Informacija

1.4.6.18: Natūrali atranka – biologija

1.4.6.18: Natūrali atranka – biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mokymosi tikslai

  • Apibrėžkite natūralią atranką

Darvinas ir kilimas su modifikacija

Charlesas Darwinas geriausiai žinomas dėl savo natūralios atrankos atradimo. Devyniolikto amžiaus viduryje tikrąjį evoliucijos mechanizmą savarankiškai sugalvojo ir aprašė du gamtininkai: Charlesas Darwinas ir Alfredas Russelis Wallace'as. Svarbu tai, kad kiekvienas gamtininkas praleido laiką tyrinėdamas gamtos pasaulį ekspedicijose į tropikus. 1831–1836 metais Darvinas keliavo po pasaulį H.M.S. Biglis, įskaitant sustojimus Pietų Amerikoje, Australijoje ir pietiniame Afrikos gale. Wallace'as keliavo į Braziliją rinkti vabzdžių Amazonės atogrąžų miškuose nuo 1848 iki 1852 m., o į Malajų archipelagą - nuo 1854 iki 1862 m. Darvino kelionė, kaip ir vėlesnės Wallace'o kelionės į Malajų salyną, apėmė sustojimus keliose salų grandinėse, iš kurių paskutinė buvo Galapagų salos. į vakarus nuo Ekvadoro. Šiose salose Darvinas įvairiose salose pastebėjo organizmų rūšis, kurios buvo aiškiai panašios, tačiau turėjo ryškių skirtumų. Pavyzdžiui, Galapagų salose gyvenantys žemės kikiliai sudarė keletą rūšių, turinčių unikalią snapo formą (1 pav.).

Salose esančios rūšys turėjo suskirstytas snapų dydžių ir formų serijas, kurių skirtumai tarp panašiausių buvo labai nedideli. Jis pastebėjo, kad šie kikiliai labai panašūs į kitą žemyninėje Pietų Amerikos dalyje esančią kikilių rūšį. Darvinas įsivaizdavo, kad salos rūšys gali būti rūšys, modifikuotos iš vienos iš pirminių žemyno rūšių. Toliau tyrinėjęs jis suprato, kad įvairūs kiekvieno kikilio snapai padėjo paukščiams įgyti tam tikros rūšies maisto. Pavyzdžiui, sėklas mintančių kikilių snapeliai buvo stipresni, storesni, kad sulaužytų sėklas, o vabzdžiais mintantys kikiliai – į ietį primenančius snapus, skirtus grobiui durti.

Wallace'as ir Darwinas pastebėjo panašius modelius kituose organizmuose ir jie savarankiškai sukūrė tą patį paaiškinimą, kaip ir kodėl tokie pokyčiai gali vykti. Darvinas šį mechanizmą pavadino natūralia atranka. Natūrali atranka, dar žinomas kaip „stipriausių išgyvenimas“, yra palankesnių savybių turinčių individų, kurie dėl tų savybių išgyvena aplinkos pokyčius, dauginimasis; tai veda prie evoliucinių pokyčių.

Pavyzdžiui, Darvinas pastebėjo, kad Galapagų salyne aptikta milžiniškų vėžlių populiacija turi ilgesnius kaklus nei tų, kurie gyveno kitose salose su sausomis žemumomis. Šie vėžliai buvo „atrinkti“, nes jie galėjo pasiekti daugiau lapų ir gauti daugiau maisto nei tie, kurių kaklas trumpas. Sausros metu, kai buvo prieinama mažiau lapų, tie, kurie galėjo pasiekti daugiau lapų, turėjo didesnę galimybę valgyti ir išgyventi nei tie, kurie negalėjo pasiekti maisto šaltinio. Vadinasi, ilgakakliams vėžliams būtų didesnė tikimybė, kad jie bus sėkmingi ir perduos ilgakaklo bruožą savo palikuonims. Laikui bėgant populiacijoje bus tik ilgakakliai vėžliai.

Darvinas teigė, kad natūrali atranka buvo neišvengiama trijų gamtoje veikiančių principų pasekmė. Pirma, dauguma organizmų savybių yra paveldimos arba perduodamos iš tėvų palikuonims. Nors tuo metu niekas, įskaitant Darviną ir Wallace'ą, nežinojo, kaip tai atsitiko, tai buvo bendras supratimas. Antra, susilaukia daugiau palikuonių, nei sugeba išgyventi, todėl išlikimo ir dauginimosi ištekliai yra riboti. Visų organizmų gebėjimas daugintis viršija išteklių jų skaičių palaikyti. Taigi kiekvienoje kartoje dėl tų išteklių vyksta konkurencija. Ir Darvinas, ir Wallace'as šį principą suprato perskaičius ekonomisto Thomaso Malthuso esė, kurioje šis principas buvo aptartas žmonių populiacijų atžvilgiu. Trečia, palikuonys skiriasi vienas nuo kito pagal savo savybes ir šie variantai yra paveldimi. Darwinas ir Wallace'as samprotavo, kad palikuonys, turintys paveldėtų savybių, leidžiančių geriausiai konkuruoti dėl ribotų išteklių, išliks ir susilauks daugiau palikuonių nei tie individai, kurių variacijos yra mažiau pajėgios konkuruoti. Kadangi savybės yra paveldimos, šios savybės bus geriau atstovaujamos kitoje kartoje. Tai lems populiacijų kaitą kartoms, procese, kurį Darvinas pavadino kilimu su modifikacijomis. Galiausiai natūrali atranka lemia didesnį gyventojų prisitaikymą prie vietinės aplinkos; tai vienintelis žinomas adaptyviosios evoliucijos mechanizmas.

Darwino ir Wallace'o straipsniai (2 pav.), kuriuose pristatoma natūralios atrankos idėja, buvo skaitomi kartu 1858 m. prieš Linnean Society Londone. Kitais metais Darvino knyga, Apie rūšių kilmę, buvo paskelbta. Jo knygoje gana išsamiai aprašyti argumentai dėl laipsniškų pokyčių ir prisitaikančio išgyvenimo natūralios atrankos būdu.

Natūralios atrankos evoliucijos demonstravimas užima daug laiko ir sunkiai pasiekiamas. Vienas geriausių pavyzdžių buvo pademonstruotas paukščiuose, kurie padėjo įkvėpti Darvino teoriją: Galapagų kikilius. Peteris ir Rosemary Grantai bei jų kolegos kasmet tyrinėjo Galapagų kikilių populiacijas nuo 1976 m. ir pateikė svarbių natūralios atrankos pavyzdžių. Grantai pastebėjo, kad snapo formos pasiskirsto iš vienos kartos į kitą su vidutinio grunto kikile Galapagų Dafnės Major saloje. Paukščiai paveldėjo snapelio formos įvairovę – vienų paukščių snapeliai platūs, o kiti plonesni. Per laikotarpį, kai dėl El Ninjo kritulių iškrito daugiau nei įprastai, sumažėjo didelių kietų sėklų, kurias valgė stambiavaliai paukščiai; tačiau buvo gausu mažų minkštų sėklų, kurias valgydavo mažaplaukiai paukščiai. Todėl vėlesniais metais smulkiaplaukių paukščių išgyvenimas ir dauginimasis buvo daug geresni. Per kelerius metus po šio El Niño Grantai išmatavo populiacijos snapo dydį ir nustatė, kad vidutinis sąskaitos dydis buvo mažesnis. Kadangi sąskaitos dydis yra paveldima savybė, tėvai, turintys mažesnes sąskaitas, susilaukė daugiau palikuonių, o vekselių dydis tapo mažesnis. Kai 1987 m. sąlygos pagerėjo ir tapo daugiau prieinamų didesnių sėklų, tendencija mažinti vidutinį kupiūrą nutrūko.


Kaip kalba galėjo išsivystyti?

Filialai Kognityvinės neurobiologijos ir Helmholtzo instituto Psichologijos ir biologijos katedros, Utrechto universitetas, Utrechtas, Nyderlandai, Zoologijos katedra ir Sidnėjaus Sasekso koledžas, Kembridžo universitetas, Kembridžas, Jungtinė Karalystė

Amerikos gamtos istorijos muziejaus antropologijos filialų skyrius, Niujorkas, Niujorkas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Lingvistikos ir filosofijos filialas, MIT, Kembridžas, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Elektros inžinerijos ir kompiuterių mokslo bei smegenų ir pažinimo mokslų filialas, MIT, Kembridžas, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos


Natūrali atranka ir žinduolių BRCA1 sekos: funkciškai svarbių vietų, susijusių su krūties vėžio jautrumu žmonėms, išaiškinimas

Ortologinių genų sekų palyginimas atsiranda kaip galingas būdas išsiaiškinti funkciškai svarbias žmogaus ligų genų pozicijas. Naudodami įvairią 132 žinduolių BRCA1 (11 egzono) sekų masyvą, įvertinome konkrečių vietų funkcinę reikšmę atrankos informacijos kontekste (gryninimo, neutralios arba diversifikuojančios), taip pat galimybę išgauti tokią informaciją iš derinimų, kurie indeksuoja skirtingą. žinduolių įvairovės laipsniai. Nedideli glaudžiai susijusių taksonų (primatų) arba skirtingų placentos taksonų duomenų rinkiniai negalėjo atskirti vietų, išsaugotų dėl gryninimo atrankos nuo vietų, išsaugotų dėl atsitiktinumo (klaidingai teigiamų rezultatų rodiklis = 65% -99%). Placentos taksonų skaičiaus padidinimas iki 57 labai sumažino galimą klaidingų teigiamų rezultatų skaičių (0–1,5 %). Naudodamiesi didesniu duomenų rinkiniu, mes įvertinome onkogeninę žmogaus missense mutacijų riziką, naudodami naują metodą, kuris apima specifinį atrankos lygį ir aminorūgščių pokyčio sunkumą, įvertintą pagal aminorūgštis, esančias kituose žinduolių taksonuose. Be svetainių, kuriose atliekama teigiama atranka Marsupialia, Laurasiatheria, Euarchontoglires ir Primates, mes nustatėme vietas, kuriose greičiausiai bus patiriamas skirtingas atrankos spaudimas skirtingose ​​​​linijose, ir šešias poras potencialiai sąveikaujančių vietų. Mūsų rezultatai rodo, kad, naudojant lyginamąjį evoliucinį metodą, būtina įtraukti daugybę sekų, kad būtų išaiškintos funkciškai svarbios baltymo vietos.


2. Kačių blusų biologija ir ekologija

Keletas bendrų atsiliepimų apie C. f. felis biologija publikuojama nuo 1997 m. [3,4,5,6,7,8,9,10,11]. Mūsų supratimas apie geografinį pasiskirstymą C. f. felis ir jo pakaitiniai šeimininkai toliau plečiasi. C. f. felis tikrai yra visuotinis kenkėjas, o visuotinis atšilimas tikriausiai neturės įtakos kačių blusų paplitimui. Mažas išorinis patvarumas C. f. felis, veisimosi patalpose, labai specializuotas gyvavimo ciklas ir specifinių temperatūros bei drėgmės sąlygų poreikis vystymuisi yra veiksniai, rodantys, kad kačių blusų pasiskirstymas išliks toks pat [12]. Tačiau padidėjus temperatūrai, kartų skaičius per metus ir galimas kačių blusų tankis gali labai padidėti.

Kačių blusos priklauso Siphonaptera ordinui ir Pulicidae šeimai. Iš Pulicidae šeimos, genties Ctenocefalidai buvo atlikta keletas pagrindinių pataisymų, atsiradus molekulinei sistematikai ir kritiškai peržiūrint esamus morfologinius požymius. Ant aedeagus esantys simboliai, tokie kaip hamulus, skiltelės ir vamzdelio vidus, leidžia identifikuoti daugumą Ctenocefalidai [13]. Tačiau morfologiniai simbolių variantai buvo naudojami diferencijuoti C. f. felis ir C. canis reikalauja, kad nustatant būtų naudojami šeimininko duomenys, geografinis pasiskirstymas ir užkrėtimo paplitimas [14,15]. Žvelgiant iš sisteminės perspektyvos, šešis dešimtmečius egzistavo keturi kačių blusų porūšiai, būtent: C. felis damarensis, C. felis felis, C. felis orientis, ir C. felis strongylus [16]. ITS1 ir TYS2 nukleotidų sekos ir 16SrDNR sekos buvo nekintamos daugelyje C. felis populiacijos, surinktos visame pasaulyje, o bendri rezultatai nepatvirtino porūšių C. felis [17]. Buvo nustatyti keli mikropalydovai, galintys padėti nustatyti, ar šeimininkas turi specifinių padermių C. f. felis porūšių egzistavimą ir išsamius epidemiologinius tyrimus Rickettsia felis [18]. Citochromo c oksidazės subvienetų sekos cox1 ir cox 2 nurodykite tai C. f. felis ir C. f. strongylus yra parafiletiniai ir C. f. orientis yra monofilinis [19]. Trys skirtingos klasės C. f. felis buvo rasti. Panašūs tyrimai su subvienetais cox1 ir cox2 atskleidė tai C. f. felis iš Naujosios Zelandijos priklausė 1 kladui, kaip ir Australijos bei Europos [20]. 52 žymeklyje ITS1 nebuvo nustatyta jokių specifinių pokyčių C. f. felis egzemplioriai, išanalizuoti iš 17 skirtingų vietų pietinėje centrinėje JAV dalyje, o tai rodo, kad yra genetinė kliūtis arba jie buvo neseniai pristatyti [21]. Populiacijos C. f. felis ir C. canis iš Ispanijos, Irano ir Pietų Afrikos buvo ištirtos ir atliktos ITS1 sekos. Abi rūšys buvo aiškiai atskirtos [22]. Svarbioms blusų kenkėjų rūšims nustatyti buvo naudojama matricos pagalba lazerinės desorbcijos / jonizacijos skrydžio laiko masės spektrometrijos (MALDI-TOF MS) technika. Vienas naujas egzempliorius vienareikšmiškai identifikavo rūšis. Mėginiai, konservuoti etanolyje, davė skirtingus rezultatus, priklausomai nuo laiko trukmės etanolyje [23].

Naujausios sistemingos pastangos, įskaitant molekulinius metodus, padidino du porūšius iki visų rūšių, C. damarensis ir C. orientis [13,24]. C. f. felis buvo rasta tik ant kačių ir šunų, tuo tarpu C. f. strongylus buvo aptiktas tik dideliems ūkio gyvūnams Libijoje [25]. Pietų Afrikoje, C. f. strongylus buvo surinkta ant laukinės katės Karakalinis karakalis ir naminiai šunys kaimo vietovėse [26]. galbūt C. f. strongylus ateityje taip pat bus pakeltas į rūšies statusą.

Dėl trumpumo C. felis felis bus vadinamas C. felis.

2.1. Geografinis pasiskirstymas ir prieglobos

Visame pasaulyje buvo atlikta daugybė gyvūnų kompanionų ektoparazitų tyrimų ir jie trumpai apžvelgiami pagal žemyną, regioną ir šalį. Tai rodo Canidae šeimai priklausančių šeimininkų blusų apžvalga C. felis yra labiausiai paplitusi naminių šunų blusa visame pasaulyje [27]. C. felis buvo surinkta apie laukinius gyvūnus, tokius kaip oposumai, lapės, žiurkės, mangustai ir ežiai, ir šie duomenys apibendrinti 1 lentelėje. Apskritai daugybė pranešimų patvirtina, kad katės dažniau užsikrečia C. felis nei šunys paplitimas C. felis yra sezoninis, bet pasirodo ištisus metus, o blusų patelės renkamos dažniau nei patinai. C. canis yra labiau paplitęs šunims kai kuriose šalyse, pavyzdžiui, Graikijoje, Irane ir Turkijoje.

1 lentelė

Apibendrinimas C. felis šeimininkai, išskyrus kates ir šunis a .

Rūšis (šnekamoji kalba, Mokslinis vardas)Regionas (-ai)/ŠalysKomentaraiPagrindinės nuorodos
Afrikos pigmėjus ežiukas Atelerix albiventrisTanzanija2-as labiausiai paplitęs ektoparazitas[28]
Paprastasis oposumas Didelphis masupialisPrancūzijos Gviana [29]
Prijaukintas asilas Equus asinusIzraelissunki anemija[30]
Prijaukintos avys Ovis avinasIzraelis, Iranas, EtiopijaSezoninis alerginis dermatitas[31,32,33]
Rytų medvilninis triušis Sylvilagus floridianusJungtinės Valstijoszoologijos sodo aplinkoje[34]
Europos ežiukas Erinaceus europaeusVokietija7,9% ežių užsikrėtė[35]
Gazelės Gazelė gazelėIzraeliszoologijos sode[36]
Ožka Capra aegagrus hircusEygpt, Iranas, Etiopija [32,33,37]
Auksinė katė Catopuma temminckiiTailandas [38]
Pilka lapė Urocyon cinereoargenteusMeksika [39]
Grizzly lokys Ursus arctos horribilisJungtinės Valstijoszoologijos sode[34]
Mažiausias žebenkštis Mustela nivalisEygptserologinis tyrimas[37]
Maned vilkai Chrysocyon brachyurusBrazilijazoologijos sode[40]
Margay Leopardus wiediiPeruzoologijos sode[41]
Pelkės elniai Blastocercecus dichotomusBrazilijazoologijos sode[42]
Norvegijos žiurkė Rattus norvegicusKinija, Eygpt [37,43]
Meškėnas Procyon loterijaVakarų Virdžinija, Virdžinija, Jungtinės Valstijos [44,45]
raudona lapė Vulpes vulpesVirdžinija, Pietų Karolina, Jungtinės Amerikos Valstijos [45,46]
Stogo žiurkė Rattus rattusEygpt [37]
Rüppel’s lapė Vulpes rueppelliEygptserologinis tyrimas[37]
Pietų Amerikos apsiaustas Nasua nasuaBrazilijamiesto miškai[47]
Dryžuotas skunksas Mefitas mefitasKonektikutas, Jungtinės Amerikos Valstijos [48]
Viriginia opossum Didelphis virginianaJungtinės Valstijos [34,45,46,49]
Azijinis buivolas Bubalus bulalisIndija [50]

a Linardi ir Santos [14] pranešė apie 41 žinduolių ir 1 paukščių rūšį Brazilijoje.

Nigerijoje buvo ištirta 200 kačių, iš kurių 13 proc C. felis [51]. Havasoje, Etiopijoje, buvo daug ektoparazitų ant kačių ir šunų: 67 % kačių ir 82,9 % šunų buvo užsikrėtę šia liga. C. felis [52]. C. felis nėra paplitęs Pietų Afrikoje, bet buvo paimtas iš šuns Johanesburge [26].

Apklausoje, kurioje dalyvavo 214 šunų, 110 (51,4 %) Japonijoje buvo seropozityvūs prieš blusų IgE, o tai rodo, kad šunys buvo užkrėsti vienu metu. Šunys šiauriniuose Japonijos rajonuose, kaip manoma, be blusų, taip pat buvo seropozityvūs [53]. Indijoje atlikta 324 valkataujančių šunų apklausa parodė, kad 24 % iš jų buvo užkrėsti C. felis sudarė 10,4 % [54]. Tik Tailande C. felis buvo rasta ant kačių, tuo tarpu C. orientis buvo rasta ant šunų [55]. Benamės katės (n = 200) Taipėjuje buvo ištirti ir 82% buvo užkrėsti C. felis [56]. Apklausus 83 šunis iš trijų Irano regionų, buvo aptiktos 407 blusos, iš kurių 67,5 proc. C. felis [57]. Kitame tyrime palei Irako ir Irano sieną buvo apklausti 802 šunys ir 50 kačių, iš kurių 2,4 % šunų ir 65 % kačių buvo užsikrėtę šia liga. C. felis [58]. Tik 2 iš 126 šunų pietvakarių Irane buvo užkrėsti C. felis [59]. Iš blusų, surinktų iš 70 benamių šunų Šiaurės ir Vidurio Irane, 19,9 proc. C. felis [60]. Izraelyje atliktame tyrime buvo ištirta 340 benamių kačių, iš kurių 54,7 % buvo užkrėstos C. felis. Blusų buvo atgauta kiekvieną mėnesį, daugiausia rudenį [61].

Australijoje 98,8% iš 2500 surinktų blusų buvo C. felis ir vienas haplotipas cox2 buvo rasta genų seka [62]. Borneo saloje buvo ištirti 195 šunys ir surinktos 1965 blusos, iš kurių 25,4 proc. C. felis, likusi būtybė C. orientis [63]. C. felis buvo surinktas iš kačių ir šunų Guame [64].

Daugelis neseniai atliktų tyrimų buvo atliekami visoje Europoje. Atlikus 1519 kačių iš septynių Europos šalių ektoparazitų ir endoparazitų tyrimą, nustatyta, kad 15,5 % į veterinarijos klinikas atvežtų kačių buvo užkrėstos blusomis. 93,5% kačių, kenčiančių nuo anemijos, buvo labai užkrėstos blusomis [65]. Pietų Lenkijoje iš 225 parazitinių vabzdžių, surinktų iš naminių gyvūnėlių, tik 3 buvo C. felis [66]. Kai Čekijoje buvo apklausti šunys ir katės, 60 proc C. felis, priklausantis kosmopolitui cox1 haplotipas. Naujas haplotipas buvo rastas ir Čekijoje, ir Rumunijoje [67]. 1342 šunys ir 1378 katės, pristatytos 22 skirtingose ​​Serbijos klinikose, parodė, kad 79,2 proc. C. felis daugiausiai aptinkama ant kačių nuo liepos iki rugsėjo [68]. Vengrijoje buvo patikrinti 2267 šunys, iš kurių 115 šunų buvo užkrėsti C. felis ir 23 iš 100 patikrintų kačių buvo užkrėstos C. felis. Kaimo gyvūnų blusos buvo labiau paplitusios nei miesto gyvūnų [69]. Vakarų Vengrijoje 71% iš 82 tirtų kačių turėjo C. felis [70]. Turkijoje buvo ištirti 48 šunys, iš kurių 43,8% buvo užkrėsti blusomis. C. felis buvo rasta 4,2% šunų, kurių blusos vidutiniškai buvo 5 vienam šuniui. Nebuvo jokių sezoninių modelių [71]. Tiranoje, Albanijoje, 128 šunys ir 26 katės buvo ištirti dėl ektoparazitų, iš kurių 5% šunų ir 100% kačių buvo užkrėsti. C. felis. Su blusomis buvo susiduriama ištisus metus [72]. Kito tyrimo metu iš Tiranos 131 naminė katė buvo ištirta dėl ektoparazitų, iš kurių 52 proc. C. felis. C. felis buvo renkami ištisus metus, o 48,8 % buvo paimti rudenį nuo rugsėjo iki lapkričio [73]. Keturios Albanijos klinikos ištyrė 602 klientams priklausančius šunis ir nustatė, kad 3,0 proc. C. felis [74]. Vokietijoje atlikta apklausa parodė, kad 5,1 % šunų ir 14,3 % kačių buvo užkrėsti blusomis. Iš surinktų blusų buvo 81,1 proc C. felis ir nebuvo skirtumų tarp miesto ir kaimo užkrėtimo rodiklių [75]. Kitas tyrimas Vokietijoje parodė, kad 71,1% šunų ir 83,5% kačių buvo užsikrėtę. C. felis. Padidėjęs paplitimas per pastaruosius dešimtmečius gali būti dėl to, kad būsto temperatūra kontroliuojama [35]. Prancūzijoje buvo ištirti 392 blusomis užkrėsti šunys ir 86,6 proc. C. felis. C. felis buvo rasta visoje Prancūzijoje viduje ir lauke. Tik 11,2% blusų, surinktų iš šunų, gyvenančių aukštyje 𾐀 m. C. felis palyginti su 32,5 proc. C. canis [76].

Buvo ištirta 31 JK klinika, iš viso buvo ištirti 2653 šunys ir 1508 katės, iš kurių 21,1% kačių ir 6,8% šunų buvo užkrėsti. C. felis buvo labiausiai paplitusi blusa – 98,9 % katėms ir 93,2 % šunims [77]. Iš 138 blusų, surinktų JK rudenį ir žiemą, 96 proc C. felis. Suaugusios kačių blusos visą rudenį ir žiemą brandino oocitus [78].

Serbijoje iš 1484 šunų, atvežtų į klinikas iš kelių miestų, 26,3 % buvo užkrėsti blusomis, iš kurių 71,9 %. C. felis. Didžiausias užsikrėtimo lygis buvo nuo birželio iki spalio [79]. Graikijoje 13,7% blusų, surinktų iš šunų, buvo C. felis, likusi būtybė C. canis [80]. Pietų Italijoje atlikta apklausa parodė C. felis 16,3 % iš 1376 tirtų šunų [81]. Blusos buvo aptiktos ištisus metus, o didžiausias paplitimas buvo nuo birželio iki spalio. Kito tyrimo Italijoje metu 80,3 % blusų, surinktų iš 73 šunų ir 44 kačių C. felis [82]. Iš 3032 blusų, surinktų iš 1084 šunų iš 42 vietų Ispanijoje, 81,7 proc. C. felis. C. felis buvo gausiausios vasaros pradžioje ir vėlyvą rudenį [83]. Kito tyrimo metu Ispanijoje 77 veterinarijos klinikos surinko 1938 blusas iš 217 kačių, iš kurių 98,4 proc. C. felis. Šiltais vasaros mėnesiais užsikrėtimo lygis buvo mažesnis, o bendras blusų gausumas buvo teigiamai susijęs su kritulių kiekiu [84]. Graikijoje buvo ištirta 341 beglobė katė, o 24,3 proc C. felis. Katės su ilgais plaukais (Ϥ cm ilgio) turėjo daug daugiau ektoparazitų nei trumpaplaukės katės – 42,3 % ektoparazitų buvo C. felis [85]. Iš 242 tirtų benamių šunų 46,2% buvo užkrėsti bet kuriuo iš jų C. felis arba C. canis Graikijoje [86].

Šiaurės Amerikoje, apklausus 200 laukinių kačių iš šiaurinės centrinės Floridos, nustatyta, kad 92,5 % jų buvo užkrėstos. C. felis. Didžiausias blusų skaičius buvo birželio ir liepos mėnesiais (16,6–16,3 blusos vienai katei), o mažiausias – nuo ​​rugpjūčio iki rugsėjo (nuo 7,7 iki 8,4 blusos vienai katei) [87]. C. felis buvo pranešta apie šunis Pietų Karolinoje [46]. Gruzijoje iš šunų buvo surinkta 2518 blusų, iš kurių 61 proc C. felis. Kiekvienam patinui buvo surinktos trys blusų patelės. Didžioji dauguma blusų buvo surinkta nuo rugpjūčio iki spalio [88]. Iš 673 ​​laisvai tarptinklinių kačių, ištirtų centrinėje JAV dalyje, 71,6 % turėjo blusų, iš kurių 97,2 % buvo C. felis [89]. C. felis yra dažna ir plačiai paplitusi naminių gyvūnėlių blusa Vakarų Virdžinijoje ir Virdžinijoje. Blusų buvo aptikta kiekvieną mėnesį, daugiausia birželį, rugsėjį ir spalį, o balandį – mažiausiai [44,45]. Meksikoje apie 30 % tirtų šunų (1803) ir kačių (517) buvo užkrėsti blusomis. Iš 4215 surinktų blusų 81,1 proc C. felis. Nebuvo jokių sezoninių blusų paplitimo skirtumų [45]. Panašiai iš 358 kačių, įtrauktų į kitą tyrimą, 53 % buvo užkrėstos blusomis. Iš 2985 surinktų blusų 89 proc C. felis [90]. Aguaskliente, Meksikoje, buvo ištirti 863 šunys ir 38% iš 629 surinktų blusų buvo ištirti. C. felis su didesniu paplitimu pavasarį ir vasarą [91]. Sent Kitso saloje 26 % iš 100 benamių kačių buvo užkrėstos C. felis [92]. Blusos buvo labiausiai paplitęs ektoparazitas Kosta Rikos namuose – 83 % šunų buvo užkrėsti. C. felis [93].

Pietų Amerikoje plačiausiai tyrimai buvo atlikti Brazilijoje. Aštuoniasdešimt aštuoni naminiai šunys, gyvenę lauke, buvo tiriami kas mėnesį vienerius metus ir tik C. felis buvo surinkti. Nebuvo jokios reikšmingos koreliacijos tarp temperatūros ir užkrėtimo indekso ir buvo neigiamas ryšys tarp užkrėtimo indekso ir kritulių [94]. Paz ir kt. [94] padarė išvadą, kad sezoniniai skirtumai C. felis greičiausiai dėl klimato sąlygų tam tikruose Brazilijos regionuose. Panašaus tyrimo metu šunys iš Brazilijos ūkio buvo tiriami 1 metus ir buvo surinktos dvi blusų rūšys, C. felis ir P. dirgina. Ilgaplaukių šunų kačių blusų skaičius buvo žymiai didesnis nei trumpaplaukių šunų [95]. Iš 292 kačių, kurioms buvo atlikta sterilizacijos / sterilizacijos programa, 60% buvo užkrėstos C. felis [96]. Šiaurės rytų Brazilijos kaime 18 iš 29 šunų buvo užkrėsti C. felis [97]. Dviejuose Brazilijos kaimo regionuose iš 328 tirtų šunų C. felis buvo rasta nuo 43,9 iki 87,3% šunų, priklausomai nuo vietovės ir metų sezono [98]. Šiaurės rytų Brazilijoje buvo ištirta 300 miesto ir 322 kaimo šunų, o 23,2 proc. C. felis. Kaimo šunys buvo užkrėsti daugiau nei miesto šunys [99]. Brazilijoje, C. felis buvo labiausiai paplitusi blusa ant šunų [100].

Kitose Pietų Amerikos šalyse buvo ištirti 107 šunys iš naminės ir laukinės gamtos sąsajos Čilės centre ir surinktos šios blusos: C. felis (74.3%), C. canis (58.4%), Pulex sp. (11,8 proc.) [101]. Centrinėje Čilėje atlikti tyrimai rodo, kad laukinės lapės (Pseudalopex griseus) ir mažieji grisonai (Galictus cuja) gali dalytis blusomis ir galimomis ligomis su naminiais šunimis. Penkiasdešimt šunų buvo ištirti Santjage, Concepción ir Osorno mieste, Čilėje ir iš 1000 kiekviename mieste surinktų blusų. C. felis sudarė atitinkamai 80,5, 38,4 ir 6,6 proc. Osornas yra labiau kaimiškas nei Santjago miestas, ir tai gali paaiškinti rūšių sudėties skirtumus [102]. Kolumbijoje buvo ištirta 140 šunų ir 30 kačių, o iš 3448 surinktų blusų 93,3 proc. C. felis [103]. C. felis buvo pranešta iš Prancūzijos Gvianos apie kates ir šunis [29].

C. felis yra oportunistinis tiektuvas ir buvo renkamas iš daugybės laukinių šeimininkų. Kitų kompiuterių sąrašas pateiktas 1 lentelėje.

2.2. Biologija ir gyvenimo istorija

Suaugęs C. felis pasižymėjo cirkadiniu ritmu, o didžiausias aktyvumas pasireiškė maždaug po 9 valandų į šviesos fazę [104]. Poravimasis niekada neįvyko iš šeimininko. Blusos turi maitintis nepertraukiamai, kad įvyktų maksimalus poravimasis ir apvaisinimas. Patinų, šertų krauju iš membranų, spermos pernešimas ir patelių apvaisinimas buvo atitinkamai 84 ir 45%. Jaunatvinio hormono analogai (JH), metoprenas ir piriproksifenas, gali netiesiogiai reguliuoti poravimosi sėkmę, skatindami spermos perdavimą [105]. Patinai, šeriami druskos tirpalais arba dieta be baltymų, patelių neapvaisino [106]. Blusų poveikis šeimininko kūno temperatūrai ir šėrimo kiekis buvo du veiksniai, turėję įtakos sėklinimui [107]. Poravimosi elgesys C. felis buvo išsamiai aprašytas [108,109]. Tik pamaitinti patinai bandė poruotis su nemaitintomis ar maitintomis patelėmis. Didžioji dalis poravimosi įvyko esant 38 ଌ temperatūrai, ty kačių ir šunų kūno temperatūrai. Įdomu tai, kad chloroformo: metanolio ekstrakte iš mergaičių patelių, atrodo, yra lytinio feromono. Moteris C. felis susiporavo su daugybe patinų [109].

Maždaug 25% blusų, surinktų iš kačių geldelės, buvo užsikimšusios per 5 minutes ir beveik visos pasimaitino per 1 val. Vidutinė blusų patelių ir patinų maitinimo trukmė buvo atitinkamai 25 ir 10 min [110]. Blusų patelės išskiria žymiai daugiau sausų išmatų lašelių nei patinai. Tačiau suaugusių blusų patinai ir patelės išmatų lašeliuose gamino panašų kiekį baltymų [111].

Žymiai daugiau blusų buvo surinkta ant kačių galvos ir kaklo, palyginti su ventraliniu kūnu. Mažiausiai blusų buvo surinkta ant kojų ir uodegos [56]. Kai suaugusios blusos įsitvirtino ant šeimininko (48 val.), judėjimas į neužkrėstą šeimininką buvo mažas (3,7 %) [112]. Maždaug 33% pirminių blusų nebuvo aptikta po 72 valandų. Iš blusų alergiškų kačių buvo pašalintas didesnis blusų skaičius, palyginti su įprastomis katėmis. Blusų patelės gamino mažiau kiaušinėlių katėms, sergančioms blusų alerginiu dermatitu (FAD), nei blusų ant įprastų kačių, nors šėrimas buvo toks pat. Kai kurie nežinomi veiksniai galėjo sumažinti FAD kačių kiaušinėlių skaičių [113]. Kačių priežiūros efektyvumas siekiant pašalinti kačių blusas svyravo nuo 4,1 iki 17,6 % kasdieninio blusų naštos. Vidutinis blusų ilgaamžiškumas šeimininkui buvo 7,8 dienos, o patelės padėjo 38,4 kiaušinius per dieną [114]. Kai blusos pasiekia šeimininką, šeimininko priežiūra yra svarbus mirtingumo veiksnys.

Sukurtas multipleksinis PGR tyrimas, galintis nustatyti žmonių, kačių, viščiukų ir žiurkių blusų kraujo miltus. Žmonės ir katės buvo pagrindiniai kraujo šaltiniai C. f. strongylus [115]. Kitas pažanga naudojant realaus laiko PGR buvo galimybė aptikti žmogaus, žiurkės ir ožkos DNR C. felis dirbtinai šeriami iki 72 valandų po maitinimo [116]. Buvo sukurta kita nauja PGR technika, kuri yra jautri ir specifinė kačių blusų prarytam kraujui [117]. Padidėjusi genų ekspresija maitinant kraują C. felis buvo ištirtas ir atskleidė nemažai genų, suaktyvėjusių šėrimo metu. Šių genų baltymai gali būti svarbūs kraujo virškinimui, ląstelių veiklai ir apsaugai maitinimo metu. Tai gali atverti naujas kontrolės galimybes [118]. Seilių sudedamosios dalys, sialomas, iš C. felis apima daug mažų nežinomos funkcijos polipeptidų. Sialomo dalys C. felis yra panašūs į X. cheopis [119].

Buvo ištirti šokinėjimo elgesio aspektai, leidžiantys manyti, kad abu C. canis ir C. felis yra labai pritaikyti dideliems judantiems šeimininkams apsaugoti. C. felis turi didesnį šokinėjimo greitį (vidutiniškai 3,6 m/s) nei X. cheopis (vidutiniškai 1,4 m/s) [120]. Vidutinis šuolių aukštis C. canis buvo 15,5 cm ir 13,2 cm C. felis, aukščiausias šuolis yra 25 ir 17 cm C. canis ir felis, atitinkamai. Vidutinis šuolių ilgis C. canis ir felis buvo atitinkamai 30,4 ir 19,9 cm [121].

Kai blusomis užkrėstos katės buvo laikomos kilimine danga išklotoje patalpoje, blusų kiaušinėliai ir lervos kaupėsi aplink augintinio maitinimo ir poilsio vietas [122]. Linardi ir kt. [123] pranešė, kad 9 skirtingų žinduolių ir paukščių kraujas buvo netinkamas, o tik 33 % lervų lėliukė. Ankstyvieji gyvenimo tarpsniai priklauso nuo pagrindinių mitybos komponentų, todėl daugiau laiko praleidžia tuose maisto produktuose. Lervos daugiausia laiko praleisdavo pleistre su suaugusių išmatų krauju ir blusų kiaušinėliais [124]. Purškiant išdžiovintas galvijų kraujas buvo patenkinama laboratorinė dieta kačių blusų lervoms [125]. Tik 13,3 % lervų išsivystė suaugusiems šeriant blusų išmatomis, palyginti su 90 %, kai šeriami blusų išmatomis ir negyvybingais blusų kiaušinėliais. Tačiau lervos išsivystė ne vien ant blusų kiaušinėlių [126]. Visi iš C. felis lervos, kurios maitinosi suaugusių išmatų medžiagomis ir šaldytais kačių blusų kiaušinėliais, išsivystė į suaugusius gyvūnus, o tik 6,6 % išmatų krauju besimaitinančių suaugusiųjų išsivystė. Lervos sunaudojo 㸠 blusų kiaušinėlių, kad išsivystytų į suaugusius. Tai gali būti populiaciją reguliuojantis veiksnys [127]. Tarp mielių vartojimo ir kokonų susidarymo yra tiesioginis teigiamas ryšys [128]. Tik 3-ioji instaliacija valgė kiaušinius, o visi instaliatoriai valgė mieles. Nuogas lėliukes suvalgė 3 stadijos lervos, o kokonuose esančios lėliukės buvo apsaugotos nuo grobuonių. Tokie substratai kaip kilimas apsaugo lervas nuo kanibalizmo ir padidina jų galimybes sėkmingai vystytis suaugusiems. Be specifinių maistinių medžiagų, vystymuisi labai svarbi santykinė oro drėgmė. Lervos aktyviai pasisavina vandenį, kai RH > 53%. Prieš lėliukės aktyviai įsisavina vandenį, kai santykinis drėgnumas yra nuo 75 iki 93%. Lėlės ir suaugusieji aktyviai nesiima vandens iš atmosferos [129].

Lervos išgyveno lauke Floridos šiaurinėje dalyje ištisus metus. Nuo rugsėjo iki lapkričio išgyvenamumas siekė net 84,6%. Birželio ir liepos mėnesiais kiaušinėliai suaugdavo per 20� dienas, o žiemą tai užtruko 36� dienų. Nebrendusios stadijos išgyveno šalčius saugomose mikrobuveinėse [130]. Patinų lėliukės ir lėliukės vystosi maždaug 20 % lėčiau nei patelės [130 131]. Esant 15,5 ଌ temperatūrai, kai kurie suaugusieji atsiranda praėjus 155 dienoms po kiaušinėlio nusėdimo [131], o tai aiškiai parodo lėliukės ir iš anksto atsiradusio suaugusio amžiaus svarbą išgyvenant nepalankiomis sąlygomis.

Bėgant metams IPM specialistams buvo įdomu sukurti modelius, kurie galėtų numatyti blusų sezonų pradžią. Meteorologinis modelis buvo sukurtas siekiant pateikti savaitės aktyvumo indeksą ir kaupiamojo aktyvumo indeksą per 12 savaičių. Kuriant modelį buvo atsižvelgta tik į blusų aktyvumą lauke [132]. Laikant šunį patalpoje ar galvijus, padaugėjo kačių blusų, užfiksuotų lipniose kortelėse ant namų Yunnan provincijos (Kinija) grindų, paplitimo ir taip paveikė jų modelį [133].

C. felis Žinoma, kad yra daug endosimbiontų, tačiau jų vaidmuo iš esmės nežinomas. Australijoje, C. felis turėjo mažesnę bakterijų įvairovę nei vietiniai Echidnofaga blusų rūšys [67]. Abiejose rūšyse dominavo endosimbiontas Volbachija. Volbachija įvairios blusų rūšys skiriasi, o praktinės pasekmės nežinomos [134]. Žarnyno gregarinas, Steinima ctenocephali, neturėjo įtakos blusų atsiradimo dažniui ar išgyvenimui. Blusų lervos su gregarinu vystėsi greičiau nei be jų [135]. Triponsomatitas Leptomonas ctenocephali buvo rasta suaugusių kačių blusų virškinamajame trakte, tačiau jos gebėjimas būti patogeniškas blusoms arba šeimininkams dar nenustatytas [136].


Trijų Brassicaceae rūšių konvergencinio prisitaikymo prie Alpių aplinkos genominiai parašai

Jau seniai buvo diskutuojama, kokiu mastu giminingos rūšys sukuria panašius genetinius mechanizmus, kad prisitaikytų prie panašios aplinkos. Daugumoje tyrimų, kuriuose dokumentuojama tokia konvergencija, buvo naudojamos skirtingos rūšys arba buvo tiriama tik ribota genomo dalis. Čia mes ištyrėme, ar panašūs ar skirtingi ortologinių genų rinkiniai buvo susiję su trijų susijusių augalų rūšių natūralių populiacijų genetiniu prisitaikymu prie panašių aplinkos gradientų Alpėse. Naudojome viso genomo sujungtą populiacijos seką, kad ištirtume genomo masto SNP variacijas 18 natūralių trijų Brassicaceae (Arabis alpina, Arabidopsis halleri ir Cardamine resedifolia) populiacijų iš Šveicarijos Alpių. Pirmiausia de novo surinkome visų trijų rūšių etaloninių genomų projektą. Tada atlikome populiacijos ir kraštovaizdžio genomines analizes

3 milijonai SNP kiekvienai rūšiai, siekiant ieškoti bendrų genominių atrankos ir prisitaikymo parašų, reaguojant į panašius aplinkos gradientus, veikiančius šias rūšis. Genų, turinčių konvergencinio prisitaikymo požymį, buvo rasta daug daugiau, nei tikėtasi atsitiktinai. Labiausiai susijusių rūšių pora parodė didžiausią santykinį per daug bendrų prisitaikymo parašų. Be to, nustatyti konvergencinio prisitaikymo genai buvo praturtinti nesinoniminėmis mutacijomis, o tai rodo šių genų funkcinę svarbą, nors daugelis nustatytų genų kandidatų turi iki šiol nežinomas arba prastai aprašytas funkcijas, pagrįstus palyginimu su Arabidopsis thaliana. Darome išvadą, kad giminingų rūšių prisitaikymą prie nevienalytės Alpių aplinkos iš dalies lemia konvergentinė evoliucija, tačiau dauguma genominių prisitaikymo požymių išlieka specifiniai rūšiai.

Raktiniai žodžiai: Alpių aplinkos Brassicaceae prisitaikymo aplinkos asociacijos genomo surinkimo genomo skenavimas.

© 2020 John Wiley & Sons Ltd.

Figūros

Studijų sistema. a ) Trys tiriamos rūšys iš Brassicaceae šeimos. Iš kairės…

Bendri pritaikymo parašai…

Bendri adaptacijos parašai Bayescan pašalinių genų genuose. Rodomas skaičius…

Bendri pritaikymo parašai…

Bendri genų, susijusių su aplinkos veiksniais, adaptacijos parašai. Kiekvienai aplinkai…


3 metodai

3.1 Pelės

Visos eksperimentuose naudotos pelės buvo auginamos Australijos BioResources (Moss Vale, NSW, Australija) ir laikomos Garvano medicinos tyrimų institute konkrečioje patogenų neturinčioje aplinkoje. Garvano gyvūnų etikos komitetas patvirtino visus pelių protokolus ir procedūras.

C57BL/6 (WT) pelės buvo įsigytos iš Australijos BioResources. Generuoti Lrba -/- pelėms, vienos krypties RNR su seka 5'-TTAACTGAGTTGCGGTCACA TGG -3' (PAM pabraukta) buvo mikroinjektuota kartu su Cas9 mRNR į C57BL/6 zigotas. Keturios iš gautų pelių įkūrėjų buvo homozigotinės dėl 8 bp delecijos, pašalinančios Chr3:86445 392–86 445 399 (Sukurkite GRCm38) LRBA alelio 37 egzone.

HyHEL10-transgeninis (SWHEL) pelės buvo aprašytos anksčiau. 45 Šios pelės turi vieną egzempliorių VH10 anti-HEL sunkiosios grandinės kintamo regiono, koduojančio egzono, nukreipto į endogeninį IgH alelį, ir daugybe V kopijųH10-κ anti-HEL lengvosios grandinės transgenas. SWHEL pelėms buvo naudojamas CD45.1 įgimtas (Ptprc a/a ) C57BL6 fonas. Eksperimentams, kuriuose SWHEL ląstelės buvo perkeltos į peles, kurioms trūksta LRBA, SWHEL pelės buvo sukryžmintos Rag1- išmuštos pelės 46, kad būtų išvengta endogeninių Igh arba Igk genų pertvarkymas, kad visos besivystančios B ląstelės išreiškė HyHEL10. Tai užtikrino, kad ne lrba Šiems eksperimentams +/+ T ląstelės buvo perkeltos į peles, kurioms trūksta LRBA.

Be to, SWHEL pelės buvo sukryžmintos lrba −/− pelėms, kad sukurtų HyHEL10 transgenines B ląsteles, kurių trūksta Lrba.

Visoms eksperimentinėms intervencijoms kiekvienoje eksperimentinėje grupėje buvo naudojami abiejų lyčių gyvūnai, kurie buvo suderinti pagal patinų ir patelių skaičių tiriamosiose ir kontrolinėse grupėse. Gyvūnai buvo neįtraukti, jei prieš įdarbinimą jie parodė kokių nors klinikinių nukrypimų nuo įprastinės fizinės apžiūros.

3.2 Kaulų čiulpų chimeros ir SRBC imunizacija

Gavėjas C57BL/6 Rag1 −/− 8–12 savaičių pelės buvo apšvitintos 425 cGy naudojant X-RAD 320 biologinį švitintuvą (Precision X-Ray, North Branford, CT, JAV). Donoro kaulų čiulpai buvo aspiruoti iš šlaunikaulio, žastikaulio ir blauzdikaulio į B ląstelių terpę, kurioje buvo RPMI (Gibco, Carlsbad, CA, JAV) su 10% termiškai inaktyvuoto veršelio vaisiaus serumo (Gibco), 2 mml glutamino ir 100 V/ml penicilino. RPMI laikmena („Gibco“). Praėjus 15 val. po švitinimo, pelėms recipientėms buvo persodinta į veną 5–10 × 106 kaulų čiulpų ląstelių, kurių 50 % buvo CD45.1 kongeninių C57BL/6 pelių ir 50 % C57BL6 (CD45.2) mišinio. pelės, kurios buvo arba Lrba −/− arba Lrba +/+ .

Nemanipuliuotos 8 savaičių amžiaus pelės ir kaulų čiulpų chimeros praėjus 8 savaitėms po čiulpų transplantacijos buvo imunizuotos 2 × 108 SRBC, leidžiamais į veną.

3.3 Rekombinantiniai HEL baltymai

Rekombinantiniai HEL 3X buvo pagaminti kaip išskiriami baltymai Pichia pastoris mielės (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) ir išgrynintos iš kultūros supernatantų jonų mainų chromatografija, kaip aprašyta anksčiau. 26, 27, 45 Baltymai buvo laikomi fosfatiniu buferiniu tirpalu 1–2,5 mg ml–1 esant –80 °C. Prieš naudojimą mėginiai buvo atšildyti ir laikomi 4 °C temperatūroje ne ilgiau kaip 8 mėnesius. Atšildymo metu baltymų koncentracijos buvo nustatytos spektrofotometrija esant 280 nm.

3.4 SRBC konjugacija ir perkėlimas

HEL baltymai buvo nudruskinti į konjugacijos buferį (distiliuotas vanduo su 0,35 m d-manitolio (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV) ir 0,01 m natrio chlorido (Sigma)). Šiam procesui PD-10 kolonėlės (Amersham, Piscataway, NJ, JAV) buvo subalansuotos su 30 ml konjugacijos buferio. Į kiekvieną kolonėlę buvo įdėta šimtas mikrogramų baltymų ir stumiamas per kolonėlę, naudojant 2,5 ml konjugacijos buferio. Baltymų eliuavimui buvo pridėta 3,5 ml konjugacijos buferio ir HEL baltymas buvo surinktas frakcijomis tokiais tūriais: 250, 1000, 250, 250 ir 250 μl. Kiekvienos frakcijos baltymų koncentracija buvo nustatyta spektrofotometrija.

Konjugacijai SRBC buvo plaunami 30 ml fosfatiniu buferiniu tirpalu 6–8 × 109 ląstelėms, o po to vieną kartą konjugacijos buferyje. Tada SRBC buvo resuspenduojami galutiniame 1000 μl konjugacijos buferio tūryje 50 ml Falcon mėgintuvėlyje, kuriame yra 10 μg ml -1 HEL 3X. Tirpalas buvo maišomas ant platformos svirties ant ledo 10 min. Šimtas mikrolitrų 100 mg ml –1 N-(3-dimetilaminopropil)-NTada buvo pridėta -etilkarbodimido hidrochlorido (Sigma) ir tirpalas maišomas dar 30 minučių ant ledo. Sėkminga konjugacija buvo patvirtinta atliekant SRBC srauto citometrinę analizę, naudojant AlexaFluor 647 konjuguotą HyHEL9 antikūną (sukurtą namuose).

3 × 10 4 SW pervedimai į venąHEL B ląstelės vienai pelei gavėjai kartu su 2 × 108 HEL 3X SRBC, kaip aprašyta anksčiau. 26

3.5 Hematologija ir tėkmės citometrija

Raudonųjų kraujo kūnelių ir trombocitų skaičius buvo nustatytas kraujyje, surinktame iš uodegos venos į EDTA (Sarstedt, Šiaurės Reinas-Vestfalija, Nümbrecht, Vokietija) mėgintuvėlius ir analizuojamas Sysmex XT-2000iV automatiniu hematologijos analizatoriumi, Kobe, Hyōgo prefecture, Japonija.

On the day of harvest organs were collected into B-cell medium, cell suspensions passed through a 70 μm cell strainer (Falcon, Corning, NY, USA). Fc receptors were blocked with unlabelled anti-CD16/32 (eBioscience, San Diego, CA, USA) before staining. To detect HEL 3X -binding cells, cells were stained with 200 ng ml −1 HEL 3X , followed by AlexaFluor 647-conjugated HyHEL9.

Anti-IgG1-FITC (BD Pharminigen, San Diego, CA, USA) stains were followed by 5% mouse serum before staining for other surface molecules. CD4-BV786 (BD Pharminigen), CD8-APCCy7 (BD Pharminigen), CD62L-PerCPCy5.5 (BD Pharminigen) CD44-FITC (BD Pharminigen) and CD25-PE (BD Pharminigen) were used as surface stains. For the intracellular stains, CTLA-4-APC (eBioscience) and FOXP3-EF450 (eBioscience) cells were first permeabilised using FOXP3 Staining Permeabilisation Kit (eBioscience) according to the manufacturer's instructions. Cells were filtered using 35 μm filter round-bottom FACS tubes (BD Pharminigen) immediately before data acquisition on an LSR II analyser (BD Pharminigen).

Cytometer files were analysed with the FlowJo Software (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

3.6 Single-cell FACS sorting

Cell suspensions were prepared and GC B cells were identified using flow cytometry. Single-cell sorting into 96-well plates (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA) was performed on the FACSAria or FACSAriaIII (BD Pharminigen). B cells from each mouse were analysed individually to ensure that over-representation of one particular clone did not affect the mutation analysis. The VDJH exon of the Hy10 heavy-chain gene was amplified from genomic DNA by PCR, sequenced and analysed as described previously. 27

3.7 Enzyme-linked immunosorbent assay

High-binding plates (Corning, NY, USA) were coated with the indicated Ig isotypes at 5 μg ml −1 (IgG2b (BD Pharminigen), clone: R9-91 IgA (BD Pharminigen), clone: C10-3 IgG1 (BD Pharminigen), clone: A85-1 IgM (BD Pharminigen), clone: 11/41 IgG3 (BD Pharminigen), clone: R2-38 IgG2a(b) (BD Pharminigen), clone: R11-89 IgE (BD Pharminigen), clone: R35-72). Bound serum antibody was quantified using Igκ (BD Pharminigen). Antibody levels were quantified against isotype-specific standards (IgG2b BD, IgA BD, IgG1 BD, IgM BD, IgG3 BD, IgG2a(b) (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) and IgE (BioLegend, San Diego, CA, USA)).

3.8 Viral infection

Mice were infected intravenously with 2 × 10 6 plaque-forming units of LCMV clone 13. T-cell stimulation with LCMV peptide, tetramer staining, surface staining and intracellular cytokine staining were performed as described previously. 47 , 48 , 49 MHC I LCMV tetramers were purchased from the Biomolecular Resource Facility, JCSMR, ANU, ACT, Australia, while the MHC II LCMV GP66–77 tetramer was obtained from the NIH Tetramer Core Facility (Emory University, Atlanta, GA, USA).

3.9 Statistical analysis

GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) was used for data analysis. When the data were normally distributed, two-tailed Student's t-test was performed for analysis. Welch's correction was used if variances were not equal. For all tests P<0.05 was considered as being statistically significant. In all graphs presented error bars indicate mean and standard distribution. *P& lt0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and ****P<0.0001.

3.10 ACKNOWLEDGMENTS

We thank the Garvan Institute ABR, GMG and Flow Cytometry facilities for expert animal husbandry, genotyping and cell sorting. This work was supported by NHMRC Project Grant 1108800, NHMRC Program Grants 1016953 and 1113904, NIH Grant U19 AI100627 and NHMRC Fellowship 1081858, and by the Ritchie Family Foundation.

Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.

LRBA deficiency decreases CTLA-4 on CD4 effector/memory and Tregs. Flow cytometric analysis of spleen cells from age- and sex-matched Lrba −/− (blue) or WT (red) mice at 6 (n=6) or 26 weeks (n=4) of age. (ac) CTLA-4 expression on CD4 memory/effector T cells. (a) Representative flow cytometry plots of permeabilised CD4 + FOXP3 − cells from 6-week-old mice showing % CTLA-4 + CD44 hi cells and histograms of CTLA-4 in the CD4 + CD44 hi CTLA-4 + population in 6- and 26-week- old mice. Lrba +/− are indicated in pale blue. Graphs show (b) the number of CTLA-4 + CD4 + CD44 hi FOXP3 − cells and (c) CTLA-4 mean fluorescence intensity (MFI) in individual mice and arithmetic mean for each genotype and age group. (dg) CTLA-4 expression on CD4 + Treg cells. (d) Representative plots of permeabilised CD4 + cells showing the % FOXP3 + Treg cells in 6-week-old mice. Representative Treg histograms and MFI for: (e) CTLA-4 (f) FOXP3 (g) CD25. Statistical analysis was carried out using t-test: *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 ****P<0.0001. Data are representative of one experiment.

Absence of immune dysregulation disease in LRBA-deficient mice. (af) Analysis of sex-matched WT (red) and Lrba −/− (blue) mice at 6 weeks of age, showing individual results and means for each group. (ac) Flow cytometric analysis of spleen, showing the numbers of: (a) CD4 + or CD8 + T-cell subsets of central memory (CD62L + CD44 + ), effector memory (CD62L − CD44 + ), naïve (CD62L + CD44 − ) or Tregs (CD4 + FOXP3 + ). (b) B cells (B220 + ) and subsets of transitional 1 (T1, B220 + CD93 + CD23 − ), transitional 2 and 3 (B220 + CD93 + CD23 + ), marginal zone (B220 + CD21 + CD23 − ), mature follicular (B220 + CD93 − CD23 + ) and B-1 (B220 − CD19 + ) B cells per spleen. (c) neutrophils (B220 − MHC II − Ly6G + CD11b + ) and NK lymphocytes (B220 − CD8 − MHC II − NK1.1 + ). (d) CD86 mean fluorescence intensity (MFI) on marginal zone and follicular B cells. (e) Flow cytometric analysis of bone marrow, showing % of lymphocytes that are pro-B cells (B220 + CD43 int ), pre-B cells (B220 + CD43 − IgM − ), immature B cells (B220 int CD43 − IgM + IgD − ), transitional B cells (B220 hi CD43 − IgM + CD24 + IgD lo ) and mature B cells (B220 hi CD43 − IgM + CD24 − IgD + ). (f) Flow cytometric analysis of thymus, showing number of CD8 − CD4 − double-negative (DN), double-positive (DP), CD8 + or CD4 + single-positive, or CD4 + FoxP3 + Treg cells. N=6 per group. Data are representative of one experiment. (g) Titres of IgG2b, IgA, IgG1, IgM, IgG3 Ig2Ga(b) and IgE antibodies in the serum of unimmunised mice, determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). N=10 per group. Representative of two comparable experiments. Statistical analysis was carried out using t-test: **P<0,01.

Decreased peritoneal B-1 B cells in LRBA-deficient mice. Flow cytometric analysis of peritoneal cavity lymphocytes from sex-matched WT (red) and Lrba −/− (blue) mice at 6 (n=6) or 26 (n=4) weeks of age, showing individual results and means for each group. (a ir b) Percentage of lymphocytes that are T cells (B220 − IgM − CD23 − CD5 + ), B-2 cells (CD19 − B220 hi ), B-1 cells (CD19 + B220 lo IgM + CD23 − ), B-1a cells (CD19 + B220 lo IgM + CD23 − CD5 + ) and B-1b cells (CD19 + B220 lo IgM + CD23 − CD5 − ). (c ir d) Representative flow cytometric plots showing gating IgM, CD23, B220 and CD19 staining for B-1 and B-2 cells and representative CD5 histograms of B-1 cells showing gates on CD5+ B-1a and CD5- B-1b cells from mice at 6 (c) and 26 (d) weeks of age. Statistical analysis was carried out using t-test: *P<0.05 **P<0,01. Data are representative of one experiment.

Cell-autonomous loss of CTLA-4 on LRBA-deficient T cells in bone marrow chimeras. Irradiated Rag1 −/− recipient mice were transplanted with a bone marrow mixture comprising 50% CD45.1 + Lrba +/+ cells and 50% CD45.2 + cells that were either Lrba −/− arba Lrba +/+ (WT). One hundred percent CD45.2 + Lrba −/− arba Lrba +/+ (WT) marrow was transplanted into a parallel group of Rag1 −/− recipients. At 8 weeks after transplantation, the chimeric mice were immunised with SRBCs three times 3 days apart and blood was analysed by flow cytometry 62 days after the first immunisation. Lines connect paired values for CD45.1 and CD45.2 cells in individual chimeric mice. (a) Percentage of CD45.2 + Lrba −/− (blue) or Lrba +/+ (WT, red) cells among the indicated lymphocyte subsets in individual mixed chimeric mice and arithmetic means: B cells (B220 + ), T cells (CD3 + ), CD4 + T cells, effector CD4 + T cells (CD25 + , CD44 hi ), CD8 + T cells, effector CD8 + T cells (CD25 + , CD44 hi ) and Tregs (CD4 + FOXP3 + ). (be) Analysis of CD4 + FOXP3 − cells. (b) Representative plots of intracellular CTLA-4 and CD44 gated on CD45.1 + (WT) or CD45.2 + (WT or Lrba −/− ) CD4 + FOXP3 − cells. (ce) Analysis of CTLA4 + CD44 + CD4 + FOXP3 − cells, showing: (c) percentage among the CD45.1 + or CD45.2 + subsets of total T cells (d) representative CTLA-4 histograms (e) CTLA-4 MFI values. Dotted lines represent CD45.2+ (Lrba +/+ or Lrba −/− ) cells in mixed chimeras solid lines represent equivalent cells in 100% Lrba +/+ or Lrba −/− chimeras. (fj) Analysis of CD4 + FOXP3 + cells. (f) Representative flow cytometric plots of CD45.2 + CD4 + cells, showing % Tregs. (g) CTLA-4 MFI values for each chimeric mouse. (h) Representative intracellular CTLA-4 histograms. (i) Representative intracellular FOXP3 histograms. (j) Representative CD25 histograms. Statistical analysis was carried out using t-test between mice or paired t-test when cells were from the same chimeric mouse: *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 ****P<0.0001. N=5 per group. Data are representative of one experiment.

Response of LRBA-deficient mice to chronic systemic viral infection. C57BL/6 Lrba +/+ (WT) (red) or Lrba −/− mice (blue) were infected intravenously with 2 × 10 6 plaque-forming unit (PFU) LCMV clone 13 to induce chronic viral infection. At 20 days after infection, spleen cells were analysed by flow cytometry. (a) Analysis plots of spleens, showing % of lymphocytes that are CD44 hi effector/memory cells in individual mice with arithmetic means. (b ir c) Representative flow cytometric plots (b) and anlaysis plots (c) showing % of CD8 + T cells binding MHC I tetramers loaded with LCMV peptides GP33–41 or NP396–404, or the % of CD4 + cells binding MHC II tetramers fused with LCMV peptide GP66–77 in individual mice with arithmetic means. (d) Representative histograms showing TIM3 staining on NP396–404 MHC I tetramer-binding CD8 + T cells in WT and Lrba −/− mice, and MFIs in individual animals for TIM3, CD160 and PD-1. Similar trends were seen with the GP33–41 tetramer. (e) Representative LY6C staining on GP66–77 MHC II tetramer-binding CD4 + T cells, and MFI's in individual animals for LY6C, PSGL1 and PD-1. (f) IFNγ + MFI of the IFNγ + T cells (top) and % TNFα + within the IFNγ + cells. Representative IFNγ and TNFα histograms are shown for the NP396 peptide-stimulated cells. Statistical analysis was carried out using t-test: *P<0.05 **P<0,01. N=5 per group. Data are representative of one experiment. IFNγ, interferon-γ.

Normal GC formation and affinity maturation by LRBA-deficient B cells. CD45.1 congenic C57BL/6 recipient mice, with WT LRBA, were injected intravenously with 30 000 HyHEL10 + SWHEL spleen B cells from Lrba −/− arba Lrba +/+ C57BL/6 donor mice. The recipient mice were immunised two times on days 0 and 4 after B-cell transfer with HEL 3X -SRBC, or unconjugated SRBC for a control group of recipients, and spleen cells were analysed by flow cytometry, sorting and single-cell Igh sequencing on day 15. (a) Total Fas hi CD38 − B220 + GC B cells per spleen of individual mice, and arithmetic mean for each group. (b) Donor-derived HyHEL10 + CD45.2 + CD45.1 − GC B cells per spleen. (c) Affinity-matured cells, measured as % donor-derived GC B cells stained brightly with 200 ng/ml HEL 3X . (d) IgG1-switched cells, measured as % of donor-derived GC B cells. (e) Light-zone CD86 + CXCR4 − GC B cells, measured as % of donor-derived GC B cells. (f) CD86 MFI on donor-derived GC B cells. (g) Number of VDJH amino-acid changing or silent nucleotide substitutions per donor-derived GC B cell. (h) Percentage of donor-derived GC B cells with affinity-increasing VDJH mutations S31R, Y53D or Y58F. (i) Percentage of donor-derived GC B cells with substitutions at each VDJH amino-acid position. (j) Co-occurrence of S31R, Y53D and Y58F mutations (rows) in individual cells (columns) sorted from separate recipient mice (boxes). Data are pooled from two independent experiments with comparable results. N=9 mice per HEL 3X -immunised group and four unconjugated controls. Statistical analysis was carried out using t-test: *P<0,05.

Normal GC formation and affinity maturation by LRBA WT B cells in LRBA-deficient recipients. The 30 000 HyHEL10 + SWHEL B cells from Rag1 −/− CD45.1 congenic mice, with WT LRBA, were injected into the circulation of Lrba −/− (n=13, blue symbols) or Lrba +/+ (n=13, red symbols) C57BL/6 recipient mice, so that all T- and B-cell specificities other than the HyHEL10 + B cells were derived from the recipient mice. The recipient mice were immunised two times with HEL 3X -SRBC on days 0 and 4 after B-cell transfer, or unconjugated SRBC for a control group of recipients, and spleen cells analysed by flow cytometry, sorting and single-cell Igh sequencing on day 15. (a) Total Fas hi CD38 − B220 + GC B cells per spleen of individual mice, and arithmetic mean for each group. (b) Donor-derived HyHEL10 + CD45.2 − CD45.1 + GC B cells per spleen. (c) IgG1-switched cells, measured as % of donor-derived GC B cells. (d ir e) Relative cell surface of CD86 MFI on (d) all B220 + B cells or (e) donor-derived GC B cells, normalised to mean of Lrba +/+ recipient group in each experiment. (f) Representative plots of donor-derived GC B cells, and gates on light-zone (LZ, CD86 hi CXCR4 lo ) and dark-zone (CD86 lo CXCR4 hi ) GC cells. (g) Relative cell surface CD86 MFI on LZ donor-derived GC B cells, normalised to mean of Lrba +/+ recipient group in each experiment. (h) Number of VDJH amino-acid changing or silent nucleotide substitutions per donor-derived GC B cell. (i) Percentage of donor-derived GC B cells with substitutions at each VDJH amino-acid position. (j) Percentage of donor-derived GC B cells with affinity-increasing VDJH mutations S31R, Y53D or Y58F. (k) Co-occurrence of S31R, Y53D and Y58F mutations (rows) in individual cells (columns) sorted from separate recipient mice (boxes). Data are pooled from two independent experiments with comparable results. Statistical analysis was carried out using t-test: **P<0.01 ***P<0.001.

Failo pavadinimas apibūdinimas
imcb201750-sup-0001.jpgapplication/jpeg, 144.6 KB Supplementary Figure S1
imcb201750-sup-0002.jpgapplication/jpeg, 240.9 KB Supplementary Figure S2
imcb201750-sup-0003.jpgapplication/jpeg, 206.7 KB Supplementary Figure S3
imcb201750-sup-0004.jpgapplication/jpeg, 159.3 KB Supplementary Figure S4
imcb201750-sup-0005.jpgapplication/jpeg, 105.8 KB Supplementary Figure S5
imcb201750-sup-0006.docxapplication/docx, 21.5 KB Supplementary Figure Legends

Atkreipkite dėmesį: leidėjas nėra atsakingas už bet kokios autorių pateiktos pagalbinės informacijos turinį ar funkcionalumą. Visos užklausos (išskyrus trūkstamą turinį) turi būti nukreiptos į atitinkamą straipsnio autorių.


Žiūrėti video įrašą: Paskaita. Moderni klasikinė genetika I (Sausis 2023).