Informacija

Biotinilintos RNR eliucija

Biotinilintos RNR eliucija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aš naudoju Neutravidin Agarozės granules, kad išskirčiau biotiniluotą RNR. Reikalas tas, kad vadove sakoma, kad biotinilintoms molekulėms eliuuoti reikia naudoti 8M guanidino-HCl, pH 1,5. Kiek žinau, tai labai griežtas eliuavimo buferis. Ar manote, kad tai paveiks mano RNR? Aš išskyriau savo RNR su TRIzol, kuriame taip pat yra guanidino druskos, tačiau koncentracija nėra tokia didelė.

Antras klausimas, ar žinote kitų būdų, kaip iš bičių susmulkintos RNR išplauti iš karoliukų?

Dėkoju!


Biotino ir streptavidino sąveika itin stipri, viena stipriausių (jei ne į stipriausia) nekovalentinė sąveika tarp biomolekulių. Taigi bet kuriuo atveju jums reikės gana atšiaurių sąlygų.

Ekstremalios pH vertės paprastai yra labai bloga RNR idėja. Esu tikras, kad jūsų minėtos sąlygos nėra skirtos nukleorūgščių eliuavimui. Tokios žemos pH vertės (ir didelės pH vertės) lemia greitą RNR fosfoesterio jungties hidrolizę, daugiau apie to mechanizmą galite perskaityti šioje apžvalgoje.

Greita „Google“ paieška atvedė mane prie šio protokolo:

Norėdami atskirti biotinilintas nukleino rūgštis nuo Streptavidin-Coupled Dynabeads®, granules inkubuokite 95% formamido + 10 mM EDTA, pH 8,2, 5 minutes 65 °C temperatūroje arba 2 minutes 90 °C temperatūroje.

Man tai skamba pagrįstai, nes formamidas taip pat dažnai naudojamas mėginių buferyje RNR gelio elektroforezei denatūruoti. Aš pats nieko panašaus nedariau, todėl negaliu garantuoti, kad jūsų atveju tai pavyks.


Kiekybinis biotinilintų baltymų išgavimas iš streptavidino pagrindu pagamintų afinitetinės chromatografijos dervų

Stipri streptavidino ir biotino sąveika yra viena iš dažniausiai naudojamų chemijos ir biologijos priemonių. Siekiant palengvinti jų atkūrimą, imobilizavimą ir aptikimą naudojant reagentus, kurių sudėtyje yra streptavidino, buvo pristatyti metodai, kaip lengvai išgauti įvairias molekules (ypač baltymus) su biotinu. Tačiau, jei pageidaujama, biotinilintų baltymų išsiskyrimas iš reagentų, kurių pagrindą sudaro streptavidinas, išlieka pagrindine problema dėl nepaprasto šio komplekso stabilumo. Šiame skyriuje pateikiamas mūsų laboratorijoje sukurtas protokolas, skirtas kiekybiniam biotinilintų baltymų eliuavimui iš streptavidino sefarozės, apibūdinantis atšiaurias eliucijos sąlygas ir konkurenciją su laisvu biotinu. Metodo naudingumą rodo biotinilintų baltymų išgavimas iš organų homogenatų, gautų iš pelių, perfuzuotų reaktyviu biotino esterio dariniu.


Biotino ir avidino sąveikos atradimas

Trečiojo dešimtmečio pabaigoje buvo pastebėta, kad gyvūnai, šeriami daugiausia kiaušinių baltymu, sukels odos pažeidimus ir kitas baisias sveikatos problemas. Ši liga buvo vadinama „kiaušinio baltymo sužalojimu“ ir nustatyta, kad ji atsirado dėl vitamino H trūkumo, vėliau pervadinto į vitaminą B7/biotiną. Kiaušinio baltymo sužalojimas vargintų šiuos gyvūnus, net jei jų mityba būtų papildyta biotinu. Taigi kažkas kiaušinio baltyme neleido absorbuoti biotino. 1940 m. Esmond E. Snell sugebėjo išvalyti baltymą, atsakingą už biotino surišimą, avidiną. Avidinas buvo teisingai pavadintas vištiena, „paukščiu“, kiaušiniu, iš kurio jis buvo išvalytas. Vėliau Snell patvirtino, kad avidinas iš tiesų buvo kiaušinio baltymo pažeidimo kaltininkas, maitindamas žiurkes išgrynintu avidinu (Kresege ir kt., 2004). Avidinas yra glikoproteinas, susidedantis iš keturių vienodų subvienetų, kurie kiekvienas gali surišti vieną biotino molekulę.

Biotinas ir avidinas turi labai stiprų giminingumą vienas kitam. Tiesą sakant, ryšys tarp jų yra viena iš stipriausių nekovalentinių baltymų ir ligandų sąveikų, randamų gamtoje. Sukūrus ryšį, jis neturi įtakos pH, temperatūros ar organinių tirpiklių pokyčiams.


Kategorijos

Naujausios žinutės

Autorių teisių pareiškimas

© „Promega Corporation“, 2009–2020 m.
Visos teisės saugomos. Neleistinas šios medžiagos naudojimas ir (arba) kopijavimas be aiškaus ir raštiško šios „Promega Corporation“ leidimo yra griežtai draudžiamas. Gali būti naudojamos ištraukos ir nuorodos, su sąlyga, kad Promega Corporation bus suteikta visapusiška ir aiški nuoroda su atitinkama ir konkrečia nuoroda į pradinį turinį. Daugiau informacijos rasite mūsų sąlygose.

Redakcinė politika

Nors skatiname atvirą ir nuoširdų pokalbį, pasiliekame teisę redaguoti arba pašalinti komentarus, kuriuose yra įžeidžiančios, nešvankios ar nešvankios kalbos. Taip pat pašaliname komentarus, kuriuose yra arba skatinami moksliniai melai arba dezinformacija.

Apdovanojimai

X Mes naudojame slapukus ir panašias technologijas, kad mūsų svetainė veiktų, vykdytų analizę, tobulintų mūsų svetainę ir rodytų suasmenintą turinį bei reklamą. Kai kurie iš šių slapukų yra būtini, kad mūsų svetainė veiktų. Kitiems mes jų nenustatysime, nebent jūs juos priimsite. Norėdami sužinoti daugiau apie mūsų požiūrį į privatumą, kviečiame skaityti daugiau

Spustelėdami „Priimti viską“ sutinkate su VISŲ slapukų naudojimu. Tačiau norėdami pateikti kontroliuojamą sutikimą, galite apsilankyti slapukų nustatymuose.

Privatumo apžvalga

Mes naudojame slapukus ir panašias technologijas, kad mūsų svetainė veiktų, vykdytų analizę, tobulintų mūsų svetainę ir rodytų suasmenintą turinį bei reklamą. Kai kurie iš šių slapukų yra būtini, kad mūsų svetainė veiktų. Kitiems jų nenustatysime, nebent priimsite. Norėdami sužinoti daugiau apie slapukus ir kaip juos valdyti, perskaitykite mūsų slapukų politiką.

Jei esate EEE, Jungtinėje Karalystėje arba Šveicarijoje, savo nustatymus galite bet kada pakeisti mūsų svetainės poraštėje spustelėdami Tvarkyti sutikimą dėl slapukų.


Filialai

Chemijos ir biochemijos katedra, Pietų Misisipės universitetas, Hattiesburg, 39406, Misisipė, JAV

Faqing Huang, June He ir Yilin Zhang

Pietų Misisipės universiteto biologijos mokslų katedra

Hattiesburg, 39406, Misisipė, JAV

Šio autoriaus taip pat galite ieškoti „PubMed Google Scholar“

Šio autoriaus taip pat galite ieškoti „PubMed Google Scholar“

Šio autoriaus taip pat galite ieškoti „PubMed Google Scholar“

Šio autoriaus taip pat galite ieškoti „PubMed Google Scholar“

Autorius susirašinėjimui


RNR ir RNR sąveikos žemėlapis visame pasaulyje naudojant biotinilintą psoraleną

Čia mes išsamiai aprašome metodą Slyginimas Psusietas soralenas, Liged, ir Sišrinktas Hhibridai (SPLASH), leidžiantys genomo mastu atvaizduoti intramolekulinę ir tarpmolekulinę RNR-RNR sąveiką in vivo. SPLASH gali būti taikomas tiriant organizmų, įskaitant mieles, bakterijas ir žmones, RNR sąveikas.

Bendras šio vaizdo įrašo tikslas yra aprašyti psoraleno susietų surištų ir pasirinktų hibridų arba SPLASH sekos nustatymo metodą, kuriame poros požiūriu in vivo RNR-RNR sąveika yra atvaizduojama viso genomo būdu. Šis metodas yra paprastas, didelio našumo metodas RNR sąveikos atvaizdavimui in vivo. Šis metodas gali padėti atsakyti į pagrindinius klausimus RNR genomikos srityje, pavyzdžiui, kaip skirtingi regionai palei vieną RNR grandinę arba tarp skirtingų RNR krypčių sąveikauja tarpusavyje.

Nors šis metodas gali suteikti įžvalgų apie mieles ir žmogaus ląsteles, jis taip pat gali būti taikomas tiriant kitus šiuolaikinius organizmus, įskaitant bakterijas ir ląstelių membranas. Pirmą kartą šio metodo idėja kilo mums, kai norėjome sugalvoti molekulinės sąveikos žemėlapį. Atminkite, kad šioje procedūroje yra keli sustojimo taškai.

Šiuo metu eksperimentas gali būti trumpam arba neribotam laikui pristabdytas. Išsamią informaciją rasite pridedamame tekste. Šią procedūrą pradėkite du kartus plaudami HeLa ląsteles penkiais mililitrais PBS.

Vieną minutę pastatykite indą vertikaliai, kad visiškai nutekėtų PBS perteklius. Tada įpilkite vieną mililitrą PBS, kuriame yra 200 mikromolių biotinilinto psoraleno ir 0,01%digitonino, kuris padidina ląstelių pralaidumą. Stenkitės tolygiai įpilti tirpalo ant ląstelių paviršiaus.

Inkubuokite 37 laipsnių Celsijaus temperatūroje penkias minutes. Po inkubacijos nuimkite indo dangtelį ir padėkite jį ant ledo, esančio UV kryžminio maišytuvo viduje, tris centimetrus nuo UV lemputės. Švitinkite 365 nanometrų UV spinduliais 20 minučių.

Po 20 minučių išimkite lėkštelę iš Crosslinker, tada išskirkite fragmentą ir nusodinkite RNR iš HeLa ląstelių pagal pridedamame dokumente pateiktas instrukcijas. Įdėkite denatūruotas kopėčias ir RNR mėginius ant 8,6 cm kvadrato 6%TBE-karbamido gelio. Dydis frakcionuojamas elektroforezės būdu, esant 180 voltų įtampai 40 minučių.

Dažykite gelį 10 mililitrų TBE buferio, kuriame yra 1:10 000 praskiedimo nukleorūgščių gelio dėmės, penkias minutes tamsoje. Kol gelis dažosi, naudokite 24 dydžio adatą, kad pradurtumėte švarų 0,6 mililitro mikrofugos vamzdelį apačioje. Įdėkite jį į dviejų mililitrų mikrofūgos mėgintuvėlį.

Naudodami transiliuminatorių, vizualizuokite juosteles ant dažyto gelio ir supjaustykite gelio gabalėlį, atitinkantį 90–110 nukleotidų. Perkelkite gelio gabalėlį į pradurtą 0,6 mililitrų mikrofūgos mėgintuvėlį dviejų mililitrų mikrofugos mėgintuvėlyje. Dydžio pasirinkimas leidžia nustatyti minimalų chimerinių fragmentų ilgį ir vėliau atskirti ligatyvinius produktus nuo nesusijusių produktų.

Centruokite gelio skilteles 12 000 kartų g kambario temperatūroje dvi minutes, kad susmulkintumėte gelio gabalėlį ir surinktumėte į dviejų mililitrų mikrofugos mėgintuvėlį. Po gręžimo išmeskite tuščią 0,6 mililitro mikrofugos mėgintuvėlį. Į susmulkintą gelio gabalėlį įpilkite 700 mikrolitrų eliuavimo buferio.

Inkubuokite keturių laipsnių Celsijaus temperatūroje per naktį, nuolat sukdamiesi, kad mėginiai būtų išsklaidyti į buferį. Gelio griežinėliai ir eliuavimo buferis perkeliami į centrifugos mėgintuvėlio filtrą ir 20 minučių centrifuguojami 20 000 kartų g. Po sukimo gelio skiltelės bus įstrigusios viršutiniame filtro skyriuje, kurį galima išmesti.

Nusodinkite ir kiekybiškai įvertinkite RNR, kaip aprašyta lydimajame dokumente. Greitai užšaldykite ir laikykite RNR minus 80 laipsnių Celsijaus temperatūroje skystame azote, kol ji bus naudojama. Norėdami praturtinti RNR kryžminimo sritis, pirmiausia įpilkite 100 mikrolitrų lizės buferio, kuriame yra RNazės inhibitoriaus, kad nuplautumėte streptavidinu dengtus magnetinius rutuliukus mikrofugalo mėgintuvėlyje.

Į 15 mililitrų kūginį centrifugos mėgintuvėlį įpilkite du mililitrus ką tik paruošto hibridizacijos buferio, vieną mililitrą papildyto lizės buferio, 1,5 mikrogramo dydžio frakcionuotos RNR ir 100 mikrolitrų resuspenduotų granulių. Švelniai sukrėskite mėgintuvėlį. Inkubuokite 37 laipsnių Celsijaus temperatūroje 30 minučių, sukdami nuo galo iki galo.

Po inkubacijos karoliukus penkis kartus nuplaukite iš anksto pašildytu plovimo buferiu. Penkto plovimo pabaigoje vieną minutę ant magnetinio stovo padėkite mikrofugos mėgintuvėlį su karoliukais, tada nuimkite plovimo buferį. Į išplautas granules įpilkite vieną mililitrą šalto T4 polinukleotido kinazės buferio.

Inkubuokite karoliukus penkias minutes keturių laipsnių Celsijaus temperatūroje, sukdami nuo galo iki galo. Ant magnetinės juostelės uždėkite mikrofugos mėgintuvėlį su karoliukais. Po minutės švelniai pašalinkite buferį.

Pakartokite šį veiksmą iš viso du kartus ir po paskutinio plovimo pašalinkite buferį. Tada vadovaukitės pridedamame dokumente pateiktomis instrukcijomis, kad konvertuotumėte penkis pirminius ir tris pirminius galus, kad jie būtų suderinami su perrišimu, ir atlikite artumo perrišimą. Po plovimo į granules įpilkite 100 mikrolitrų RNR PK buferio ir pakartotinai suspenduokite pipete aukštyn ir žemyn.

Mėginius kaitinkite 95 laipsnių Celsijaus temperatūroje 10 minučių ant kaitinimo bloko. Tada vieną minutę atšaldykite mėginį ant ledo. Į mėginį įpilkite 500 mikrolitrų guanidinio tiocianato-fenolio-chloroformo.

Maišykite intensyviai maišydami 10 sekundžių. Inkubuokite mišinį kambario temperatūroje 10 minučių. Po inkubacijos naudokite rinkinį, kad nusodintumėte, išvalytumėte ir atgautumėte RNR, užtikrinkite, kad būtų išsaugotos net mažos RNR.

RNR eliuuojama 100 mikrolitrų vandens be nukleazių. Perkelkite 100 mikrolitrų išplautų mėginių į 24 duobučių plokštelės šulinį. Laikant mėginį ant ledo, ultravioletinė spinduliuotė jį apšvitina 254 nanometrais penkias minutes.

Perkelkite atvirkštinio skersinio ryšio mėginį į švarų mikrofugos mėgintuvėlį. Įpilkite 10 mikrolitrų natrio acetato, vieną mikrolitrą glikogeno ir 300 mikrolitrų 100%etanolio. RNR nusodinkite minus 20 laipsnių Celsijaus temperatūroje mažiausiai vieną valandą.

Norėdami atgauti RNR, nusodintą RNR centrifuguokite 20 000 kartų g 30 minučių keturių laipsnių Celsijaus temperatūroje. Po sukimo pašalinkite supernatantą ir įpilkite vieną mililitrą 70 % šalto etanolio, kad išplautumėte RNR nuosėdas. Išplautas granules centrifuguokite 20 000 kartų g 15 minučių 4 laipsnių Celsijaus temperatūroje.

Pašalinkite plovimo buferį ir įpilkite 4,25 mikrolitrų vandens be nukleazės, kad suspenduotumėte RNR. Perkelkite RNR į 0,2 mililitro PGR mėgintuvėlį. Galiausiai, atvirkštinis transkribavimas, cirkuliavimas ir amplifikacija pagal cDNA pagal pridedamame dokumente pateiktas instrukcijas.

Šioje schemoje pavaizduota SPLASH darbo eiga. Pridėjus biotinilinto psoraleno, esant 0,01% digitonino ir UV kryžminimo, iš ląstelių išgaunama visa RNR ir atliekamas taškinis blotavimas, siekiant užtikrinti, kad kryžminis ryšys buvo veiksmingas. Tada biotinilintos 20 bazių oligos naudojamos kaip teigiamos kontrolinės medžiagos, titruojant į ląsteles pridedamo biotinilinto psoraleno kiekį taip, kad maždaug vienas iš 150 bazių būtų susietas.

Tada atliekama nedidelio masto PGR amplifikacija, naudojant didėjantį PGR ciklų skaičių, kad būtų nustatytas minimalus ciklų skaičius, reikalingas giliajai sekos nustatymui. Veiksmingo bibliotekos paruošimo proceso metu cDNR sekos biblioteka gali būti sustiprinta iš 1,5 mikrogramo dydžio RNR įvesties per mažiau nei 15 PGR amplifikacijos ciklų. Tada biblioteka suskirstoma naudojant du 150 bazinių porų skaitymus aukštoje sekos mašinoje.

Tada sekos nuskaitymai apdorojami pagal skaičiavimo schemą. Galutinis rezultatas yra filtruotų chimerinių sąveikų sąrašas, apimantis ir intramolekulinę, ir tarpmolekulinę RNR-RNR sąveiką transkripte. Bandant šią procedūrą, svarbu nepamiršti patikrinti, ar biotinilintas psoralenas yra įtrauktas naudojant SPLASH naujiems organizmams.

Po jo sukūrimo ši technika atvėrė kelią RNR biologijos tyrinėtojams tyrinėti RNR sąveiką įvairiuose organizmuose. Peržiūrėję šį vaizdo įrašą, turėtumėte gerai suprasti, kaip sukurti sekos biblioteką, kurioje užfiksuojama porinė RNR sąveika visame pasaulyje.


ĮVADAS

Baltymų ir baltymų sąveikos (PPI) ir tarpląstelinių proteomų atvaizdavimas yra svarbi strategija, padedanti atskleisti biologinius ligos reiškinius ir mechanizmus. Naujai sukurti nuo artumo priklausomi biotinilinimo metodai, tokie kaip APEX ir BioID, palengvina PPI ir subcellulinių proteomų atradimą gyvose ląstelėse. Taikant šiuos metodus, dominančio baltymo (masalo), sujungto su inžineriniu fermentu, ekspresija ląstelėse sukelia nuo artumo priklausomą dominančių baltymų biotinilinimą. Abiem šiais metodais naudojamas išoriškai tiekiamas biotinas arba jo analogas, kad jie būtų naudojami kaip molekuliniai zondai, kuriuos naudoja fermentai. APEX sistema naudoja inžinerinį askorbato peroksidazės fermentą APEX2, kuris naudoja vandenilio peroksidą, kad katalizuotų biotino-fenolio perkėlimą į tirozino likučius baltymuose. 2,3 BioID taip pat remiasi sukurta biotino ligaze, vadinama BirA* 4,5, kad susidarytų biotinoil-5 ′-AMP, kuris reaguoja su baltymų lizino liekanomis. 6

Biotiniluotų baltymų, gautų naudojant šias strategijas, identifikavimas iki šiol buvo pagrįstas gaudymu naudojant streptavidino baltymų šeimą, po to buvo virškinama granulėmis arba virškinama gelyje, o po to buvo atlikta LC−MS/MS analizė. Nors šie metodai buvo sėkmingai naudojami, jie abu priklauso nuo nustatytų nebiotinilintų peptidų, kaip biotinilinimo pakaitalų, naudojimo, nes biotinilinti peptidai retai aptinkami, jei iš viso aptinkami. Priežastis, kodėl biotinilinti peptidai retai nustatomi, visų pirma yra dėl stipraus streptavidino afiniteto biotinui. Kai naudojamas virškinimas gelyje, prieš elektroforezę reikia eliuuoti biotiniluotus baltymus. Buvo sukurti keli eliuavimo metodai, naudojant ploviklius, 7 itin žemą pH 8 arba tirpiklius 9, ir buvo naudojamos alternatyvios strategijos, įskaitant susilpnėjusį streptavidino/avidino afinitetą biotinui cheminėmis 10 ar genetinėmis 11 priemonėmis. Tačiau net ir dėl šių modifikacijų tik iš dalies atsigauna biotinilinti baltymai iš streptavidino, 12 ir nebiotinilintų peptidų, kurie visada gerokai viršija biotinilintų peptidų skaičių. 2 Gerų eliuavimo strategijų poreikis buvo apeinamas naudojant virškinimą ant granulių, kuris tapo patogiu ir plačiai naudojamu metodu atliekant nuo artumo priklausančius biotinilinimo eksperimentus. Tačiau biotinilinti peptidai lieka susieti su karoliukais ir nėra aptinkami, nes streptavidino ir#x02212biotino sąveika nėra sutrikdyta. Taikant kitokį požiūrį, kuris nepatiria ką tik aprašytų apribojimų, Schiapparelli ir kt. aprašė strategiją, pavadintą „DiDBiT“ (tiesioginis biotino turinčių žymių aptikimas), kai jie pirmiausia suvirškino baltymus į peptidus, o po to praturtino biotinilintus peptidus, naudodami „NeutrAvidin“. Kadangi šis metodas daugiausia buvo išbandytas naudojant biotinilintus baltymus in vitro, mes manėme, kad stiprus NeutrAvidin afinitetas biotinui vis tiek gali apriboti biotinilintų peptidų aptikimą, ypač atsižvelgiant į biotinilinimą in vivo, pavyzdžiui, taikant nuo artumo priklausančius biotinilinimo metodus. bendras biotinilinimo lygis gali būti žemas.

Siekdami pagerinti biotiniluotų peptidų aptikimą, sukūrėme strategiją Biografijatinilinimas Site denti ® katijonas Technologija (BioSITE). Mes parodome, kad biotiniluotų peptidų aptikimas labai padidina kandidato baltymo identifikavimo pasitikėjimą nuo artumo priklausančiais biotinilinimo metodais. Pateikiant šiais metodais pažymėtų baltymų biotinilinimo vietą, šis metodas taip pat suteikia naujo lygio informaciją apie struktūrinius PPI aspektus ir baltymų topologiją. Galiausiai aprašome paprastą kiekybinių BioSITe eksperimentų metodą, naudojant izotopiniu būdu pažymėtą biotiną, išvengiant medžiagų apykaitos ženklinimu pagrįstų kiekybinių strategijų, tokių kaip SILAC, naudojimo. Kol šis dokumentas buvo baigtas skelbti, buvo paskelbta ataskaita apie panašią strategiją, naudojant antikūnų metodą tiesioginiam biotinilinto peptido praturtinimui. 15


Eksperimentinės procedūros

Konstrukcijos. Kodavimo sritis Escherichia coli birA biotino-baltymų ligazės genas (20) buvo klonuotas iš genominės DNR PGR būdu kaip ≈1 kb fragmentas, naudojant Deep-VENT DNR polimerazę (New England Biolabs) ir patikrintas nustatant seką. BirA genas buvo perklijuotas į BglEritroidinės ekspresijos vektoriaus pEV-puromicino II vieta, kurią sudaro žmogaus β-globino lokuso kontrolės regionas (miniLCR), žmogaus β-globino promotorius ir antrasis β-globino intronas (21). GATA-1 cDNR, klonuota pEV-neomicine, buvo pažymėta N-galu, įvedant į NcoI vieta starto kodone, oligonukleotido jungtis su NcoI perdangos kodavimo 23-aa biotinylation tag (16). Pažymėtas eritroidinio Krüppel tipo faktoriaus (EKLF) cDNR buvo sukurta pBluescript, nuosekliai klonuojant į NcoI vietos pradžios kodonas pirmiausia yra oligonukleotidas, koduojantis tris hemagliutinino žymos kopijas, po to-oligonukleotidas, koduojantis 23-aa biotinilinimo žymę. Tada pažymėtas EKLF buvo subklonuotas į pEV-neomiciną.

Pelių eritroleukemijos (MEL) ląstelių transfekcijos. MEL ląstelės (22) iš pradžių buvo elektroporuotos su linearizuotu BirA / pEV, o stabilūs klonai buvo atrinkti naudojant puromiciną. Klonai buvo tikrinami dėl BirA RNR ekspresijos atliekant Northern blot analizę. Pasirinktas BirA / pEV MEL klonas buvo transfekuotas pažymėtu GATA-1 / pEV, o stabilūs klonai buvo du kartus atrinkti puromicinui ir neomicinui (Invitrogen).

Branduolinio ekstrakto paruošimas. MEL ląstelės, kultivuotos DMEM, papildytu 10% FCS, 37 °C temperatūroje, mažiausiai 3 dienas buvo skatinamos diferencijuotis į brandžius eritroblastus su 2% DMSO (22). Ląstelės buvo surinktos centrifuguojant 640 × g ir vieną kartą išplauti šaltu PBS. Ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos 2,2 M sacharozės tirpale 10 mM Hepes, pH 7,9/25 mM KCl/0,15 mM spermato/0,5 mM spermidino/1 mM EDTA ir inkubuojamos 20 min. Ląstelės buvo lizuojamos maišytuvu, o lizė buvo patikrinta šviesos mikroskopu, dažant branduolius Unna (Methylgreen-Pyronin). Branduoliai buvo granuliuojami ultracentrifuguojant 141 000 × g 2 valandas 4 °C temperatūroje, resuspenduojamas lizės buferyje (10 mM Hepes, pH 7,9/100 mM KCl/3 mM MgCl2/0,1 mM EDTA/20 % glicerolio) ir ekstrahuojamas lašais pridedant 3,3 M KCl, kol galutinė koncentracija buvo ≈400 mM. Netirpi medžiaga buvo pašalinta ultracentrifuguojant 300 000 × g 1 valandą 4 ° C temperatūroje. Branduoliniai ekstraktai buvo padalyti į alikvotas ir laikomi –70 °C temperatūroje.

Imunobloto analizė. GATA-1 išraiškos analizei ir in vivo biotinilinimo metu, branduoliniai ekstraktai (1–2,5 μg/juosta) buvo ištirpinti SDS/PAGE 8% gelyje ir nuvalomi ant ProTran nitroceliuliozės membranos (Schleicher & amp. Schuell), naudojant standartines procedūras. Filtrai buvo užblokuoti 1 valandą 5% BSA/1 × TBS/0,2% Tween-20 ir 1 valandą inkubuojami kambario temperatūroje su anti-GATA-1 N6 žiurkių monokloniniu antikūnu (Santa Cruz biotechnologija, skiedimas 1: 5000) arba streptavidinu –krienų peroksidazės konjugatas (HRP) (NEN, skiedimas 1:10 000). Filtrai buvo plaunami 1 × TBS/0,5 M NaCl/0,3% Triton X-100 ir inkubuojami antriniame triušio anti-žiurkės antikūne (DAKO, praskiedimas 1: 3000), kaip aprašyta aukščiau. Po filtrų inkubavimo su streptavidinu-HRP antrinio antikūnų etapo nereikėjo. Filtrai buvo sukurti naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (Amersham Pharmacia).

Pririšimas prie streptavidino karoliukų. Paramagnetiniai streptavidino granulės [Dynabeads M-280, Dynal (Great Neck, NY)] buvo užblokuoti tris kartus plaunant TBS su 200 ng/μl išgryninto vištienos serumo albuminu (Sigma-Aldrich). 1 mg branduolinio ekstrakto sunaudojome ~ 20 μl karoliukų. Pririšimas buvo atliktas 1 × TBS/0, 3% Nonidet P-40 4 ° C temperatūroje 1 valandą iki nakties ant supamosios platformos, po to šešis kartus nuplauti rišamuoju tirpalu kambario temperatūroje. Susieta medžiaga buvo eliuuojama 5 minutes verdant Laemmli baltymų mėginio pakrovimo buferiu ir analizuojama imunoblotuojant, kaip aprašyta aukščiau.

MS. Baltymai, išplauti iš granulių po BirA branduolinio ekstrakto surišimo, buvo atskirti SDS/PAGE elektroforezės būdu ant 8% poliakrilamido gelio ir nudažyti koloidiniu mėlynu (Invitrogen). Visa juosta buvo iškirpta ir padalinta į mažiausiai 20 gelio kamščių, kurių kiekvienas buvo dar sumažintas iki 1 mm3 gelio gabalėlių ir išdžiovintas naudojant 100% acetonitrilą (Fluka) 60% acetonitrilu apdorotuose mėgintuvėliuose (Bioquote, York, U.K.). Baltymai buvo virškinami gelyje, naudojant modifikuotą tripsiną (Roche Diagnostics) 50 mM amonio bikarbonate. Virškinimai buvo analizuojami naudojant nanoflow skysčių chromatografiją-tandeminę MS, naudojant elektros purškimo jonizacijos kvadrupolio skrydžio laiko masės spektrometrą (Q-Tof, Micromass, Mančesteris, JK), veikiantį teigiamų jonų režimu. NanoLC sistema buvo sujungta su Q-Tof iš esmės taip, kaip aprašyta (23). Peptidų mišiniai buvo pristatyti į sistemą naudojant „Famos“ automatinį mėginių ėmiklį („LC Packings“, Amsterdamas) 3 μl/min. ]. Srauto padalijimas iki 150–200 nl/min., peptidai buvo perkelti į analitinę kolonėlę (Pep-Map, LC Packings kolonėlės matmenys 25 cm × 50 μm ID, supakuota viduje) acetonitrilo gradientu (1 % per minutę). ). Eliuuojančių peptidų suskaidymas buvo atliktas priklausomu nuo duomenų režimu, o masės spektrai buvo gauti viso nuskaitymo režimu. Duomenų bazių paieškos buvo atliktos naudojant talismaną (www.matrixscience.com).

Chromatino ištraukimo tyrimai. MEL ląstelės buvo apdorotos 1% formaldehidu 40 mM Hepes, pH 7,9, kambario temperatūroje 10 minučių, po to užgesintos 0, 125 M glicinu. Kryžminio ryšio chromatinas buvo suskaidytas ultragarsu [10 × 30 s pliūpsniai 5 amplitudėje, po to 10 × 30 s pliūpsniai 8 amplitudėje naudojant Sanyo Soniprep (Loughborough, JK) 150 soniką] ir alikvotinės dalys, atitinkančios 4–10 OD 260 vienetai buvo staigiai užšaldyti. Ištraukimas buvo atliktas inkubuojant susieto chromatino alikvotinę dalį mažiausiai 1 valandą 4 ° C temperatūroje su 20 μl streptavidinu padengtų Dynabeads, iš anksto užblokuotų 1 mg/ml BSA ir 0,4 mg/ml ultragarsu apdorotos lašišos spermos DNR. Skalbimas buvo atliktas pagal standartinius protokolus (www.upstate.com/misc/protocols.asp). Surištos medžiagos eliucija ir kryžminių nuorodų pakeitimas buvo atliktas 1% SDS TE buferiniame tirpale (10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 8,0), inkubuojant per naktį 60 ° C temperatūroje, purtant. DNR buvo gauta po deproteinizacijos, o ištrauktos DNR alikvotinės dalys buvo tiriamos PGR, naudojant pradmenis prieš eritroidinės pelės βmaj globino promotorių, kaip aprašyta Pagalbinės medžiagos ir metodai, kuris yra paskelbtas kaip pagalbinė informacija PNAS svetainėje www.pnas.org.

Transgeninės pelės. DNR fragmentai, turintys pažymėtą EKLF ir BirA eritroidinės ekspresijos kasetes, buvo išlaisvinti iš prokariotinių vektorių sekų dvigubai virškinant Aat II/Asp 718. DNR buvo išvalyta geliu, naudojant gelazę (Epicenter Technologies, Madison, WI), ir paruošta mikroinjekcijai naudojant EluTip (Schleicher & Schuell) pagal gamintojų instrukcijas. Mikroinjekcija į pelės apvaisintus kiaušinius buvo atlikta pagal standartines procedūras (24). Pelių atranka dėl transgeninių medžiagų buvo atlikta Southern blot analize, naudojant BirA cDNR ir žmogaus β-globino introną II kaip zondus.


Imobilizuota streptavidino derva (1 citata)

Streptavidinas yra tetramerinis baltymas, turintis 4 biotino surišimo vietas. Streptavidinas daugeliu atžvilgių yra panašus į avidiną, tačiau jame nėra angliavandenių, o jo molekulinė masė (apie 60 kDa) yra šiek tiek mažesnė. Streptavidino (izoelektrinis pH5) tirpumas vandeniniame buferiniame tirpale yra daug mažesnis nei avidino, tačiau streptavidino prisijungimas prie biotino yra labai panašus į avidino.

Streptavidino pranašumas yra tas, kad angliavandenių trūkumas žymiai sumažina nespecifinio surišimo kiekį.

Streptavidinas, naudojamas imobilizavimui ant poringos 6% susietos agarozės, yra rekombinantinė forma, jos masė 53 kDa ir beveik neutralus pH. Streptavidinas yra kovalentiškai sujungtas su agaroze, todėl jis yra minimaliai išplovęs ir yra stabilus esant pH diapazonui nuo 2 iki 11.

Streptavidino derva skirta vieno etapo, mažo ir didelio masto baltymų, antikūnų ir kitų molekulių, turinčių biotino žymę, afinitetiniam valymui. Derva taip pat gali būti naudojama tyrimams kurti ir baltymams imunoprotezuoti naudojant biotinu pažymėtus antikūnus.

Mūsų streptavidinas tiekiamas kaip dervos srutos arba 1 ml sukimosi kolonėlės formatas.


Aptamerų parinkimas ir eliuavimas naudojant nanoporines sol-gelio matricas su integruotais mikrošildytuvais

Jei nesate šio straipsnio autorius ir norite iš jo atgaminti medžiagą trečiosios šalies, ne RSC, leidinyje, turite oficialiai paprašyti leidimo naudodami Autorių teisių patvirtinimo centrą. Norėdami gauti daugiau informacijos, apsilankykite mūsų puslapyje „Autorių teisių patvirtinimo centro naudojimo instrukcijos“.

Autoriams, prisidedantiems prie RSC publikacijų (žurnalų straipsnių, knygų ar knygų skyrių), nereikia oficialiai prašyti leidimo atgaminti šiame straipsnyje pateiktą medžiagą, jei kartu su atgaminta medžiaga pateikiamas teisingas patvirtinimas.

Atkurta medžiaga turėtų būti priskiriama taip:

  • NŽC medžiagos atkūrimui:
    Pagaminta iš nuorodos XX gavus leidimą iš Nacionalinio de la Recherche Scientifique centro (CNRS) ir Karališkosios chemijos draugijos.
  • Medžiagos atgaminimui iš PCCP:
    Atkurta iš nuor. XX su PCCP savininkų draugijų leidimu.
  • Medžiagos atgaminimui iš PPS:
    Pagaminta iš nuorodos XX gavus leidimą iš Europos fotobiologijos draugijos, Europos fotochemijos asociacijos ir Karališkosios chemijos draugijos.
  • Norėdami atgaminti medžiagą iš visų kitų RSC žurnalų ir knygų:
    Atkurta iš nuor. XX gavus Karališkosios chemijos draugijos leidimą.

Jei medžiaga buvo pritaikyta, o ne atgaminta iš originalaus RSC leidinio „Atgaminta iš“ gali būti pakeista „Adaptuota iš“.

Visais atvejais nuorodą Nr. XX yra XX nuoroda nuorodų sąraše.

Jei esate šio straipsnio autorius, jums nereikia oficialiai prašyti leidimo atgaminti šiame straipsnyje esančius paveikslus, diagramas ir pan. trečiųjų šalių leidiniuose arba disertacijoje, su sąlyga, kad kartu su atgaminta medžiaga pateikiamas teisingas patvirtinimas.

Atgaminta medžiaga turėtų būti priskirta taip:

  • NŽC medžiagos atkūrimui:
    [Originali citata] – Atkurta gavus Karališkosios chemijos draugijos (RSC) leidimą Nacionalinio mokslo mokslo centro (CNRS) ir RSC vardu.
  • Medžiagos atgaminimui iš PCCP:
    [Originali citata] – atkurta gavus PCCP savininkų draugijų leidimą
  • Medžiagos atgaminimui iš PPS:
    [Originali citata] – Atkurta gavus Karališkosios chemijos draugijos (RSC) leidimą Europos fotobiologijos draugijos, Europos fotochemijos asociacijos ir RSC vardu
  • Jei norite atkurti medžiagą iš visų kitų RSC žurnalų:
    [Originali citata] - dauginama gavus Karališkosios chemijos draugijos leidimą

Jei esate šio straipsnio autorius, vis tiek turite gauti leidimą atkurti visą straipsnį trečiosios šalies leidinyje, išskyrus viso straipsnio atkūrimą disertacijoje ar disertacijoje.

Informaciją apie medžiagos, skirtos RSC straipsniams, turinčioms skirtingas licencijas, atgaminimą rasite mūsų leidimų prašymų puslapyje.