ir nustoja migruoti (izoelektrinis fokusavimas). Pasibaigus izoelektriniam fokusavimui, imobilizuotos pH gradiento juostelės perkeliamos į didelio formato gelius, kad būtų galima atskirti antrajame matmenyje, kur baltymai pagal jų molekulinę masę išskiriami SDS-PAGE.

Skirtingai nuo SDS-PAGE, 2-DE geliai sukuria sudėtingus proteomų žemėlapius, kurie vizualizuojami kaip atskiros baltymų „dėmės“. Kadangi pI ir Mw yra nepriklausomos savybės, 2-DE geliai gali išskirti daug daugiau baltymų nei SDS-PAGE. Svarbu tai, kad tas pats baltymas gali būti keliose gelio vietose. PI arba Mw poslinkiai rodo, kad yra potransliacinių modifikacijų, baltymų skaidymas arba baltymų izoformos. 6, 7 Baltymų savybės vizualizuojamos naudojant Coomassie arba sidabro dažymą, o diferencinė išraiška tarp mėginių nustatoma naudojant santykinį densitometrinį kiekybinį nustatymą. Tačiau gelio ir gelio kintamumas gali apriboti kiekybinį tikslumą ir neleisti aptikti nedidelių išraiškos skirtumų.

Sudėtingesnė 2-DE technika yra skirtumo gelio elektroforezė (DIGE, 2A pav). 8 DIGE apima fluorescencinį baltymų mišinių ženklinimą Cy-dažais, siekiant nustatyti santykinius baltymų ekspresijos skirtumus. Įtrauktas vidinis standartas, kurį sudaro jungtiniai eksperimentiniai mėginiai, kuris yra tipiškas visiems mėginiams. DIGE aptikimo jautrumas yra panašus į sidabro dažymo jautrumą 9, o dažai atitinka pI ir Mw. Pagrindinis DIGE pranašumas, palyginti su įprastiniais 2-DE geliais, yra tas, kad mėginius galima multipleksuoti ant to paties gelio, taip sumažinant reikalingų gelių skaičių ir apribojant eksperimentinius skirtumus. DIGE, naudojamas su vidiniu standartu, patikimai kiekybiškai įvertina net 10% baltymų ekspresijos skirtumus. 10 Geliai nuskaitomi naudojant fluorescencinį skaitytuvą, kuris konkrečiai matuoja kiekvieno Cy dažo spinduliuotės bangos ilgį. Komercinės programinės įrangos paketai atitinka baltymų savybes ir apskaičiuoja skirtingą išraišką pagal nuskaitytus gelio vaizdus. Baltymų lygis gelyje normalizuojamas lyginant baltymų santykius su vidiniu standartu, kuris kartu aptinkamas kiekviename gelyje.

Gelio pagrindu pagaminta proteomika. Pelės širdies proteomo atskyrimas DIGE naudojant skirtingus imobilizuotus pH gradientus: pH 3–10 NL (A) ir pH 4–7 (B). Baltas langelis pabrėžia geresnę tos pačios srities skiriamąją gebą siaurame pH gradiente. (C) Šešių ekstraląstelinių glikoproteinų Mw pasiskirstymas pagal SDS-PAGE. Būdingas pilvo aortos aneurizmų (AAA) „kopėčios“, palyginti su normaliu aortos audiniu (CON), rodo proteolizę. Spektrinių skaičių skirtumai žymimi spalvomis (aukšta raudona, žema mėlyna). (D) Sveikų aortos audinių inkubavimas su matricos metaloproteinazėmis-12 (MMP-12) sukėlė panašų fibronektino fragmentacijos modelį, kaip ir AAA. Palyginimui, skaidymas matricos metaloproteinazėmis-9 (MMP-9) buvo ne toks ryškus (atkurtas gavus Didangelos leidimą ir kt. 15 ).

Gelio pagrindu pagaminta proteomika. Pelės širdies proteomo atskyrimas DIGE naudojant skirtingus imobilizuotus pH gradientus: pH 3–10 NL (A) ir pH 4–7 (B). Baltas langelis pabrėžia geresnę tos pačios srities skiriamąją gebą siaurame pH gradiente. (C) Šešių ekstraląstelinių glikoproteinų Mw pasiskirstymas pagal SDS-PAGE. Būdingas pilvo aortos aneurizmų (AAA) „kopėčios“, palyginti su normaliu aortos audiniu (CON), rodo proteolizę. Spektrinių skaičių skirtumai yra koduojami spalvomis (didelis raudonas, mažas mėlynas). (D) Sveikų aortos audinių inkubavimas su matricos metaloproteinazėmis-12 (MMP-12) sukėlė panašų fibronektino fragmentacijos modelį, kaip ir AAA. Palyginimui, skaidymas matricos metaloproteinazėmis-9 (MMP-9) buvo ne toks ryškus (atkurtas gavus Didangelos leidimą ir kt. 15 ).

Skirtingai nuo kitų proteominių metodų, 2-DE kiekybinis nustatymas atliekamas baltymų, o ne peptidų lygiu, o kiekybinis nustatymas yra atsietas nuo identifikavimo masės spektrometrijos (MS). Sidabrinis dažymas gali būti naudojamas norint vizualizuoti baltymų ypatybes ant gelio, kad būtų lengviau pašalinti atitinkamas MS dėmes. Arba dėmės yra parenkamos tiesiogiai iš fluorescencinių gelių, naudojant robotą dėmių rinkiklį. Tada prieš identifikuojant baltymus, dėmės yra virškinamos gelyje.

Vienas iš pagrindinių 2-DE metodo įspėjimų yra tas, kad dideli baltymai užmaskuoja mažiau gausius baltymus. Tai iš dalies galima išspręsti naudojant gradientus su siauru pH diapazonu (2B pav). Tačiau atskyrimas pirmojoje dimensijoje, ypač perėjimas iš pirmojo į antrąjį, nėra be nuostolių, o labai didelius, mažus ir hidrofobinius baltymus vis dar sunku išspręsti.

2.2 Skysčių chromatografijos tandeminė masės spektrometrija

Skysčių chromatografijos tandeminė masės spektrometrija (LC-MS/MS) yra dabartinis aukso standartas proteomikoje. Pagrindinis MS principas apima masės ir įkrovos santykio matavimą (m/z) jonizuoto peptido ir jo suskaidymo produktų. Iš pradžių baltymai virškinami fermentais, tokiais kaip tripsinas, kad susidarytų peptidų fragmentai, kuriuos lengviau atskirti atvirkštinės fazės LC ir jonizuoti naudojant elektropurškimo MS. 11 Priklausomai nuo jų hidrofobiškumo, peptidai iš atvirkštinės fazės kolonėlės išsiskiria skirtingais laiko momentais (laikymo laikas). Įprasta darbo eiga naudojant LC-MS/MS apima reguliarų tyrimo nuskaitymą, kad būtų fiksuojamos eliuuojančių peptidų masės ir intensyvumas. Gausiausi iš kolonėlės eliuuojantys pirmtakų jonai atrenkami suskaidymui (MS/MS). Informacija apie aminorūgščių seką, gauta iš MS/MS duomenų, leidžia identifikuoti baltymą. Peptidų parametrai, tokie kaip spektrinis skaičius, jonų intensyvumas ir chromatografinės smailės plotas, gali pateikti kiekybinį baltymų gausos indeksą (kiekybinis nustatymas be etikečių). 12 Masės spektrometrijos technologijos universalumas sukūrė daugybę skirtingų masės spektrometrų, o MALDI-TOF-TOF, Q-TOF ir Orbitrap masės analizatoriai 13 yra vieni iš įprastų, šiuo metu naudojamų atradimų proteomikai.

2.3 Gelio-LC-MS/MS analizė

Išankstinis frakcionavimas SDS-PAGE metodu prieš MS pasirodė esąs naudingas charakterizuojant mėginius, kurių negalima atskirti 2-DE. Tai taip pat padeda įveikti vienintelę didžiausią nukrypimo nuo mažai gausių baltymų priežastį – stochastinį mažo peptidų kiekio mėginių ėmimą, kuris atsiranda dėl to, kad masės spektrometro darbo cikle dominuoja daug peptidų. Gelio-LC-MS/MS analizei baltymai atskiriami naudojant SDS-PAGE, visa gelio juosta padalinama į juostų serijas, juostos išpjaunamos nepaliekant tuščių gelio gabalėlių, suardomos tripsinu ir LC-MS/ MS analizė atliekama kiekvienoje iš juostų. 14, 15 Kadangi gelio juostos dažniausiai yra baltymų mišiniai, LC atskyrimas yra būtinas baltymų identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui, ty spektriniu skaičiavimu. 16 Spektrinis skaičiavimas tapo populiari strategija santykiniam baltymų gausumui nustatyti, tačiau sudėtingiems mišiniams jis yra mažiau patikimas. Paprastai kuo gausesnis baltymas, tuo didesnė tikimybė, kad jį aptiks MS/MS. Spektriniai skaičiai gaunami iš MS/MS spektrų, atitinkančių konkretų baltymą, skaičiaus.

Taikant gelio-LC-MS/MS metodą, išsaugoma informacija apie natūralią baltymo Mw. Jei baltymai suskaidomi prieš skaidymą triptiniu būdu, MS aptinka peptidus gelio segmentuose, mažesniuose už numatomą natūralių baltymų Mw (2C pav). Taigi būtina patikrinti, ar skirtingai išreikšti baltymai apsiriboja tomis pačiomis gelio juostomis. Priešingu atveju suskaidytas baltymas gali atrodyti sureguliuotas dėl jam būdingo „kopėčių“ SDS-PAGE (2D pav). Arba baltymų fragmentai gali būti per maži ir išvengti aptikimo, nes jie migravo prieš buferinį frontą. Kita vertus, informacija apie proteolitinius skilimo produktus yra svarbi ir prarasta atliekant įprastą šautuvo proteomiką, analizuojant triptinius peptidus be išankstinio atskyrimo baltymų lygiu.

2.4 Šautuvų proteomika

Be gelio metodų, yra ir be gelio metodų, leidžiančių kiekybiškai įvertinti baltymų ekspresijos skirtumus, pagrįstus peptidų gausa. Nors šie šaudymo proteominiai metodai gali įsiskverbti giliau į proteomą, kyla problemų dėl kiekybinio nustatymo, jei mėginiai yra per sudėtingi. MS nėra savaime kiekybinė dėl jonizacijos efektyvumo skirtumų. Gausiausi jonai pritrauks daugiausiai krūvių elektropurškimo jonizacijos metu, todėl mažesnė tikimybė, kad žemo lygio peptidai jonizuojasi. Kad būtų išvengta klaidingai teigiamų baltymų pokyčių dėl kartu išsiskiriančių daug peptidų, patikimam kiekybiniam nustatymui turėtų būti naudojami ženklinimo metodai. Populiarūs ženklinimo metodai apima izobarinį žymėjimą santykiniam ir absoliučiam kiekybiniam nustatymui (iTRAQ), tandeminės masės žymes (TMT) ir stabilų izotopų žymėjimą aminorūgštimis ląstelių kultūroje (SILAC). 17 iTRAQ šiuo metu galima įsigyti kaip keturių ir aštuonių jungčių, leidžiančių santykinį kiekybinį įvertinimą iki aštuonių mėginių, o TMT ir SILAC ženklinimas gali būti naudojamas atitinkamai su šešiais ir trimis mėginiais. 18 Tačiau peptidai yra tik pakaitinė priemonė ir ne visada patikimi baltymų kiekybiniam nustatymui, ty jei jie yra modifikuojami po transliacijos arba proteolizė.

2.4.1 Stabilus izotopų žymėjimas aminorūgštimis ląstelių kultūroje

SILAC naudoja neradioaktyviąsias izotopines etiketes, kad ženklintų baltymus šviesiais (pvz., 12 C) ir sunkiais izotopais (pvz., 13 C). 18 mėginių gali būti multipleksuojami ir analizuojami to paties MS paleidimo metu, taip sumažinant eksperimentinę klaidą. 19 SILAC poros kartu eliuuoja chromatografijos metu, tačiau atitinkami sunkiosios ir lengvosios izoformos peptidai atsiranda su būdingu masės poslinkiu. Santykinį kiekvieno baltymo kiekį galima apskaičiuoti pagal SILAC žymėtų peptidų smailių intensyvumo skirtumus. SILAC naudojimas skirtingam baltymų lygiui nustatyti neapsiriboja ląstelių naudojimu kultūroje. SILAC pažymėtos pelės buvo aprašytos beveik visiškai paženklinusios visus baltymus, nors SILAC dieta yra brangi. 20 Metabolinis ženklinimas taip pat suteikia informacijos apie aminorūgščių sintezę ir tiekimą, baltymų surinkimą ir apyvartos kinetiką.

2.4.2 Izobarinis santykinio ir absoliutaus kiekybinio / tandemo masės žymenų žymėjimas

Tais atvejais, kai naudojamas žmogaus audinys, iTRAQ arba TMT yra galimybė suskaidyti klinikinius mėginius diferencinės ekspresijos tyrimams LC-MS/MS 21 , tačiau šie metodai nėra be išlygų. 22 (i) Vienas iš iTRAQ ir TMT sistemos trūkumų, palyginti su SILAC, yra tai, kad ženklinimas atliekamas peptidų lygiu ir vyksta eksperimentinio proceso pabaigoje.Prieš ženklinant, baltymai pirmiausia ekstrahuojami iš ląstelių arba audinių ir virškinami iki peptidų. Tai galimas variacijos šaltinis. (ii) Skirtingai nuo SILAC, kiekybinis nustatymas atliekamas MS/MS, o ne MS lygiu. Peptidai iš skirtingų mėginių išlieka identiški m/z santykiai po ženklinimo (MS). Tik suskaidžius (MS / MS), izobarinės masės žymenys išskiria skirtingus reporterių jonus su vienu izotopo pakaitalu ir pateikia kiekybinę informaciją apie kiekvieną atskirą mėginį. Dažniausiai stebima iTRAQ eksperimentų problema yra ta, kad sudėtingas fonas gali nulemti baltymų klosčių pokyčių nepakankamumą. Prekursoriaus jonų atrankos metu daugiau nei vienas peptidas gali būti fragmentavimui pasirinktame masės lange. Tokiuose mišriuose MS / MS spektruose reporterių jonai, kilę iš skirtingų baltymų peptidų, yra klaidingai sujungiami kiekybiniam įvertinimui.

2.5 Baltymų identifikavimas

Nors kiekvienai „-omikos“ sričiai reikalingos tikslios ir prieinamos duomenų bazės, proteomika bene labiausiai priklauso nuo šių išteklių. Baltymų identifikavimo ir kiekybinio nustatymo technologijos priklauso nuo išsamių duomenų bazių baltymų identifikavimui ir peptidų kiekybiniam nustatymui. Šios duomenų bazės nėra tiesiogiai įtrauktos į sistemų biologijos sritį, tačiau jos suteikia pagrindą pastarosioms analizėms, nes šių duomenų bazių kuravimas ir priežiūra yra gyvybiškai svarbūs norint teisingai identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti tiriamus baltymus.

Funkcinėms ir sekomis pagrįstoms duomenų bazėms UniProt yra viena iš išsamiausių. „UniProt“ susideda iš kelių klasifikacijų: „Swiss-Prot“ ir „TrEMBL“ pateikia seką ir funkcinę informaciją apie baltymus, „UniRef“ ir „UniParc“ – sekos ir archyvuotų sekų įrašus ir, jei įmanoma, pagalbinius duomenis, tokius kaip literatūros nuorodos ir kryžminių nuorodų duomenų bazės. 23 Tokios programos kaip Mascot, SEQUEST arba X!Tandem ieško FASTA baltymų sekų, gautų iš viešų duomenų bazių, tokių kaip UniProt. Atlikęs „in silico suskaidymas“ su žinomu fermento specifiškumu, smailių masės sąrašai su intensyvumu (eksperimentiniai duomenys) ieškomi pagal in silico- suskaidyta duomenų bazė. Pirminių jonų masės nuskaitomos pagal mases, gautas iš duomenų bazės sekų. Jei sutampa tam tikros masės tolerancijos ribose, tada stebimi MS/MS spektrai lyginami su teorinėmis sekos jonų serijomis. Nors čia nėra aiškiai aptarta, Noble ir MacCoss 24 apžvalga ir komentarai suteikia įžvalgos apie šias metodikas ir metodus. Balų skaičiavimo algoritmai gali duoti skirtingus rezultatus, o priklausomybė nuo vieno peptido identifikavimo didelio masto duomenų rinkiniuose yra galima klaidingo identifikavimo priežastis. Dauguma proteominių tyrimų praneša tik apie identifikavimą su mažiausiai dviem unikaliais peptidais arba apima MS / MS spektrus vieno peptido identifikavimui.


Metodai

Augalinė medžiaga ir mėginių ėmimas

Šiame tyrime buvo naudojama elitinė kininių kukurūzų veislė Denghai 661 (DH351/DH372). Sėkla buvo gauta iš Shandong Denghai Seeds Co., Ltd. (Laidžou, Kinija). Kukurūzų auginimo sezono metu augalai buvo auginami Shandong žemės ūkio universiteto Taiano eksperimentiniame ūkyje (36°10′ rytų ilgumos, 117°04′ šiaurės platumos), Kinijoje. Tą pačią dieną žydintys augalai buvo pažymėti ir dirbtinai apsidulkinti. Kiekviename 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ir 50 DAP etape buvo surinktos devynios ausys. Siekiant padidinti medžiagos vienodumą, buvo imami tręšti grūdai iš kiekvienos varpos vidurinės dalies. Kiekvienam etapui buvo paruošti trys mėginiai, sumaišius vienodą skaičių grūdų iš trijų burbuolių, mėginiai buvo nedelsiant laikomi –80 °C temperatūroje iki baltymų ekstrahavimo. Kiekviename grūdų etape buvo matuojamas šviežias ir sausas svoris. Bendram krakmolo kiekiui ir endospermo ląstelių skaičiui nustatyti buvo surinkti 10–50 DAP ir 3–30 DAP grūdeliai, kaip aprašyta anksčiau [83].

Baltymų ekstrahavimas

Grūdų mėginiai buvo susmulkinti į smulkius miltelius skystame azote, naudojant grūstuvą ir grūstuvę. Milteliai buvo suspenduoti 10 kartų atšaldytame acetone (-20 °C), turinčiame 10 % (t/v) trichloracto rūgšties (TCA). Po to gerai sumaišius, homogenatas nusodinamas 2 valandas –20 ° C temperatūroje. Po to homogenatas centrifuguojamas 30 min 20 000 laipsnių kampu g 4 ° C temperatūroje, o supernatantas buvo atsargiai pašalintas, nuosėdos tris kartus perplaunamos šaltu acetonu, paliekamos -20 ° C temperatūroje 30 min., o po to centrifuguojamos 20 000 g 30 minučių 4 °C temperatūroje. Gautos granulės buvo ištirpintos lizės buferyje, kuriame yra 8 M karbamido, 30 mM HEPES, 1 mM polivinilpolipirolidono (PMSF), 2 mM EDTA ir 10 mM ditiotreitolio (DTT), ir po to 5 min. Ištirpęs baltymų ekstraktas buvo centrifuguojamas esant 20 000 g 30 minučių 4 ° C temperatūroje supernatantas buvo surinktas ir redukuotas 10 mM DTT 56 ° C temperatūroje 1 valandą, o po to alkilintas 55 mM jodoacetamidu (IAM) 1 valandą tamsoje. Mišinys nusodinamas naudojant 5 kartus didesnį šalto acetono tūrį –20 °C temperatūroje 3 valandas, po to centrifuguojamas 20 000 g 30 min. Gautos nuosėdos buvo ištirpintos 0,5 M trietilamonio bikarbonato (TEAB) buferyje su 0,1 % SDS, 5 minutes apdorotos ultragarsu ir centrifuguojamos esant 20 000 g 30 min. Supernatantas buvo naudojamas virškinimui skysčiu, o baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant Bradfordo testą (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV), naudojant BSA kaip standartą.

Virškinimas tirpale ir iTRAQ ženklinimas

Kiekvienam mėginiui 3, 3 μl tripsino (1 μg / μL) (Promega, Madison, WI, JAV) buvo pridėta prie 100 μg baltymų TEAB buferyje ir baltymai buvo virškinami 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Buvo pridėta nauja tripsino alikvotinė dalis (1 μL) ir mėginys vėl virškinamas 12 valandų. Nuosėdos ištirpintos 30 μL 0,5 M TEAB ir sumaišytos su 70 μL izopropanolio. Tada suskaidyti peptidai buvo pažymėti iTRAQ reagentais (AB SCIEX, Framingham, MA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Grūdų mėginiai, gauti iš 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ir 50 DAP, buvo pažymėti atitinkamai iTRAQ reagentais 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ir 121. Buvo atlikti trys nepriklausomi biologiniai eksperimentai.

SCX ir LC-MS/MS

Sujungti peptidai buvo ištirpinti stipriame katijonų mainų (SCX) buferyje A (10 mM kalio fosfato vienbazis (KH).2PO4) 25 % acetonitrile, pH 2,8). Mišinio pH buvo nustatytas iki 3 naudojant fosforo rūgštį, o po to frakcionuojamas naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografijos (HPLC) sistemą (Shimadzu, Kioto, Japonija), turinčią silicio dioksido pagrindu pagamintą SCX kolonėlę (250 × 4,6 mm, 5 μm, 100). Å, Phenomenex, Torrance, CA, JAV). Iš viso buvo surinktos 36 frakcijos 1 ml/min srauto greičiu su buferiu B (10 mM KH2PO4 ir 2 M kalio chlorido (KCl) 25 % acetonitrile, pH 2,8) su tokiu gradientu: 0 % 45 min., 0-5 % 1 min., 5-30 % 20 min., 30-50 % 5 min. ir palaikoma 5 min., ir 50–100 % 5 min., ir palaikoma 10 min. Frakcijos buvo nudruskintos strata-X 33 μm PolyRevStage SPE (Phenomenex) pagal gamintojo instrukcijas ir liofilizuotos išcentrinio greičio vakuuminiame koncentratoriuje. Tada į kiekvieną išdžiovintą frakcijos mėgintuvėlį įpilta 30 μl 0,1 % skruzdžių rūgšties, o 0,1 μl pakartotinai ištirpinto tirpalo buvo pastebėta ant tikslinės inkaro lusto plokštės šulinėlio MALDI-TOF tyrimui. Atlikus MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Vokietija) testą, 36 frakcijos buvo sujungtos į 16 galutinių frakcijų pagal smailės plotą.

Masių spektrometrijos analizė buvo atlikta naudojant Dionex Ultimate 3000 Nano LC sistemą, prijungtą prie Q-Exactive masės spektrometro (Thermo Fisher Scientific, MA, JAV). Peptidų mišiniai buvo įkelti į Acclaim PePmap C18 atvirkštinės fazės kolonėlę (75 μm × 2 cm, 3 μm, 100 Å, Thermo Scientific) ir atskirti atvirkštinės fazės C18 kolonėle (75 μm × 10 cm, 5 300 μm, , Agela Technologies), naudojant 5–80 % (v/v) acetonitrilo gradientą 0,1 % skruzdžių rūgštyje per 45 min., esant 300 nL/min srautui. Tirpiklis A buvo 0,1 % skruzdžių rūgšties vandenyje. Viso masės spektrometrijos (MS) skenavimas (350–2000 m/z) buvo gautas teigiamų jonų režimu, kai skiriamoji geba yra 70 000 (esant 200 m/z), AGC tikslinė vertė 3–6, didžiausia jonų kaupimosi trukmė 50 ms, nuskaitymo diapazonų skaičius 1 ir dinaminis išskyrimas 15 s. Informacija apie peptidus ir peptidų fragmentus m/z buvo gauta tokiomis sąlygomis: po kiekvieno pilno nuskaitymo (MS2 nuskaitymo) surinkta 20 fragmentų failų, didesnės susidūrimo energijos disociacijos (HCD) fragmentacija, 2 m/z izoliacijos langas, pilnas nuskaitymas. esant 17 500 skiriamajai gebai (esant 200 m/z), mikro nuskaitymai 1, didžiausia jonų kaupimosi trukmė 100 ms, normalizuota susidūrimo energija 28 eV ir 1 % nepakankamo užpildymo koeficientas.

Duomenų analizė

Baltymų identifikavimui MS neapdoroti failai buvo apdoroti naudojant Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Fisher Scientific) ir ieškoma naudojant vidinę MASCOT programinę įrangą 2.3.01 (Matrix Science, Londonas, JK). Gauti MS/MS spektrai buvo automatiškai ieškomi pagal UniProt-Zeamays baltymų duomenų bazė (86 922 sekos 2014 m. gruodžio mėn.). Paieškos parametrai buvo tokie: tripsinas buvo pasirinktas kaip fermentas su vienu praleistu skilimu, leido fiksuotas cisteino liekanų karbamidometilinimo modifikacijas iTRAQ 8-plex N galo modifikacija, K ir Y, Gln → N galo Pyro-Glu ir oksidacija metionino buvo nustatytas kaip kintamos modifikacijos peptidų tolerancija buvo nustatyta 15 ppm, o MS/MS tolerancija buvo nustatyta 20 mmu. Baltymų identifikavimui ir kiekybinio įvertinimo duomenų analizei reikėjo bent vieno unikalaus peptido, kurio klaidingų atradimų dažnis (FDR) ≤1 %.


Žiūrėti video įrašą: Brief Introduction of SILAC (Gruodis 2022).