Informacija

PCR Mastermix paruošimas

PCR Mastermix paruošimas


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Šiuo metu pirmą kartą ruošiu PGR pagrindinį mišinį ir turiu keletą klausimų dėl platinimo. Bandau amplifikuoti specifinį genų sankaupą DNR pavyzdyje, kad galėčiau jį panaudoti klonavimo vektoriuje; tačiau nesu tikras, kiek atskirų PGR reakcijos mišinių turėčiau paruošti savo pagrindiniame mišinyje šiuo tikslu? Be to, koks yra neigiamo PGR reakcijos mišinio (be šablono DNR) tikslas, nes mačiau, kad procedūra rekomenduoja tokį pasidaryti. Ar turėčiau paruošti tiek pat neigiamų reakcijų, kiek teigiamų, ar tik 1?


PCR Master Mix yra tik būdas pagreitinti pipetavimą. Užuot ruošę 10 skirtingų reakcijų po 20 ul (pavyzdžiui), paruošite vieną 200 ul reakciją ir padalinkite ją į 10 mėgintuvėlių. Tai taip pat sumažina išsiblaškymo klaidas (mažiau tikėtina, kad pamiršite vieną kartą 100 ul pipete nei 20 kartų 5 ul). Taip pat sunaudojama mažiau plastiko (pipečių antgalių).

Kai kurie patarimai:

Atsižvelgiant į kai kurių pipečių paklaidą, paprastai naudinga skaičiuoti papildomą reakciją kas 10. Pavyzdžiui, jei reikia atlikti 10 PGR, padarykite pagrindinį mišinį 11.

Jei planuojate paleisti tą patį PGR su skirtingais šablonais (dažnai taip ir būna), tada šablono į savo mišinį pridėti nereikia.

Visada turi būti įtraukta neigiama ir teigiama kontrolė.

Neigiama PGR reakcijos kontrolė dažnai atliekama DNR šabloną pakeičiant vandeniu. Neigiama kontrolė neturėtų rodyti amplifikacijos juostos. Tai garantuoja, kad jūsų mišinyje nėra DNR teršalų ir kad pradmenys neamplifikuoja vienas kito.

Teigiama kontrolė yra reakcija, kuri, kaip tikimasi, veiks. Šiuo atveju, jei jūsų teigiama kontrolė rodo amplifikaciją, o jūsų mėginys ne, žinote, kad tai ne dėl kurio nors reakcijos komponento netikėtai pasielgimo (polimerazė, buferis ir kt.).

Padarykime praktinį pavyzdį.

Tarkime, aš noriu amplifikuoti tą pačią tikslinę seką iš 10 skirtingų DNR mėginių.

1X reakcija atrodo maždaug taip:

**PGR 1X** Šablonas 1 ul grunto F 1 ul grunto R 1 ul H2O 10 ul MgCl2 2 ul dNTP 2 ul buferio 10 x 2 ul polimerazės 1 ul

Dabar, atsižvelgdamas į teigiamą ir neigiamą kontrolę bei 10% papildomą tūrį, paruoščiau pagrindinį mišinį 13 reakcijų. Žinoma, šablonas turi būti pašalintas.

**Master Mix 13X:** Gruntas F 13ul Primer R 13ul H2O 130ul MgCl2 26ul dNTPs 26ul Buferis 10X 26ul polimerazė 13ul

Dabar paskirstykite 19 ul į 12 mėgintuvėlių, į kiekvieną iš jų įpilkite 1 ul tinkamo šablono (C – tiesiog įpilkite 1 ul H2O) ir paleiskite!

Yra atvejų, kai galbūt norėsite sustiprinti skirtingas taikinių sekas iš tos pačios DNR. Pagal šį scenarijų šabloną norite įtraukti į pagrindinį mišinį, nes jis yra vienodas visoms reakcijoms, tačiau pradmenis norite pridėti atskirai, nes kiekvienoje reakcijoje bus tam tikras pradmenų rinkinys, skirtas tam tikrai sekai sustiprinti.


Atsižvelgiant į tai, kiek DNR reikia įterpti į klonavimo vektorių, galite pakeisti keturis dalykus:

  • i) PGR reakcijos mišinių kiekis (kiek mėgintuvėlių)
  • ii) DNR šablono koncentracija („kiek DNR šablono mėgintuvėlyje“)
  • iii) kiek ciklų („kiek kartų sustiprinsite savo šabloną“)
  • (iv) kiek efektyvus yra amplifikavimas („kiek efektyvus yra amplifikacija“), t. y. idealiu atveju kiekvienas ciklas tiksliai padvigubina jūsų DNR, bet praktiškai tai yra beveik dvigubai arba kartais žymiai mažesnis nei dvigubai

Atminkite, kad 1 mėgintuvėlyje po 10 ciklų idealiai yra lygiai tiek DNR, kiek 2 mėgintuvėliuose po 9 ciklų. Paprastai reikia pakeisti ciklų skaičių. Jums nereikia tiek daug DNR vektoriui įterpti, aš norėčiau pradėti nuo vieno vamzdelio.

Kiek man reikia DNR?

Mes negalime jums padėti nustatyti, kiek jums reikia, bet pažiūrėkite, kiek jums reikia įterpti į vektorių; padarykite perteklių naudodami PGR, patikrinkite, ar PGR veikė su geliu (gryninimas pagal dydį), ir išmatuokite produkto koncentraciją. Tada paimate reikiamą kiekį vektoriui sukurti.

Neigiama PGR kontrolė?

Neigiama kontrolė yra kontrolinė reakcija, kurioje yra visi pagrindiniai amplifikacijos reakcijos komponentai, išskyrus šabloną. Tai leidžia aptikti užteršimą dėl užterštų reagentų arba svetimos DNR. Čia neturėtumėte matyti jokio PGR produkto – jei tai padarysite, turėsite pašalinti reagentų triktis!

Kiek atskirų PGR reakcijos mišinių turėčiau paruošti?

Jei tik amplifikuojate DNR, vieno mėgintuvėlio turėtų pakakti, kad ant gelio matytumėte aiškias juostas. Kitais atvejais, pavyzdžiui, naudodamiesi kiekybine PGR (to nedarote), turėtumėte paruošti pakartojimus, kad gautumėte neigiamą mėgintuvėlį ir, tarkime, 3 eksperimentinius mėgintuvėlius (techninius pakartojimus), kad galėtumėte nustatyti jų vidurkį, kad būtų geresnis tikslumas. ir patikimumas.

Ruošiant pagrindinį mišinį, pvz. 10 reakcijų paruoškite taip, lyg darytumėte 10% daugiau reakcijų (11 reakcijų), kad galėtumėte patogiai viską pipete. Eksperimentui reikia 100 ml tirpalo? Padarykite 110 ml. Tai yra bendra gera laboratorijos praktika – visada darykite nedidelį pagrindinių mišinių perteklių.


Jūsų nustatytų reakcijų skaičius priklauso nuo daugelio parametrų. Norėdami atsakyti į šį klausimą, jums reikia informacijos apie DNR šablono šaltinį, pradmenų lydymosi temperatūrą, naudojamą taq ir produkto, kurį norite amplifikuoti, dydį. Visa tai lems, kaip optimizuosite PGR. Peržiūrėkite toliau pateiktą nuorodą http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/4/pdb.ip66.abstract


Kas yra PCR pagrindinis mišinys?

Pagrindinis PGR mišinys yra iš anksto sumaišytas tirpalas, kuriame yra dauguma komponentų, reikalingų PGR tyrimui atlikti. Mišinyje yra Taq DNR polimerazės, dNTP, MgCl2, taip pat stiprikliai ir stabilizatoriai buferyje, kuris yra optimizuotas DNR amplifikacijai naudojant PGR.

PCR pagrindinio mišinio naudojimo privalumai

Pagrindinis PGR mišinio naudojimo pranašumas yra jo patogumas. Dauguma komponentų jau buvo pridėta, o formulė jau optimizuota, todėl gerokai sutrumpėja paruošimo prieš tyrimą laikas.

Pagrindinių PGR mišinių naudojimas taip pat užtikrina aukštą nuoseklumo laipsnį net didelio tūrio tyrimo aplinkoje, o kuo mažiau pipetavimo etapų, tai reiškia ir mažiau užteršimo galimybių. Naudojant pagrindinį PGR mišinį taip pat sumažėja paruošimo klaidos, pvz., netyčia paliktas komponentas, tikimybė.

Be to, komerciniuose pagrindiniuose mišiniuose gali būti įvairių stiprintuvų ir stabilizatorių, kurie nėra žinomi pradedantiesiems PGR naudotojams. Jiems taip pat taikomos kokybės kontrolės procedūros ir analizė, kurios dėka gaminamas itin tikslus ir patikimas produktas. Šie veiksniai padidina bendrą tyrimo efektyvumą.

Į visus šiuos pranašumus ypač svarbu atsižvelgti pradedantiesiems PGR naudotojams.

Ką pridėti prie PCR pagrindinio mišinio?

Pagrindinis mišinio formatas ir stabilumas

PGR pagrindiniai mišiniai paprastai egzistuoja dviem pagrindiniais formatais. Dažniausiai PGR pagrindiniai mišiniai yra skysto formato. Skystiesiems PGR pagrindiniams mišiniams paprastai reikalingos laikymo sąlygos nuo -20 °C – ­­4 °C ir paprastai yra pigesni nei liofilizuoti mišiniai. Prieš naudojant PGR tyrime, jie atšildomi.

PGR pagrindiniai mišiniai taip pat gali būti liofilizuoti arba liofilizuoti. Tai leidžia gabenti mišinį esant aplinkos temperatūrai. Kai kurie liofilizuoti pagrindiniai mišiniai taip pat gali būti ilgai laikomi aplinkos temperatūroje. Tada prieš naudojimą pagrindinis mišinys atskiestas pridedamu buferiniu tirpalu.

Įprasti PGR pagrindiniai mišiniai

Pagrindiniai mišiniai, naudojami įprastiniams PGR tyrimams, paprastai amplifikuoja tikslines sekas iki 5 kb dydžio, o GC kiekis svyruoja nuo 40% iki 60%.

Taip pat yra įvairių pagrindinių mišinių, skirtų tyrimams, kuriems reikia didesnio PGR veikimo lygio:

  • Hot Start Taq: nespecifinio stiprinimo prevencija žemesnėje temperatūroje
  • High-Fidelity Taq: specializuoti fermentai ilgo nuotolio amplikonams, iki 20 kb

Realaus laiko PGR pagrindiniai mišiniai

Pagrindiniai mišiniai, sukurti naudoti su realaus laiko PGR tyrimais, yra optimizuoti tyrimams, kuriuose naudojama dažų arba zondo aptikimo chemija.

Pagrindiniuose PGR mišiniuose, naudojamuose tyrimuose, kuriuose naudojama dažų aptikimo chemija, gali būti arba nebūti faktinio dvigrandinio DNR surišančio dažiklio. Jei dažų nėra, vartotojas gali pridėti išorinių pasirinktinių dažų į pagrindinį mišinį.

Panašiai PGR pagrindiniuose mišiniuose, skirtuose tyrimams, kuriuose naudojama zondo aptikimo chemija, į mišinį neįtraukiamas fluoroforu pažymėtas zondas, tačiau jį gali pridėti vartotojas.

Pagrindiniuose PGR mišiniuose, skirtuose tyrimams, naudojant bet kurio tipo aptikimo chemiją, taip pat gali būti pasyvaus etaloninio dažiklio, kuris dažniausiai yra ROX. Šis etaloninis dažiklis yra būtinas tam tikrų, bet ne visų realaus laiko PGR prietaisų veikimui. Prieš pasirenkant realaus laiko pagrindinį PGR mišinį, reikia nustatyti, ar jūsų instrumentui reikia šių etaloninių dažų.

Ar turėčiau kada nors naudoti naminį PCR pagrindinį mišinį?

Daugeliu atvejų PGR pagrindinio mišinio naudojimo pranašumai yra daug didesni už naudą, kurią galima gauti kuriant asmeninį PGR pagrindinio mišinio sprendimą.

Tačiau atliekant tyrimus, kuriems reikalinga didesnė naudotojo eksperimentinių sąlygų kontrolė, geriausias pasirinkimas gali būti naminiai PGR pagrindiniai mišiniai. Tolesnėse programose, kurioms reikia tokio lygio naudotojo kontrolės, susijusios su tyrimo specifikacijomis, gali būti sekos nustatymas, klonavimas ir kt.

Šie naminiai PGR mišiniai taip pat dažnai kainuoja pigiau. Visgi, buferio optimizavimą turi atlikti pats vartotojas, o tai reikalauja papildomų laiko investicijų.


Paruoškite pagrindinį mišinį

Štai pagrindinis PGR eksperimento nustatymo protokolas:

Pirma, visi ingredientai, išskyrus DNR šablonus, yra sujungti į a master mix (taip pat vadinamas kokteiliu). Pagrindinis mišinys pipete pilamas į atskirus PGR mėgintuvėlius ir galiausiai į kiekvieną mėgintuvėlį pridedamas skirtingas DNR šablonas. Šiame pavyzdyje yra keturi PGR mėgintuvėliai, kuriuose paprastai būtų du eksperimentiniai PGR ir teigiama bei neigiama kontrolė.


Metodai  

PGR pagrindinis mišinys buvo paruoštas įtraukiant šiuos komponentus (vienai reakcijai): „SapphireAmp Fast PCR Master Mix“ (2X premiksas), 25 &mikrolio M13 Primer M4 (20 &mikroM), 0,5 &mikrolio M13 Primer RV (20 &mikroM), 0,5 &mikrolio dH.2O, 24 & mikro. PGR pagrindinio mišinio alikvotinės dalys (50 µl) buvo išpilstytos į kiekvieną PGR mėgintuvėlį. Sterilus mikropipetės antgalis buvo naudojamas kelioms ląstelėms iš kiekvienos kolonijos perkelti į atitinkamą PGR mėgintuvėlį, kur ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos PGR pagrindiniame mišinyje. PGR buvo atlikta naudojant Takara PCR Thermal Cycler Dice termociklerį (ne visose geografinėse vietose). Dviračių sąlygos buvo: 94 ir laipsnių C, 1 min., po to 30 ciklų 98 ir laipsnių C, 5 sek. 55 ir laipsnių C, 5 sek. ir 72 ir laipsnių C, 40 sek. Po to, kai PGR buvo baigta, po 5 mikrolius kiekvienos reakcijos buvo atlikta elektroforezė 1% L03 agarozės gelyje.


Amerika

Svetainė bus rodoma anglų kalba.

Šiuos slapukus naudojame siekdami užtikrinti, kad mūsų svetainė veiktų saugiai ir tinkamai. Jie yra būtini mūsų paslaugoms funkcionuoti ir negali būti išjungti mūsų sistemose. Paprastai jie nustatomi tik reaguojant į jūsų veiksmus, kurie prilygsta paslaugų užklausai, pvz., prisijungimas, naudojimasis pirkinių krepšeliu ar formų pildymas. Galite nustatyti, kad naršyklė blokuotų šiuos slapukus arba įspėtų apie juos, tačiau kai kurios mūsų paslaugų dalys neveiks be jų. Kaip ir kiti mūsų naudojami slapukai, būtinai būtini slapukai gali būti pirmosios arba trečiosios šalies slapukai.

Šiuos slapukus naudojame norėdami atsiminti jūsų nustatymus ir nuostatas. Pavyzdžiui, galime naudoti šiuos slapukus, kad prisimintume jūsų kalbos nuostatas.
Leisti pirmenybių slapukus

Šiuos slapukus naudojame norėdami rinkti informaciją apie tai, kaip sąveikaujate su mūsų paslaugomis, ir padėti mums jas įvertinti bei tobulinti. Pavyzdžiui, galime naudoti šiuos slapukus siekdami nustatyti, ar sąveikavote su tam tikru puslapiu.
Leisti našumo / statistikos slapukus

Mes ir mūsų reklamos partneriai naudojame šiuos slapukus, kad pateiktume reklamą, kad ji būtų jums aktualesnė ir prasmingesnė, taip pat stebėtume reklaminių kampanijų efektyvumą tiek mūsų paslaugose, tiek kitose svetainėse ir socialiniuose tinkluose.
Leisti rinkodaros slapukus


Amerika

Svetainė bus rodoma anglų kalba.

Šiuos slapukus naudojame siekdami užtikrinti, kad mūsų svetainė veiktų saugiai ir tinkamai. Jie yra būtini mūsų paslaugoms funkcionuoti ir negali būti išjungti mūsų sistemose. Paprastai jie nustatomi tik reaguojant į jūsų veiksmus, kurie prilygsta paslaugų užklausai, pvz., prisijungimas, naudojimasis pirkinių krepšeliu ar formų pildymas. Galite nustatyti, kad naršyklė blokuotų šiuos slapukus arba įspėtų apie juos, tačiau kai kurios mūsų paslaugų dalys neveiks be jų. Kaip ir kiti mūsų naudojami slapukai, būtinai būtini slapukai gali būti pirmosios arba trečiosios šalies slapukai.

Šiuos slapukus naudojame norėdami atsiminti jūsų nustatymus ir nuostatas. Pavyzdžiui, galime naudoti šiuos slapukus, kad prisimintume jūsų kalbos nuostatas.
Leisti pirmenybių slapukus

Šiuos slapukus naudojame norėdami rinkti informaciją apie tai, kaip sąveikaujate su mūsų paslaugomis, ir padėti mums jas įvertinti bei tobulinti. Pavyzdžiui, galime naudoti šiuos slapukus siekdami nustatyti, ar sąveikavote su tam tikru puslapiu.
Leisti našumo / statistikos slapukus

Mes ir mūsų reklamos partneriai naudojame šiuos slapukus, kad pateiktume reklamą, kad ji būtų jums aktualesnė ir prasmingesnė, taip pat stebėtume reklaminių kampanijų efektyvumą tiek mūsų paslaugose, tiek kitose svetainėse ir socialiniuose tinkluose.
Leisti rinkodaros slapukus


Pfu DNR polimerazės „MasterMix“ [2X] (1 citatos)

Pfu DNA Polymerase Mastermix [2X] yra iš anksto sumaišytas, paruoštas naudoti tirpalas, kurio sudėtyje yra Pfu DNR polimerazės, dNTP, MgSO4 ir optimalios koncentracijos reakcijos buferis efektyviam DNR šablonų amplifikavimui PGR būdu. Norint paruošti galutinį PGR, pridedami tik pradmenys ir šablono DNR. Pfu Mix prisideda prie labai atkuriamo PGR, sumažindamas pipetavimo klaidų, klaidingo skaičiavimo ir užteršimo riziką.


Nustatyta, kad Pfu DNR polimerazė, gauta iš hipertermofilinių archų Pyrococcus furiosus, pasižymi geresnėmis termostabilumo ir korektūros savybėmis, palyginti su kitomis polimerazėmis. Skirtingai nuo Taq polimerazės, labai termostabili Pfu DNR polimerazė turi 3–5–39 egzonukleazės korektūros aktyvumą, leidžiantį polimerazei ištaisyti netinkamo nukleotidų įsisavinimo klaidas. Tai reiškia, kad Pfu DNR polimerazės sukurti PGR fragmentai turės mažiau klaidų nei Taq sukurti PGR intarpai. Naudojant Pfu DNR polimerazę PGR reakcijose gaunami bukais galais PGR produktai, kurie idealiai tinka klonuoti į bukus turinčius vektorius. Naudokite Pfu polimerazę metodams, kuriems reikalinga didelio tikslumo DNR sintezė.

VIENETO APIBRĖŽIMAS
Vienas Pfu polimerazės vienetas (U) apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas 10 nanomolių dezoksiribonukleotidų įtraukimui į rūgštyje netirpią medžiagą per 30 minučių 70°C temperatūroje katalizuoti, naudojant silkės spermos DNR kaip substratą.

Pfu MIŠINIO SUDĖTIS
Pfu DNR polimerazė tiekiama 2X Pfu buferyje, dNTP, 3 mM MgSO4 ir bromfenolio mėlyna. Pfu mišinio buferis yra patentuota formulė, optimizuota patikimam PGR veikimui.


NZYTaq II 2x Green Master Mix (MB358)

Apibūdinimas: NZYTaq II 2× Green Master Mix yra paruoštas naudoti tirpalas, kurio sudėtyje yra NZYTaq II DNR polimerazės (MB354), kuri priklauso naujos kartos Taq- gautos DNR polimerazės, optimizuotos standartinėms PGR programoms. Pagrindiniame mišinyje yra optimalios koncentracijos dNTP, reakcijos buferio ir priedų, jis palaiko tvirtą ir patikimą įvairių DNR šablonų iki 6 kb amplifikaciją. MgCl2 galutinė koncentracija yra 2,5 mM, leidžianti įgyvendinti platų PGR protokolų spektrą. Be to, reakcijos, surinktos naudojant NZYTaq II 2× Green Master Mix, gali būti tiesiogiai dedamos į agarozės gelius. Mišinyje yra du dažikliai (mėlyna ir geltona), kurie leidžia stebėti elektroforezės eigą.

Gauti PGR produktai turi A iškyšą ir yra tinkami klonuoti naudojant NZYTech NZY-A PGR klonavimo rinkinį (MB053) arba NZY-A Speedy PCR klonavimo rinkinį (MB137).

Funkcijos:
– Patogus paruoštas naudoti PGR pagrindinis mišinys
– Tiesioginis gelio pakrovimas
– Didelis derlius su minimaliu optimizavimu
– Tvirtas amplifikavimas naudojant įvairius DNR šablonus
– Palieka A formos iškyšą

Programos:
– Galingas PGR
– Kolonijos PGR
– Produktų, skirtų TA klonavimui, generavimas

Specifikacijos:

Produkto ilgis: 0-6 kb
Į karštą paleidimą panašus pajėgumas: ne
Pratęsimo laikas: 15-30 sek./kb 72 °C temperatūroje
3´→5´ veikla: ne
Produkto iškyša: 3'-A
Laikymo sąlygos: Laikyti -20 ºC temperatūroje
Siuntimo sąlygos: Siunčiama kambario temperatūroje sausam ledui

Komponentai:
NZYTaq II 2 × Green Master Mix (0,2 U/μL)

1. Ką daryti, kai nėra produkto stiprinimo arba mažas derlius?
Tai gali būti dėl šių situacijų:
a) Nepakankama atkaitinimo temperatūra. Reakcijos mišinio sudėtis gali turėti įtakos pradmenų ir DNR lydymosi savybėms. Sureguliuokite atkaitinimo temperatūrą, kad gruntas atitiktų žemiausią lydymosi temperatūrą (nuo 5 °C iki 10 °C žemesnė nei Tm).
b) PGR inhibitorių buvimas. Kai kurios DNR išskyrimo procedūros, ypač genominės DNR išskyrimas, gali sukelti bendrą PGR inhibitorių gryninimą. Sumažinkite DNR šablono tūrį reakcijoje arba atskieskite DNR šabloną prieš pridėdami prie reakcijos. Įrodyta, kad mėginių skiedimas net 1:10 000 efektyviai pagerina rezultatus, priklausomai nuo pradinės DNR koncentracijos.
c) Magnio koncentracija per maža. Mg 2+ yra įtrauktas į pagrindinį mišinį, kurio galutinė koncentracija yra 2,5 mM, kurios pakanka daugumai taikinių. Kai kuriems taikiniams gali prireikti didesnės Mg 2+ koncentracijos. Titruokite nuo 2,5 mM iki 4 mM (galutinė koncentracija) 0,5 mM žingsniais. (Pastaba: MgCl2 nėra atskiruose vamzdeliuose).

2. Kaip galiu sumažinti nespecifinių juostų skaičių?
Sureguliuokite atkaitinimo sąlygas ir (arba) sukurkite kitą pradmenų rinkinį, padidindami ilgį ir išvengdami papildomų sekų.

3. Kaip turėčiau laikyti savo NZYTaq II 2× Green Master Mix?
Produktas turi būti laikomas -20 ºC temperatūroje, pastovios temperatūros šaldiklyje.

Preliminari lyginamoji COX1 skiriamosios gebos analizė ir
16S-rDNR kaip molekuliniai žymenys erkėms iš Portugalijos identifikuoti

Filipe D, Parreira R, Pereira A, Galvão N, Cristovão MJ, Nunes M, Vieira LM, Campino L, Maia, C
Veterinarinė parazitologija: regioniniai tyrimai ir ataskaitos , 2021

Fotoautotrofinių populiacijų struktūrinė įvairovė UNESCO svetainėje „Senoji Koimbros katedra“ (Portugalija), taikant kombinuotą metodą
Soares F, Portugal A, Trovão J, Coelho C, Mesquita N, Pinheiro AC, Gil F, Catarino L, Cardoso SM, Tiago I
Tarptautinis biologinis nusidėvėjimas ir biologinis skaidymas, 2019

Grybų įvairovė ir pasiskirstymas per skirtingus biologinio gedimo reiškinius senosios Koimbros katedros, įtrauktos į UNESCO pasaulio paveldo sąrašą, kalkakmenio sienose
Trovão J, Portugal A, Soares F, Paiva DS, Mesquita N, Coelho C, Pinheiro AC, Catarino L, Gil F, Tiago I
Tarptautinis biologinis nusidėvėjimas ir biologinis skaidymas, 2019


    „eLONGase Enzyme Mix“ („GibcoBRL Life Technologies“ kat. Nr. 10480-028)
    dNTP (Roche Molecular Biochemicals, 1051466, 1051458, 1051440, 1051482) – 4 mM
    Pirmieji / atvirkštiniai oligonukleotidiniai pradmenys – 7µM = 100 ng/µL 40-merų pradmenų su 5' uodega
    universalus išplėtimas (žr. DNR analizės protokolų vadovą – PGR pradmenų pasirinkimas / projektavimas) („GibcoBRL Life Technologies“)

I. Vienos reakcijos nustatymas

    Bendras vienos PGR reakcijos tūris yra 10 µL. 1 lentelė išvardija reagentus
    vienai reakcijai ir pradinei bei galutinei koncentracijai.

    1 lentelė. Reagentų koncentracijos ir tūriai vienai PGR reakcijai
    Reagentas[Pradinė koncentracija][Galutinė konc.]Tūris (µL)
    eLONGase buferis A10X0,5X1
    eLONGase buferis B10X0,5X1
    ddH2010X0,5X1
    DNTP4 mM100 µM0.25
    eLONGasetaq1 U/µL0,4 U/µL0.4
    1 gruntas7 µM140 nM0.2
    2 gruntas7 µM140 nM0.2
    DNR5 µM2 ng/µL4
    Bendras tūris10

II. „eLONGase MasterMix“ reagento sąranka

  1. eLONGase MasterMix yra padalytas į dvi 96 šulinėlių PGR plokštelės kolonėles.
  2. 7 kartus didesnis tūris (39,2 l/šulinėlyje) MasterMix dedamas į 1 ir 7 stulpelius PGR paruoštoje plokštelėje.
  3. Įtraukiame vieną papildomą reakciją, kad būtų išvengta pipetavimo klaidos kolonėlėse.
      Pastaba: Reagento sąranka būdinga mūsų PGA DNR skydelio (žr. DNR skydelį) bloko sąrankai, kurią sudaro 96 formato giliųjų šulinių blokas, kuriame yra 48 DNR mėginiai, dubliuoti abiejose bloko pusėse, atitinkamai 1–6 ir 7–12 stulpeliai. (žr. 1 pav.).

III. „eLongase Master Mix“ receptas

  1. Kad būtų lengviau paskirstyti į PGR paruoštą plokštelę, didelio tūrio MasterMix (12x96 plokštelės tūris ar didesnis) gali būti įrengtas gilioje 96 šulinėlių plokštelėje ir naudojant daugiakanalią pipetę (arba robotą) perkeliamas į PGR paruoštą plokštę. plokštelė (žr. paskutinį stulpelį, 2 lentelė, žemiau).
    2 lentelė.eLONGase MasterMix koncentracija ir apimtys
    Reagentas[Pradinė koncentracija][Galutinė konc.]Tūris (µL)
    1x96 plokštelė
    (2 stulpeliai)
    Tūris (µL)
    12x96 plokštės
    (24 stulpeliai)
    eLONGase buferis A5X0,5X14168.0
    eLONGase buferis B5X0,5X14168.0
    ddH201X1X41.3495.6
    dNTP4 µM100 µM5.642.0
    eLONGase Taq1 U/µL0,04 µL0.2567.2
    Bendras tūris78.4940.8
    Pastaba: Visi papildymai atliekami į vieną šulinėlį vienoje gilios 96 šulinėlių plokštelės stulpelyje, jei nenurodyta kitaip.

IV. Elongase MasterMix paruošimas padalyti į alikvotas

  1. Atšildykite Elongase buferius A ir B bei ddNTP. Atšildžius gerai išmaišyti.
  2. Laikykite Elongase fermentą šaldiklyje, kol prireiks.
  3. Įpilkite 495,6 l - ddH2O
  4. Įpilkite 168 l - Elongase buferio A
  5. Įpilkite 168 l - Elongase buferio B
  6. Pridėkite 42 L - dNTP
  7. Išimkite Elongase fermentą iš šaldiklio
  8. Įpilkite 67,2 l - Elongazės fermento
  9. Lėtai sumaišykite MasterMix 30 kartų kiekvienoje duobutėje naudodami 20-200 l daugiakanalę pipetę (nustatymas = 15 L).
  10. Centrifuguokite gilų 96 šulinėlių bloką esant mažo greičio nustatymui (Jouan centrifuga: 190 x g 20 sek., 1 programa (1000 aps./min. 20 sek.).

V. 96 šulinėlių skirtų PGR paruoštų plokštelių paruošimas

  1. Nubrėžkite liniją tarp 6 ir 7 stulpelių, kad nurodytumėte dvi 96 šulinėlių plokštelės puses.
  2. Apibraukite šulinį Q eilutėje ir 1 stulpelį (viršutiniame kairiajame kampe), kad būtų galima orientuotis.
  3. Iš kiekvienos gilios 96 šulinėlių plokštelės šulinėlių 39.w L alikvotinės dalies paskirstykite į PGR paruoštos 96 šulinėlių plokštelės 1 ir 7 stulpelius, naudodami 20-200 daugiakanalio pipetę.
  4. Kiekvieną paruoštą lėkštę padėkite ant ledo.
  5. Ant aliuminio sandarinimo folijos pažymėkite esamą datą ir PGR READY MASTERMIX.
  6. Uždenkite kiekvieną plokštelę aliuminio sandarinimo folija ir nėriniais -20 C šaldiklyje.

VI. PCR paruošta amplifikacijos sąranka

Ranka:

Šiose instrukcijose aprašomas vienos plokštės nustatymas. Du pradmenų rinkiniai gali būti amplifikuojami vienoje plokštelėje, vienas rinkinys 1–6 stulpeliuose (vadinamas toliau kaip pradmenų rinkinys Nr. 1), o kitas – 7–12 stulpeliuose (toliau vadinamas pradmenų rinkiniu Nr. 2). Vienu metu galima pastatyti kelias lėkštes, kad visos lėkštės būtų ant ledo, kol jos nenaudojamos.


Žiūrėti video įrašą: PCR Master Mix-All in One ready to use! (Gruodis 2022).