Informacija

PGR alternatyvos

PGR alternatyvos


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

PGR naudoja šildymo ir aušinimo ciklus, kad denatūruotų sruogas, todėl reikia specialių termostabilių DNR polimerazių. Ląstelėje replikacijos metu Helicase išvynioja DNR nereikalaudama šilumos. Ar galima Helicase naudoti vietoj šilumos ciklo, kad būtų gauta viengrandė DNR? Ar tai pašalintų šilumos ciklo poreikį, taigi ir specialias termostabilias polimerazes?


Redaguota po atitinkamų paaiškinimų,

Pradėkime nuo normalių abiejų fermentų funkcijų. Sraigtasparniai atskiria DNR grandinės polimerazės metu sintezuoti DNR grandinės, kaip parodyta toliau pateiktame paveikslėlyje. (Vaizdo šaltinis: Wikimedia Commons)

Žiūrėkite šią animaciją, ji pašalins jūsų abejones dėl funkcijos. Tačiau RNR polimerazė turi abi veiklas.

Ląstelėse, norint atskirti DNR grandines, reikia helikazės. Po to gali veikti tik polimerazė. PGR metu sruogos atskiriamos didinant temperatūrą. Šis procesas vadinamas DNR tirpimu. Ši temperatūra paprastai yra labai aukšta, apie $ 90^oC $ iki $ 100^oC $, priklausomai nuo jūsų sekos. Esant tokiai temperatūrai, daugelis baltymų neveiks, todėl jums reikia termostabilios polimarazės. Maždaug prieš 40 metų toks fermentas buvo atrastas iš ekstremofilų (Chien ir kt., 1976). Dabar jis parduodamas kaip Taq polimerazė. Šie fermentai yra rekombinantiniai baltymai, turintys keletą mutacijų, kurios taip pat padidino jo derlių ir stabilumą (Villbrandt ir kt., 1997).

Dabar pereikite prie pagrindinio klausimo (Ką, manau, šį kartą supratau teisingai).

Koncepcija, apie kurią klausiate, jau buvo sėkmingai išbandyta aptikti RNR. Tyrėjai naudojo "Izoterminė atvirkštinės transkripcijos termofilinė helikazės priklausoma amplifikacija"(Goldmeyer ir kt., 2007). Jie naudojo ne tik helikazę, bet ir atvirkštinę transkriptazę (nes jie aptiko RNR). Šis vaizdas (paimtas iš popieriaus) rodo pagrindinius šio proceso žingsnius. Apskritimai rodo DNR polimerazę, kvadratai - atvirkštinę transkriptazė, o trikampiai rodo helikazę.

Citata iš popieriaus (kulkos taškai yra mano),

Rodyklės rodo specifinius pradmenis, apskritimai - DNR polimerazę, kvadratai - atvirkštinę transkriptazę, o trikampiai - helikazę. Pirmosios grandinės cDNR pirmiausia susintetinama atvirkštinės transkriptazės būdu

  • (1 ir 2 veiksmai). Tada atvirkštinės transkripcijos RNR-DNR hibridai yra atskirti UvrD helikazės, generuojančios vienos grandinės (ss) RNR ir DNR šablonus
  • (3 ir 4 veiksmai). SsRNR patenka į kitą RT reakcijos etapą
  • (5-a žingsnis) sukuriant daugiau pirmosios grandinės cDNR. DNR polimerazė ssDNR pavertė dvigubos grandinės DNR
  • (5-b žingsnis) ir tuo pačiu metu amplifikuojamas tHDA reakcijoje
  • (6–9 veiksmai). Šis procesas kartojasi, kad būtų pasiektas eksponentinis RNR tikslinės sekos amplifikacija.

Sukurtos izoterminės DNR amplifikacijos technologijos. Norint sustiprinti DNR fragmentus šiuo metodu, jums nereikia terminio ciklo.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17720718


Mikrobiologija: kultūra vs molekulinė

Mikrobiologas dr. Markas Wilksas apžvelgia pagrindines šių metų Didžiosios Britanijos mikrobiologinės technologijos draugijos konferencijos temas ir pranešimus.

Neseniai 32 -oji Britanijos mikrobų technologijų draugijos metinė mokslinė konferencija pavadinta „Karštos mikrobiologijos temos“. Jame daugiausia dėmesio buvo skiriama medicinos mikrobiologijos sritims, kuriose pokyčiai buvo spartūs ir greičiausiai bus dar greitesni.

Diagnostinėje klinikinėje virusologijoje didmeninis perėjimas nuo kultūros prie polimerazės grandininės reakcijos (PGR) ir visai neseniai - sekos. Priešingai, diagnostinė bakteriologija išliko daugiausia pagrįsta kultūra. Tam yra daug priežasčių, įskaitant išlaidas, reikalingus įgūdžius ir tai, kad kultūros metodai, nepaisant apribojimų, paprastai yra tinkami.

Nuomonės buvo poliarizuotos, kai kurie atsisakė naudotis naujais molekuliniais metodais, o kiti žvelgia žemyn į tuos, kurie vis dar naudoja kultūrą, ir primygtinai reikalauja, kad PGR jau yra pasenęs, o naujos kartos sekos nustatymas (NGS) yra vienintelis kelias. Kai kurie teigė, kad vienintelė kliūtis didelio našumo sekos nustatymui yra „įgimtas profesijos konservatyvumas“.

Susitikime aptariamų įvairių temų spektras rodo, kad iš tikrųjų nėra jokio konflikto tarp dviejų skirtingų metodų. Didelis pelnas pasiekiamas naudojant molekulinius ir kultūrinius metodus, kad būtų galima susidoroti su skirtingomis situacijomis, o kai kuriais atvejais derinant metodą gaunami geriausi rezultatai. Pažiūrėkime, kaip metodai naudojami kai kuriose greitai kintančiose srityse.

Sepsio diagnozės gerinimas

Profesorius Paulas Darkas, Mančesterio universitetas ir NIHR klinikinių tyrimų tinklo „Critical Care Lead“ vadovas, pirmą kartą pristatė pranešimą „Judėjimas link tikslių vaistų pristatymo sepsyje“.

Čia mes turime neįprastą situaciją, kai aukso standartas - teigiama kraujo kultūra - iš tikrųjų nėra labai geras. Kraujo pasėliai yra neigiami net ir tais atvejais, kai dėl klinikinių priežasčių labai įtariamas sepsis. Svarbiausia to priežastis tikriausiai yra ankstesnis gydymas antibiotikais, o ne pačios kultūros neadekvatumas. Kultūros metodai, be to, yra nejautrūs, dažnai yra per lėti, kad būtų naudingi esant sunkiam sepsiui.

Vargu ar bus reikšmingų kultūros metodų patobulinimų, taigi kokios yra molekulinės alternatyvos? Vis labiau stengiamasi sukurti molekulinius metodus, kad būtų galima greitai aptikti bakterijų ir grybelių DNR tiesiai iš kraujo, nereikalaujant kraujo kultūros. Prieš tai bandomasis gydymas antibiotikais jiems įtakos neturi. Buvo peržiūrėti keli CE ženklu pažymėti metodai, kurie parodė didelį potencialą, nors kiekvieno bandymo kaina buvo didelė.

Nemokamas molekulinis metodas yra pažvelgti į šeimininko biomarkerius, tokius kaip CRP ir PCT, kurie išleidžiami į kraujotaką reaguojant į ūminius priešuždegiminius dirgiklius. Bakteriniai dirgikliai yra susiję su greitu ir dideliu atsaku ir, svarbiausia, greitai mažėja tinkamai gydant bakterinę infekciją. Taigi, kai jie naudojami kiekybiškai, jie gali padėti priimti sprendimus dėl antibiotikų vartojimo pradžios ir nutraukimo. Nors, žinoma, jie nesuteikia jokios tiesioginės informacijos apie sukėlėją ar jautrumą antibiotikams.

Tikėtina, kad molekulinių metodų, skirtų DNR ir šeimininko biomarkerių aptikimui, derinys duos geriausius rezultatus ir lems didelę pažangą nustatant patikimą ir greitą sepsio diagnozę.

Bendruomenėje įgytos pneumonijos (CAP) etiologija

Viena sritis, kurioje aiškiai įrodytas molekulinių metodų pranašumas, yra bendruomenėje įgytos pneumonijos etiologijos nustatymas. Prieš antibiotikų erą, Streptococcus pneumoniae galima išskirti iki 95% atvejų, tačiau daugeliu atvejų patikimas patogenas neišskiriamas. Neaišku, ar tai yra tikras ligos etiologijos pasikeitimas, platesnis antibiotikų vartojimas ar abu.

Dr Kate Templeton, klinikinės mokslininkės konsultantė, Edinburgas, aprašė neseniai atliktą reikšmingą tyrimą, kurio metu jie atliko suaugusiųjų, gydomų BŽŪP, skreplių mėginių kiekybinį daugiapatogeninį tyrimą. Jie surinko gleivinių pūlingų skreplių mėginius (96%) ir endotrachėjinius aspiratus (4%) iš 323 suaugusiųjų, sergančių radiologiškai patvirtinta pneumonija, paguldytų į dvi tretinio lygio ligonines Jungtinėje Karalystėje. Jie atliko 26 kvėpavimo takų bakterijų ir virusų kiekybinę kultūrą ir daugialypę realaus laiko PGR. Naudodami PGR, jie nustatė galimą patogeną (bakterinį ar virusinį) 87% pacientų, palyginti su 39%, naudojantys tik kultūrą. Nuspėjama, kad pacientams, vartojusiems antibiotikus, PGR bakterijos buvo aptiktos dažniau nei pasėlis (77,6 % ir 32,1 %).

Žinoma, patikimo patogeno išskyrimas neįrodo, kad jis visais atvejais buvo atsakingas už ligą, ypač todėl, kad daugelis aptiktų bakterijų yra nešiojamos viršutiniuose kvėpavimo takuose, nesukeliant akivaizdžios žalos daugumai gyventojų. Nepaisant to, tyrimo rezultatai yra labai džiuginantys.

Mikobakterijų identifikavimas

Įrodyta, kad NGS galima nustatyti Mycobacterium tuberculosis iš skreplių mėginių, tačiau šiuo metu mikobakterijų aptikimas priklauso nuo kultūros. Dr Pieter Jan Ceyssens, Antibiotikų ir atsparumo skyriaus vadovas Nacionaliniame mikobakterijų ir tuberkuliozės centre Belgijoje, aprašė MALDI-TOF naudojimą greitam mikobakterijų identifikavimui. Šiuo atveju molekulės yra baltymai, o ne nukleorūgštys, kaip ir kituose aprašytuose pavyzdžiuose.

Kultivuotų bakterijų identifikavimas pagal MALDI-TOF sukėlė revoliuciją darbui daugumoje JK ir Europos laboratorijų. Didžiąją dalį bakterijų ir mielių dabar galima identifikuoti per kelias minutes su minimaliu paruošimu. Tačiau buvo daug sunkiau atpažinti mikobakterijas ir siūlinius grybus. Dr Ceyssensas aprašė keletą paprastų metodų, kai teigiamos kultūros yra žudomos karščiu, ekstrahuojamos etanoliu, apdorojamos ultragarsu ir įprastu būdu įkeliamos į MALDI-TOF. Tai leido per kelias minutes identifikuoti maždaug 90 % skirtingų ne tuberkuliozės mikobakterijų rūšių, kurios aptinkamos klinikinėse laboratorijose, o tai yra didžiulis žingsnis į priekį, palyginti su esamais metodais, kurie yra sudėtingi, brangūs ir trunka keletą dienų. Šis pigus ir greitas molekulinis metodas daugeliu atvejų gali pasirodyti pranašesnis už NGS.

Mikrobų tamsioji medžiaga

Profesorius Williamas Wade'as iš Londono Karalienės Marijos universiteto parodė, kaip galima panaudoti molekulinius ir kultūrinius metodus, kad labai padidėtų mūsų žinios apie mikrobiologiją toje srityje, kur kultūros apribojimai galbūt buvo pernelyg lengvai priimti. Jo kalba nerimą keliančiai pavadinta „Kultūruojanti nekultūringą“. Tai pasirodė ne nuoroda į auditoriją, o nepaprastai išradingas ir kruopštus požiūris į naujų bakterijų auginimą iš burnos.

Burnos bakterijos paprastai yra greitos ir lėtai augančios - tam reikia sudėtingos terpės ir ilgo inkubacijos laiko. Daugelis jų yra griežti anaerobai, kuriems reikia ypatingo atsargumo renkant, transportuojant ir inkubuojant.

Išsami kultūrinė mėginių analizė yra sudėtinga, o tai reiškia, kad galima išanalizuoti tik nedidelį mėginių skaičių, o maždaug pusė burnos bakterijų, aptiktų molekuliniais metodais, yra neauginamos.

Kai kurie iš jų priklauso gerai žinomam augalui, pavyzdžiui, Bacteroidetes, kur yra daug kultūrinių atstovų, pvz. Bacteroides fragilis, kurie buvo žinomi daugiau nei šimtmetį. Kiti sudaro naujai atrastas giliai išsišakojančias linijas, kuriose nėra auginamų atstovų. Sėkmės trūkumo priežastys gali būti mėginių ėmimas, nes kultūra reikalauja daug daugiau darbo nei molekuliniai metodai, ir priklausomybė nuo kitų bendruomenės bakterijų. Tai gali būti dėl ypatingų mitybos ar signalizacijos reikalavimų, kuriuos sunku daugintis laboratorijoje, arba pačios bakterijos gali būti tarpląstelinės ir parazitinės, todėl jas sunku auginti grynoje kultūroje.

Jo kalba buvo sutelkta į jo bandymus kultivuoti nekultūrintus prieglobsčio narius Sinergetės. Pagrindinė hipotezė buvo ta, kad kai kurioms neaugintoms burnos bakterijoms reikia kitų bakterijų, todėl gali būti įmanoma jas iš pradžių auginti mišrioje kultūroje in vitro, siekiant galiausiai atpratinti jas nuo priklausomybės nuo kitų bakterijų ir taip gauti grynas kultūras.

Mėginys, gautas iš periodonto kišenės, buvo kultivuojamas ant kraujo agaro ir inkubuojamas anaerobiškai 10 dienų. Tada plokštelės buvo nufotografuotos, padengtos kopijomis ir nuvalomos ant nailono membranų. Membranos buvo hibridizuotos su Sinergetės zondas, leidžiantis sritį Sinergetės kolonijos turi būti greitai išdėstytos originalioje plokštelėje. Tada šios kolonijos vėl galėjo būti subkultūruojamos ant kraujo agaro, todėl pirminė kultūra palaipsniui praturtėjo Sinergetės. Po aštuonių pasėlių mišinį sudarė keturios gerai aprašytos bakterijos.

Molekuliniai metodai parodė, kad egzistuoja ne tik keturios bakterijų rūšys, bet ir Sinergetės tipas W0 90. Iki 12 ištraukos šis organizmas galėjo augti savarankiškai, nors ir šalia Parvimonas micra kultūros. Organizmas buvo aprašytas, pavadintas (Fretibacterium fastidiosum) ir visas jo genomas suskirstytas.

Atminkite, kad kiekvienas pasėjimas užtruko 10 dienų, o norint gauti izoliatą grynoje kultūroje, prireikė 12 pasažų, todėl prireikė beveik šešių mėnesių kruopštaus darbo, norint atkurti organizmą grynoje kultūroje.

Tai galėjo būti padaryta tik derinant tradicinius kultūrinius metodus su molekuliniais metodais, ir tai iš tikrųjų parodo absurdą bandant kultūrinius ir molekulinius metodus laikyti vienas kitam prieštaraujančiais.

Markas Wilksas yra pagrindinis Barts Health NHS Trust klinikinis mokslininkas, mikrobiologas ir Didžiosios Britanijos mikrobiologinės technologijos draugijos komiteto narys.


Prieigos parinktys

Pirkite vieną straipsnį

Tiesioginė prieiga prie viso straipsnio PDF.

Mokesčių apskaičiavimas bus baigtas apmokėjimo metu.

Prenumeruokite žurnalą

Tiesioginė prieiga prie visų problemų nuo 2019 m. Prenumerata automatiškai atnaujinama kasmet.

Mokesčių apskaičiavimas bus baigtas apmokėjimo metu.


Anotacija

Objektyvai Vertintojas la concordance entre différentes méthodes de diagnostic ir patvirtina des cas cliniques įtariamą infekciją àPlasmodium chez des enfants en Tanzanie et au Kenya.

Metodas Des gouttes de sang digital ont été collectionées chez 338 infants avec une suspicion clinique de malaria non compliquée dans les cliniques de Tanzanie et du Keny. La présence de parasites de Plasmodium a mikroskopija, diagnostinis rapsas (TDR) ir moléculaires kiekybiniai matavimai, pagrindiniai tyrimo metodai (QT-NASBA) ir PGR. Les résultats ont été compaés et analysés pour leurs concordances.

Resultats Le degré de concordance obtenu était élevé, allant de 88,6%à 100% entre les TDR ou les tests moléculaires et la microscopie. Kenijos zonos, kuriose yra maliarija, yra paplitusios maliarijos atveju, o leistinas 0,94 koeficientas - 0,94 iki TDR - 0,76 PGR. Dans les zone urbaines de la Tanzanie avec une incidence faible des cas, pour les TDR une valeur de R = 1,0 a été trouvée mais cette valeur était de 0,25 pour la PCR et de 0,33 pour NASBA.

Išvados La maliarija est surestimée lorsque le diagnostic est unikalus bazé sur les signes cliniques. Dès lors, laboratoire est essentielle. La mikroskopija yra neįtikėtina, kai yra zonų rurales où la malaria est fréquemment rencontrée mais les TDR sont une bonne alternatyva avec l'avantage d’être simples et rapides. Atliekami bandymai moléculaires sont plus sensibles mais plius difficiles à implémenter dans les zone rurales. Dans les zone avec une incidence plus faible, les tests moléculaires détectent un nombre signativement plus élevé d'infections àPlasmodium tai yra TDR mikroskopija. Bien que l'implémentation des tests moléculaires soit difficile, leur avantage d'offrir un sstème de détection simple et moins cher les présentent comme outils prometteurs dans un futur proche.


DPCR: technologijų apžvalga

Skaitmeninė polimerazės grandininė reakcija (dPCR) yra naujas metodas absoliučiam tikslinių nukleorūgščių kiekybiniam įvertinimui. Kiekybinis nustatymas pagal dPCR priklauso nuo to, kad atsitiktinis molekulių pasiskirstymas daugelyje skaidinių atitinka Poissono pasiskirstymą. Kiekviena pertvara veikia kaip atskiras PGR mikroreaktorius, o skaidiniai, kuriuose yra sustiprintų tikslinių sekų, aptinkami fluorescencija. PGR teigiamų pertvarų dalies pakanka, kad būtų galima nustatyti tikslinės sekos koncentraciją be kalibravimo. Mikrofluidikos pažanga įgalino dabartinę skaitmeninio kiekybinio įvertinimo revoliuciją, pateikdama efektyvius skaidymo metodus. Šioje apžvalgoje mes lyginame pagrindines sąvokas, susijusias su nukleorūgščių kiekybiniu įvertinimu pagal dPCR ir kiekybinį realaus laiko PGR (qPCR). Išsamiai aprašome pagrindinę dPCR statistiką ir paaiškiname, kaip ji apibrėžia jos tikslumo ir našumo metriką. Apžvelgiame skirtingus mikrofluidinio skaitmeninio PGR formatus, pristatome jų pagrindinius fizinius principus ir analizuojame technologinę dPCR platformų raidą. Pateikiame naujas multipleksavimo strategijas, įgalintas dPCR, ir išnagrinėjame, kaip izoterminis amplifikacija galėtų būti alternatyva PCR skaitmeniniuose tyrimuose. Galiausiai, mes nustatome, ar teoriniai dPCR pranašumai, palyginti su qPCR, yra teisingi, peržiūrėdami tyrimus, kurie tiesiogiai palygina abu metodus atliktus tyrimus.

Raktažodžiai: absoliutūs kiekybiniai mikroschemų matricos dPCR skaitmeniniai PGR lašeliai mikrofluidikai mikrofluidinės kameros mikrofluidinės technologijos mikrofluidiniai mikroschemų vožtuvai, skaidantys qPCR kiekybinis realaus laiko PGR realaus laiko PGR.

Interesų konflikto pareiškimas

Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.

Skaičiai

( a ) Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) principai. Kiekvienas PGR ciklas…

Realaus laiko qPCR tyrimas naudojant…

Realaus laiko qPCR tyrimas naudojant standartinę kreivę. ( a ) Stiprinimo kreivės…

Skaitmeninio PGR principai. …

Skaitmeninio PGR principai. Pavyzdys yra padalintas į daugybę nepriklausomų skaidinių, tokių kaip…

PGR metodų palyginimas. Per…

PGR metodų palyginimas. Įprasto PGR metu amplifikacijos produktai analizuojami ...

DPCR kiekybinis tikslumas. …

DPCR kiekybinis tikslumas. DPCR tikslumas nevienodas ir priklauso nuo…

Aktyvios skaidymo platformos. ( a…

Aktyvios skaidymo platformos. ( a ) Prispaudžiamojo vožtuvo schema…

Pasyvios skaidymo platformos. ( a…

Pasyvios skaidymo platformos. ( a ) Megapikselių skaitmeninis PGR naudojant plokštumines emulsines matricas.…

Savaiminio užpildymo ir pertvarų platformos. (…

Savaime prisipildančios ir skaidančios platformos. ( a ) Geometrija, skirta laipsniškai išdėstytai spąstų konfigūracijai…

Mikrofluidinės lašelių platformos. ( a…

Mikrofluidinės lašelių platformos. ( a ) Schema, iliustruojanti lašelių susidarymą su…

Daugkartiniai lašelių dPCR tyrimai. dPCR…

Daugkartiniai lašelių dPCR tyrimai. dPCR tyrimus galima multipleksuoti koduojant lygį…


Biologinių laboratorijų teikimo mažų išteklių kontekste normų kūrimas: seminaro medžiaga (2019 m.)

Charlesas Chiu, mokslų daktaras, dirbtuvių planavimo komiteto narys, pristatė pranešimą „ldquoMolecular Diagnostics in Low Resource Settings“. & Rdquo Jis apibūdino & ldquoklassical & rdquo (t. Y. Nemolekulinius) mikrobiologinio tyrimo metodus, įskaitant:

  • Kultūra
  • Serologija
  • Mikroskopija
  • Biocheminis profiliavimas
  • Tiesioginis antigeno tyrimas: šoninio srauto imuniniai tyrimai ir matricos padedama lazerio desorbcija/jonizacija (MALDI) bakterijų, virusų ir grybelių identifikavimui

Molekulinė diagnostika arba DNR pagrįstas aptikimas apima daugybę naujų ir net eksperimentinių technologijų, tokių kaip:

  • Hibridizacija (zondai), pavyzdžiui, sugrupuoti reguliariai įsiterpę trumpi palindrominiai pasikartojimai (CRISPR) – Cas pagrįsti tyrimai
  • Genotipavimas
  • Sekos nustatymas, įskaitant nanoporų seką
  • Signalo stiprinimas
  • Tikslinė amplifikacija (polimerazės grandininė reakcija [PGR]): Singleplex ir multiplex

Molekulinės diagnostikos testai suteikia tam tikrų pranašumų, kai naudojami mažai išteklių. Ligos sukėlėjai yra inaktyvuojami bandymams, todėl juos tvarkyti yra saugiau nei taikant metodus, reikalaujančius naudoti užkrečiamus gyvus organizmus, taip sumažinant profesinio poveikio tikimybę. Jie nesiremia kultūra pagrįsta amplifikacija, kuri yra svarbi, nes yra daug patogenų

nėra kultivuojami. Kadangi toks molekuliniu pagrindu atliktas tyrimas leidžia atlikti neinfekcinių inaktyvuotų patogenų diagnostiką, labai brangių ir sudėtingų BSL-3 arba -4 izoliavimo poreikis yra pašalinamas atliekant labai pavojingų patogenų diagnostinį darbą. Molekuliniai metodai taip pat suteikia greitesnį apsisukimo laiką ir nereikalauja didelių mėginių kiekių.

Tačiau daktaras Chiu tęsė, kad molekuliniai tyrimai taip pat turi didelių trūkumų. Pirma, šie metodai yra brangesni nei klasikiniai metodai. Pavyzdžiui, vienas dalyvis pažymėjo, kad vieno PGR rinkinio kaina yra lygi maždaug 1 metų & rsquos atlyginimui laboratorijos darbuotojui esant mažai išteklių. Antra, daugelio šių metodų veikimo įvertinimas, patvirtinimas ir reguliavimo patvirtinimas yra sudėtingi, ypač jei darbas atliekamas ne labai kontroliuojamoje klinikinėje laboratorinėje aplinkoje, kuri gali būti neprieinama esant mažai išteklių. Dr. Chiu apžvelgė kai kurias sritis, kuriose trūksta standartų molekuliniams tyrimams, ypač aplinkai, kuri nėra griežtai reguliuojama: teigiamos ir neigiamos kontrolės, platformos, analizės efektyvumas, tiksliniai patogenai ir etaloninės duomenų bazės. Dėl to, kad trūksta standartizacijos, tas pats tyrimas dviejose skirtingose ​​laboratorijose gali duoti skirtingus rezultatus, o patvirtinamieji tyrimai yra lėti ir brangūs.

Be to, subjektai, kurie paprastai sertifikuoja ir (arba) patvirtina tokius testus (pvz., JAV maisto ir vaistų administracija [FDA], JAV nacionalinis standartų ir technologijų institutas, Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) ir įvairios nevyriausybinės organizacijos) to dar nepadaryta daugeliui naujų molekulinių technologijų. Jungtinėse Amerikos Valstijose klinikinių laboratorinių tyrimų metu vadovaujamasi reguliavimo sistema - Klinikinių laboratorijų tobulinimo pakeitimai (CLIA). Jame nustatyti minimalūs standartai, pagal kuriuos veikia visos klinikinės laboratorijos. CLIA laboratorijos yra sertifikuotos tikrinant tokiai agentūrai kaip Amerikos patologijos koledžas. Atitiktis CLIA reikalauja patvirtinimo ir kokybės užtikrinimo visiems laboratoriniams tyrimams, naudojamiems klinikinėje priežiūroje, įskaitant ir laboratorinius tyrimus. Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas (CLSI) taip pat išleidžia &ldquoGuidelines&mdashCLSI Molekulinės diagnostikos metodus, skirtus infekcinėms ligoms5 (CLSI5, rd02). Tačiau sertifikavimas pagal šias sistemas nėra tas pats, kas FDA patvirtinimas. Be to, daugelis laboratorijų, kuriose yra mažai išteklių, gali neatitikti CLIA ar panašių reguliavimo standartų, susijusių su kvalifikacijos tikrinimu, standartizuotos kontrolės įtraukimu ir kt.

Chiu paaiškino, kad yra išankstinės, analitinės ir poanalitinės molekulinės diagnostikos problemos. Išankstinės analizės klausimai apima tinkamų mėginių surinkimo metodų poreikį, tinkamą laiką, tinkamas organizmų ir tyrimo komponentų laikymo sąlygas (pvz.

šalčio grandinės priežiūra, kuri ypač svarbi esant mažai išteklių ir esant nestabiliai ribonukleino rūgščiai [RNR]), ir užteršimo kontrolė. Analitiniai klausimai sutelkti į bandymų atlikimo įvertinimą ir jautrumą, specifiškumą, tikslumą, tikslumą, tiesiškumą, matricos efektą, trukdžius, atkuriamumą ir apribojimus. Poanalitiniai klausimai apima tinkamą rezultatų ataskaitų pateikimą, kopijas/ml arba TV/ml arba Log TV TV/ml, teigiamas ir neigiamas nuspėjamąsias vertes (atitinkamai PPV ir NPV), diagnostinę vertę ir klinikinę naudą.

Remdamasis šiomis ir kitomis aplinkybėmis, daktaras Chiu pateikė svarbių klausimų, kuriuos reikia spręsti atliekant molekulinius tyrimus mažų išteklių sąlygomis, sąrašą:

  • Kas mokės už testą, o kas apmokytas ir sertifikuotas jį atlikti?
  • Kaip dažnai bus vykdomas testas? Kokio tūrio medžiagos reikia? Ar konkrečios aplinkybės pateisina išlaidas?
  • Ar galima nustatyti ir kiekybiškai įvertinti kliniškai reikšmingus organizmus pacientų mėginiuose ar kultūroje?
  • Jei kultivavimas neįmanomas, molekuliniai metodai gali būti pateisinami. Bet ar jie bus naudojami prognozuojant, stebint, siekiant nukreipti visuomenės sveikatos intervencijas, ar diagnozuoti, kad būtų galima gydyti atskirus pacientus, ar jie suteiks reikiamą tikslią informaciją?
  • Kur bus atliekamas testas ir kokiomis sąlygomis? Ar šie nustatymai tinka tiksliams rezultatams pasiekti?

Tada daktaras Chiu trumpai apibūdino kiekvieną technologijų kategoriją, kurią jis išvardijo savo pristatymo pradžioje, ir pakomentavo jų raidos būklę (žr. Šio skyriaus pabaigoje pateiktą 4.1 langelį).

Dr Chiu paaiškino, kad tiesioginiai aptikimo metodai, tokie kaip sekos nustatymas, negali visiškai pakeisti serologijos - laboratorinės medicinos šakos, kuri tiria kraujo serumą, kad nustatytų antikūnus ir antigenus. 1 Jis mano, kad molekuliniai bandymai papildo, bet ne pakeičia klasikinius testavimo metodus. Jis taip pat apibūdino kiekvienos molekulinės technologijos kūrimo ir naudojimo etapą:

  • PGR yra įdiegtas, tačiau išlieka sudėtingas, nes trūksta standartizacijos.
  • Naujos kartos sekos nustatymas vis dar yra ribotas. Nors FDA dar nepatvirtintas, tam tikra nanoporų seka naudojama lauke.
  • CRISPR-Cas yra labai perspektyvus, tačiau tebėra tyrimų etape.
  • MALDI paprastai yra per brangus, kai reikia mažai išteklių.
  • Yra daugialypis PGR, tačiau jis taip pat yra brangus.
  • Tikėtina, kad ateityje šeimininko atsaku pagrįsti tyrimai sparčiai vystysis.
  • Metagenominė seka yra perspektyvi, bet taip pat brangi ir dar nėra plačiai prieinama.

Dr. Chiu pasiūlė šiuos išsinešimui skirtus pranešimus:

  1. Greičiausiai reikės tradicinių metodų (pvz., imunofluorescencinių juostelių, realaus laiko PGR) ir naujausių metodų (pvz., nanoporų sekos nustatymo, CRISPR-Cas tyrimų, multipleksinio PGR) derinio.
  2. Išlaidos ir kiti praktiniai sumetimai teikia pirmenybę tikrajai molekulinei diagnostikai (pvz., šoninio srauto imunologiniai tyrimai, CRISPR-Cas).
  3. Bus svarbu nuspręsti, ar pagrindinis dėmesys turėtų būti skiriamas diagnostiniams tyrimams ar stebėjimui. PSO (vietoje, šalyje, tarptautinė) ką turėtų daryti? Atsirandančios infekcinės ligos nepaiso sienų.
  4. Sekos nustatymas padarė didžiausią įtaką genomo stebėjimui, bet dar ne molekulinei diagnostikai.
  5. MALDI, daugialypės PGR platformos (pvz., „BioFire“, „Luminex“) ir net vienpusės PGR priemonės (pvz., „Cepheid GeneXPert“) išlieka per brangios diagnozei, tačiau gali būti priimtinos tikslinei priežiūrai, pvz., Protrūkių metu.
  6. Skubiai reikalinga nebrangi, laukui paruošta multipleksuota diagnostika, tačiau jos nėra.
  7. Tikėtina, kad tiesioginiai aptikimo metodai artimiausiu metu nepakeis serologijos (pvz., šoninio srauto tyrimai).
  8. Sudėtingiems genomo sekos nustatymo ir kitų metodų duomenims reikės debesų kompiuterijos išteklių, kad rezultatai būtų greitai paskleisti, o tai yra labai svarbu visuomenės sveikatos scenarijuose.

Dr. Chiu baigė savo pranešimą teigdamas, kad daugelio molekulinių technologijų veiksmingumas ir tikslumas turi būti įrodytas, kad jos taptų plačiai naudojamos mažai išteklių reikalaujančiose aplinkose. Nors kai kurie bandymai atliekami naudojant mažai išteklių turinčias nuostatas, dar reikia daug nuveikti.

Per vėliau vykusią diskusiją vienas dalyvis teigė, kad jo grupė stengiasi sukurti nezondinius PGR metodus, bando naudoti multipleksinius imunologinius tyrimus serologijai ir teikia Sanger sekos nustatymą naudojant

jei reikia, nuotolinė analizė kaip atsarginė PGR lauko programų atsarginė kopija. Jis pažymėjo, kad tikrieji klausimai yra tai, kaip pristatyti naujus įrankius į lauką ir išmokyti žmones visų šių naujų įgūdžių, ypač duomenų tvarkymo, saugojimo ir saugumo. Kai kurie dabar prieinami įrankiai nereikalauja priežiūros ir turi vienkartines kasetes. Vienas iš duomenų apdorojimo būdų yra naudoti debesimis pagrįstą bioinformatiką duomenims analizuoti ir rezultatams grąžinti, kad šiam tikslui nereikėtų jokių vietinių bioinformatikos talentų, jei yra interneto ryšys. Tačiau kitas dalyvis teigė, kad ryšiai šioje srityje yra tikra problema, nes pralaidumas yra nepakankamas. Todėl protrūkio atveju debesies metodai gali neveikti.

Dalyvis paklausė, ar galima pagrįsti reagento savarankiškumo siekimu. Dr Chiu atsakė, kad taip yra todėl, kad reagentų rinka nėra labai konkurencinga ir konkurencija greičiausiai sumažintų išlaidas. Tas pats dalyvis teigė, kad neegzistuojanti, bet reikalinga išlaidų ir naudos analizė galėtų padėti donorams nuspręsti, kokios rūšies paramą jie turėtų teikti.

Dalyvaudami daktaro Chiu & rsquos naujausių technologijų santrauką ir padarę išvadas apie pasirengimą technologijoms, dalyviai buvo pasirengę ištirti lauko diegimo ir naudojimo praktiką. Jonathanas Towneris, JAV ligų kontrolės ir prevencijos centrų (CDC) mokslų daktaras, pristatė savo praktinę patirtį kelių hemoraginių virusų protrūkių metu, įskaitant Vakarų Afrikos Ebolos protrūkį 2014–2015 m. „Towner & rsquos“ patirtis iliustruoja turimų metodų taikymą realaus pasaulio reagavimui į didelių ligų protrūkius. Pirmoji jo patirtis buvo Ugandoje 2000–2001 m., Kur CDC naudojo ir ELISA, ir PCR pagrįstus testus. Darbas buvo atliktas ligoninės laboratorijoje ir per 3 mėnesius buvo apdorota daugiau nei 1000 mėginių, iš kurių daugiau nei 280 buvo patvirtinti virusui. 2005 m. jis dalyvavo reaguojant į Marburgo viruso protrūkį Angoloje. Vėl buvo naudojami ELISA ir PGR, o šį kartą darbas buvo atliktas esamoje laboratorijoje, kuri buvo sukurta ŽIV diagnostikai. Šį kartą nustatyta, kad 180 iš 505 kraujo ar serumo, motinos pieno ar tamponų mėginiai buvo teigiami virusui. 2010–2016 m. Daktaras Towneris dalyvavo sustiprintos virusinės hemoraginės karštligės (VHF) stebėjimo ir diagnostikos programoje Ugandoje, kad galėtų mokyti vietos medicinos ir kitus darbuotojus. Ši programa apgyvendino CDC darbuotojus šalyje ir padėjo pasiekti žymiai mažesnį vėlesnių VHF atvejų skaičių, taip pat sutrumpino laiką iki diagnozės.

Tada 2014 m. Vakarų Afrikoje įvyko didžiulis Ebolos protrūkis, kuris rimtai paveikė Gvinėją, Siera Leonę ir Liberiją. Šis įvykis, dr. Townerio žodžiais tariant, sulaukė „Jungtinių Tautų“ reakcijos su

Vokietija, Prancūzija, Italija, Belgija, Nyderlandai, Anglija, Kanada, JAV, Nigerija, Pietų Afrika, Kinija ir Rusija siunčia žmones, įrangą ir kitą pagalbą įspūdingai reaguodamos ir bendradarbiaudamos. Tarp JAV agentūrų buvo CDC, Nacionaliniai sveikatos institutai ir Gynybos departamentas. Tikslas buvo suteikti greitą diagnostiką šioje srityje. Iš viso Vakarų Afrikoje buvo įsteigtos 27 lauko laboratorijos.

Reagavimo į Vakarų Afrikos Ebolos protrūkį mastas sukėlė savo iššūkių. Pavyzdžiui, dideliame laboratorijų tinkle buvo naudojama daug įvairių realaus laiko PGR tyrimų, todėl atsirado poreikis kokybiškoms plokštėms ir bandymai standartizuoti tyrimus. Siera Leonėje ir Gvinėjoje CDC platinamose plokštėse 2 iš 6 laboratorijų pateikė 10 procentų neteisingus rezultatus, todėl reikėjo įgyvendinti patobulinimus. Reikėjo atlikti dviejų tikslų Ebolos tyrimą ir ląstelių RNR PGR kontrolę, kad sumažėtų klaidingai teigiamų ar neigiamų rodiklių dažnis, kai buvo naudojamas tik vienas taikinys. Ląstelių RNR kontrolės trūkumas taip pat padidino klaidingai neigiamų rezultatų riziką.

Taip pat buvo duomenų bazių, dokumentų ir ataskaitų teikimo iššūkių. Buvo sunku užpildyti pavyzdžių pateikimo formas, todėl nemaža dalis pavyzdžių turėjo mažai dokumentų arba jų neturėjo. Nebuvo unikalių mėginių ir atvejų identifikatorių ir buvo sunku susieti laboratorinius, klinikinius ir epidemiologinius duomenis. Dažnai trūko informacijos apie pradžios datą, taip pat žinių, ar tepinėliai buvo iš lavonų (tinkami), ar iš gyvų pacientų (netinkami). Galiausiai kilo problemų dėl rezultatų pateikimo laiko, nepakankamo apmokytų flebotomų skaičiaus ir mėginių gabenimo.

Daktaras Towneris padarė išvadą, kad, nepaisant šių problemų, buvo daug pasiekta. Didžiausias bandymas įvyko 2014 m. Spalio – gruodžio mėn., O 2015 m. Liepos mėn. Didžiausias mėginių skaičius buvo 180 (per dieną). Vidutiniškai 71 proc. Mėginių buvo ištirti tą dieną, kai jie atvyko į laboratoriją, ir 99,9 proc. tą pačią ar kitą dieną. Mėginiai buvo gauti maždaug 14 mėnesių iš 12 iš 14 rajonų ir daugiausia buvo viso kraujo ir lavono burnos tamponai. Iš viso buvo ištirta daugiau nei 27 000 mėginių. „Towner & rsquos“ laboratorija veikė 406 dienas, be poilsio dienų ar testavimo sutrikimų. Gegužės 23 d. buvo pradėtas bandomasis tyrimas dėl viruso patvarumo tarp išgyvenusių vyrų, kurių metu buvo ištirta daugiau nei 500 spermos mėginių. Siera Leonės vakcinos tyrimas, arba STRIVE, prasidėjo gegužės 24 d., Buvo ištirtas 51 mėginys iš 30 dalyvių. Dvidešimt aštuonios darbuotojų komandos iš 17 skirtingų CDC filialų buvo apmokytos Atlantoje apie Bo laboratorijos protokolus ir procedūras, o vėliau buvo dislokuotos, kad laboratorija veiktų.

Pasibaigus epidemijos krizės etapui, daktaras Aiah Lebbie iš Njala universiteto Siera Leonėje buvo išrinktas 3 metų CDC bendradarbiavimo susitarimo gavėju, kad būtų atliktas ekologinis VHF stebėjimas regione ir rsquos šikšnosparniai. 2017 m. kovo–rugpjūčio mėn. Universiteto ir rsquos laboratorijos patalpos buvo kapitališkai atnaujintos. Dabar yra stabili ir tinkamai prižiūrima elektra, šaldikliai ir kita darbo įranga. Pirkimas veikia, nors greitai gendančių prekių pristatymas išlieka problema. Šis susitarimas su universitetu suteiks švietimo ir visuomenės sveikatos naudos regionui ir parodys, ką gali pasiekti partnerystė. Buvo surinkta apie 5000 šikšnosparnių egzempliorių, visi iš miškingų vietovių. Yra dvi lauko stotys: viena Tiwai saloje Siera Leonėje, kuri pradeda renovaciją, o kita - Gola atogrąžų miškų nacionaliniame parke Liberijoje.

Po daktaro Towner & rsquos pristatymo vienas dalyvis pažymėjo, kad naujos molekulinės technologijos sumažina riziką, todėl reikia minimalių izoliacijos lygių, jei tokie patogenai kaip Ebola ir Marburgas yra vietiniai tam tikroje vietovėje. Tokiu atveju BSL-3 ir -4 laboratorijos tikriausiai nereikalingos, tačiau kai kurie recipientai prestižui, o ne realiems poreikiams ieško aukšto izoliavimo patalpų. Kitas dalyvis pakartojo poreikį atskirti laboratorijas, atliekančias stebėjimą ir atliekančias diagnostiką, ir pažymėjo, kad etaloninės laboratorijos yra būtinos štamų identifikavimui ir tyrimams. Galbūt lauke pakanka žemo izoliavimo, o etaloninėms laboratorijoms reikia didesnio izoliavimo.

Nors daktaras Chiu sakė, kad molekulinių technologijų sąnaudos turi būti sumažintos, kad jas būtų galima naudoti mažai išteklių naudojančiose patalpose, vienas dalyvis teigė, kad priimtinos išlaidos gali priklausyti nuo ligos, paveiktų pacientų skaičiaus, priežiūros ir gydymo išlaidų. gydymas ir kiti veiksniai. Tai reiškia įprastas ligas, kurioms reikia pigesnių analitinių galimybių. Kai kurios technologijos jau plinta. Pavyzdžiui, 165 & ldquoGene Expert & rdquo mašinos jau buvo dislokuotos visoje Kongo Demokratinėje Respublikoje, nors, kaip nurodė vienas dalyvis, jų našumas yra mažas. Be to, šios mašinos aptinka tik Ebola Zaire padermę, kuri, jei ji mutuos, gali būti neaptikta, kaip ir kitos padermės. Kitas dalyvis pažymėjo, kad finansuotojai, priimdami sprendimus dėl paramos, turėtų atsižvelgti į jau panaudotas galimybes.

Dalyvis pabrėžė skirtingus įprastų darbo situacijų poreikius ir atsakus į epidemijas. Jo organizacija naudoja „Luminex“ testavimą, tačiau tai, kas tinka, priklauso nuo to, ar tyrėjas ieško vieno ar daugiau konkretaus patogeno. Kitas dalyvis teigė, kad viskas, kas pastatyta, turėtų būti susieta su esamais objektais

jau yra tinklo dalis, kad būtų galima dalytis reagentais ir kitais ištekliais.

Dr Chiu teigė, kad tiesioginis dominančio organizmo aptikimas yra & ldquogold standartas. & Rdquo Klinikai yra konservatyvesni nei tyrinėtojai, todėl gali praeiti 5–10 metų, kol nauji bandymų tipai bus priimti kaip paciento gydymo pagrindas. Kadangi besivystančiose šalyse jau įvyko bjaurių incidentų, susijusių su vaistų ir vakcinų bandymais, ypač reikia būti konservatyviems ir molekulinės diagnostikos, kaip naujų priemonių, skirtų medicininiam gydymui vadovautis šiais pagrindais.

Dalyvis pakartojo, kad reagentų kaina yra problema, ypač dėl mažų mažai išteklių turinčių šalių biudžetų. Kitas dalyvis atkreipė dėmesį, kad pačios technologijos yra labai brangios, todėl donorams reikėtų patarti kaip pagrindą pasikliauti patikrintomis technologijomis. Atsižvelgdamas į sąnaudų veiksnius, kitas dalyvis teigė, kad tikslinga pagrindiniams bandymams naudoti paskirstytus laboratorijų rinkinius ir rezervuoti brangias, didelio našumo galimybes centrinėms vietoms. Dar vienas dalyvis pažymėjo, kad ekstremalios situacijos yra ypatingos, tačiau reagavimas į ekstremalias situacijas pagerės, jei bus įrengta daugiau laboratorijų normaliam verslui. Įrengus laboratoriją normaliam darbui, darbuotojai ir tiekimo grandinės taip pat yra apmokyti ir praktikuojami. Donorai taip pat turėtų pasiteirauti apie kokybės valdymo sistemas. Besivystančiose šalyse etaloninių laboratorijų ir kitų išteklių gali nebūti, kad būtų lengviau standartizuoti, patikrinti ir atlikti kitus būtinus veiksmus.

Dalyvis sakė, kad & ldquoWild West & rdquo gali atsirasti dėl to, kad Jungtinėse Valstijose, bet kai kuriose besivystančiose šalyse, trūksta reguliavimo priežiūros. Tačiau kitas dalyvis pažymėjo, kad Prancūzija prižiūri frankofoniškas šalis. Kitas dalyvis teigė, kad reagentų, įrangos priežiūros ir remonto trūkumas yra donoro košmaras ir kad pastarosioms funkcijoms atlikti mokymai yra labai reikalingi. Tačiau kitas dalyvis pažymėjo, kad kai kuriose vietovėse išsilavinimo lygis yra toks žemas, kad priežiūros sąvoka neegzistuoja, todėl tokį mokymą vietos personalui organizuoti yra labai sunku. Be to, transportavimas yra kliūtis kuriant atskaitos galimybes. Norint tiekti kurą, sausą ledą ir kitus laboratorinius reikmenis, reikia partnerystės. Pavyzdžiui, tarptautinės korporacijos, tokios kaip „Coca Cola“, ir naftos kompanijos pateikė kai kuriuos iš šių atsargų. Afrikos Sąjunga, Vakarų Afrikos valstybių ekonominė bendrija ir Pietų Afrikos vystymosi bendrija sukūrė būdų, kaip išspręsti kai kurias iš šių problemų,

Dalyvis pasiūlė, kad biobankai būtų saugiose vietose, pavyzdžiui, karinėse bazėse. Kitas dalyvis pažymėjo, kad biobankai yra saugūs ir

pripažįsta gyvų mėginių vertę, bet gali neturėti planų, ką su jais daryti, todėl kyla klausimų, ar jie turėtų turėti kolekcijas be aiškiai apibrėžtų tikslų.

Dalyviai ragino platesnę viziją, kad būtų užtikrintas pasirengimas kitam protrūkiui. Jie taip pat iškėlė klausimą, kaip sudominti donorus siekiant pagerinti tai, kas jau yra, o ne statyti naujas patalpas. Galiausiai jie stebėjosi, kaip donorai galėtų padėti po protrūkio, kaip buvo padaryta Siera Leonėje po 2014 m. Ebolos protrūkio.

4.1 LANGELIS Molekulinės diagnostikos raidos būklė: santrauka

Dr. Charles Chiu aprašė molekulinės diagnostikos raidos būklę. Jis pradėjo paaiškindamas, kad „& ldquoprobe“ hibridizacijos ir rdquo ar nepastiprintų nukleorūgščių zondų atveju DNR arba RNR grandinės, kurių dydis yra mažesnis nei 50 bazinių porų iš mėginio, yra tiriamos dėl konkrečios nukleorūgšties sekos ir ldquotargets & rdquo, rodančių tam tikrų patogeninių organizmų buvimą. DNR arba RNR grandinės yra pažymėtos fermentais, antigeniniais substratais, chemiliuminescenciniais molekuliniais subvienetais arba radioizotopais. Jie labai specifiškai jungiasi su papildomomis DNR arba RNR sekomis, kurios vadinamos & ldquohybridization. & Zdquo Jie gali būti naudojami tiesiogiai paciento mėginiuose arba kultūrų izoliatuose. Tačiau jie yra 100–10 000 kartų mažiau jautrūs nei amplifikacijos metodai, ir tokio jautrumo lygio gali nepakakti nustatant organizmus, tokius kaip Ebolos virusas, kurių audinių mėginiuose, pvz., Kraujyje, yra mažas kopijų skaičius. Zondo hibridizacija tradiciškai naudojama, kai yra daug organizmų, nors, kaip pažymėta, metodas nėra labai jautrus. Nustatyta, kad jis ypač naudingas patvirtinant mikobakterijų rūšių, sisteminių grybų, Campylobacter, Enterococci, Haemophilus influenzae, A ir B grupės streptokokų, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus ir Listeria buvimą.

CRISPR-Cas pagrįsti tyrimai (CRISPR reiškia „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“ ir „Cas“-su CRISPR susijusi sistema) pastaruoju metu sulaukė milžiniško viešumo kaip genomo redagavimo priemonė. Šios sistemos, sukurtos iš natūralaus bakterijų gynybos mechanizmo nuo jas užkrečiančių virusų, padarė genomo redagavimą pridedant, pakeičiant arba pašalinant DNR bazių poras daug tikslesnius, efektyvesnius, lankstesnius ir pigesnius, palyginti su ankstesnėmis genų keitimo strategijomis. sekos (Nacionalinė mokslų akademija, Nacionalinė medicinos akademija, 2017). Jie gali būti naudojami ne žmogaus organizmams, žmonėms ir mikroorganizmams. Šios pažangos paskatino visame pasaulyje didelį susidomėjimą galimais būdais, kuriais genomo redagavimas gali pagerinti žmonių sveikatą. Chiu teigė, kad CRISPR-Cas pagrįsta molekulinė diagnostika gali būti priemonė pakeisti ir nustatyti infekcines ligas, stebėti naujų patogenų atsiradimą, virusų genotipus, nustatyti atsparumo antibiotikams veiksnius, atranką vėžiui ir kitas programas.

Pasak Dr. Chiu, CRISPR-Cas ir minuso tyrimai turi privalumų ir trūkumų. Tarp privalumų yra tai, kad šie tyrimai yra labai jautrūs, jų apdorojimo laikas yra trumpesnis nei 2 valandos ir jie yra labai lankstūs, todėl nuo projektavimo iki įgyvendinimo reikia mažiau nei 1 savaitės. Jie yra labai nešiojami, nereikalauja elektros energijos ar brangių prietaisų ir gali pateikti kolorimetrinius rodmenis, kuriuos gana lengva interpretuoti. Kalifornijos Berklio universitetas neseniai parodė, kad žmogaus papilomos virusą galima aptikti tiesiai iš lytinių audinių, neištraukiant per 1 valandą, naudojant CRISPR-Cas. Šiuo metu jis taip pat naudojamas Zikos ir dengės karštligės virusams identifikuoti klinikiniuose mėginiuose. Tačiau trūkumai apima keletą veiksnių, susijusių su tuo, kad CRISPR-Cas lieka etape. Jis turi neaiškias multipleksavimo galimybes, jam reikia tikslinio stiprinimo žingsnio, kuris gali sukelti užteršimo problemų, o jo veiksmingumas daugeliu faktinių klinikinių naudojimo būdų dar nėra įrodytas. Taip pat yra svarbių reguliavimo klausimų, taip pat susirūpinimą dėl testavimo prieinamumo, nes daugelis numatomų naudojimo būdų gali būti patentuoti.

Chiu aprašė signalų ir taikinių stiprinimo technologijas. Plačiausiai naudojamas signalo stiprinimo metodas diagnostikai yra šakotosios grandinės technologija. Ši technologija jau seniai naudojama nustatant ŽIV ir hepatito C virusų kiekį (Tsongalis, 2006). Jis gali būti naudojamas aptikti baltymus ir nukleino rūgštis, tiek DNR, tiek RNR. Zodo arba taikinio koncentracija nesikeičia, tačiau jautrumas didėja didėjant žymėtų molekulių, prijungtų prie tikslinės nukleino rūgšties, koncentracijai. Jo pranašumas prieš taikinio amplifikacijos metodus, tokius kaip PGR, yra tas, kad aptikimas ir signalas bei rdquo yra tiesiogiai proporcingi taikinio kiekiui mėginyje, todėl jį lengviau nustatyti. Taip pat sumažėja užteršimo rizika, o inhibitoriai nėra problema.

Tikslinio amplifikacijos metodai, tokie kaip PGR ir transkripcijos tarpininkaujama amplifikacija (TMA), naudoja fermentų tarpininkaujamus procesus, kad gautų tikslinės nukleorūgšties kopijas. Rezultatas yra toks, kad analitikas gauna milijonus ar milijardus tikslo, todėl gali kilti problemų dėl užteršimo ir klaidingai teigiamų rezultatų. Pasaulio sveikatos organizacija paskelbė PGR standartus (PSO, 2016).

PGR yra gana paprastas būdas amplifikuoti ir aptikti DNR ir RNR sekas, pvz., susijusias su patogenų genetine medžiaga. Palyginti su tradiciniais DNR klonavimo ir amplifikavimo metodais, kurie gali užtrukti kelias dienas, PGR reikia tik kelių valandų. Dvigubos DNR pirmiausia denatūruojama karščiu, kad būtų atskirtos sruogos. Tada pradmenys susilygina su atskirtomis DNR grandinėmis (prijungimas), o DNR polimerazė pratęsia pradmenis. Rezultatas yra dvi originalios DNR grandinės kopijos. Denatūracijos, atkaitinimo ir pailgėjimo procesas yra vienas stiprinimo ciklas, kuris kartojamas 20–40 kartų. Tada galima analizuoti sustiprintą produktą.

Šis metodas yra plačiai naudojamas DNR amplifikavimui eksperimentiniam naudojimui, genetiniams tyrimams ir patogeninės medžiagos aptikimui. PGR yra labai jautrus ir reikalauja tik nedidelio mėginio kiekio. Dr Chiu pabrėžė 2010 m. Dokumentą (Boehme ir kt., 2010), kuris parodė, kad PCR pagrįsta technika gali greitai nustatyti TB, įskaitant antibiotikams atsparias formas, buvimą iš skreplių mėginių. Boehme pažymėjo, kad visuotinę tuberkuliozės kontrolę trukdo lėti ir nejautrūs diagnostikos metodai, ypač vaistams atsparios tuberkuliozės aptikimui. Ankstyvas aptikimas sumažina mirtingumą ir pertraukia perdavimą, tačiau jautrių metodų sudėtingumas ir infrastruktūros poreikiai riboja jų prieinamumą ir poveikį mažai išteklių reikalaujančiomis sąlygomis. Greito aptikimo testas, kurį sukūrė Boehme ir kt. buvo greitai dislokuotas Afrikoje ir kitur, nors tai brangu.

Taip pat buvo daug PGR rezultatų neatitikimų tarp laboratorijų atvejų, o tai rodo, kad laboratorijose skiriasi našumas, nors PGR tyrimai yra patvirtinti, akredituoti ir reguliariai naudojami kai kuriose laboratorijose. Be to, &ldquogenominis dreifas&rdquo daro įtaką šiems tyrimams, o PGR veikimas laikui bėgant blogėja, nes virusai mutuoja. Multipleksinis PGR, kuris yra pageidautinas, bet dar nevisiškai įgyvendintas tikslas, leistų analizuoti kelis to paties mėginio taikinius. Dr Chiu citavo Mahoney ir kt. (2007) dėl daugialypio PGR skydo testo, skirto aptikti 20 žmogaus kvėpavimo takų virusų, sukūrimo.

Dr Chiu & rsquos ypatinga kompetencijos sritis yra DNR sekos nustatymas. Šiuo metu yra daug DNR sekos nustatymo prietaisų ir metodų. Pavyzdžiui, bakterijoms 16S RNR yra bakterijų ribosomos dalis. Šiuose RNR fragmentuose yra labai konservuotos ir & ldquohypervariable & rdquo sekos regionai, kurie gali būti laikomi molekuliniais ir pirštų atspaudais & rdquo, kurie gali būti naudojami bakterijų gentims ir rūšims identifikuoti. Šie konservuoti regionai gali būti nukreipti į platų bakterijų spektrą iš klinikinių mėginių. Tačiau šis metodas nėra kiekybinis, nes skiriasi kopijų skaičius. Pagrindinis šio metodo privalumas yra tai, kad nereikia kultūros, todėl jis gali būti naudojamas labai įvairiems organizmams. Taikant šį metodą, DNR išgaunama iš klinikinio mėginio, pavyzdžiui, audinio ar kūno skysčio. 16S RNR genai yra amplifikuojami, sekvenuojami ir lyginami su etalonine duomenų baze, pvz., „GenBank“, siekiant rasti atitikmenį. Šio tipo tyrimai dar tik prieinami klinikinėje aplinkoje. Panašus metodas, naudojant 18S, 28S ir ITS genus, taip pat galimas eukariotų patogenams (grybeliams ir parazitams).

Kitas metodas yra skrydžio masių spektrometrijos (MALDI-TOF MS) matricos padedama lazerio desorbcijos jonizacijos trukmė. Ši technologija atsirado kaip priemonė identifikuoti ir diagnozuoti nežinomus mikrobus iš nepažeistų ląstelių arba ląstelių ekstraktų, naudojant baltymus, išverstus iš mikrobų genomų. Tai greita, jautru ir ekonomiška. Jį patvirtino mikrobiologai mikrobų identifikavimui ir padermių tipavimui, epidemiologiniams tyrimams ir biologinio karo sukėlėjų, vandens ir maisto sukeltų patogenų aptikimui,

atsparumo antibiotikams veiksniai ir kraujo bei šlapimo takų patogenai (Singhal ir kt., 2015).

Masių spektrometrija (MS) apima cheminių junginių jonizavimą į įkrautas molekules ir jų masės ir krūvio (m/z) santykio matavimą. MS chemijos moksluose buvo naudojama nuo 1900-ųjų pradžios, tačiau elektronų purškimo jonizacijos (ESI) ir MALDI plėtra devintajame dešimtmetyje padidino jos pritaikymą didelėms biologinėms molekulėms, tokioms kaip baltymai.

Tiek ESI, tiek MALDI yra pagrįsti & ldquosoft jonizacijos ir rdquo metodais, dėl kurių labai nesumažėja mėginio vientisumas. Jonizacijos metu baltymai paverčiami jonais pridedant arba praradus vieną ar daugiau protonų. MALDI-TOF MS turi tam tikrų pranašumų, palyginti su ESI-MS, nes ji gamina atskirai įkrautus jonus, todėl duomenų interpretavimas yra lengvas. Be to, ESI-MS reikia iš anksto atskirti chromatografija, bet ne MALDI-TOF MS, kuri yra visiškai automatizuota. Didelis pralaidumas ir greitis, susiję su MALDI-TOF MS, padarė jį pranašesniu atliekant didelio masto proteomikos darbus.

Mėginys analizei MALDI-TOF MS paruošiamas sumaišant arba padengiant jį energiją sugeriančio organinio &ldquomatrix&rdquo junginio tirpalu. Tiek matrica, tiek joje įstrigęs mėginys kristalizuojasi džiovinant, o matricoje esantis mėginys jonizuojamas lazerio spinduliu. Dėl to iš mėginio susidaro protonuoti jonai, kurie paspartinami taip, kad atsiskiria vienas nuo kito pagal jų masės ir įkrovos (m/z) santykį. Santykis matuojamas nustatant laiką, kurio reikia, kad jonas nuvažiuotų TOF vamzdžio ilgį (taigi ir skrydžio laikas ir rdquo). Remiantis TOF informacija, mėginio analitams sukuriamas būdingas spektras, vadinamas peptidų masės pirštų atspaudais (PMF). Mikrobai identifikuojami lyginant nežinomo mikrobų izoliato MS spektrą su žinomų izoliatų spektrais etaloninėje duomenų bazėje. Akivaizdu, kad technologijos apribojimas yra tas, kad tikslus naujų izoliatų identifikavimas yra įmanomas tik tuo atveju, jei etaloninėje duomenų bazėje yra konkrečių genčių, rūšių ir porūšių mėginių PMF.

Nežinomybių tema labai svarbi sergant infekcinėmis ligomis. Daktaras Chiu nurodė, kad iš trijų dažniausiai pasitaikančių ligų: mdashpneumonia, meningito/encefalito ir karščiavimo/sepsio-15–62 proc., 40–60 proc. Ir 20 proc. Atitinkamai sukelia nežinomi organizmai ir jie netenka ligoninės diagnostikos laboratorijose. išsivyščiusios šalys. Dėl to idėja, kad būtų galima viską sekti pacientų mėginiuose, yra patraukli, o tai dabar galima padaryti naudojant metagenominę naujos kartos seką. Metagenomika įveikia dvi problemas – nesugebėjimas auginti daugumos mikroorganizmų ir susidoroti su didžiule mikrobų genomine įvairove. Tai yra didžiausios kliūtys siekiant pažangos klinikinėje ir aplinkos mikrobiologijos srityje (Nacionalinė tyrimų taryba, 2007). Metagenomika siekia suprasti

biologija bendrame lygmenyje, peržengianti atskirus organizmus ir sutelkdama dėmesį į genus visoje mikrobų bendruomenėje, nesvarbu, ar tai būtų iš dirvožemio mėginio, ar iš žmogaus kūno. Tam taip pat reikia sukurti pažangius skaičiavimo metodus, kurie maksimaliai suprastų bendruomenių genetinę sudėtį ir veiklą, kuri yra tokia sudėtinga, kad gali būti imami mėginiai, bet niekada jų visiškai negalima apibūdinti (Nacionalinė tyrimų taryba, 2007).

Nors metagenomika vis dar yra palyginti naujas mokslas, ji sukūrė daug naujų žinių apie nekultūringą mikrobų pasaulį, naudojant radikaliai naujus mikrobiologijos metodus. Visas metagenomikos darbas prasideda tuo pačiu pirmuoju žingsniu: DNR išgaunama tiesiai iš visų tam tikrame mėginyje esančių mikrobų. Šis sumaišytas DNR mėginys gali būti analizuojamas tiesiogiai arba klonuojamas į formą, kurią galima išlaikyti kultivuojamose laboratorinėse bakterijose. Tai leidžia tyrėjams sukurti visų tame mėginyje rastų mikrobų genomų biblioteką. Šią biblioteką savo ruožtu galima tirti analizuojant klonuotos DNR nukleotidų sekas arba nustatant, kokius baltymus klonuoti genai gamina, kai jie yra išreikšti. Ši technika leidžia išspręsti sudėtingas ligos situacijas, kurios gali turėti daug įvairių priežasčių. Pavyzdžiui, atogrąžų karščiavimo ligas gali sukelti daugybė bakterijų, virusų ar parazitų rūšių, pasireiškiančių panašiais simptomais, o metagenomikos naudojimas gali padėti nustatyti, kuris konkretus organizmas sukelia karščiavimą paveiktiems pacientams.

Metagenominė biblioteka yra analogiška tūkstančiams dėlionių, supakuotų į vieną dėžutę, ir dėlionių vėl sudėjimas yra vienas iš didžiausių metagenomikos iššūkių. Šis metodas dabar įmanomas, nes yra nebrangi, didelio našumo DNR seka ir pažangios skaičiavimo galimybės, reikalingos norint suprasti milijonus atsitiktinių sekų, esančių genomo bibliotekose. Pastaruoju atveju reikalingas tvirtas bioinformatikos vamzdynas, pvz., Seka pagrįstas itin greito patogeno identifikavimo (SURPI) vamzdynas, kurį nurodė dr. Chiu.

Kaip metagenomikos technologijos pavyzdį, kuris gali būti tinkamas naudoti mažai išteklių reikalaujančioje aplinkoje, Dr. Chiu aptarė nanoporų seką, kuri leidžia realiu laiku aptikti metagenominį patogeną pacientams, sergantiems karščiavimu / sepsiu. Nanoporų sekos nustatymo privalumai yra galimybė atlikti realaus laiko sekų analizę, ilgus skaitymus ir tiesioginę DNR, RNR ir baltymų seką iš mėginių. Jis yra nešiojamas naudojant kišeninį prietaisą, jam nereikia interneto ryšio ir siūlomas potencialiai greitas apsisukimo laikas, kuris yra raktas į infekcinių ligų seką. Jo trūkumai yra tai, kad jo naudojimas yra brangus (500 USD už srauto elementą), vis tiek klaidų lygis yra 8–12 procentų, o srauto elementų kokybė gali būti kintama. Vis dėlto nanoporų sekos nustatymas buvo sėkmingai naudojamas realiuoju laiku stebint Ebolos virusą Vakarų Afrikoje (Quick ir kt., 2016). Greitai ir kt. rodo, kad rezultatai buvo gauti per mažiau nei 24 valandas po to, kai buvo gautas teigiamas Ebolos virusas

mėginio, o sekos procesas trunka tik 15–60 minučių. Tai iliustruoja, kad genomo stebėjimas realiuoju laiku yra įmanomas esant mažai išteklių sąlygoms ir gali būti greitai nustatytas protrūkiams stebėti. Dr Chiu & rsquos grupė Kalifornijos universitete, San Franciske, taip pat paskelbė neseniai paskelbtą darbą (Th & eacutez & eacute ir kt., 2018), kuriame aprašomas metagenomikos naudojimas atkuriant Zikos viruso įvedimą ir plitimą Meksikoje ir Centrinėje Amerikoje.

Kitame dokumente, kurį cituoja dr. Chiu, Gardy ir Loman (2017), teigiama, kad:

& ldquoNeseniai įvykusios Ebolos ir Zikos epidemijos rodo, kad reikia nuolat stebėti, greitai diagnozuoti ir stebėti infekcines ligas realiuoju laiku. Greitas ir įperkamas patogenų genomų sekos nustatymas ir žinios apie visuomenės sveikatos mikrobiologijos laboratoriją, turinčias pakankamai išteklių, gali paveikti kiekvieną iš šių sričių. Genomo diagnostikos ir epidemiologijos sujungimas su naujoviškomis skaitmeninėmis ligų aptikimo platformomis padidina atviros, pasaulinės, skaitmeninės patogenų stebėjimo sistemos galimybę. Tokia genomika pagrįsta sistema, turėdama informacijos apie „One Health“ metodą, kuriame kartu atsižvelgiama į žmonių, gyvūnų ir aplinkos sveikatą, turi didelį potencialą pagerinti visuomenės sveikatą aplinkoje, kurioje trūksta patikimų laboratorinių pajėgumų. & Rdquo

Vis dėlto, norint realizuoti šį potencialą, kyla iššūkių. Gardy ir Lomanas apibūdina kai kuriuos iš šių iššūkių, susijusių su Zikos virusu, kuriam būdingi žemi viruso titrai, mažas genomas (& lt11 kilobazių) ir trumpalaikė virimija. Visi šie veiksniai apsunkina viruso nukleorūgšties aptikimą metagenominiu metodu. Gardy ir Lomanas taip pat praneša, kad norint gauti pakankamą kiekį virusinės nukleorūgšties genomo sekos nustatymui, be paprastos diagnostikos, taip pat gali prireikti PGR ir amplikonų sekos nustatymo metodo. Kiti iššūkiai gali apimti & ldquoa prieigą prie patikimų interneto ryšių, galimybę rinkti metaduomenų pavyzdžius ir genomo išvadų pavertimą realaus laiko rekomendacijomis. & Rdquo


Biologijos virtualios laboratorijos ir modeliavimas

Čia yra mano mėgstamiausios virtualios laboratorijos ir modeliai, skirti mokytis ir tyrinėti biologiją, kai nėra praktinių parinkčių.

Išplečiama proto programinė įranga

Pirmą kartą šį svetainės brangakmenį radau, kai praeitais metais ieškojau alternatyvų gyvūnų skrodimui. Nors tai yra nemokamas šaltinis, jis vertas labai priimtinos kainos.

„EFrog“ virtualios skrodimo laboratorija

Šioje svetainėje rasite aukščiausio lygio virtualius gyvūnų skrodimus. Yra daug skilimų: žuvys (niežai, rykliai ir ešeriai), katės, vaisiaus kiaulės, sliekai, varlės ir bestuburiai (kalmarai, jūrų žvaigždės ir vėžiai).

Kiekvieno skrodimo metu studentai gali ištirti tiek išorinę, tiek vidinę anatomiją. Kadangi organams pašalinti naudojami virtualūs pincetai, pateikiamas kiekvieno organo paaiškinimas. Be to, studentai gali pasirinkti žiūrėti vaizdo įrašą, susijusį su konkrečiu organu. Pavyzdžiui, atlikdamas virtualią varlių skrodimą, mokinys gali žiūrėti vaizdo įrašus apie žarnyno peristaltiką, širdies pumpavimą ir plaučių pripūtimą.

Be virtualių skrodimų, šioje svetainėje yra ir kitų virtualių laboratorijų.

„Animacules“ laboratorijoje studentai gali peržiūrėti įvairias ląsteles per virtualų mikroskopą.

Aš tiesiog pamišęs dėl „eFly“ laboratorijos. Studentai tyrinėja genetinius kryžius, nes jie praktiškai veisiasi vaisines muses. Analizuodami savo kryžminimo vaisinių muselių palikuonis, jie susipažįsta su Punnetto aikštėmis, dominuojančiais ir recesyviniais genų aleliais ir su lytimi susijusiais bruožais.

Tai yra vienas iš mano mėgstamiausių virtualių laboratorijų šaltinių! Prieš pirkdami jie turi galimybę išbandyti laboratorijas demonstraciniu režimu.

BioInteractive

Be fantastiškų vaizdo įrašų, pamokų planų ir kitos veiklos, „Biointeractive“ turi keletą gražių virtualių biologijos laboratorijų.

Vykdydamas bakterijų identifikavimo laboratoriją, studentas supažindinamas su PGR taikymo procesu, siekiant nustatyti nežinomas bakterijas, išskirtas iš Petri lėkštelės.

Bakterijų identifikavimo laboratorijoje mokinys supažindinamas su PGR taikymo procesu, siekiant nustatyti nežinomas bakterijas, išskirtas iš Petri lėkštelės.

Kardiologijos virtualioje laboratorijoje studentas tiria 3 pacientus ir naudoja rezultatus diagnozei nustatyti. Tai fantastiškas modeliavimas paaugliams, svarstantiems apie medicinos karjerą, ir aš planuoju juos naudoti šiais metais su savo anatomijos ir fiziologijos studentais.

Išmok genetikos

PGR virtuali laboratorija iš „Learn Genetics“.

Jau daugelį metų „Learn Genetics“ yra viena iš mano mėgstamiausių svetainių, kuriose galima rasti idėjų mokant apie DNR ir genetiką. Jie taip pat turi keletą virtualių laboratorijų ir modeliavimo. Jų interaktyvūs modeliai padeda studentams suprasti procedūras, kurias mokslininkai naudoja tyrinėdami ląsteles ir DNR, įskaitant PGR, gelio elektroforezę, srauto citometriją, DNR išskyrimą ir DNR mikromasyvas.

Biomano biologija

BIOMAN Biologija pasiūlymų žaidimai ir virtualūs modeliavimas apie savo interneto svetainėje. Tai šiek tiek labiau panašūs į žaidimus nei į virtualias laboratorijas, tačiau jie atliekami taip, kad padėtų studentams suprasti medžiagą.

Kvėpavimo kelionės modeliavimo metu studentai keliauja per visas kvėpavimo sistemos dalis: iš pradžių kaip deguonies, o paskui kaip anglies dioksido molekulę.

Simuliacija, kurią planuoju naudoti savo anatomijos ir fiziologijos pamokoje, vadinama kvėpavimo kelione.

Jame jūs kontroliuojate deguonies molekulės kelią, einantį per kvėpavimo sistemą: per trachėją, į plaučius, per aveolių sienas ir į kraują, per širdį ir į kūno ląsteles. Tada studentai nuveda deguonies molekulę į ląstelės mitochondrijas ir stebi, kaip ji naudojama ATP gamybai. Tada jie paima anglies dioksido molekulę (ląstelių kvėpavimo atliekas) ir nukreipia kelionę atgal per venas į širdį, atgal į plaučius ir trachėją.

Tai tikrai šauni interaktyvi patirtis ir tikiuosi, kad tai padės studentams užmegzti kelis ryšius tarp bendrosios anatomijos ir ląstelių procesų.


Alternatyvaus pradmenų pasiūlymas ARTIC tinklo multipleksiniam PGR, siekiant pagerinti SARS-CoV-2 genomo sekos aprėptį

Biologų grupė „ARTIC Network“ pasiūlė multipleksuotą PGR pradmenų rinkinį, skirtą viso naujojo koronaviruso, SARS-CoV-2, genomo analizei netrukus po to, kai buvo atskleistos šio patogeno epidemijos. Atrodo, kad pradmenų rinkinį jau pritaikė daugelis mokslininkų visame pasaulyje ir prisidėjo prie kokybiškos ir greitos šio galimo pandeminio viruso genomo epidemiologijos. Mes taip pat matėme puikų jų pradmenų rinkinio našumą ir protokolą, pagal kurį pradmenų rinkinys galėjo amplifikuoti visus norimus PGR produktus su nedideliu amplifikacijos poslinkiu iš klinikinių mėginių, turinčių palyginti didelę viruso apkrovą. Tačiau mes pastebėjome, kad iš 98 nurodytų produktų, sumažėjus viruso apkrovai, labai sumažėjo rodmenų, gautų iš dviejų konkrečių PGR produktų, 18 ir 76, skaičius. Įtarėme, kad šios mažos aprėpties problemos priežastis buvo dimerų susidarymas tarp pradmenų, naudojamų tiems dviem PGR produktams amplifikuoti. Čia siūlome pakeisti tik vieną iš tų pradmenų, nCoV-2019_76_RIGHT(−), į naujai sukurtą gruntą. Grunto pakeitimo rezultatas parodė, kad pagerėjo abiejų produktų, taikomų 18 ir 76 regionuose, aprėptis. Tikimės, kad šis paprastas pakeitimas išplės viso SARS-CoV-2 genomo analizės ribą, įtraukdamas mėginius, kurių viruso apkrova mažesnė, ir pagerins genomo šio patogeno epidemiologija.


Bakterinių infekcijų tyrimo identifikavimo ir tipavimo metodai: trumpa apžvalga ir mikobakterijos kaip tyrimo atvejis

Graciela Castro-Escarpulli 1, Nayelli Maribel Alonso- Aguilar 1, Gildardo Rivera S & aacutenchez 3, Virgilio Bocanegra-Garcia 4, Xianwu Guo 5, Sara R Ju & Aacuterez-Enr & iacutequez 6, Julieta Luna-Herreutra-2 Gvadalupė 1*

1 Laboratorio de Bacteriolog & iacutea M & eacutedica, Departamento de Microbiolog & iacutea, Meksika

2 Laboratorio de Inmunoqu & iacutemica II, Departamento de Inmunolog & iacutea, Escuela Nacional de Ciencias Biol ir oacutegicas del Instituto Polit & eacutecnico Nacional, Meksika DF, 11340, Meksika

3 Laboratorio de Biotecnolog & iacutea Ambiental, Meksika

4 Laboratorio de Medicina de Conservación, Meksika

5 Lab. Biotecnología Genómica Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, Reynosa, 88710, Meksika

6 Laboratorio de pruebas especiales, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre del Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado, Meksika DF, 03229, Meksika

* Autorius susirašinėjimui: dr mA. Gvadalupė Aguilera Arreola
Laboratorio de Bacteriología Médica
Mikrobiologų ir širdies ligų departamentas
Nacionalinė gelbėjimo įstaiga „Ciencias Biol“ ir „oacutegicas“
IPN, Esq. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n
Pulkininkas Casco de Santo Tomás, del. Miguel Hidalgo
CP. 11340. México City, DF, Meksika
Tel: (+52-55) 57296300, pratęsimas 62374
Faksas: (+52-55) 57296207
El. Paštas: [el. paštas ir#160apsaugota]

Gauta data: 2015 m. spalio 25 d Priėmimo data: 2015 m. Gruodžio 05 d Paskelbimo data: 2015 m. Gruodžio 15 d

Citata: Aguilera-Arreola MG. Bakterinių infekcijų tyrimo identifikavimo ir tipavimo metodai: trumpa apžvalga ir mikobakterijos kaip tyrimo atvejis. Arch Clin Microbiol. 2015, 7: 1.

Anotacija

Keli metodai, pagrįsti molekulinė biologija ir buvo sukurta analitinė chemija, siekiant sumažinti kai kuriuos bakterijų apibūdinimo apribojimus. Molekuliniai metodai yra geriausia identifikavimo alternatyva bakterijų padermių izoliuotas nuo skirtingos kilmės ir pagerinti mokslinius tyrimus molekulinės kontekste epidemiologija. Tačiau šios metodikos yra sudėtingos ir brangios, palyginti su fenotipiniais ar klasikiniais metodais, ir nėra patikimų įprastų laboratorijų. Šioje apžvalgoje pateikiami pagrindiniai elementai, padedantys suprasti šias metodikas ir sudominti bendradarbiaujant jas naudoti analitinėse laboratorijose, kuriose bakterijų identifikavimas ir tipavimas yra prioritetiniai, nes molekuliniai metodai nėra visuotinai taikomi, tačiau yra prieinami mokslinių tyrimų ir etaloninėse laboratorijose.

Raktažodžiai

Identifikavimo apibūdinimas Bakterijos Infekcijos

Įvadas

Viena iš pagrindinių mikrobiologijos laboratorijos užduočių yra visiškai identifikuoti mikroorganizmus, dalyvaujančius procesuose, susijusiuose su infekcija ar susijusiais su žmonėmis. Tai leidžia žinoti jų etiopatogenines pasekmes, klinikinę raidą, taip pat taikyti veiksmingą antimikrobinį gydymą [1].

Bakterijų identifikavimas ir apibūdinimas praeityje buvo pagrįstas įvairiais fenotipiniais ir genotipiniais metodais (1 lentelė), tačiau pastaraisiais dešimtmečiais buvo pastebėta, kad genotipiniai metodai gali būti geresnė alternatyva bakterijų tapatybei nustatyti ir infekcinių ligų epidemiologiniams tyrimams praturtinti [2].

Fenotipiniai metodai Genotipiniai metodai
Biocheminės reakcijos Hibridizacija
Serologinės reakcijos Plazmidžių profilis
Jautrumas antimikrobinėms medžiagoms Plazmidžių polimorfizmo analizė
Jautrumas fagams Ribojančių fermentų virškinimas
Jautrumas bakteriocinams Reakcija ir atskyrimas impulsinio lauko gelio elektroforeze (PFGE)
Ląstelių baltymų profilis Ribotipų kūrimas
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ir jo variantai
Ligazės grandininė reakcija (LCR)
Transkripcija pagrįsta stiprinimo sistema (TAS)
Daugialypis sekų tipavimas (MLST)
Spoligotipų nustatymas ir MIRUS-VNTR

1 lentelė: naudojami klinikinių laboratorijų bakterijų identifikavimo arba spausdinimo metodai.

Bakterinės infekcijos sukelia sergamumą ir mirtingumą ir yra atsakingos už pacientų išlaidų padidėjimą ir hospitalizavimo laiką. Laikas, kurio reikia patogenui nustatyti remiantis jo fenotipinėmis savybėmis, yra pirmasis iššūkis, nes mėginys turi būti sėjamas ir inkubuojamas mažiausiai 24 valandas, o vėliau dar mažiausiai 24 valandas turi būti atliekami įprasti biocheminiai tyrimai, Sąlygos, kurios vilkina rezultatus ir kenkia paciento sveikatai.

Šiuo metu daugelyje mikrobiologijos laboratorijų įprasta naudoti automatines arba pusiau automatines komercines bakterijų identifikavimo sistemas, pavyzdžiui: API ENTEROTUBE, VITEK, PHOENIX, MALDI-TOF MS ir mikobakterijų sistemą GENOTYPE MYCOBACTERIUM CM. Kai kurios savybės, į kurias atsižvelgiama renkantis identifikavimo sistemą, yra šios: paprastumas skiepyti mėginius, charakteristikos, kurios turi būti nustatytos, būtinas apdorojimas mėginiams apdoroti po inkubacijos ir duomenų bazių prieinamumas bei apimtis [3].

Fenotipiniai metodai ne visada gali identifikuoti mikroorganizmą pagal rūšies lygį, o dar mažiau - į padermės lygį. Todėl, jei reikia nustatyti protrūkį, už kurį atsakingas tik vienas klonas, reikia daugiau laiko ir naudoti genotipinius (molekulinius) arba specifiškesnius imunologinius metodus. Nepaisant ribotumo, fenotipiniai metodai suteikia pirminį identifikavimą, leidžiantį priimti sprendimus ir yra labiau prieinami klinikinėse laboratorijose ar ligoninėse dėl mažų sąnaudų ir didelio personalo mokymo šioje sveikatos srityje [4].

Organizmų išskyrimo ir identifikavimo iš žmogaus mėginių, biologinių produktų ar bet kokios kitos kilmės metodai apima izoliavimą grynoje dominančio organizmo kultūroje, po kurio atliekami būtini tyrimai, siekiant nustatyti mikrobų metabolizmą ir (arba) įvairūs imunologiniai metodai tai palengvins identifikavimą. Daugeliu atžvilgių kultūros metodai ir kiti identifikavimo metodai yra riboti jautrumo, specifiškumo ar abiejų aspektų atžvilgiu. Jautrumo, specifiškumo ir reikalingo laiko patobulinimai grindžiami molekulinės biologijos pažanga, kuri buvo integruota į komercines greitos diagnozės strategijas. Molekulinės biologijos metodų naudojimas patogenams identifikuoti ir sekti yra pagrįstas konkretaus organizmo, kurį reikia aptikti ar apibūdinti, genomo ypatybėmis. Tačiau kai kurie aspektai vis dar apsunkina jų taikymą mikrobiologijos laboratorijoje: izoliacijos sunkumai, lėtas augimas, tyrimų išlaidos ir menkas jų aptikimo jautrumas nustatant kai kurias bakterijų rūšis, gautas iš sudėtingų mėginių, be kita ko.

Ši apžvalga apima skirtingas fenotipines, dar vadinamas klasikines, metodikas, taip pat skirtingus molekulinės biologijos metodus, taikomus bakterijų apibūdinimui. Taip pat siekiama padidinti susidomėjimą bendradarbiaujant šias metodikas naudoti laboratorijose, kuriose bakterijų identifikavimas ir tipavimas yra prioritetiniai, nes, nors molekuliniai metodai dar nėra visuotinai taikomi, jie yra prieinami tyrimų ir etaloninėse laboratorijose, kurios galėtų suteikti patirties. išspręsti su pirmojo lygio metodikas sveikatos problemas šalyje.

Fenotipinis identifikavimas

Norint nustatyti infekcinio proceso sukėlėją, reikia atsižvelgti į: 1) mėginių paėmimą, 2) mikroskopinių ir kolonijinių morfotipų nustatymą ir 3) nustatymą remiantis bakterijų metabolizmu atliekant įprastus arba automatinius tyrimus [2]. Fenotipinis tyrimas atspindi klasikinį identifikavimo požiūrį, ir dauguma identifikavimo strategijų yra pagrįsti juo [5].

Daugeliu atvejų fenotipinis identifikavimas grindžiamas ne tik vienu metodu, bet ir daugiau nei vieno deriniu. Mėginys turi būti paimtas iš tos vietos, kurioje mikroorganizmas daro žalą, arba turi būti reprezentatyvi vieta ar produktas, kuriame jis dauginasi. Kai kurie klinikinėje mikrobiologijoje naudojami mėginiai yra: išmatos, šlapimas, ryklės eksudatas, smegenų skystis, ašaros, sperma, makšties skystis, audiniai ir (arba) biopsijos. Kai kurie metodai reikalauja gryno mikroorganizmo išskyrimo iš mėginio, o kitiems to nereikia. Fenotipinis bakterijų identifikavimas iš esmės pagrįstas nežinomų bakterijų fenotipinių savybių palyginimu su tipo kultūros savybėmis. Identifikavimo patikimumas yra tiesiogiai proporcingas panašių charakteristikų skaičiui. Medicininėje bakteriologijoje išankstiniam identifikavimui labai svarbi ankstesnė analizatoriaus patirtis ir susiejimas tarp mikroorganizmų, vietos ir infekcijos tipo. Taigi tradicinio ar klasikinio bakterijų identifikavimo proceso metu buvo nustatyti trys apdorojimo lygiai [1].

a) Pirminis testai laikomi pirmojo lygio. Tai yra greiti ir paprasti bandymai, tokie kaip dažų ir dėmių, tokių kaip Gram arba Ziehl-Neelsen, įsisavinimas, mikroskopinis bakterijų morfotipo nustatymas, kurį atskleidžia dėmės, augimo charakteristikos skirtingose ​​inkubacinėse atmosferose, skirtingose ​​temperatūrose ir įvairiose auginimo terpėse, oksidazės ir katalazės fermentų gamyba, oksidacija-fermentacija, gliukozės fermentacija, sporų susidarymas ir mobilumas. Atliekant šiuos tyrimus, paprastai galima laikinai priskirti patogeną į kai kurias pagrindines klinikinės reikšmės grupes. Vėliau gali būti naudojami kiti metodai, turintys didesnę diskriminacinę galią, kad būtų galima atskirti mikroorganizmus, kurie makro- ir mikroskopinėse analizėse pateikia labai panašų aspektą [6].

b) antrasis lygis identifikavimo turi būti nurodyti mikroorganizmo genties. Tiek šiuo, tiek ankstesniu lygmeniu hipotezė apie mikroorganizmų tikrąją tapatybę yra pagrįsta kultūros savybėmis ir pirminiais tyrimais, kurie leis nustatyti gentį, genčių grupę ar, kai kuriais atvejais, šeimą. izoliatas. Taip pat reikia atsižvelgti į klinikinius duomenis. Tai labai priklausys nuo stabilaus fenotipinių požymių modelio ir nuo mikrobiologo patirties [7].

c) Galiausiai trečias identifikavimo lygis yra rūšies lygmenyje. Kai biocheminiai tyrimai leidžia nustatyti tiksliai dauguma kliniškai reikšmingų bakterijų. Jei tai neįmanoma, galima naudoti daugiau bandymų, kaip ir įvairiose komercinėse sistemose.

Rinkoje yra daug įvairių bandymų sistemų ar įrangos, kad bakterijų atpažinimas būtų greitas ir patikimas. Taikant šiuos metodus reikia tiksliai kontroliuoti inokuliatą, jo grynumą ir pasėjimo būdą, inkubaciją ir testų nuskaitymą, nes šių kriterijų nesilaikymas gali sukelti klaidų. Šios sistemos gali būti rankinis, pusiau automatinis arba automatinis. Rezultatas lyginamas su standartizuotais bandymais arba su skaitmeninių profilių duomenų baze, kurią šiam tikslui sukūrė komerciniai metodai. Apribojimas yra mutuojančių padermių atsiradimas ir plazmidžių, kurios gali sukelti skirtingų savybių padermes, įsigijimas [5,8].

Skirtingai nuo klinikinės biochemijos ar hematologijos laboratorijų, kurioms buvo naudinga mėginių apdorojimo supaprastinimo technologija ir taip per trumpą laiką gaunami rezultatai, mikrobiologijos laboratorijos automatizavimas yra sudėtingesnis, atsižvelgiant į didelę analizuojamų klinikinių mėginių įvairovę ir būdingas savybes. skirtingų mikroorganizmų savybės. Neseniai masės spektrofotometrija (MS) tapo mikrobiologijos laboratorijos dalimi, siūlančia greitą ir patikimą alternatyvą mikroorganizmams, įskaitant vieną iš sunkiausiai nustatomų bakterijų grupių, mikobakterijų identifikuoti [9,10].

MS yra analitinis metodas, leidžiantis labai tiksliai išanalizuoti skirtingų cheminių elementų sudėtį, leidžiant išmatuoti jonus, gautus iš molekulių, ir atskirti juos pagal jų masės/apkrovos (m/z) santykį [11]. Kiekvieno junginio masės spektras yra pavadintas &ldquochemical trace&rdquo ir yra gautų fragmentų grafinis vaizdas didėjančia masės tvarka pagal santykinį gausumą. Prieš keletą dešimtmečių buvo pasiūlytas bakterijų identifikavimas pagal baltymų profilį, gautą MALDI-TOF masės spektrometrijos metodu. Tačiau jis buvo naudojamas tik neseniai kaip greitas ir patikimas bakterijų identifikavimo metodas [9]. Šiuo metu parduodamose platformose MS naudojama mikroorganizmams identifikuoti taikant įvairius metodus: identifikavimą, pagrįstą kiekvieno mikroorganizmo specifiniu baltymų profiliu (proteominis metodas) arba jo nukleorūgščių analizę (genominis metodas). Kai kurios komercinės sistemos, kuriose naudojamos MS, yra šios: „MALDI-TOF“ mikrobų identifikavimui „Waters Corporation“ „MicrobeLynxTM“, „Bruker Daltonics“ „MALDI BiotyperTM“ ir „BioM & eacuterieux“ [12]. Paskutinis leidžia identifikuoti mikobakterijas [13].

Genotipinis (molekulinis) identifikavimas

Pastaraisiais metais ir atsiradus naujoms metodikoms, pagrįstoms molekuliniais metodais, padaryta didelė pažanga kliniškai svarbių bakterijų diagnostikoje. Tarp jų išsiskiria ribosominės RNR aptikimas hibridizuojant su DNR zondu ir nukleorūgščių amplifikacija iš klinikinių mėginių. Šie metodai pagerina jautrumą ir diagnostinį specifiškumą, palyginti su kitais aptikimo metodais, įskaitant kultūrą, ir kai kuriais atvejais leido vienu metu aptikti kelis mikrobinius agentus iš to paties mėginio [14].

Pirmasis žingsnis kuriant metodikas, pagrįstas molekulinės biologijos metodais, buvo paremtas mikroorganizmų nukleorūgščių aptikimu zondo pagalba hibridizacijos būdu. Genetinis zondas yra nukleorūgšties molekulė, monokatuota ir pažymėta, kuri gali būti naudojama norint nustatyti papildomą DNR seką. Oligonukleotidų zondai gaunami iš natūralios DNR, klonuojant DNR fragmentą į atitinkamus plazmidės vektorius, o po to išskiriant klonuotą DNR arba atliekant tiesioginę sintezę naudojant kombinuotą chemiją. Zondai gali būti pažymėti medžiagomis, kurios tinkamomis sąlygomis sukelia spalvingas reakcijas [15].

DNR hibridizacijos metodai yra gana lengva atlikti ir interpretuoti. Amplifikacijos metodai, pagrįsti DNR aptikimu naudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR) ir ligazės grandininę reakciją (LCR), arba transkripcijos sukeltos specifinės rRNR amplifikacijos jau yra prieinami tiek namuose, tiek komerciniais tikslais. Šie metodai suteikia greitesnius rezultatus su didesniu jautrumu ir specifiškumu nei įprasti metodai.Priklausomai nuo mėginio tipo, šie metodai aptinka nuo 15 iki 20% daugiau infekcinių ligų sukėlėjų nei įprasti ir 25–70% daugiau nei naudojant imunofluorescenciją arba fermentinę imuninę analizę (PAV) [14, 16].

Sukuriant zondus, skirtus aptikti virulentiškumo žymenis, kaip tuos, kurie nukreipti į toksinus koduojančius genus, galima identifikuoti tuos organizmus, kurie šiuos genus nešioja klinikiniuose mėginiuose, nereikia auginti mėginių. Vėlesnių pavyzdžiai yra zondai, skirti Escherichia coli enterotoksinai, skirti Vibrio cholerae toksinasarba dėl toksinų Clostridium difficile, kurį galima tepti tiesiai ant išmatų mėginių [17].

Mikroorganizmams aptikti naudojami skirtingi tiksliniai genai, pavyzdžiui, tie, kurie sukelia lytiniu keliu plintančias infekcijas (STI), kurie buvo naudojami PGR tyrimuose, tarp jų yra genai. omp1 ir omp2 pagrindinių membraninių baltymų (MOMP), kad ištirtų pagrindinius etiologinius veiksnius, paslaptingą plazmidę pCT ir genus 16S rRNR ir 23S rRNR, tyrimams, skirtiems identifikuoti C. trachomatis [14,18,19]. Dėmesys genams 16S rRNR ir 23S rRNR padidina tyrimo jautrumą, nes paprastai mikroorganizmuose yra daug kopijų. Tačiau kai kurie autoriai teigia, kad kryžminės reakcijos su kitomis bakterijomis gali sukelti problemų, o kiti įrodė, kad naudojant konservuotus 16S geno regionus rRNR amplifikacijos reakcijose leidžia diferencijuoti konkrečiai rūšiai [19, 20]. Genų ir tikslinių regionų naudojimas mikobakterijoms aptikti yra gerai ištirta sritis, ypač dėl šių mikroorganizmų išskyrimo iš biologinių mėginių sunkumų, be to, dėl dabartinių sunkumų tvarkant šiuos labai virulentiškus mikroorganizmus. Šios bakterijų genties identifikavimui buvo panaudotos kelios sekos, genai ir tarpgeniniai regionai, tarp jų rRNR 16-23S sritis, 16S genai. rRNR, gyrB ir rpoB, įterpimo elementas IS6110 ir pašalinimo diferenciacijos regionai RD1 ir RD4 [21]. Šių genų arba genų sekų tyrimas naudojant PGR galiausiai leis palyginti gauto produkto seką su etaloninių izoliatų sekomis. Sukurta keletas komercinių infekcinių ligų diagnozavimo zondų, tačiau gebėjimas aptikti nedidelį skaičių organizmų ar kelias geno kopijas klinikiniame mėginyje vis dar yra ribojantis šios technikos veiksnys. Tačiau PGR derinimas su zondų hibridizacija gali tapti pasirinktu metodu, ypač mikroorganizmams, kurių kultūra laboratorijoje yra lėta ir sunki [15].

PGR yra in vitro DNR sintezės metodas, kuriuo tam tikras DNR segmentas yra amplifikuojamas atribojant porą gretimų pradmenų. Kopijavimas pasiekiamas eksponentiškai per pasikartojančius skirtingų inkubacijos periodų ir temperatūrų ciklus, dalyvaujant termostabiliam DNR polimerazės fermentui. Tokiu būdu per porą valandų galima gauti milijonus norimos DNR sekos kopijų. Tai labai specifinis, greitas, jautrus ir universalus molekulinės biologijos metodas, leidžiantis aptikti mažiausius konkrečios DNR kiekius, palengvinti jos identifikavimą ir išvengti radioizotopų naudojimo [22]. Nepaisant PGR metodo pranašumų, palyginti su kultūra, skirta kai kuriems mikroorganizmams aptikti, komerciškai prieinamų metodų yra nedaug ir jie taikomi tik mokslinių tyrimų laboratorijoms arba etaloninėms laboratorijoms, kurios, be kitų priežasčių, specializuojasi molekulinėje diagnostikoje, dėl didelių sąnaudų. Alternatyva, kaip molekulinės diagnozės taikymas būtų įmanomas kaip įprastas metodas, galėtų būti reagentų įsigijimas atskirai ir kiekvienoje diagnostikos laboratorijoje sukurtų nukleorūgščių ekstrahavimo ir amplifikacijos protokolų standartizavimas, dėl to labai sumažėtų technologinė priklausomybė ir padidėjęs naudojamų diagnostikos metodų jautrumas ir specifiškumas [23].

Daugybinis kai kurių mikroorganizmų aptikimo stiprinimas kai kuriais atvejais padidina jautrumą ir specifiškumą tiems, kurie yra aptariami vienam mikroorganizmui. Šis PGR variantas vadinamas daugybiniu PGR (mPCR), kuriame vienu metu galima sustiprinti daugiau nei vieną tikslinę seką, į reakciją įtraukiant daugiau nei porą pradmenų [24]. Ši technika buvo sėkmingai taikoma daugelyje diagnostikos sričių, tokių kaip infekcinių ligų tyrimas, rūšių genotipų nustatymas, paveldimų ligų diagnostika, mutacijų nustatymas, paleontologija, antropologija ir teismo medicinos mokslai, be kita ko, ši technika parodė, kad galima sutaupyti daug laiko, nepakenkiant bandymo naudingumui ir efektyvumui [24]. Kita vertus, tampa prieinamos patogenų identifikavimo platformos, tokios kaip piroseguencing ir spektroskopija [25].

Amplifikacijos-pirozės sekos nustatymo platformose bakterijų identifikavimas pasiekiamas trijų kintamų 16S rRNR regionų (V1-V3 arba V1, V2 ir V6) PGR būdu. Gaunami mažesni 500 bp amplikonai, jų nukleotidų sudėtį galima nustatyti skleidžiant šviesą, išsiskiriant pirofosfatams (išplėstiniai šalutiniai produktai polimerizuojant DNR grandinę). Ši platforma buvo vis labiau diegiama, atsižvelgiant į klinikinio mėginio tipą ir skirtingų genų fragmentų, atitinkančių skirtingus virulentiškumo veiksnius, ir atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymą, o tai pagerino šios platformos universalumą [2,25]

Kita novatoriška bakterijų identifikavimo platforma yra amplifikacijos (PGR) ir masių spektrofotometrijos (PGR/ESI-TOF) jungtis. Pastarasis leidžia universaliai aptikti vieną ar kelis patogenus, sutinkamus įvairiausiuose mėginiuose (aplinkos, klinikiniuose, maisto produktuose, o kultūrose). Jį sudaro nukleorūgščių ekstrahavimas ir PGR amplifikacija naudojant plataus diapazono pradmenų poras, gaunamas vienas ar keli PGR produktai, atitinkantys skirtingų mikrobinių sričių genomo identifikavimo sritis, atsižvelgiant į probleminio mėginio sudėtingumą. Iš produktų pašalinama druska, po to jonizuojama ir aerozolizuojama masės spektrometro link, sukuriant signalus, kurie apdorojami siekiant nustatyti jų masę ir sudėtį. Rezultatai aiškinami naudojant TIGER (Triangulation Identification for the Genetic Evaluation of Risks) strategiją ir prieigą prie informacijos į genomo duomenų bazę, kuri priskiria rūšį. Šios platformos privalumai yra tai, kad jai nereikia kultivavimo, ji yra veiksminga polimikrobinių mėginių atveju ir, jei nėra naujų būdingų patogenų, ji leidžia priskirti juos bakterijų gentims ar šeimoms. Be to, jis taip pat leidžia aptikti kai kuriuos virulentiškumo ir atsparumo genus bei nustatyti identifikuoto mikroorganizmo tipą [2,12].

Mikroorganizmų tipavimas

Nustačius bakterijas, epidemiologiniams tyrimams reikia įvesti mikroorganizmus, taigi molekulinės tipavimo sistemos yra viena iš molekulinių metodų, padedančių pastaraisiais metais plačiai naudoti mikrobiologiją. Šios sistemos apima daugybę metodų, skirtų palyginti tarpusavyje susijusių organizmų genomų struktūrą.

Tipavimo metodai (fenotipiniai ir genotipiniai) leidžia atskirti vieną bakterijų padermę nuo kitos. Prieš naudojant tipavimo metodą, svarbu užtikrinti, kad šis metodas galėtų atskirti nesusijusias izoliacijas, kad jis gali aptikti tą patį padermę skirtinguose mėginiuose ir kad jis atspindėtų genų ryšius tarp izoliacijų su epidemiologiniu ryšiu [26].

Praktiniu požiūriu spausdinimo sistema turėtų būti atkuriama, turi didelį diskriminacinį pajėgumą, ja būtų lengva naudotis ir interpretuoti rezultatus [26]. Nepaisant to, molekulinio metodo pasirinkimas priklauso ir nuo kitų veiksnių, tokių kaip tiriamas mikroorganizmas, klinikinis mėginys, tiriamas objektas (vienas genas arba visas genomas), taikymo sritis, prieinama infrastruktūra. klinikinė laboratorija ir greitis, reikalingas rezultatui pasiekti. Nustačius mikroorganizmą, svarbu žinoti, ar jis yra atsakingas už išsiveržimą, todėl reikia atlikti atitinkamus epidemiologinius tyrimus. Šiam procesui atlikti buvo naudojami įvairūs molekuliniai metodai, kuriais siekiama nustatyti kloninį ryšį tarp kelių tam tikros rūšies izoliatų. Ši informacija yra naudinga sporadinėms infekcijoms, o dar labiau ligų protrūkių ir epidemijų metu, nes leidžia nustatyti cirkuliuojančių klonų skaičių, aptikti patogenus ir užsikrėtimo kelią, nustatyti infekcijos šaltinį, ypač atpažinti virulentines padermes ir taip sukelti tinkamiausias gydymas [27,28].

Rašymo technologijos, pagrįstos visu mikroorganizmo genomu, duoda geresnių rezultatų nustatant kloninį ryšį. Tačiau šiai analizei reikalingas genomo virškinimas restrikcijos fermentais, kad gautume įvairaus dydžio DNR fragmentus, kurie pateikia modelius ar profilius, kai jie buvo atskirti elektroforezės būdu. Kita vertus, nepatogu, kad įvairūs fragmentai, gauti taikant apribojimo procedūrą, yra didelio dydžio fragmentai, kuriuos reikia išanalizuoti naudojant impulsinio lauko gelio elektroforezę (PFGE) [26]. PFGE yra metodas, plačiai naudojamas kliniškai svarbių bakterijų tipavimui. Jo svarba priklauso nuo to, kad šio tipo elektroforezės būdu galima atskirti didesnius nei 50 kb ilgio fragmentus iki 10 Mb, o tai neįmanoma naudojant įprastinę elektroforezę, kuri gali atskirti tik nuo 100 bp iki 50 kb fragmentus. Ši PFGE talpa atsiranda dėl jos daugialypės savybės, nuolat keičiančios elektrinio lauko kryptį, taigi, leidžiančios perorientuoti DNR molekulių kryptį, kad jos, be šio įvykio, galėtų migruoti per agarozės gelį , taikomi elektros impulsai yra skirtingos trukmės, skatinantys molekulių persiorientavimą ir skirtingo dydžio fragmentų atskyrimą [29]. Ilgą laiką buvo kuriama įvairių tipų PFGE įranga (2 lentelė), daugiausia siekiant pagerinti gelių skiriamąją gebą ir sumažinti reagentų bei elektros sąnaudas. Labiausiai naudojamas aparatas yra kontūro prispaudžiami vienarūšiai elektriniai laukai (CHEF, BioRad), nes jis gali atskirti 7000 kb molekules. Šią charakteristiką užtikrina 24 elektrodai, paskirstyti šešiakampiu būdu ir generuojantys vienalytį elektrinį lauką, leidžiantį paimti mėginius. vienodai [29,30]. Kai kurie PFGE privalumai yra šie: jis pasižymi didele diskriminacine galia, puikiu atkuriamumu, paprastumu išmatuoti genomą ir leidžia dirbti su daugybe mėginių. Trūkumai apima tai, kad daugumai protokolų impulsų tipams gauti ir išanalizuoti reikia daugiau nei 4 dienų, palyginti su kitais metodais, kurie gali būti pigesni, bet netinkami tirti su kloniniu būdu susijusias padermes (2 lentelės ir 3) [27,29]. PFGE taikymą mikobakterijų infekcijos tyrimui apribojo poreikis tikėtis didelės mikobakterijų DNR koncentracijos, kurią sunku gauti, nes veiksmingas ląstelių sienelės lūžimas ir mikobakterijas dengiančių lipidų skaidymas yra sudėtingos procedūros, mikobakterijų augimas. yra linkęs kauptis grupėse, o tai taip pat trukdo tyrimui [31].

Metodas Technikos lengvumas Rezultatų aiškinimas Testo trukmė (dienomis) Atkuriamumas tarp laboratorijų Atkuriamumas atliekant tyrimą Mokestis už testą
PFGE Vidutinis Lengva 3 Gerai Gerai Vidutinis
PCR-RFLP Lengva Lengva 1 Gerai Gerai Žemas
pakartotinis PGR Lengva Lengva 1 Gerai Vidutinis Žemas
AP-PGR Lengva Lengva 1 Vidutinis Žemas Žemas
AFLP Vidutinis Vidutinis 2 Gerai Gerai Vidutinis
MLST Sunku Vidutinis 2 Gerai Gerai Aukštas

2 lentelė: Svarbiausios kai kurių tipavimo metodų, pagrįstų nukleorūgščių PGR amplifikacija, ypatybės, palyginti su impulsinio lauko gelio elektroforeze (PFGE).

Rašymo būdas apibūdinimas Žymeklių skaičius Laiko skalė Variacijos šaltinis Diskriminacinė galia Atgaminamumas Taikymas Duomenų bazė
MLST PGR amplifikacija namų tvarkymas genai alelių profiliams sukurti 7 GE DNR seka Nuo vidutinio iki aukšto Aukštas Acinetobacter baumannii pubmlst.org
LE Clostidium difficile www.mlst.net
Koaguliazės neigiami stafilokokai
Enterokokai
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
pakartotinis PGR Pakartotinių genomo sekų PGR amplifikacija NA LE Juostų raštai Nuo vidutinio iki didelio Vidutinis Staphylococcus aureus NA
Mycobacterium tuberculosis
Acinetobacter baumannii
PFGE Makro restrikcijos fragmentų palyginimas NA LE Juostų raštai Nuo vidutinio iki didelio Aukštas Acinetobacter baumannii NA
Staphylococcus aureus
Koagulazės neigiami stafilokokai
AFLP Genominės DNR fermentų restrikcijos virškinimas, restrikcijos fragmentų surišimas ir selektyvus amplifikacija NA LE Juostų raštai Nuo vidutinio iki aukšto Žemas Acinetobacter baumannii NA
Klebsiella pneumoniae
Staphylococcus aureus
Mycobacterium tuberculosis
MLVA Vietų VTR PCR amplifikacija, vizualizuojant polimorfizmą, kad būtų sukurtas alelio profilis Spalio-80 d GE DNR seka Nuo vidutinio iki didelio Aukštas Clostidium difficile minisatellites.upsud.fr
Enterokokai www.mlva.net
Mycobacterium tuberculosis www.pasteur.fr/mlst
Staphylococcus aureus
RFLP Genominis DNR skaidymas arba amplikonas su restrikcijos fermentais, gaminantis trumpus restrikcijos fragmentus NA LE Juostų raštas Žemas Aukštas Staphylococcus aureus https: //app.chuv .ch/prasite/index.htm
Pseudomonas aeruginosa
Mycobacterium tuberculosis

3 lentelė: Kai kurių molekulinės biologijos metodų ir ligoninėje svarbių bakterijų lyginamoji analizė, kai jos taikomos.

Polimerazės grandininė reakcija-RFLP

Susideda iš PGR, skirto geno ar jo dalių amplifikacijai, kartu su tolesniu PGR produktų virškinimu naudojant vieną ar kelis restrikcijos fermentus. Elektroforezinė restrikcijos produktų analizė atskleidžia geno ar jo fragmentų (RFLP) polimorfizmus ir įrodo genetinius pokyčius tarp izoliatų. Ši technologija gali greitai atskleisti sekų polimorfizmus, ji yra technologiškai paprasta ir labai atkuriama. Be to, jis gerai lyginamas su kitais metodais, tokiais kaip: denatūruojančio gradiento gelio elektroforezė (DGGE), temperatūros gradiento gelio elektroforezė (TGGE) arba vienos grandinės konformacijos polimorfizmas (SSCP) ir pjaustytų fragmentų ilgio polimorfizmas (CFLP), kurie taip pat atskleidžia sekos polimorfizmus kamienai, nenustatant visos sekos [32]. Mikobakterijoms PCR-RLFP buvo plačiai naudojamas, ypač tiriant įterpimo elementą IS6110, kur fermentas Pvull naudojamas restrikcijos fragmentams iš genominės DNR generuoti [33]. Kitos sekos arba genai, naudojami identifikuoti ir genotipui Mycobacterium tuberculosis, taip pat kitos ne tuberkuliozės mikobakterijos yra 16S rDNR ir genai rpoB, recA, ir hsp65, kurie davė įvairių rezultatų [34]. Iš šių sekų nuosekliausias buvo genas, koduojantis 65 kDa šilumos šoko baltymą (hsp65), analizuojamas naudojant PGR pagrįstą tyrimą ir jo užpakalinį restrikciją su fermentais BstEII ir HaeIII, kuris žinomas kaip PRA (polimerazės grandininė reakcija). Restrikcijos fermentų analizė ir mdash PRA) [35]. Iš nekomercinių molekulinių metodų PRA metodas yra vienas iš labiausiai naudojamų greitai besivystančioms mikobakterijoms identifikuoti dėl savo greičio, mažos kainos ir visų pirma dėl to, kad duomenų bazė: https: // app. chuv. ch/prasite/index.htm, yra prieinamas ir jame yra mažiausiai 113 rūšių apribojimo profiliai [36].

Pakartotinė polimerazės grandininė reakcija

Versalovic ir kt. [37] aprašė metodą, kaip ištirti bakterijų genomą, išnagrinėjus konkrečius tam tikros padermės modelius, gautus PGR amplifikuojant pasikartojančius DNR elementus, esančius bakterijų genomuose. Rašymo tikslais jie naudojo du pagrindinius pasikartojančių elementų rinkinius-REP su 38 bp sekomis, kurias sudaro šešios išsigimusios padėtys ir kintama 5 bp kilpa tarp kiekvienos konservuotos palindrominės dalies pusės. REP sekos buvo aprašytos tiek enterinių bakterijų, tiek gramteigiamų [28, 38] ir pastaruoju metu mikobakterijų, įskaitant netuberkuliozines mikobakterijas, pastarosiose, o pastarosiose buvo gauti geri rezultatai [39]. ERIC sekos yra antrasis DNR sekų rinkinys, kuris buvo sėkmingai naudojamas štamų tipavimui, tai yra 126 pb elementai, kuriuose yra labai konservuotas centrinis apverstas pasikartojimas ir yra ekstrageniniuose bakterijų genomo regionuose. ERIC analizė taip pat buvo naudojama mikobakterijų genotipams nustatyti [40]. REP arba ERIC amplifikaciją galima atlikti tik su vienu pradmeniu arba su vienu ar keliais pradmenų rinkiniais. ERIC modeliai paprastai yra mažiau sudėtingi nei REP modeliai, tačiau abu užtikrina gerą diskriminaciją padermių lygiu. Abiejų metodų (REP-PGR ir ERIC-PGR) naudojimas kartu įvedamose padermėse padidina jų diskriminacinę galią [28]. Nors REP ir ERIC sekos yra dažniausiai naudojami DNR tipavimo taikiniai, taip pat naudojamos BOX sekos, pastarosios buvo naudojamos diferencijuoti Streptococcus pneumoniae. BOX elementai yra tarpgeniniuose regionuose ir dėl tolygios simetrijos taip pat gali sudaryti kamieninių kilpų struktūras. Jie yra pasikartojančių elementų mozaika, sudaryta iš kelių trijų sekų, žinomų kaip boxA, boxB ir boxC, derinių. Trijų subvienetų sekos turi atitinkamai 59, 45 ir 50 nukleotidų molekulinius ilgius. DĖŽUTĖS elementai neturi ryšio su REP ir ERIC sekomis [28].

Sustiprintas fragmento ilgio polimorfizmas

Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) yra genomo pirštų atspaudų ėmimo metodas, pagrįstas selektyviu DNR fragmentų pogrupio amplifikavimu, gautu virškinant restrikcijos fermentus. Iš pradžių taikytas augalų genomų apibūdinimui, šiuo metu AFPL buvo naudojamas bakterijų tipavimui. Buvo aprašyti du AFLP variantai: pirmasis su dviem skirtingais restrikcijos fermentais ir dviem pradmenimis amplifikacijai, o antrasis - tik su vienu pradmeniu ir vienu restrikcijos fermentu. Bakterinė DNR išgaunama, išgryninama ir po to virškinama dviem skirtingais fermentais, tokiais kaip EcoRI ir MseI. Po to restrikcijos fragmentai sujungiami su adapteriais, kuriuose yra kiekviena restrikcijos vieta ir seka, kuri yra homologiška PGR pradmens surišimo vietai. Amplifikacijai naudojami PGR pradmenys turi DNR sekas, kurios yra homologiškos adapteriui ir turi vieną ar dvi selektyvias bazes savo 3&rsquo galuose [30,41]. AFLP metodas pritaikytas tirti M. tuberkuliozė, tačiau jis buvo mažai naudojamas dėl silpnos genotipų skiriamosios galios sergant M. tuberculosis [42].

Multilocus Sequence Tiping

Daugialokių sekos tipavimas (MLST) yra didelės skiriamosios gebos genetinis metodas, pagrįstas 7 genų fragmentų, kurių ilgis yra 450–500 bp (su dideliu kintamumo laipsniu), sekos nustatymu. Analizė aptinka skirtumus skirtinguose lokusuose ir leidžia identifikuoti identiškus mikroorganizmus (klonus) arba labai susijusius (klonines linijas arba genotipus). Todėl jie yra žymenys, kurie evoliucijos metu išliko stabilūs ir yra naudojami palyginimui dideliais laikotarpiais arba iš skirtingų geografinių regionų [43]. Sekos nustatymas leidžia aptikti tik vieno pokyčio variantus analizuojamo geno duomenų bazėje. Taigi paskaičiuota, kad jei viename lokuse randama 30 skirtingų alelių ir tiriami septyni genai, galima būtų išskirti iki 307 skirtingų genotipų [44]. Kiekvienas alelis yra sunumeruotas, atsižvelgiant į ankstesnį jo pateikimą duomenų bazėje, ir kiekvienas sekos tipas (ST) yra apibrėžtas septynių skaitmenų brūkšniniu kodu, būdingu septyniems lokusams [45].

Spoligotyping ir MIRU-VNTR

Mikobakterijų genotipui nustatyti dažniausiai naudojami trys metodai: spoligotipų nustatymas, MIRU-VNTR analizė ir restrikcijos fragmentų, gautų naudojant fermentą „Pvull“, analizė, siekiant nustatyti įterpimo elementą IS6110 hibridizacijos būdu. Spoligotipas buvo antrasis metodas, plačiai naudojamas greitam mikobakterijų genotipui nustatyti, iš pradžių aprašytas tiriant M. bovis izoliatai [46]. Ši technologija apjungia kiekvieno izoliato tiesioginio kartojimo (DR) regiono PGR amplifikaciją ir tarpinių sričių hibridizaciją, pastarosios yra unikalios sekos, atskiriančios DR, yra 47 DR. M. tuberculosis ir 41 DR M. bovis šie tarpikliai vaizduoja didelį polimorfizmą, kuris leidžia juos naudoti kaip kintamumo rodiklius. Metodas buvo pavadintas &ldquospoligotyping&rdquo, kilęs iš &ldquosspacer oligotyping&rdquo [47]. Kiekvieno izoliato parodytas hibridizacijos modelis yra aiškinamas matricoje, kurią galima dirbti su dvejetaine sistema arba naudojant & ldquoctal kodą & rdquo, kad būtų lengviau valdyti modelius [48]. Genominių lokusų analizė M. tuberkuliozė turintis kintamo skaičiaus tandemines pakartotines sekas (VNTR) yra greitas genotipų nustatymo metodas, panašus į spoligotipų nustatymą, ir pagrįstas pakartotinių mikobakterijų genomo (MIRUMycobacterial Interspersed Repetitive Units) sekų, kurios yra skirtingos DR regionuose, analize. Minimalus MIRUS-VNTR rinkinys, skirtas diferenciacijai pasiekti, yra 12 lokusų, o tai suteikia kodą, nustatantį skirtingų genotipų atitikimą atliekant informatikos analizę [49]. MIRUS lokusų skaičius buvo padidintas iki 24, suteikiant didesnę šio protokolo skiriamąją gebą ir išplėtus jo taikymą evoliucinio tipo tyrimams [50].

Išvados

Vieno mėginio izoliatų išskyrimas, identifikavimas ir analizė yra keletas pagrindinių mikrobiologijos laboratorijos funkcijų ir tikslų. Tačiau būtina prisiminti, kad geriausias bakteriologinis rezultatas gaunamas tada, kai laboratorijoje gautas mėginys buvo įsigytas geriausiomis sąlygomis. Be to, pagrindinė laboratorijos užduotis yra atskirti patogeninį mikroorganizmą per se arba galimą kolonizacijos ir teršalo patogeniškumą ir, jei taikoma, aprašyti galimus atsparumo mechanizmus, kad būtų galima pasiūlyti veiksmingiausią gydymą.

Medicinos bakteriologijos diagnostikos laboratorija šiuo metu remiasi įvairiomis metodikomis, kurios yra pagrindinis kertinis akmuo bakterinės kilmės infekcijų diagnostikos procese. Klinikinė laboratorija, siekdama savo tikslų, kasdien naudoja fenotipinius metodus. Tačiau šie metodai turi tam tikrų jautrumo, specifiškumo ir laiko apribojimų. Šie apribojimai labiau išryškėja kai kurioms sunkiai ar lėtai augančioms bakterijoms, vadinamosioms nekultivuojamoms bakterijoms arba daugkartinio gydymo pacientų mėginių apdorojimui. Per pastarąjį dešimtmetį molekulinės biologijos ir analitinės chemijos srityse buvo sukurti įvairūs metodai, turintys didelį potencialą sumažinti kai kuriuos iš šių apribojimų, o tai leido ieškoti ir nustatyti priežastinį veiksnį, taip pat įvertinti epidemiologiniams tyrimams ir tikslams. Kadangi šie metodai vis dar yra daug darbo reikalaujantys ir brangesni nei kai kurie fenotipiniai metodai, jie paprastai nėra prieinami valstybinių ligoninių laboratorijose. Nors jų įgyvendinimas nėra universalus, juos galima rasti tyrimų ir etaloninėse laboratorijose.

Kad mikroorganizmas būtų kliniškai naudingas, jis turi būti identifikuotas kuo greičiau. Ekonominiai aspektai ir praktika siūlo naudoti minimalų diagnostinių tyrimų skaičių. Prireikus identifikavimas klinikinėje laboratorijoje visada bus tikslumo ir tikslumo kompromisas, viena vertus, o greitis ir ekonomija, kita vertus, todėl viešųjų klinikinių laboratorijų ir tyrimų bei etaloninių laboratorijų pastangos neabejotinai yra teisingos veiksmai, skirti geriau diagnozuoti.

Padėkos

Šis darbas buvo mokslinių tyrimų ir projektų "Centro M & eacutedico Nacional (CMN) 20 de Noviembre" infekcinių ligų etiologinių veiksnių identifikavimas "dalis, kurią finansavo Mokslo ir technologijų bei inovacijų sekretoriatas, anksčiau ICYT-DF pagal ICyTDF/325/2011 susitarimą ir" ir taikomieji bakteriologijos tyrimai" Nacionalinio politechnikos instituto SIP 20150966. MGAA, JLH, GCE, VB, GR, XG gauna SNI, EDI ir COFAA stipendijas. NMAA buvo BEIFI stipendija.


PGR alternatyvos – biologija

Jūs paprašėte mašininio vertimo iš pasirinkto turinio iš mūsų duomenų bazių. Ši funkcija skirta tik jūsų patogumui ir jokiu būdu nėra skirta žmogaus vertimui pakeisti. Nei BioOne, nei turinio savininkai ir leidėjai neteikia ir aiškiai atsisako jokių tiesioginių ar numanomų pareiškimų ar garantijų, įskaitant, bet neapsiribojant, pareiškimus ir garantijas dėl vertimo funkcijos funkcionalumo arba vertimo tikslumo ar išsamumo. vertimus.

Vertimai mūsų sistemoje nesaugomi. Naudojant šią funkciją ir vertimus taikomi visi naudojimo apribojimai, nustatyti „BioOne“ svetainės naudojimo sąlygose.

Alternatyvus izofermento profilio metodas ląstelių linijai identifikuoti ir kryžminėms taršoms tarp rūšių: citochromas b PCR-RLFP analizė

Claretta G. Losi, 1 Stefania Ferrari, 1 Enrico Sossi, 1 Riccardo Villa, 1 Maura Ferrari 1

1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell 'Emilia Romagna, Breša, Italija el. Paštas: [email protected]

Apima PDF ir HTML, jei įmanoma

Šis straipsnis yra prieinamas tik abonentų.
Jo negalima parduoti individualiai.

Viena iš pagrindinių pavojų ląstelių kultūros laboratorijose yra klaidingas ląstelių linijų identifikavimas ir kryžminis užteršimas. Ląstelių linijoms autentifikuoti buvo naudojami keli metodai, įskaitant izofermento profiliavimą, Europos Farmacopeia pasiūlytą testą, kuris atliekamas Brešos audinių kultūros centre. Tačiau šis metodas turi keletą trūkumų, tokių kaip didelis kintamumas ir mažas atkuriamumas, be to, jis užima daug laiko ir reikalauja didelės ląstelių koncentracijos. Todėl buvo sukurtas alternatyvus metodas, patvirtinantis 27 skirtingų gyvūnų ląstelių kultūrų kilmę. Buvo optimizuotas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) apribojimo fragmento ilgio polimorfizmo (RFLP) tyrimas, pagrįstas poros pradmenų, kurie atkaitina citochromo dalį, naudojimu. b visų rūšių genas. Amplifikacijos produktas buvo suvirškintas naudojant šešių restrikcijos fermentų skydelį, o gautas modelis buvo išspręstas 3% didelės skiriamosios gebos agarozės geliu. 23 rūšims šis protokolas sukūrė unikalų restrikcijos modelį, o šių gyvūnų ląstelių kilmė buvo patvirtinta šia analize. Be to, rezultatai rodo, kad citochromas b PCR-RFLP sugebėjo sustiprinti tikslines sekas, naudojant labai mažą kiekį dezoksiribonukleino rūgšties (DNR). Jo jautrumas nustatant tarprūšines rūšis, kryžminis užterštumas buvo panašus į izofermento analizės (užteršianti DNR turėtų sudaryti ne mažiau kaip 10% visos DNR). 4 iš 27 rūšių (avys, šunys, jūrų kiaulytės ir rezus beždžionės) stebėtas modelis, net jei buvo labai dauginamas, parodė papildomas šių rūšių juostas, taip pat buvo atliktas specifinis PGR.

Claretta G. Losi, Stefania Ferrari, Enrico Sossi, Riccardo Villa ir Maura Ferrari „Alternatyvus izofermento profilio metodas ląstelių linijos identifikavimui ir tarprūšiniam kryžminiam užteršimui: citochromas b PCR-RLFP analizė, „In vitro ląstelių ir vystymosi biologija-gyvūnai 44 (8), 321-329, (2008 m. Liepos 2 d.). Https://doi.org/10.1007/s11626-008-9125-x

Gauta: 2008 m. kovo 10 d. Priimta: 2008 m. gegužės 16 d. Paskelbta: 2008 m. liepos 2 d.

Šis straipsnis yra prieinamas tik abonentų.
Jo negalima parduoti individualiai.


Žiūrėti video įrašą: Punishing Gray RavenPGR, but not totally PGR (Gruodis 2022).