Informacija

Kaip sužinoti, ar baltymas buvo denatūruotas?

Kaip sužinoti, ar baltymas buvo denatūruotas?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Taigi neseniai atlikau eksperimentą su kiaušinių albuminu ir turėjome 5 mėgintuvėlius. tikslas buvo pamatyti, ar jie buvo denatūruoti. 1- šiluma 2-rūgštis (HNO3) 3-bazė (NaOH) 4- alkoholis (etanolis) 5- sunkiųjų metalų jonai (AgNO3)

Taigi kai kurie mėgintuvėliai tapo drumsti / pieniški, o kai kurie skaidrūs. Ar tai aiškūs, kurie buvo denatūruoti? Aš nežinau, kaip pasakyti.

Ačiū iš anksto :)


Mano patirtis rodo, kad kai baltymai denatūruojasi, jie paprastai agreguojasi ir nusėda iš tirpalo. Tikėčiau, kad denatūruotas baltymas sukurs drumstą tirpalą arba faktines nuosėdas mažų rutuliukų ar smulkių gabalėlių pavidalu. Tirpalas, kuriame baltymai yra tinkamai suformuoti ir ištirpinti tirpale, turi būti skaidrus.


Skirtumas tarp baltymų denatūracijos ir koaguliacijos

Kuo skiriasi denatūravimas, koaguliacija ir krituliai?

Tony Russell, Ph.D. Bostono universitete (1962 m.)

Biochemijoje denatūracija yra molekulės savybių panaikinimas. Denatūracija = kažko prigimties pakeitimas. Pavyzdžiui, fermento denatūravimas reiškia, kad fermentas nebegali atlikti savo funkcijos. Virimas denatūruoja fermentus, todėl virdami galite nužudyti bakterijas. „denatūruotas alkoholis“ reiškia, kad į geriamą alkoholį buvo įdėta teršalų, todėl gėrimas yra nuodingas arba blogo skonio.

Koaguliacija – tai dalelių sulipimas tirpale. Į pieną įpylus citrinos sulčių, pieno baltymai susitraukia arba „krešėja“. Pjūvis kraujas krešėja, o fibrino molekulės kraujyje sulimpa, sulaikydamos raudonuosius ir baltuosius kraujo kūnelius.

Krituliai yra tada, kai molekulės sulimpa ir išsiskiria iš tirpalo. Panašiai kaip į pieną įpylus citrinos sulčių, švelnūs baltymai susikaupia į tokias dideles daleles, kad nusėda iš tirpalo.


Amino rūgštys:

Baltymai sudaro apie 50% daugumos ląstelių sausos masės ir yra struktūriškai sudėtingiausios žinomos makromolekulės. Kiekvienas baltymų tipas turi savo unikalią struktūrą ir funkciją.

Polimerai yra bet kokios didelės molekulės, sudarytos iš pasikartojančių identiškų ar panašių subvienetų, vadinamų monomerais. Krakmolas ir celiuliozė, apie kuriuos kalbėjome anksčiau, yra gliukozės polimerai, kurie šiuo atveju yra monomeras. Baltymai yra maždaug 20 polimerų amino rūgštys (monomeras).


Viena amino rūgštis Amino rūgštys yra sudarytos iš centrinės anglies, sujungtos su keturiomis skirtinga grupės. (nuveskite pelės žymeklį virš aminorūgšties, kad pamatytumėte dalių pavadinimus)

  1. vandenilis ( H),
  2. amino grupė (NH2),
  3. karboksilo grupė (COOH),
  4. ir tam tikra šoninė grandinė, kurią simbolizuoja R .

Maždaug 20 aminorūgščių, randamų mūsų kūne, skiriasi šoninė grandinė. Kai kurios šoninės grandinės yra hidrofilinės, o kitos yra hidrofobinės. Kadangi šios šoninės grandinės išsikiša iš molekulės stuburo, jos padeda nustatyti iš jų pagaminto baltymo savybes.


Kairiosios ir dešiniosios veidrodinio vaizdo molekulės Dauguma natūraliai esančių aminorūgščių yra l formos, o sintetiniu būdu pagamintos aminorūgštys sudaro 50:50 mišinį. Atkreipkite dėmesį, kad šios molekulės yra viena kitos veidrodiniai atvaizdai, todėl jokiu būdu negalite pasukti vienos molekulės, kad ji atrodytų kaip kita.


Galutinis atsakymas

Dėkojame už galimybę padėti išspręsti jūsų klausimą!

Jis nebegalės atlikti įprastų funkcijų. Baltymai turi įvairias tretines ir ketvirtines struktūras, kurios yra labai svarbios baltymo funkcijai, šios struktūros yra labai jautrios šilumai ir kitiems veiksniams. Kai šiluma denatūruoja baltymus, kelio atgal nėra. Pavyzdys galėtų būti kiaušinio virimas. Kiaušinio baltymas iš pradžių yra skaidrus skystis, tačiau kaitinant jis tampa kietu ir šis procesas negrįžtamas.

Praneškite, jei reikia paaiškinimo. Visada mielai atsakau į jūsų klausimus.


Denatūruoti

Denatūruoti Apibrėžimas
Biologinės molekulės denatūravimas reiškia jos trimatės (3-D) struktūros praradimą. Kadangi molekulės, tokios kaip baltymai ir DNR, priklauso nuo jų struktūros, kad galėtų atlikti savo funkcijas, denatūravimas yra susijęs su funkcijos praradimu.

Denatūruoti: visam laikui pakeiskite ir inaktyvuokite fermentą.
Fermentai: baltymai, kurie pagreitina reakcijas, kurios paprastai vyktų daug lėčiau, nes sumažina reakcijos aktyvinimo energiją.
Endergonic: anabolinės reakcijos.

denatūruoti Pakeisti baltymo molekulės konfigūraciją taip, kad ji prarastų specifiškumą ir nebeveiktų kaip fermentas.
dendritas Bet kuris nervinių ląstelių procesas, vedantis impulsus į ląstelės kūną.
dendrochronologija Mokslas, tiriantis medžių augimo žiedus, siekiant nustatyti praeities sąlygas.

d Atskiedus DNR neprisijungs
Biologijos projektas
Arizonos universitetas
1996 m. spalio 24 d., ketvirtadienis
Susisiekite su plėtros komanda.

d Fermentas: apibrėžimas ir apžvalga
Įvadas į organines molekules I: funkcinės grupės
Baltymai I: struktūra ir funkcija .

d baltymas neturi tiek tretinės, tiek antrinės struktūros ir egzistuoja kaip vadinamoji atsitiktinė ritė. Tam tikromis sąlygomis kai kurie baltymai gali persilankstyti, tačiau daugeliu atvejų denatūracija yra negrįžtama.

s DNR fragmentai.
Lakšto maudymas tirpale, kuriame yra radioaktyviai pažymėtas zondas, leidžia zondui prijungti bazes prie dominančios DNR sekos.
Juostas, kuriose yra etiketė, galime vizualizuoti naudodami autoradiografiją.

d fermentas : fermentas, praradęs formą ir nebegalintis atlikti savo funkcijų.
Biologinis apdorojimas: fermentų valdomų reakcijų naudojimas gaminiui gaminti.
Bioreaktorius: indas, naudojamas fermentų kontroliuojamoms reakcijoms vykdyti.

10) Fermentai gali prarasti formą (tapti

d) ir tampa neaktyvūs dėl temperatūros ar pH pokyčių.

Nors šios raukšlės yra mažiau taisyklingos nei spiralės, jos yra labai specifinės ir konkretus baltymas visada bus sulankstytas taip pat. Jei struktūra sutrinka, baltymas nustoja tinkamai funkcionuoti ir teigiama

d
Atgaus savo funkcijas, kai grįš į normalią temperatūrą
Termofilinis: mylintis šilumą
Hipertermofilinis: organizmai negali augti žemesnėje nei +70°C temperatūroje
Psichofilai: mylintys šaltį.

. Sukelti struktūrinius pokyčius, kurie sutrikdo molekulės biologinį aktyvumą.

Jie egzistuoja mielėse ir mūsų kūne, todėl geriausiai veikia esant 40 °C temperatūrai, tačiau jie

netrukus po to, todėl mūsų kūno temperatūra palaikoma 37 °C, kad taip neatsitiktų. Denatūracija yra negrįžtamas 3D fermentų struktūros praradimas, kurį gali sukelti šilumos perteklius arba PH pasikeitimas.

d RNR ir maži DNR fragmentai perkelti į nitroceliuliozę". PNAS. 77 (9): 5201-5. doi:10.1073/pnas.77.9.5201. ISSN 1091-6490. PMC 350025 . PMID 6159641.
^ Brown, T. (2001 m. gegužės 1 d.). „Pietų blotingas“. Dabartiniai imunologijos protokolai. 10 skyrius: 10.6A blokas. doi: 10.1002/0471142735.

Aukšta temperatūra ir ekstremalūs rūgščių bazių pokyčiai

(inaktyvuoti) jie praranda savo specifinę formą, kišenes ir nebegali atlikti savo darbo. Dauguma fermentų geriausiai veikia esant neutraliam pH, pavyzdžiui, randamam citozolyje. Tačiau kai kurie baltymai geriausiai veikia rūgščioje aplinkoje.

Naujai susintetinti ir pažymėti DNR fragmentai yra šiluma

d, ir atskirtas pagal dydį (tik vieno nukleotido skiriamoji geba) gelio elektroforeze ant denatūruojančio poliakrilamido-karbamido gelio, kai kiekviena iš keturių reakcijų vyksta vienoje iš keturių atskirų juostų (A, T, G, C juostos).

Todėl baltymai paprastai yra

d esant plovikliui, pvz., natrio dodecilsulfatui/natrio docecilo fosfatui (SDS/SDP), kuris padengia baltymus neigiamu krūviu.

Po elektroforezės gelyje esanti DNR yra

d mirkant gelį į šarminį tirpalą. Tada ant agarozės gelio uždedama nitroceliuliozės arba nailono membrana, o ant membranos – sugeriamojo popieriaus sluoksniu.

s (sruogos atskiria) baltymai iš daugumos organizmų (pvz., DNR polimerazės) taip pat išsiskiria. Tai kelia problemą. Arba tyrėjas turėtų pridėti naują polimerazę kiekvieną ciklą, arba reikės rasti karščiui stabilią polimerazę.

Po pradmenų, esančių ant cDNR šablono DNR polimerazės išplėtimo, reakcija yra šiluminė.

d ir leidžiama dar kartą atkaitinti su pradmenimis. Kitas pratęsimo etapas sukelia daugybinį DNR produktų padidėjimą.

Karšta temperatūra ilgainiui sukels fermentus

, negrįžtamas trimatės formos, taigi ir fermento funkcijos, pokytis.

Baltymų struktūros apžvalga – vaizdų įvairovė:

d baltymų
26. Kaip galima klasifikuoti denatūraciją pagal jos grįžtamumą?

Baltymų denatūracija gali būti grįžtama arba negrįžtama. Tai reiškia, kad baltymui gali būti įmanoma arba neįmanoma atgauti pradinę erdvinę konformaciją.

fermentą keičiant fermento formą. Fermentai taip pat pritaikyti veikti esant tam tikram pH arba pH diapazonui.

Atsitiktinė pradinė sintezė: jei turite DNR kloną ir norite pagaminti radioaktyvias jo kopijas, vienas iš būdų yra

jį (atskirkite grandines), tada hibridizuokite su tuo šablonu visų galimų 6-merų oligonukleotidų mišinį.

SSCP vienos grandinės konformacijos polimorfizmas. Gelio pagrindu sukurta priemonė, skirta aptikti vieno nukleotido pokyčius aleliniuose PGR produktuose

d ir geliu frakcionuota kaip atskiros gijos.
SSLP paprastos sekos ilgio polimorfizmas, žr. mikropalydovą.
SSR Simple Sequence Repeat žr. mikropalydovą.

Procedūra, kurios metu DNR restrikcijos fragmentai perkeliami iš agarozės gelio į nitroceliuliozės filtrą, kur

d DNR hibridizuojama su radioaktyviu zondu (blotingas).

Taip yra dėl to, kad molekulės greičiau juda ir dažniau susiduria tarpusavyje. Tačiau tam tikru momentu temperatūra pakyla ir fermentai

ir nustoti veikti. Taip yra dėl to, kad šiluma sukelia fermento vibracijas, naikinančias jo struktūrą, suardant fermento ryšius.

Kai kurios archėjos gamina neįprastai didelę termoprotekcinių baltymų (šilumos šoko baltymų) koncentraciją, kurios yra visose ląstelėse. Šie baltymai padeda iš dalies persilankstyti

d baltymai. Kiti archėjai gamina unikalius baltymus, kurie padeda stabilizuoti DNR.

Hibridizacija priklauso nuo temperatūros, todėl DNR, kurios stipriai hibridizuojasi žemoje temperatūroje, gali būti laikinai atskirtos (

d) kaitinant.
mitozė: ląstelių dauginimosi dalijimosi procesas.

d (2 784 peržiūros)
Susieti genai (2 783 peržiūros)
Antibiotikas (2 781 peržiūros)
Plėtra (2 774 peržiūros)
Taksi (2 770 peržiūrų)
Pagrindinė niša (2 765 peržiūros)
Ląstelės plokštė (2 761 peržiūra)
Dirbtinė atranka (2 753 peržiūros)
Millons testas (2 749 peržiūros) .


Kaip denatūruoti baltymą

Šio straipsnio bendraautorė yra mokslų daktarė Meredith Juncker. Meredith Juncker yra biochemijos ir molekulinės biologijos doktorantė Luizianos valstijos universiteto sveikatos mokslų centre. Jos studijos yra orientuotos į baltymus ir neurodegeneracines ligas.

Šiame straipsnyje cituojamos 9 nuorodos, kurias rasite puslapio apačioje.

Šis straipsnis buvo peržiūrėtas 22 883 kartus.

Galbūt norite denatūruoti baltymą moksliniam projektui, o gal skaitėte apie denatūruotą maistą ir norite sužinoti, kaip tai veikia. Denatūracija yra procesas, kurio metu baltymas praranda savo formą ir struktūrą dėl išorinių jėgų, įskaitant šilumą, spinduliuotę, rūgštis ir tirpiklius, veiksmų. Organiniai tirpikliai dažniausiai denatūruoja baltymus. [1] X Tyrimo šaltinis Tikslus baltymų denatūravimo būdas priklauso nuo konkretaus baltymo, su kuriuo norite dirbti, nes jiems visiems reikia skirtingų denatūravimo agentų skirtingu lygiu. Tačiau dauguma baltymų gali būti denatūruojami, jei žinote, ką pakeisti baltymų aplinkoje.


AP Biologija: Baltymai

Neteisingai sulankstytas baltymas greičiausiai susidūrė su kurio iš šių fermentų problema?

Chaperoninas yra fermentas, atsakingas už besiformuojančių polipeptidinių grandinių sulankstymą į teisingą ir funkcionalią 3 dimensiją. Lipazė yra fermentas, skaidantis lipidus arba riebalus. Amilazė skaido krakmolą ir sudėtinius angliavandenius arba cukrų. Helikazė padeda išvynioti DNR spiralę replikacijos metu, o topoizomerazė II padeda išlaikyti DNR nesusipainiojusią ir veikia kaip klijai DNR atkūrimo ar replikacijos metu.

Baltymai: 2 klausimo pavyzdys

__________ struktūra apima įvairių aminorūgščių šoninių grandinių sąveiką.

Pirminė struktūra sukasi aplink aminorūgščių seką, o antrinė struktūra pasiekiama per vandenilio ryšius, sąveikaujančius palei polipeptido pagrindą. Tretinė struktūra pasiekiama sąveikaujant tarp įvairių aminorūgščių šoninių grandinių ir reikalinga, kad baltymas veiktų. Ketvirtinė struktūra apima dviejų ar daugiau polipeptidų subvienetų sąveiką ir padidina jų gebėjimą katalizuoti reakciją.

Baltymai: 3 klausimo pavyzdys

Jei baltymo molekulės vandenilio ryšiai būtų sutrikdyti, koks struktūros lygis būtų labiausiai paveiktas?

Baltymai turi keturis struktūros lygius: pirminį, antrinį, tretinį ir ketvirtinį. Tai reiškia molekulėje vykstančius surišimo ir lankstymo tipus, dėl kurių ji įgauna stabilią formą. Vandenilio ryšiai susidaro tarp molekulės dalių, kuriose yra šiek tiek teigiamo vandenilio, ir kitų dalių, kurios gali būti šiek tiek neigiamos (paprastai turinčių deguonies). Šie ryšiai stabilizuoja antrinę baltymo struktūrą, leidžiančią sudėtingiau sulankstyti į tretinę ir ketvirtinę struktūras. Alfa spiralės ir beta klostuoti lakštai sudaro bendras antrines baltymų struktūras.

Pirminę struktūrą lemia peptidinis ryšys, o tretinė struktūra susidaro iš disulfidinių jungčių ir hidrofobinių sąveikų. Kvarterinė struktūra apibūdina kelių subvienetų sankaupą, kurią lemia hidrofobinė sąveika ir baltymų sukeltas surinkimas.

Baltymai: 4 klausimo pavyzdys

Kokį baltymų struktūros lygį pirmiausia įtakoja vandenilio ryšys?

Sraigtinių ir klostuotų lakštų susidarymas sudaro antrinę baltymo struktūrą. Šias konformacijas sustiprina vandenilio ryšiai tarp polipeptidinės grandinės atomų.

Pirminę struktūrą lemia peptidiniai ryšiai, kurie seka susieja greta esančias aminorūgštis. Tretinę struktūrą lemia disulfidiniai ryšiai tarp cisteino liekanų ir hidrofobinės sąveikos. Ketvirtinę struktūrą lemia kelių baltymo subvienetų sąveika.

Baltymai: 5 klausimo pavyzdys

Kokio tipo ryšiai pirmiausia yra atsakingi už antrinių baltymų struktūrų vystymąsi?

Vandenilio ryšys yra atsakingas už antrinių baltymų struktūrų formavimą. Visos baltymo aminorūgštys turi karboksilo ir amino galus, kurie gali sudaryti vandenilinius ryšius. Antrinė baltymo struktūra reiškia alfa spiralių ir beta klostuotų lakštų susidarymą per vandenilinį ryšį aminorūgščių pagrinde. R grupės nedalyvauja antrinėje struktūroje.

Kovalentiniai ryšiai yra naudojami visam laikui sujungti atomus ir nėra matomi baltymų sulankstymo metu. Peptidiniai ryšiai yra ypatinga kovalentinių jungčių klasė, kuri yra atsakinga už atskirų aminorūgščių laikymą kartu ir sudaro pagrindinę baltymo struktūrą. Joninės jungtys paprastai susidaro tarp metalų ir nemetalų, o baltymuose jų paprastai nėra.

Baltymai: 6 klausimo pavyzdys

Kuris iš šių teiginių apie ketvirtinio baltymo struktūrą yra teisingas?

Kvarterinę struktūrą pirmiausia laiko disulfidiniai ryšiai

Baltymai, turintys ketvirtinę struktūrą, yra sudaryti iš dviejų ar daugiau polipeptidinių grandinių

Ketvirtinę struktūrą pirmiausia laiko peptidiniai ryšiai

Visi baltymai turi ketvirtinę struktūrą

Baltymai, turintys ketvirtinę struktūrą, yra sudaryti iš dviejų ar daugiau polipeptidinių grandinių

Ketvirtinė baltymų struktūra išsiskiria tuo, kad kelios polipeptidinės grandinės susijungia ir sudaro funkcinį baltymą. Tai skiriasi nuo pirmųjų trijų baltymų struktūros lygių, kurie apima tik vieną polipeptidinę grandinę. Ketvirtinę struktūrą pirmiausia palaiko hidrofobinė sąveika tarp polipeptidinių grandinių (dažnai taip pat pastebimas joninis ir (arba) vandenilinis ryšys). Kiekviena polipeptidinė grandinė sudaro baltymo subvienetą.

Baltymai: 7 klausimo pavyzdys

Kokio tipo jungtis yra disulfidiniame tilte?

Disulfidiniai tilteliai susidaro tarp dviejų cisteino liekanų sulfhidrilo (-SH) grupių. Šie ryšiai yra kovalentiniai ir yra svarbūs daugelio baltymų tretinės struktūros stabilizavimui.

Baltymai: 8 klausimo pavyzdys

Hemoglobinas yra baltymas, sudarytas iš keturių identiškų subvienetų, kurių kiekvienas gali surišti vieną deguonies molekulę. Kokio lygio struktūra leidžia hemoglobinui turėti subvienetus?

Baltymai turi skirtingą struktūrą. Pirminė struktūra yra aminorūgščių seka, sujungta peptidiniais ryšiais. Antrinę struktūrą lemia vandenilinis ryšys aminorūgščių grandinės stubure. Tretinė struktūra yra viso baltymo forma, nulemta R grupės sąveikos ir hidrofobinių jėgų. Ketvirtinė struktūra randama tik tam tikruose baltymuose ir atsiranda dėl kelių polipeptido subvienetų sujungimo į funkcinį baltymą.

Baltymai: 9 klausimo pavyzdys

Kokia yra palydovo funkcija?

Nuneškite tRNR į tinkamas vietas

Nuneškite mRNR į tinkamas vietas

Padėkite sulankstyti baltymus

Padėkite sulankstyti baltymus

Šaperonai yra baltymai, kurie yra gyvybiškai svarbūs tinkamam kai kurių polipeptidinių grandinių sulankstymui. Be chaperonų baltymai gali būti neteisingai sulankstyti ir neveikti. Šaperonai yra ypač svarbūs tretinei ir ketvirtinei struktūrai.

Kiti atsakymai apibūdina kitų tipų baltymų funkcijas.

Baltymai: 10 klausimo pavyzdys

Toliau išvardyti išskiriamo baltymo gamybos etapai.

  1. Baltymai į Golgi aparatą perkeliami transportavimo pūslele
  2. Baltymų seką verčia ribosomos
  3. Baltymai pernešami į ląstelės membraną
  4. MRNR sintetinama branduolyje
  5. Baltymas yra sulankstytas grubiame endoplazminiame tinkle

Kuriame iš šių atsakymų pateikiami teisinga seka išskiriamo baltymo gamybos žingsniai?


Denatūracijos atstatymas

Dažnai įmanoma pakeisti denatūraciją, nes pirminė polipeptido struktūra, kovalentiniai ryšiai, laikantys aminorūgštis teisinga seka, yra nepažeista. Kai denatūruojantis agentas pašalinamas, pradinė aminorūgščių sąveika grąžina baltymą į pradinę konformaciją ir jis gali atnaujinti savo funkciją.

Tačiau ekstremaliose situacijose, pavyzdžiui, kepant kiaušinį, denatūracija gali būti negrįžtama. Keptuvės karštis denatūruoja skystame kiaušinio baltyme esantį baltymą albuminą ir jis tampa netirpus. Mėsoje esantys baltymai taip pat denatūruojasi ir verdant tampa kieti.

Baltymų denatūravimas kartais yra negrįžtamas(Viršuje) Baltymų albuminas žaliame ir virtame kiaušinio baltyme. (Apačioje) Sąvaržėlių analogija vizualizuoja procesą: susijungus sąvaržėlės (‘aminorūgštys’) nebejuda laisvai, jų struktūra persitvarko ir ‘denatūruojama’.

Šaperono baltymai (arba chaperoninai) yra pagalbiniai baltymai, kurie sudaro palankias sąlygas baltymams susilankstyti. Chaperoninai susikaupia aplink besiformuojantį baltymą ir neleidžia kitoms polipeptidinėms grandinėms agreguotis. Kai tikslinis baltymas susilanksto, chaperoninai atsiskiria.

Beribiai tikrina ir kuruoja aukštos kokybės, atvirai licencijuotą turinį iš viso interneto. Šiam konkrečiam šaltiniui buvo naudojami šie šaltiniai:


Rezultatai ir DISKUSIJA

Stebime netikėtai platų skirtingų baltymų elgseną (1 lentelę ir 1 pav. taip pat žr. 3 pav., kuri paskelbta kaip pagalbinė informacija PNAS svetainėje). Beveik visose elektroferogramose agregacija su SDS padidina mobilumą ir perkelia smailes į dešinę. Daugumos baltymų denatūruotų formų 10 mM SDS judrumas (μ) yra 15–18 cm 2 kV –1 ·min –1. Labai nedidelis poslinkis į mažesnį superoksido dismutazės (SOD) judrumą esant didelėms SDS koncentracijoms tikriausiai yra dėl padidėjusio veikimo buferio klampumo (17), o ne dėl baltymo sąveikos su SDS. Tai, kad visi baltymai [išskyrus SOD ir streptavidiną, kurie mūsų sąlygomis nedenatūruojasi (18)] turi maždaug tokį patį mobilumą esant didelėms SDS koncentracijoms, atitinka teiginį, kad visi baltymai jungiasi su SDS maždaug tokiu pačiu santykiu. SDS molekulės priklauso nuo aminorūgščių skaičiaus. Tačiau atidžiau pažvelgus į elektroferogramas, akivaizdu, kad smailės, atitinkančios sočiųjų baltymų ir SDS agregatus, turi struktūras, kurios, mūsų manymu, yra dėl kelių rūšių. Šios rūšys gali turėti skirtingą su jomis susietų SDS molekulių skaičių, gali skirtis pagal konformaciją ir gali būti tarpusavyje konvertuojamos per ribotą laiko skalę, todėl šiuo metu negalime tiksliai nustatyti konkrečios piko struktūros priežasties. Ši struktūra atkuriama per kelias injekcijas, ji neatsiranda dėl atsitiktinio triukšmo, susijusio su instrumentu. Smulkesnė elektroferogramų smailių struktūra SDS / PAGE nepastebėta dėl to, kad SDS / PAGE skiriamoji geba yra mažesnė arba dėl sąlygų ir ilgo laiko, reikalingo baltymams paruošti SDS / PAGE ir atskirti juos naudojant SDS. /PUSLAPAS.

Šiame darbe tirti baltymai ir SDS koncentracijos, kuriose jie denatūruojasi

SDS koncentracijos, kurioms esant pradėjo keisti baltymų mobilumą, skyrėsi daugiau nei dviem dydžiais (0,1 mM SDS žmogaus serumo albuminui iki >10 mM SDS SOD ir streptavidinui). Atrodo, kad kai kurie baltymai kapiliaruose denatūruojasi gerokai žemiau kritinės micelių koncentracijos (pvz., albuminas ir ubikvitinas), kai kurie viršija kritinę micelių koncentraciją [pvz., karboanhidrazė (BCA) ir IgG], o kai kurie nedenatuoja jokioje SDS koncentracijoje. mes ištyrėme (pvz., streptavidiną ir SOD). Mes nenustatėme pokyčių, dėl kurių pasikeičia baltymų smailių mobilumas, pobūdžio. Čia aptariame hipotezę, kad nedideli mobilumo pokyčiai, dėl kurių smailės formos yra panašios į natūralaus baltymo [pvz., β-laktoglobulino B (β-LgbB)], tikriausiai atspindi specifinį, nedenatūruojantį komplekso susidarymą (ir, tikėtina, , nedidelis, bet apibrėžtas konkrečiai surištų SDS molekulių skaičius), ir kad dideli mobilumo pokyčiai (pvz., BCA) atspindi atsiskleidimą (ir, tikėtina, didelį skaičių – šimtus – susijusių SDS molekulių). Negalime apibūdinti rūšių su vidutinio dydžio poslinkiais (pvz., Žmogaus serumo albuminas esant [SDS] = 0, 4–1, 2 mM) be papildomos informacijos, nors mes spėliojame, kad tai yra iš dalies išsiskleidę baltymų agregatai su daugybe susijusių SDS molekulių. Šios rūšys (pavyzdžiui, du agregatai, susidarę susiejant ubikvitiną ir SDS, kai koncentracija yra nuo 0, 8 iki 3, 0 mM SDS), anksčiau nebuvo aprašyta.

Elektroferogramos, surinktos taikant šią procedūrą, mūsų aprašytu analizės lygiu nesuteikia kiekybinės informacijos apie išsiskleidimo kinetiką ir termodinamiką, tarpinių produktų gyvavimo trukmę ar bet kurioje būsenoje surištų SDS molekulių skaičių. Šios elektroferogramos gali suteikti galimybę pradėti riboti denatūracijos greitį ir apriboti baltymų sąveikos su SDS modelius.

Konkretūs baltymai 1 ir 3 paveiksluose iliustruoja elgsenos spektrą, kurį stebime, šio elgesio įvairovę ir greitį, kuriuo duomenys renkami naudojant CE, yra priežastis manyti, kad šie daug informacijos turintys eksperimentai bus naudingas baltymų diferencijavimo metodas.

SOD (1 pavF).

Šis baltymas nedenatūruoja jokioje šiame darbe tirtoje SDS koncentracijoje. Manning ir Colón (18) iškėlė hipotezę, kad šių baltymų kinetinį stabilumą lėmė didelė β lakšto struktūra.

BCA (1 pavE).

Didelis μ pokytis, kurį mes siejame su visišku išsiskleidimu, įvyksta esant [SDS] = 5 mM 15 ° C temperatūroje. Esant tokiai SDS koncentracijai, baltymo išsiskleidimo greitis tampa panašus į laiką, kurio reikia baltymui judėti per kapiliarą esant tokiai SDS koncentracijai.

Β-LgbB (1 pavD).

Atrodo, kad šis baltymas yra susijęs su vienu SDS ekvivalentu, esant 0, 1 mM (vertinant pagal mobilumo pokytį). Kadangi β-LgbA (3 pavD) turi dar vieną neigiamai įkrautą liekaną nei β-LgbB (Asp-64 β-LgbA yra Gly-64 β-LgbB) (19, 20), galime palyginti mobilumo pokytį, kai SDS pridedama prie β-LgbB ( ΔμSDL = 0,52 cm 2 ·kV −1 ·min −1 ) iki mobilumo poslinkio pašalinus vieną neigiamai įkrautą aminorūgštį (μ β-LgbA - μ β-LgbB = 0,61 cm 2 ·kV −1 ·s −1) (1 pav.). D ir 3D). Sutapimas tarp jų verčių, Δμ SDL ≈ 0,9·(μ β-LgbA - μ β-LgbB), pakanka susieti 1 pav. parodytą tarpinį produktą D su maždaug vienu krūvio vienetu, taigi ir viena SDS molekule. Esant 1,6 mM SDS, β-LgbB pradeda denatūruotis.

Lakas (1 pavC).

Esminis smailės išplėtimas dėl α-laktalbumino, kai [SDS] = 0,6 mM, atitinka natūralaus baltymo pavertimą agregatu, apimančiu daug SDS molekulių. Nuo 0, 8 iki 5 mM SDS laipsniškai didėja mobilumas, kuris, mūsų nuomone, atitinka tolesnį susijusių SDS molekulių skaičiaus padidėjimą.

Ubikvitinas (1 pavB).

Ubikvitino elektroferogramos plečiasi esant [SDS] = 0,4 mM, susidarant dviem stabiliems tarpiniams junginiams (jų stabilumą sprendžiame iš smailių aštrumo), kurių santykinė koncentracija kinta priklausomai nuo SDS 0,8–3,0 diapazone. Esant [SDS] > 3.0, šie tarpiniai produktai virsta agregatų mišiniu, kurių mobilumas rodo, kad jie yra visiškai denatūruoti.

Baltymų buvimo kapiliare laikas gali būti keičiamas didinant kapiliaro ilgį arba mažinant taikomą įtampą. Išbandėme du atvejus: ubikvitiną esant 0,6 mM SDS ir BCA esant 3 mM SDS, esant 25 °C, kad pamatytume, ar stebimos elektroferogramos yra jautrios taikomai įtampai, taigi ir buvimo kapiliare trukmei (4 pav. paskelbta kaip pagalbinė informacija PNAS svetainėje). Ubikvitino smailės forma išliko nepakitusi mažėjant įtampai. Šis stebėjimas rodo, kad ubikvitino ir SDS agregato susidarymas esant 0, 6 mM SDS yra greitas, palyginti su CE atskyrimo laiko skale. BCA atveju esant 3 mM SDS, natūralios BCA smailės plotas sumažėjo, nes pailgėjo baltymo buvimo kapiliaruose laikas, darome išvadą, kad BCA denatūracija, esant 3 mM SDS, vyksta panašiai kaip ir CE atskyrimo metu. (21).

Mes taip pat išanalizavome baltymų renatūravimo tarpinius produktus pašalinus SDS iš tirpalo (5 pav., kuris skelbiamas kaip pagalbinė informacija PNAS svetainėje) (22). Dauguma baltymų laipsniškai pereina prie vietinio mobilumo, mažėjant SDS koncentracijai bėgimo buferyje. Šių eksperimentų metu nė vienas baltymas negrįžta į sulankstyto baltymo mobilumą, kai SDS buvo pašalintas iš buferio. (SOD ir streptavidinas yra išimtys, jie tiesiog nedenatūruoja mūsų eksperimentuose.) Perlankstymas yra akivaizdžiai lėtesnis nei išsiskleidimas tokiomis sąlygomis. Mes ištyrėme BCA nepriklausomai (21, 23) ir žinome, kad pašalinus SDS jis visiškai susilanksto, kai laiko konstanta yra ≈10 min. Mes negalime numatyti ilgalaikio kitų baltymų elgesio.

Mūsų pastebėtas platus elgesio spektras siūlo strategijas, kaip diferencijuoti baltymus mišiniuose, remiantis SDS naudojimu. Pavyzdžiui, vienas iš galimų neatidėliotinų šios technikos pritaikymų būtų palyginti paprastų mišinių elektroferogramų supaprastinimas (galbūt gaunamas kaip tarpiniai mišiniai gryninant). 2 pav. parodytas pavyzdys. Elektroforezės buferyje be SDS smailės, atitinkančios natūralų mioglobiną, BCA ir SOD, sutampa. Kadangi čia esančių baltymų stabilumas labai skiriasi nuo SDS, paleidus mėginį su pakankamai SDS, kad būtų galima denatūruoti vieną ar daugiau baltymų tipų, galima geriau kiekybiškai įvertinti visus mėginyje esančius baltymus.

Mioglobino, BCA, SOD ir α-LgbB mišinys didėjančiose SDS koncentracijose CE atskyrimo buferyje. Denatūravimo tvarka didėjant SDS koncentracijai yra mioglobinas, β-LgbB, BCA ir SOD, kurie nedenatūruoja esant šio eksperimento SDS koncentracijoms.

Mes taip pat išnagrinėjome šio metodo taikymą nefrakcionuotam serumui (6 pav., kuris paskelbtas kaip pagalbinė informacija PNAS svetainėje). Serumas yra sudėtingas mišinys, o rezultatai yra sudėtingi. Keičiantis SDS koncentracijai, pastebimi elektroferogramų pokyčiai, o smailės dėl gausiausių baltymų (įskaitant albuminą ir γ-globulinus) pasislenka ir atskleidžia daug naujų, anksčiau neaiškių smailių. Tačiau pokyčiai yra pernelyg sudėtingi, kad juos būtų galima interpretuoti be daugiau žinių apie prisidedančius baltymus.

Todėl SDS tirpaluose esantys baltymai pasižymi daugybe būdingų elgsenų, kurių nenumatyta iš patirties naudojant SDS/PAGE. CZE yra patogus, didelės raiškos analizės įrankis, galintis pateikti tarpinių junginių skaičių sąveikaujant SDS su baltymais, šiek tiek informacijos apie šių tarpinių produktų sudėtį ir pusiau kiekybinę informaciją apie jų tarpusavio konversijos kinetiką – visa tai vienoje lengvai pasiekiamoje klasėje. atliko eksperimentus. Nors daugiausia dėmesio skyrėme SDS, manome, kad kitos aktyviosios paviršiaus medžiagos, ypač kitos įkrautos paviršiaus aktyviosios medžiagos, suteiks papildomos informacijos.

Kuo ši gausybė informacijos gali būti panaudota proteomikoje ir baltymų chemijoje? Galime spėlioti. Gali būti įmanoma (i) atskirti vieną baltymą nuo kito remiantis skirtingu agregatų susidarymu arba išsiskleidimu / denatūravimu (ii) pakeiskite persidengiančias CZE smailes, kad pagerintumėte analitinę skiriamąją gebą (iii) naudoti informaciją, gautą iš mobilumo pokyčių, kaip SDS funkciją (po kalibravimo), kad padarytų informaciją apie baltymų ir baltymų·SDS agregatų stabilumą ir galbūt struktūrą. Nors daugumą šios technikos detalių dar reikia tobulinti, CE ir įkrautų paviršinio aktyvumo medžiagų derinys (galbūt kartu su neįkrautomis) gali suteikti įvairios informacijos apie baltymus ir tai padaryti naudojant baltymams plačiai prieinamas procedūras. biochemikai. Baltymų chemijoje problemos yra tokios sudėtingos, kad visada praverčia nauji analizės ir atskyrimo įrankiai.


Baltymas

Biologinė makromolekulė, sudaryta iš įvairių α-amino rūgščių, kurios yra sujungtos peptidiniais ryšiais. Peptidinė jungtis yra amido jungtis, susidaranti reaguojant α-amino grupei (—NH2) vienos aminorūgšties su kitos aminorūgšties karboksilo grupe (𠅌OOH), kaip parodyta toliau. Baltymai paprastai turi nuo 50 iki 1000 aminorūgščių liekanų vienoje polipeptido grandinėje. Pamatyti Peptidas

Atsiradimas

Baltymai yra svarbūs visose biologinėse sistemose, atliekantys įvairius struktūrinius ir funkcinius vaidmenis. Jie sudaro pirminį organinį struktūrų, tokių kaip plaukai, sausgyslės, raumenys, oda ir kremzlės, pagrindą. Visi fermentai, biocheminių virsmų katalizatoriai, savo prigimtimi yra baltyminiai. Daugelis hormonų, tokių kaip insulinas ir augimo hormonas, yra baltymai. The substances responsible for oxygen and electron transport (hemoglobin and the cytochromes, respectively) are conjugated proteins that contain a metalloporphyrin as the prosthetic group. Chromosomes are highly complex nucleoproteins, that is, proteins conjugated with nucleic acid. Viruses are also nucleoprotein in nature. Of the more than 200 amino acids that have been discovered either in the free state or in small peptides, only 20 amino acids are present in mammalian

Specificity

The linear arrangement of the amino acid residues in a protein is termed its sequence (primary structure). The sequence in which the different amino acids are linked in any given protein is highly specific and characteristic for that particular protein.

This specificity of sequence is one of the most remarkable aspects of protein chemistry. The number of possible permutations of sequence in even so small a protein as insulin, of molecular weight 5732 and with 51 amino acid residues, is astronomic: 1051 permutations. Yet it has been established that the pancreatic cell of a given species has only one of these possible sequences. The elucidation of the mechanism conferring such a high degree of specificity on the biosynthetic reactions by which proteins are built up from free amino acids has been one of the key problems of modern biochemistry. Pamatyti Molekulinė biologija

Proteins are not stretched polymers rather, the polypeptide backbone of the molecule can fold in several ways by means of hydrogen bonds between the carbonyl oxygen and the amide nitrogen. The folding of each protein is determined by its particular sequence of amino acids. The long polypeptide chains of proteins, particularly those of the fibrous proteins, are held together in a rather well-defined configuration. The backbone is coiled in a regular fashion, forming an extended helix. As a result of this coiling, peptide bonds separated from one another by several amino acid residues are brought into close spatial approximation. The stability of the helical configuration can be attributed to hydrogen bonds between these peptide bonds.

In addition to hydrogen bonds, there are electrostatic interactions, such as those between COO - and NH3 + groups of the side chains, and van der Waals forces, that is, hydrophobic interactions, which help to determine the configuration of the polypeptide chain. The term secondary structure is used to refer to all those structural features of the polypeptide chain determined by noncovalent bonding interactions.

In addition to the α-helical sections of proteins, there are segments that contain β-structures in which there are hydrogen bonds between two polypeptide chains that run in parallel or antiparallel fashion.

The tertiary structure (third level of folding) of a protein comes about through various interactions between different parts of the molecule. Disulfide bridges formed between cysteine residues at different locations in the molecule can stabilize parts of a three-dimensional structure by introducing a primary valence bond as a cross-link. Hydrogen bonds between different segments of the protein, hydrophobic bonds between nonpolar side chains of amino acids such a phenylalanine and leucine, and salt bridges such as those between positively charged lysyl side chains and negatively charged aspartyl side chains all contribute to the individual tertiary structure of a protein.

Finally, for those proteins that contain more than one polypeptide chain per molecule, there is usually a high degree of interaction between each subunit, for example, between the α- and β-polypeptide chains of hemoglobin. This feature of the protein structure is termed its quarternary structure.

Savybės

The properties of proteins are determined in part by their amino acid composition. As macromolecules that contain many side chains that can be protonated and unprotonated depending upon the pH of the medium, proteins are excellent buffers. The fact that the pH of blood varies only very slightly in spite of the numerous metabolic processes in which it participates is due to the very large buffering capacity of the blood proteins.

Biosynthesis

The processes by which proteins are synthesized biologically have become one of the central themes of molecular biology. The sequence of amino acid residues in a protein is controlled by the sequence of the DNA as expressed in messenger RNA at ribosomes. Pamatyti Deoxyribonucleic acid (DNA), Ribonucleic acid (RNA), Ribosomes

Degradavimas

As with many other macromolecular components of the organism, most body proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation (proteolysis). During proteolysis, the peptide bond that links the amino acids to each other is hydrolyzed, and free amino acids are released. The process is carried out by a diverse group of enzymes called proteases. During proteolysis, the energy invested in generation of the proteins is released. Pamatyti Fermentas

Distinct proteolytic mechanisms serve different physiological requirements. Proteins can be divided into extracellular and intracellular, and the two groups are degraded by two distinct mechanisms. Extracellular proteins such as the plasma immunoglobulins and albumin are degraded in a process known as receptor-mediated endocytosis. Ubiquitin-mediated proteolysis of a variety of cellular proteins plays an important role in many basic cellular processes such as the regulation of cell cycle and division, differentiation, and development DNA repair regulation of the immune and inflammatory responses and biogenesis of organelles.

Molecular chaperones

Molecular chaperones are specialized cellular proteins that bind nonnative forms of other proteins and assist them to reach a functional conformation. The role of chaperone proteins under conditions of stress, such as heat shock, is to protect proteins by binding to misfolded conformations when they are just starting to form, preventing aggregation then, following return of normal conditions, they allow refolding to occur. Chaperones also play essential roles in folding under normal conditions, providing kinetic assistance to the folding process, and thus improving the overall rate and extent of productive folding.

Protein engineering

The amino acid sequences, sizes, and three-dimensional conformations of protein molecules can be manipulated by protein engineering, in which the basic techniques of genetic engineering are used to alter the genes that encode proteins. These manipulations are used to generate proteins with novel activities or properties for specific applications, to discover structure-function relationships, and to generate biologically active minimalist proteins (containing only those sequences necessary for biological activity) that are smaller than their naturally occurring counterparts.

Many subtle variations in a particular protein can be generated by making amino acid replacements at specific positions in the polypeptide sequence. For example, at any specific position an amino acid can be replaced by another to generate a mutant protein that may have different characteristics by virtue of the single replaced amino acid. Amino acids can also be deleted from a protein sequence, either individually or in groups. These proteins are referred to as deletion mutants. Deletion mutants may or may not be missing one or more functions or properties of the full, naturally occurring protein. Moreover, part or all of a protein sequence can be joined or fused to that of another protein. The resulting protein is called a hybrid or fusion protein, which generally has characteristics that combine those of each of the joined partners.