Informacija

Kiek specifiniai yra CRISPR-cas9 pjūviai?

Kiek specifiniai yra CRISPR-cas9 pjūviai?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

CRISPR-cas9 naudoja RNR eilutę, kuri sutampa su DNR ir tuo metu padaro dvigubą pjūvį.

Jei RNR yra vos kelių raidžių ilgio, fermentas daugelyje vietų supjaustytų DNR. Tai būtų nekonkretu. Bet jei galite padaryti RNR eilutę labai ilgą, ji nutrūktų tik toje vietoje, kur norite nupjauti.

Taigi, kiek laiko galite sudaryti RNR sekas? Ir ar to pakanka, kad išvengtumėte netyčinių pjūvių?


Dažnai aptariama CRISPR/Cas nukrypimų nuo tikslų problema. Buvo parodyta, kad sistema leidžia nesutapimus iki penkių bazinių porų. Jūsų klausimui, ar naudinga pailginti gRNR: buvo įrodyta, kad RNR sutrumpinimas labiau padidina specifiškumą nei pailgėjimas (taip pat žr. čia).

Taigi, ką mes galime padaryti? Na, yra įvairių metodų, kaip pagerinti specifiškumą. Paprasčiausia gali būti mažesnės CRISPR/Cas sistemos dozės. Kitas būdas – naudoti pakeistus PAM motyvus.

Sudėtingesnis būdas yra konvertuoti Cas9 į nickase. Pagal šią strategiją naudotumėte dvi skirtingas gRNR dviem skirtingoms tikslinėms vietoms ir įvestumėte ss pertraukas. Šio metodo modifikacija yra visiškai panaikinti Cas9 fermentinį aktyvumą ir sujungti jį su FokI nukleaze, kuri supjaustys DNR tik tada, kai ji dimerizuojasi.

Šie metodai turi keletą privalumų, tačiau taip pat galite prarasti tikslinį poveikį.

Yra dar vienas metodas, kuris, mano nuomone, yra tikrai nuostabus. Galima pakeisti DNR surišimo vietos energiją, todėl gaunami didelio tikslumo Cas9 variantai (HF1 ir HF2)

Taigi, tikiuosi, kad galėjau jums padėti. Yra ir kitų ir dar efektyvesnių būdų, kaip padidinti CRISPR/Cas specifiškumą, o ne keisti gRNR. Jei susidomėjote, pažiūrėkite į nuorodas.


CRISPR / Cas9 vietai būdingos funkcijos įvertinimas ir sgRNR sekos patvirtinimas naudojant Cas9 / sgRNR padedamą atvirkštinio PGR metodą

Veiksmingą grupinės reguliariai tarpais esančios trumpo palindrominio kartojimo (CRISPR) / Cas9 sistemos taikymą biologijoje, medicinoje ir kitose srityse trukdo netikslinis Cas9-sgRNR poveikis ir lokusinis afinitetas, ypač genomo mastu. Siekdami pašalinti netikslinio poveikio pasireiškimą ir įvertinti lokuso afinitetą atitinkamai CRISPR / Cas9 vietiniam aptikimui ir didelio afiniteto sgRNR sekų atrankai, mes sukuriame CRISPR / Cas9 palaikomą atvirkštinio PGR metodą, skirtą konkrečiai vietai. aptikimas ir sgRNR sekos patvirtinimas. PGR pagrįstas aptikimo metodas gali būti naudojamas tiesiogiai laboratorijoje su PGR reakcijos sąlygomis, nereikalaujant papildomos aptikimo sistemos, o visas aptikimo procesas gali būti baigtas per 2 val. Todėl jį galima nesunkiai išpopuliarinti naudojant PGR instrumentą. Galiausiai, šis metodas yra visiškai patikrintas aptikus kelias vietos mutacijų formas ir įvertinus įvairių sgRNR sekų afinitetą CRISPR / Cas9 sistemai. Apibendrinant, tai yra veiksmingas naujas analizės įrankis, skirtas su CRISPR / Cas9 genomo redagavimu susijusiems tyrimams. Buvo sukurtas CRISPR / Cas9 padedamas atvirkštinės PGR metodas, skirtas Cas9 / sgRNR vietai aptikti ir sgRNR sekos patvirtinimui. Metodas aptinka tikslinę DNR trimis etapais: (1) tikslinė DNR yra specialiai supjaustoma Cas9/sgRNR kompleksų pora (2) suskaldyta DNR greitai sujungiama T4 DNR ligaze (3) liguota DNR efektyviai amplifikuojama PGR ( PGR arba qPCR).

Raktiniai žodžiai: CRISPR/Cas9 Konkrečios vietos aptikimo sgRNR patvirtinimas.

Interesų konflikto pareiškimas

Autoriai pareiškia, kad neturi interesų konflikto.

Figūros

Sukurtas CRISPR/Cas9 palaikomas atvirkštinio PGR metodas…

CRISPR / Cas9 padedamas atvirkštinio PGR metodas buvo sukurtas Cas9 / sgRNR vietos aptikimui ir sgRNR sekos patvirtinimui.…

Scheminė CARP aptikimo iliustracija

Scheminė CARP aptikimo iliustracija

Vienos bazės mutacijos CARP aptikimas…

Vienbazės mutacijos (PGR) CARP aptikimas. a Nustatant CARP gebėjimą…

Vienos bazės mutacijos CARP aptikimas…

CARP vienos bazės mutacijos (qPCR) aptikimas (klaidų juostos rodo technines kopijas ir…

Cas9-sgRNR vieno nukleotido specifiškumo aptikimas…

Cas9-sgRNR vieno nukleotido specifiškumo aptikimas naudojant qPCR pagrįstą CARP. a Detali bendrojo naudojimo vieta…

SgRNR vieno nukleotido specifiškumo įvertinimas…

SgRNR vieno nukleotido specifiškumo įvertinimas naudojant qPCR pagrįstą CARP. a Detali vienos bazės vieta…

Tyrinėjant skirtingų…

Vienu metu tiriamas skirtingų sgRNR poveikis skilimo efektyvumui. a qPCR logaritminis…


CRISPR funkcija ir mechanizmas prokariotuose

CRISPR suteikia prokariotams įgytą imunitetą nuo invazinių genetinių elementų. Šie lokusai apima genetinę medžiagą iš virusų ir plazmidžių ir naudoja ją svetimiems genetiniams elementams nukreipti specifiniu sekos būdu. Apsauga nuo svetimų genetinių elementų naudojant CRISPR/Cas sistemą yra tarpinės DNR gavimas iš invazinio viruso, CRISPR RNR (crRNR) biogenezė, kuri leis atpažinti svetimą DNR, ir trukdžiai, kurių metu invazinė DNR. yra atpažįstamas ir suskaldytas.

Tarpinės DNR įsigijimas

Kai į prokariotinę ląstelę įsiveržia virusas, viruso DNR dalys paimamos ir įtraukiamos į CRISPR lokuso tarpines sritis. Nukleazės fermentai Cas1 ir Cas2 dalyvauja E. coli ir tikriausiai visose CRISPR/Cas sistemose tarpiklių gavime, nes jie yra vieninteliai Cas baltymai, konservuoti visose sistemose. DNR, kuri paimama ir įtraukta į CRISPR lokusus kaip tarpikliai, gali būti šalia protospacer gretimų motyvų (PAM) viruso genomo viduje. PAM yra svarbios atrenkant svetimas nukleorūgštis I ir II tipo sistemose. Tarpikliai paprastai pridedami šalia pirmaujančios sekos, nors naujas tarpiklis taip pat gali būti atsitiktinai įterptas į kartotinių tarpiklių masyvą.

CrRNR biogenezė

Interferencijos stadijoje crRNR asocijuojasi su Cas baltymais ir sudaro kompleksą, kuris atpažįsta, nukreipia ir sunaikina viruso genetinę medžiagą. crRNR bazinės poros su komplementaria viruso DNR seka žymi ją sunaikinimui. PAM sekos atpažinimas taip pat gali būti reikalingas svetimos DNR atpažinimui. II tipo sistemose Cas9 atlieka trukdžių žingsnį naudodamas ir crRNR, ir tracrRNR, leidžiančias atpažinti svetimą DNR. Cas9 ne tik atpažįsta tikslines sekas, bet ir turi endonukleazės aktyvumą ir skaido svetimą DNR.


Paveiksle pavaizduota, kaip CRISPR/Cas sistema apsisaugo nuo svetimų genetinių elementų prokariotuose.


CRISPR-Cas9 taip pat gali sumažinti RNR

Würzburg mokslininkai išsiaiškino, kad vadinamosios Cas9 DNR žirklės iš Campylobacter taip pat gali lengvai nukreipti RNR. Iš kairės: prof. dr. Cynthia Sharma, Sara Eisenbart, Thorsten Bischler, Belinda Aul iš Molekulinės infekcijos biologijos instituto (IMIB) ir prof. dr. Chase'as Beiselis iš Helmholtzo RNR pagrįstų infekcijų tyrimų instituto (HIRI) Würzburge. Kreditas: Hilde Merkert, IMIB

Galimybė redaguoti genus savo nuožiūra, nepaisant genetinių ligų panaikinimo ar maistinių ir energetinių augalų gerinimo, išgyvena revoliuciją. Jį varo CRISPR-Cas9 – technologija, sukurta pagal bakterijose randamą ląstelių mechanizmą. CRISPR-Cas9 atpažįsta ir supjausto svetimą genominę medžiagą nuo įsiveržusių virusų ir taip apsaugo bakterijas nuo užkrėtimo.

Cas9 baltymas veikia kaip žirklės, o kitos sistemos dalys nukreipia Cas9 į pjaunamas DNR dalis. Mokslininkai panaudojo šias molekulines žirkles kartu su dirbtiniais kreiptuvais, kad specifiškai modifikuotų genus ne tik bakterijose, bet ir augaluose bei gyvūnuose.

Nors žinoma, kad Cas9 žirklės pjauna DNR, mokslininkai iš Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) ir Helmholtz RNR pagrįstų infekcijų tyrimų instituto (HIRI) Vokietijoje įrodė, kad per maistą plintančios patogeno Campylobacter Cas9 baltymas. jejuni taip pat pjauna RNR.

„Baltymai taip pat gali sumažinti ribonukleino rūgštis – trumpai tariant RNR“, – sako JMU Molekulinės infekcijos biologijos instituto (IMIB) profesorė Cynthia Sharma. "Ne tik tai, bet mes nustatėme, kad taip pat galime užprogramuoti Cas9, kad būtų nukreiptos ir supjaustytos specifinės RNR molekulės."

RNR vaidina pagrindinį vaidmenį visose gyvybės formose. Pagrindinis RNR vaidmuo yra būti genominės medžiagos pasiuntiniu ląstelėje. DNR užkoduoti genai ekstrahuojami transkribuojant juos į RNR. Tada RNR tarnauja kaip šablonas šios informacijos vertimui į baltymus. Galimybė nukreipti RNR vietoj DNR išplečia Cas9 žirklių naudojimo galimybes. Galimas panaudojimas apima kontrolę, kurie genai yra aktyvuojami arba deaktyvuojami, kovą su žmogaus virusais ir greitą infekcinių agentų aptikimą.

Tyrėjai atrado šią funkciją, žiūrėdami į molekules, kurios sąveikauja su Campylobacter Cas9. Tai apėmė daugybę RNR iš ląstelės. Tolesnė analizė parodė, kad Cas9 ne tik prisijungė prie RNR, bet ir gali ją sumažinti, kaip tai daroma su DNR. Tyrėjai nustatė, kad gali būti nesunkiai nurodyta iškirpti specifines RNR.

„Išvada nustebino, nes manoma, kad Cas9 natūraliai taikosi tik į DNR“, – sako prof. Chase'as Beiselis, neseniai prisijungęs prie HIRI iš NC valstijos universiteto (JAV) ir bendradarbiaujantis su prof. Sharma įgyvendindamas projektą.

Nors mokslininkai padarė šią išvadą su Cas9 baltymu iš Campylobacter, dvi kitos tyrėjų grupės neseniai pranešė apie panašius atradimus su Cas9 iš dviejų kitų bakterijų. Tai padidina galimybę, kad šis žavus naujas atradimas gali būti bendras Cas9 baltymų bruožas gamtoje. Kitas šio tyrimo iškeltas klausimas yra tai, ar Cas9 gebėjimas nukreipti RNR turi kokių nors fiziologinių vaidmenų Campylobacter. Pavyzdžiui, kaupiasi įrodymų, kad CRISPR-Cas sistemos gali ne tik padėti kovoti su infekcijomis, bet ir natūraliai dalyvauti kontroliuojant, kurie Campylobacter genai yra įjungiami ir išjungiami. Prof. Sharma ir prof. Beiselis sutinka: „Mes ir toliau stebimės tuo, ką Cas9 gali padaryti ir kokias naujas programas bei technologijas sukuria šios įžvalgos“.


CRISPR atradimas atveria kelią naujam COVID-19 tyrimo metodui

Nauja platforma LEOPARD gali aptikti įvairius su liga susijusius biologinius žymenis tik vienu tyrimu. Kreditas: Sandy Westermann / HIRI

Dauguma įprastinės molekulinės diagnostikos paprastai nustato tik vieną su liga susijusį biomarkerį. Puikūs pavyzdžiai yra PGR testai, šiuo metu naudojami diagnozuoti COVID-19, nustatant konkrečią SARS-CoV-2 seką. Tokie vadinamieji singleplex metodai suteikia patikimus rezultatus, nes jie kalibruojami pagal vieną biomarkerį. Tačiau norint nustatyti, ar pacientas yra užsikrėtęs nauju SARS-CoV-2 variantu ar visiškai kitu patogenu, vienu metu reikia tirti daug skirtingų biomarkerių.

Mokslininkai iš Helmholtzo RNR pagrįstų infekcijų tyrimų instituto (HIRI) ir Julius Maximilians universiteto (JMU) Viurcburge dabar atvėrė kelią visiškai naujai diagnostikos platformai su LEOPARD. Tai CRISPR pagrįstas metodas, kuris yra labai daugkartinis ir gali aptikti įvairius su liga susijusius biologinius žymenis tik vienu tyrimu.

LEOPARD, kuris reiškia „Inžinerinių tracrRNR ir tikslinių DNR panaudojimas PArallel RNR aptikimui“, yra pagrįstas atradimu, kad DNR pjaustymas naudojant Cas9 gali būti susietas su specifine ribonukleino rūgštimi (RNR). Ši nuoroda leidžia LEOPARD aptikti daug RNR vienu metu, atveriant galimybes vienu metu aptikti RNR iš virusų ir kitų patogenų paciento mėginyje.

Šiandien paskelbtas tyrimas Mokslas inicijavo Chase'as Beiselis, JMU profesorius ir HIRI tyrimų grupės vadovas, ir profesorė Cynthia Sharma iš JMU Molekulinės infekcijos biologijos instituto (IMIB). "Naudodami LEOPARD mums pavyko aptikti devynių skirtingų virusų RNR fragmentus, - sako Beiselis. "Mes taip pat sugebėjome atskirti SARS-CoV-2 ir vieną iš jo variantų paciento mėginyje, tuo pačiu patvirtindami, kad kiekvienas mėginys buvo teisingai paimtas iš kantrus“.

CRISPR-Cas9 iš esmės žinomas kaip biomolekulinis įrankis genomo redagavimui. Čia CRISPR-Cas9 veikia kaip molekulinės žirklės, pjaustančios specifines DNR sekas. Bakterijos natūraliai naudoja tas pačias žirkles, kad supjaustytų DNR, susijusią su invaziniais virusais. Nesvarbu, ar redaguojate genomus, ar pašalinate virusus, Cas9 pjovimą nukreipia vadovaujančios RNR. Bakterijose esančios pagalbinės RNR turi susieti su atskira RNR, vadinama tracrRNR. Tada RNR pora gali dirbti su Cas9, kad nukreiptų DNR pjovimą.

Netikėtas atradimas

Manoma, kad tracrRNR poruojasi tik su vadovaujančiomis RNR, gaunamomis iš antivirusinės sistemos. Tačiau Viurcburgo mokslininkai išsiaiškino, kad tracrRNR poruojasi su kitomis RNR, paversdama jas vadovaujančiomis RNR. Cynthia Sharma, IMIB II molekulinės infekcijos biologijos katedros vedėja ir JMU Infekcinių ligų tyrimų centro (ZINF) atstovė spaudai, nustebino šiuo atradimu: „Kai ieškojome RNR, prisijungiančių prie Cas9 mūsų modeliniame organizme Campylobacter, stebėtinai radome. kad ląstelėje aptikome ne tik vadovaujančias RNR, bet ir kitus RNR fragmentus, kurie atrodė kaip nukreipiančiosios RNR. TracrRNR buvo susieta su šiomis RNR, todėl atsirado „nekanoninės“ pagalbinės RNR, galinčios nukreipti DNR pjovimą naudojant Cas9.

LEOPARD diagnostikos platforma remiasi šiuo atradimu. „Mes supratome, kaip perprogramuoti tracrRNR, kad nuspręstume, kurios RNR tampa pagalbinėmis RNR“, - sako Beiselis. "Stebėdami atitinkančių DNR rinkinį, galime nustatyti, kurios RNR buvo mėginyje, remdamiesi tuo, kurios DNR buvo supjaustytos. Vykstant pandemijai LEOPARD gali leisti gydytojui išsiaiškinti, ar pacientas yra užsikrėtęs SARS-CoV. -2, jei tai unikalus variantas ir ar mėginys buvo paimtas teisingai, ar jį reikia pakartoti – visa tai atliekama vienu bandymu.

Ateityje LEOPARD našumas gali nulemti net multipleksinius PGR testus ir kitus metodus. „Ši technologija gali pakeisti medicininę diagnostiką ne tik infekcinių ligų ir atsparumo antibiotikams, bet ir vėžio bei retų genetinių ligų diagnostikoje“, – sako Oliveris Kurzai, JMU Higienos ir mikrobiologijos instituto direktorius, pateikęs pacientų mėginius tyrimui.

"Darbas pabrėžia puikų bendradarbiavimą ir tarpdisciplininius tyrimus, vykstančius čia, Viurcburge", - sako Jörg Vogel, IMIB ir HIRI, bendros JMU įstaigos su Helmholtz infekcijų tyrimų centru Braunšveige, direktorius. „LEOPARD įspūdingai parodo, kad galime aprėpti visą papildomų pažangiausių Viurcburgo tyrimų spektrą – nuo ​​RNR tyrimų pagrindų iki klinikinių pritaikymų.


Dėl paprastos technologijos CRISPR genų redagavimas yra pigesnis

Kalifornijos universiteto Berklyje mokslininkai atrado daug pigesnį ir lengvesnį būdą nukreipti į karštą naują genų redagavimo įrankį CRISPR-Cas9, kad būtų galima iškirpti arba pažymėti DNR.

Kai kurios DNR sekos genome pasirodo kelis kartus. Čia RNR kreipiamasis zondas žymi pasikartojančius regionus varlės Xenopus laevis spermos ląstelės branduolyje.

CRISPR-Cas9 technika, išrastas prieš tris metus UC Berkeley, ėmėsi genomika audra, su galimybe sklende labai tikra seka DNR ir jį atpjauti, neutralizuojant genus su be vargo. Tai labai žada tikslinę genų terapiją genetinėms ligoms gydyti ir ligų priežastims atrasti.

Šią technologiją taip pat galima pritaikyti taip, kad ji įsitvirtintų nepjaustant, paženklinant DNR fluorescenciniu zondu, leidžiančiu tyrėjams surasti ir sekti geną tarp tūkstančių gyvos besidalijančios ląstelės branduolyje.

Naujai sukurta technika dabar leidžia lengviau sukurti RNR vadovus, leidžiančius CRISPR-Cas9 taip tiksliai nukreipti DNR. Tiesą sakant, už mažiau nei 100 USD atsargų kiekvienas gali pagaminti dešimtis tūkstančių tokių tiksliai valdomų zondų, apimančių visą organizmo genomą.

Procesas, kurį jie vadina CRISPR-EATING – „Viskas, kas turima, pavertė naujais vadovais“, aprašyta žurnalo rugpjūčio 10 d. numeryje. Vystymosi ląstelė.

Kaip principo įrodymą, mokslininkai pakeitė visą įprastos žarnyno bakterijos genomą E. coli į 40 000 RNR vadovų biblioteką, kuri apėmė 88 procentus bakterijų genomo. Kiekvienas RNR vadovas yra 20 RNR bazių porų segmentas: šablonas, kurį naudoja CRISPR-Cas9, kai ieško papildomos DNR, kurią suriša ir pjausto.

Tyrėjai sukūrė šimtus RNR kreipiamųjų zondų nedideliam varlės Xenopus laevis genomo regionui, prijungė juos prie CRISPR-Cas9 su fluorescencine etikete ir sėkmingai pažymėjo tą DNR regioną branduolyje, kad jį būtų galima sekti gyvai. pavyzdžiai.

Šios bibliotekos gali būti naudojamos tradiciniam CRISPR-Cas9 redagavimui, kad būtų nukreipta į bet kurią konkrečią genomo DNR seką ir ją supjaustoma. Tai yra tai, ką mokslininkai daro norėdami nustatyti geno funkciją: išmuškite jį ir pamatysite, kas blogai vyksta ląstelėje. . Tai gali padėti tiksliai nustatyti, pavyzdžiui, ligos priežastį. Šis procesas vadinamas genetine atranka ir atliekamas partijomis: kiekvienas iš tūkstančių zondų įvedamas į vieną ląstelę plokštelėje, užpildytoje šimtais tūkstančių ląstelių.

„Galime sukurti šias bibliotekas už daug mažiau pinigų, todėl genetinis patikrinimas gali būti prieinamas mažiau gerai ištirtuose organizmuose“, pavyzdžiui, tų, kurių genomai dar nebuvo sekvenuoti“, sakė pirmasis autorius Andrew Lane'as, UC Berkeley doktorantas. .

Ląstelių stebėjimas realiuoju laiku

Tačiau Lane'as ir kolega Rebecca Heald, UC Berkeley molekulinės ir ląstelių biologijos profesorius, sukūrė technologiją, siekdami sekti chromosomas realiu laiku gyvose ląstelėse, ypač ląstelių dalijimosi metu, ty procesą, vadinamą mitoze. Tai dalis didesnio Healdo projekto, kuriuo siekiama išsiaiškinti, kas reguliuoja branduolio ir kitų tarpląstelinių komponentų dydį, kai organizmai auga nuo kelių ląstelių iki daugelio ląstelių.

„Ši technologija leis mums nupiešti visą chromosomą ir pažvelgti į ją gyvai bei iš tikrųjų sekti ją branduolyje ląstelės ciklo metu arba jam vykstant vystymosi perėjimams, pavyzdžiui, embrione, kad pamatytume, kaip keičiasi jos dydis ir struktūra. “, - sakė Healdas.

Naujasis metodas naudoja standartinę PGR (polimerazės grandininę reakciją), kad generuotų daug trumpų DNR atkarpų iš bet kurio tyrėją dominančio DNR segmento, iki viso genomo. Tada šie fragmentai tiksliai nupjaunami regione, vadinamame PAM, kuris yra labai svarbus CRISPR surišimui. Tada naudojami paprasti restrikcijos fermentai, kad kiekvienas gabalas būtų atpjautas po 20 bazių porų nuo PAM galo, sukuriant tikslaus dydžio RNR kreiptuvą, kurį CRISPR naudoja ieškodamas papildomų vietų genome. Tada šios orientacinės RNR lengvai įtraukiamos į CRISPR-Cas9 kompleksą, todėl gaunama dešimtys tūkstančių zondų, skirtų DNR žymėjimui ar pjaustymui.

„Naudojant patį genomą kaip orientacinių RNR šaltinį, jų požiūris leidžia sukurti bibliotekas, nukreiptas į gretimus regionus, pasiekiamas beveik bet kuriai laboratorijai“, - sakė Berklio universiteto Inovatyvios genomikos iniciatyvos vadovas ir mokslinis direktorius Jacobas Cornas. „Tai gali būti labai naudinga genomo vaizdavimui ir tam tikrų tipų ekranams, ir man labai įdomu sužinoti, kaip tai leidžia atlikti biologinį atradimą naudojant Cas9 įrankius.

Lane ir Healdo bendraautoriai yra Magdalena Strzelecka, Andreas Ettinger, Andrew W. Grenfell ir Torsten Wittmann. Šį darbą parėmė Nacionaliniai sveikatos institutai.

SUSIJUSI INFORMACIJA


Kiek specifiniai yra CRISPR-cas9 pjūviai? – Biologija

Sistemos grožis yra tas, kad ją sudaro tik du elementai: nukreipiančioji RNR, jungianti tikslinę DNR, ir DNR pjaunančios nukleazės Cas9, kuri kompleksuoja su nukreipiančia RNR. Abu elementai gali būti pristatyti į ląsteles naudojant vieną vektorių. Labai efektyvus ir ekonomiškas metodas yra toks universalus, kad gali pakeisti daugybę disciplinų – nuo ​​medicinos iki žemės ūkio ir pramoninės biotechnologijos.

Žmogaus sveikata

CRISPR-Cas9 naudojimas suteikia milžiniškų galimybių toliau gerinti žmonių sveikatą ir gerovę. Nors galutinis tikslas yra išnaikinti ligas, dauguma darbų naudojant šią techniką vis dar yra tyrimo stadijoje. Pavyzdžiui, CRISPR daro didžiulę įtaką tam, kaip atrandami galimi vėžio ir kitų ligų vaistų taikiniai, nes tai leidžia tyrėjams daug efektyviau ir pigiau patobulinti ir redaguoti konkrečius genus nei naudojant ankstesnius genomo redagavimo metodus.

2016 m. vasario mėn. Londono mokslininkams buvo suteiktas leidimas naudoti CRISPR-Cas9 sveikiems žmogaus embrionams redaguoti, siekiant sukurti nevaisingumo gydymo būdus. Tai buvo pirmasis tokių tyrimų patvirtinimas pasaulyje ir yra stiprus precedentas, leidžiantis taikyti panašias programas.

Taigi, kas laimės lenktynes, skirtas sukurti pirmąjį CRISPR terapiją? 2015 m. „Editas Medicine“ paskelbė apie savo planus naudoti CRISPR, kad būtų galima gydyti retą aklumo formą, žinomą kaip Leberio įgimta amaurozė.

Visai neseniai, 2016 m. birželį, JAV federalinė komisija patvirtino pirmąjį klinikinį CRISPR tyrimą, kurio tikslas – sukurti genetiškai pakeistas imunines ląsteles vėžiui gydyti. Pensilvanijos universiteto mokslininkai planuoja naudoti CRISPR novatoriškoje chimerinio antigeno receptorių (CAR)-T ląstelių terapijos technologijoje, kad sukurtų T ląsteles, kad jos būtų veiksmingesnės nustatant ir sunaikinant trijų tipų vėžines naviko ląsteles. Gydymas CAR-T ląstelėmis sulaukė stulbinančios ankstyvos sėkmės gydant tam tikrus kraujo vėžio atvejus pacientams, kuriems nepavyko reaguoti į kitus gydymo būdus. CRISPR-Cas9 naudojimas kartu su CAR T-ląstelėmis gali pakeisti žaidimą išgelbėjant gyvybes tiems, kurie anksčiau nebuvo gydomi vėžiu.

Kitur mokslininkai tiria galimybę panaudoti CRISPR, kad išgydytų ŽIV. Jau pranešta apie tam tikrą sėkmę izoliuotose žmogaus ląstelėse ir pelių bei žiurkių modeliuose, o kita komanda Berklyje bando panaudoti metodą, kad ištaisytų mutaciją, sukeliančią pjautuvą. ląstelių anemija.

Pasėlių tyrimai

Nors dėmesio centre neabejotinai yra galimas CRISPR vaidmuo terapijoje, jis taip pat naudojamas kaip genomo redagavimo įrankis įvairiose kultūrose, įskaitant kviečius, ryžius, sojų pupeles, bulves, sorgus, apelsinus ir pomidorus. Neseniai atliktame tyrime John Innes centro mokslininkai panaudojo technologiją, kad tikslingai redaguotų dvi JK pasėlius – į brokolius panašią brassica ir miežius – ir įrodyta, kad šie pakeitimai išsaugomi kitose kartose. CRISPR taip pat buvo naudojamas kuriant vynuoges, kurios yra atsparios pelėsinei ligai, ir kviečiams, atspariems miltligei.

Pramoninė biotechnologija

CRISPR panaudojimas pramoninėje biotechnologijoje yra didžiulis. Pagrindinis šios srities žaidėjas yra Caribou Biosciences, kurie stengiasi pagerinti mikrobų gamybos padermes, kad būtų sukurtos geresnės fermentacijos ląstelių gamyklos. Jie taip pat naudoja techniką, kad išlaisvintų mikrobų potencialą biologiškai gaminti chemines medžiagas ir fermentus, kurie anksčiau niekada nebuvo gaminami fermentacijos būdu.

Šveicarijos sintetinės biologijos įmonė „Evolva“ taip pat prideda CRISPR į savo priemonių rinkinį, o tai žada didelį postūmį ieškant naujų ingredientų ir specialių cheminių medžiagų su alaus gamybos ir inžineriniais mikroorganizmais. „Evolva“ gaminiai svyruoja nuo nootkatone, skonio greipfrutų sudedamosios dalies, galinčios padėti sustabdyti Zikos plitimą, iki žemės ūkio bioaktyvių medžiagų ir naujos kartos medžiagų komponentų.

Už CRISPR ribų

Nepaisant ypatingos galios ir galimo šios technikos pritaikymo, mokslo bendruomenė nerimauja, kad CRISPR gali netyčia pakeisti kitus genomo regionus, nei numatyta, ir taip paveikti apdorotą ląstelę galbūt nenuspėjamai. Nors netikslinių mutacijų galimybė turi mažiau reikšmės taikant tokius metodus kaip CAR-T ląstelių terapija, apimanti somatinius, o ne genomo pakeitimus, tai yra problema, kurią reikia spręsti. Daugelis tyrėjų, įskaitant tuos, kurie planuoja klinikinius tyrimus, naudoja internetinius algoritmus, kad nuspėtų netikslų CRISPR poveikį. Tačiau dabar žinoma, kad jie nėra šimtu procentų tikslūs, o tai reiškia, kad norint saugiai gydyti pacientus genomo redagavimo metodus reikės gerokai patobulinti netikslinius identifikavimo metodus.

CRISPR turi kitų apribojimų, paskatinusių ieškoti alternatyvių genų redagavimo metodų. Pavyzdžiui, CRISPR komponentai yra per dideli, kad juos būtų galima įterpti į viruso, paprastai naudojamo genų terapijai, genomą. Galimas sprendimas yra mini-Cas9, kuris buvo sėkmingai naudojamas pelėms, siekiant ištaisyti geną, atsakingą už raumenų distrofiją. Kitos problemos yra tai, kad „Cas9“ nenusiskirs visur, kur jis bus nukreiptas, o kelias, kurį jis naudoja naujai DNR sekai įterpti, yra klaidų. Tyrėjai aktyviai ieško alternatyvių Cas9 fermentų, kad išplėstų technikos repertuarą, be strategijų, kurios apima Cas9 išjungimą ir pririšimą prie kitų fermentų, kad būtų galima pakeisti skirtingus sekos pokyčius.

Gegužės mėnesį visiškai nauja genų redagavimo sistema – iš bakterijos gautas baltymas, vadinamas NgAgo, užprogramuotas naudojant trumpą DNR seką, atitinkančią tikslinę sritį – sukėlė pradinį susijaudinimo bangą. Nors laboratorijoms iki šiol nepavyko atkurti rezultatų, ši technika žada sukurti naują kelią į priekį šioje srityje.

Atsakingos naujovės

Negalima ignoruoti visuomenės susirūpinimo dėl CRISPR naudojimo manipuliuojant genomu, nes daugelis žmonių mano, kad tai atveria kelią į ateitį, kurioje tėvai gali pasirinkti savo vaikų bruožus. Kita baimė yra ta, kad toks gemalo linijos redagavimas leidžia modifikuotą geną perduoti ateities kartoms su nenuspėjamais rezultatais. Kiti siūlo subjektyvesnius argumentus. Kas gali nuspręsti, kas yra genomo patobulinimas? Ar apskritai turėtume keisti gyvus organizmus?

Mokslo bendruomenė visiškai pripažįsta, kad šioje prieštaringai vertinamoje srityje reikia elgtis atsargiai ir nustatyti konkrečias atsakingos veiklos gaires. 2015 m. gruodžio mėn. Vašingtone vykusioje konferencijoje, skirtoje aptarti CRISPR technologijos naudojimo žmonėms etiką, buvo raginama paskelbti „moratoriumą bet kokiems bandymams modifikuoti lytinių ląstelių genomą klinikiniam pritaikymui žmonėms“ ir sukurti „atviro diskurso apie CRISPR-Cas9 technologija, skirta manipuliuoti žmogaus genomu“.

Teisinga, kad mokslininkai ir toliau turėtų spręsti visuomenės problemas ir atvirai diskutuoti apie CRISPR naudą ir riziką. Tikėtina, kad laikui bėgant ši technika taps labiau priimta, nes bus suvoktos nepaprastos jos galios ir išnyks baimės dėl galimo netinkamo jos naudojimo. Tuo tarpu negalima ignoruoti fakto, kad CRISPR jau pasiekia visus gyvybės mokslų sektorius ir tik laiko klausimas, kada susidursime su rimta technologine revoliucija.


Nuorodos

Costanzo M, Baryshnikova A, Bellay J, Kim Y, Spear ED, Sevier CS ir kt. Genetinis ląstelės kraštovaizdis. Mokslas. 2010327:425–31.

Berns K, Hijmans EM, Mullenders J, Brummelkamp TR, Velds A, Heimerikx M ir kt. Didelio masto RNRi ekranas žmogaus ląstelėse nustato naujus p53 kelio komponentus. Gamta. 2004428:431–7.

Marcotte R, Sayad A, Brown KR, Sanchez-Garcia F, Reimand J, Haider M ir kt. Žmogaus krūties vėžio veiksnių, pažeidžiamumo ir atsparumo funkcinis genominis kraštovaizdis. Ląstelė. 2016164:293–309.

McDonald ER 3rd, de Weck A, Schlabach MR, Billy E, Mavrakis KJ, Hoffman GR ir kt. Projektas DRIVE: priklausomybių nuo vėžio ir sintetinių mirtinų santykių rinkinys, atskleistas didelio masto giluminio RNR patikrinimo metu. Ląstelė. 2017170:577–92 e10.

Tsherniak A, Vazquez F, Montgomery PG, Weir BA, Kryukov G, Cowley GS ir kt. Priklausomybės nuo vėžio žemėlapio apibrėžimas. Ląstelė. 2017170:564–76 e16.

Jackson AL, Burchard J, Leake D, Reynolds A, Schelter J, Guo J ir kt. Padėčiai būdingas cheminis siRNR modifikavimas sumažina „ne tikslinį“ transkripto nutildymą. RNR. 200612:1197–205.

Echeverri CJ, Beachy PA, Baum B, Boutros M, Buchholz F, Chanda SK ir kt. Sumažinti klaidingų teigiamų pranešimų apie didelio masto RNAi ekranus riziką. Nat metodai. 20063:777–9.

Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelson T ir kt. Genomo masto CRISPR-Cas9 išmušimo atranka žmogaus ląstelėse. Mokslas. 2014343:84–7.

Wu X, Scott DA, Kriz AJ, Chiu AC, Hsu PD, Dadon DB ir kt. CRISPR endonukleazės Cas9 surišimas žinduolių ląstelėse genomo mastu. Nat Biotechnol. 201432:670–6.

Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES. Genetiniai ekranai žmogaus ląstelėse naudojant CRISPR-Cas9 sistemą. Mokslas. 2014343:80–4.

Koike-Yusa H, Li Y, Tan E-P, Velasco-Herrera MDC, Yusa K. Genomo masto recesyvinis genetinis patikrinimas žinduolių ląstelėse su lentivirusine CRISPR vadovo RNR biblioteka. Nat Biotechnol. 201432:267–73.

Morgens DW, Deans RM, Li A, Bassik MC. Sistemingas pagrindinių genų CRISPR / Cas9 ir RNAi ekranų palyginimas. Nat Biotechnol. 201634:634–6.

Evers B, Jastrzebski K, Heijmans JPM, Grernrum W, Beijersbergen RL, Bernards R. CRISPR išmušimo atranka lenkia shRNR ir CRISPRi nustatant esminius genus. Nat Biotechnol. 201634:631–3.

Tzelepis K, Koike-Yusa H, De Braekeleer E, Li Y, Metzakopian E, Dovey OM ir kt. CRISPR atmetimo ekranas nustato genetinius pažeidžiamumus ir terapinius tikslus sergant ūmine mieloidine leukemija. Cell Rep. 201617:1193–205.

Hartas T, Chandrashekhar M, Aregger M, Steinhart Z, Brown KR, MacLeod G ir kt. Didelės skiriamosios gebos CRISPR ekranai atskleidžia tinkamumo genus ir genotipui būdingus vėžio įsipareigojimus. Ląstelė. 2015163:1515–26.

Wang T, Yu H, Hughes NW, Liu B, Kendirli A, Klein K ir kt. Genų būtinumo profiliavimas atskleidžia genų tinklus ir sintetinę mirtiną sąveiką su onkogeniniu Ras. Ląstelė. 2017168:890–903 e15.

Kaelin WG Jr. Sintetinio letalumo samprata priešvėžinės terapijos kontekste. Nat Rev vėžys. 20055:689–98.

Itsara A, Cooper GM, Baker C, Girirajan S, Li J, Absher D ir kt. Žmogaus genetinės ligos didelio kopijų skaičiaus variantų ir karštųjų taškų populiacijos analizė. Aš esu J Hum Genet. 200984:148–61.

Beroukhim R, Mermel CH, Porter D, Wei G, Raychaudhuri S, Donovan J ir kt. Žmogaus vėžio somatinių kopijų skaičiaus kitimo kraštovaizdis. Gamta. Gamtos leidybos grupė. 2010463:899–905.

Aguirre AJ, Meyers RM, Weir BA, Vazquez F, Zhang C-Z, Ben-David U ir kt. Genominės kopijos skaičius diktuoja nuo genų nepriklausomą ląstelių atsaką į CRISPR / Cas9 taikymą. Vėžio atradimas. Amerikos vėžio tyrimų asociacija. 20166:914–29.

Munoz DM, Cassiani PJ, Li L, Billy E, Korn JM, Jones MD ir kt. CRISPR ekranai pateikia išsamų vėžio pažeidžiamumo įvertinimą, tačiau sukuria klaidingai teigiamus rezultatus labai sustiprintuose genomo regionuose. Vėžio atradimas. 20166:900–13.

Meyers RM, Bryan JG, McFarland JM, Weir BA, Sizemore AE, Xu H ir kt. Kopijų skaičiaus efekto skaičiavimo korekcija pagerina CRISPR-Cas9 būtinumo ekranų specifiškumą vėžio ląstelėse. Nat Genet. 201749:1779–84.

Iorio F, Behan FM, Gonçalves E, Bhosle SG, Chen E, Shepherd R ir kt. Neprižiūrimas nuo genų nepriklausomų ląstelių atsako į CRISPR-Cas9 taikymą korekcija. BMC genomika. 201819:604.

Sudmant PH, Rausch T, Gardner EJ, Handsaker RE, Abyzov A, Huddleston J ir kt. Integruotas 2504 žmogaus genomų struktūrinių variacijų žemėlapis. Gamta. 2015526:75–81.

Li Y, Roberts N, Weischenfeldt J, Wala JA, Shapira O, Schumacher S, et al. Patterns of structural variation in human cancer [Internet]. bioRxiv. 2017 [cited 2017 Dec 14]. p. 181339. Available from: https://www.biorxiv.org/content/early/2017/08/27/181339

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Nat Genet. 201749:341–8.

Garnett MJ, Edelman EJ, Heidorn SJ, Greenman CD, Dastur A, Lau KW, et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Gamta. 2012483:570–5.

Iorio F, Knijnenburg TA, Vis DJ, Bignell GR, Menden MP, Schubert M, et al. A landscape of pharmacogenomic interactions in cancer. Ląstelė. 2016166:740–54.

Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Gamta. 2016534:47–54.

McBride DJ, Etemadmoghadam D, Cooke SL, Alsop K, George J, Butler A, et al. Tandem duplication of chromosomal segments is common in ovarian and breast cancer genomes. J Pathol. 2012227:446–55.

Stephens PJ, Greenman CD, Fu B, Yang F, Bignell GR, Mudie LJ, et al. Masinis genomo pertvarkymas, įgytas per vieną katastrofišką įvykį vėžio vystymosi metu. Ląstelė. 2011144:27–40.

Turner KM, Deshpande V, Beyter D, Koga T, Rusert J, Lee C, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Gamta. 2017543:122.

Barrangou R, Doudna JA. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nat Biotechnol. 201634:933–41.

Knott GJ, Doudna JA. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Mokslas. 2018361:866–9.

Greenman CD, Bignell G, Butler A, Edkins S, Hinton J, Beare D, et al. PICNIC: an algorithm to predict absolute allelic copy number variation with microarray cancer data. Biostatistika. 201011:164–75.

Garcia-Alonso LM, Iorio F, Matchan A, Fonseca NA, Jaaks P, Peat G, et al. Transcription factor activities enhance markers of drug sensitivity in cancer. Cancer Res. 2017canres.1679.2017.

Fonseca NA, Petryszak R, Marioni J, Brazma A. iRAP - an integrated RNA-seq analysis pipeline [Internet]. bioRxiv. 2014 [cited 2018 Feb 26]. p. 005991. Available from: http://biorxiv.org/content/early/2014/06/06/005991

Agu CA, Soares FAC, Alderton A, Patel M, Ansari R, Patel S, et al. Successful generation of human induced pluripotent stem cell lines from blood samples held at room temperature for up to 48 hr. Stem Cell Reports. 20155:660–71.

Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatika. 200925:1754–60.

Quinlan AR, Hall IM. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatika. 201026:841–2.

Dale RK, Pedersen BS, Quinlan AR. Pybedtools: a flexible Python library for manipulating genomic datasets and annotations. Bioinformatika. 201127:3423–4.

Pedregosa F, Varoquaux G, Gramfort A, Michel V, Thirion B, Grisel O, et al. Scikit-learn: machine learning in python. J Mach Learn Res. 201112:2825–30.

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Dataset. Figshare. https://figshare.com/articles/Structural_rearrangements_generate_cell-specific_gene-independent_CRISPR-Cas9_loss_of_fitness_effects/7610918

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Dataset. European Genome-Phenome Archive. https://ega-archive.org/datasets/EGAD00001004124.

Glodzik D, Morganella S, Davies H, Simpson PT, Li Y, Zou X, et al. A somatic-mutational process recurrently duplicates germline susceptibility loci and tissue-specific super-enhancers in breast cancers. Dataset. European Genome-Phenome Archive. https://www.ebi.ac.uk/ega/studies/EGAS00001000978.

Gonçalves E, Behan FM, Louzada S, Arnol D, Stronach EA, Yang F, Yusa K, Stegle O, Iorio F, Garnett MJ. Structural rearrangements generate cell-specific, geneindependent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Programinė įranga. Zenodo. . https://doi.org/10.5281/zenodo.2530755.


These authors contributed equally: Xueli Tian and Tingxuan Gu

Filialai

Basic Medical College, Zhengzhou University, 450001, Zhengzhou, Henan, China

Xueli Tian, Mee-Hyun Lee & Zigang Dong

China-US (Henan) Hormel Cancer Institute, No.127, Dongming Road, Jinshui District, 450008, Zhengzhou, Henan, China

Xueli Tian, Tingxuan Gu, Satyananda Patel, Mee-Hyun Lee & Zigang Dong

The Hormel Institute, University of Minnesota, Austin, 55912, USA

The Collaborative Innovation Center of Henan Province for Cancer Chemoprevention, Zhengzhou, China

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

Įnašai

X.T. and M.H.L. contributed to the literature search and collection of articles, assisted with designing the figures and writing T.G. and S.P. assisted in the literature search and advised which articles were most appropriate A.M.B. edited the manuscript Z.D. supervised the studies and allocated the funding.

Atitinkantys autoriai