We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Po to, kai baltymas yra susintetintas ir priimtas paskutinis tretinis/ketvirtinis, kaip jis pasiekia savo substratą ląstelėje ir kas sukelia jo sąveiką?
Konkretaus geno transkripcijos faktoriai yra baltymai, kurie paverčiami iš kai kurių kitų DNR dalių esančių genų. (Tai atsitinka citoplazmoje) Bet kaip transkripcijos faktoriai žino, kad jis turi pasklisti į branduolio DNR sritį.
Baltymai nejuda į nieką. Jis tiesiog atsitiktinai pasklinda (atšoka) ląstelėje, kol prie kažko prilimpa. Tam tikra cheminė baltymo struktūra (forma) ir tai, ką jis pataiko, lems, kaip jie tvirtai laikosi ir ar vyksta cheminė reakcija.
Kaip tai įsivaizduoti, pagalvokite apie stiklainį, užpildytą daugybe stiklo rutuliukų (vandens), 1 marmuro formos magnetą (baltymą) ir 1 metalinį marmurą (substratą). Įdėkite magnetą į apačią, užpildykite stiklainį iki galo stiklo rutuliukais, o tada uždėkite metalinį marmurą ant viršaus. Tada uždarykite stiklainį ir suplakite. Galų gale, susidūrus su daugybe stiklo rutuliukų, magnetas ir metalinis rutuliukas susidurs ir prilips vienas prie kito. Taip jis veikia ir ląstelėse. Ląstelėse molekulių judėjimo greitis yra proporcingas temperatūrai.
Čia yra puikus vaizdo įrašas, kuriame parodyta, kaip labai specifinės formos baltymai, atsitiktinai atsitrenkiantys į aplinką, gali sudaryti sudėtingą struktūrą.
Norėdami suprasti, kaip greitai molekulės juda ląstelėje, pagalvokite apie bakterijų ląstelę. An E. coli ląstelės skersmuo yra apie 1 mikrometras. Tokio dydžio ląstelėje, kurioje nėra tarpląstelinių skyrių, kiekviena molekulė susidurs su kiekviena kita ląstelės molekule maždaug kartą per sekundę (jei darysime tam tikras prielaidas, pvz., nesusijungs su kitomis molekulėmis). Taigi, jei ląstelėje yra tik vienas tam tikro fermento vienetas ir tik viena jo substrato molekulė, jie vis tiek susidurs gana dažnai (maždaug kartą per sekundę).
Šis greitis smarkiai sumažėja, kai ląstelės spindulys didėja. Pavyzdžiui, dvigubo skersmens (2 mikrometrai) ląstelės tūris yra aštuonis kartus didesnis, todėl bet kurių dviejų molekulių susidūrimai trunka 8 kartus ($2^3$) ilgiau (kitaip tariant, molekulėms reikia 8 kartus ilgiau „susirasti“ vienas kitą). Tai yra viena iš priežasčių, kodėl yra tam tikra viršutinė atskiros ląstelės dydžio riba. Didesni organizmai yra didesni, nes turi daugiau ląstelių, o ne todėl, kad turi didesnes ląsteles.
Biologijos sritis, susijusi su reakcijos tikimybe, vadinama fermentų kinetika. Susijęs laukas, kuriame nagrinėjamas molekulių susidūrimo dažnis, vadinamas statistine mechanika.
Ubikvitinuotų substratų pristatymas į baltymų išskleidimo mašinas
Naujausi darbai parodė, kad ubikvitinacija leidžia atpažinti tikslinius baltymus pagal įvairius ubikvitino receptorius. Viena receptorių šeima tiekia visur esančius baltymus į proteasomą, dėl kurio atsiranda nuo ATP priklausomas substratas ir proteolizė. Panašu, kad susijusi ubikvitiną surišančių baltymų šeima įdarbina visur esančius baltymus į Cdc48-ATPazės žiedo kompleksą, kuris taip pat gali išskleisti baltymus. Kai kurie taikiniai, atrodo, priplaukia Cdc48 prieš proteasomą, pagal užsakytą kelią. Intymi proteasomos ir Cdc48 sąveika, kurią iš dalies skatina laisvai susieti ubikvitino receptoriai, atlieka svarbias ląstelių reguliavimo funkcijas.
Įvadas
Paprastai manoma, kad baltymai yra transportuojami per baltymus pralaidų ER membranos kanalą išskleista formacija. Atliekant kotransliacinę translokaciją, išskleista būsena palaikoma vien dėl to, kad besiformuojanti polipeptidinė grandinė yra transportuojama sintezuojant ribosomą, kuri yra prijungta prie membranos kanalo. Priešingai, po transliacijos gabenamiems baltymams turi būti mechanizmas, neleidžiantis jų agregacijai ar priešlaikiniam sulankstymui į stabilią struktūrą prieš juos gabenant per kanalą. Tikėtina, kad citozoliniai chaperonai, prieš patekdami į kanalą, išlaikys translokacinį substratą išlankstytoje ar laisvai sulankstytoje konformacijoje (Chirico ir kt., 1988 m. Deshaies ir kt., 1988 m. Zimmermann ir kt., 1988 m. Caplan ir kt., 1992 m. Tačiau chaperonų tapatybė ir jų veikimo mechanizmas iš esmės nežinomi. Be to, atrodo, kad chaperonai ir kiti sąveikaujantys citozoliniai baltymai, prisijungę prie substrato, sukeltų problemų tolesniam translokacijos etapui. Kaip jie išleidžiami, kad polipeptidinė grandinė galėtų slysti per kanalą? Viena iš galimybių yra ta, kad yra aktyvus mechanizmas, kuriuo jie išsiskiria, kai substratas prisijungia prie kanalo arba persikelia per jį. Arba citozolyje gali atsirasti spontaniškas išsiskyrimas, o membranos kanalas gali užfiksuoti tik laisvas polipeptidines grandines.
Po transliacijos translokacija vyksta tiek mielėse, tiek žinduolių ląstelėse, nors pastaruoju atveju perkeliami tik mažesni nei 70 aminorūgščių substratai, o transportavimo mechanizmas nėra gerai suprantamas (Zimmermann ir kt., 1988). Mielių tyrimai parodė, kad posttransliacinis translokacijos kanalas yra suformuotas iš septynių komponentų membraninių baltymų komplekso-Sec komplekso (Panzner ir kt., 1995). „Sec“ kompleksas suriša perkėlimo substratą per savo signalų seką. Pastarasis įsiterpia į du komplekso Sec61p subvieneto transmembraninius domenus, todėl polipeptidinė grandinė į kanalą įterpiama kaip kilpa (Plath ir kt., 1998). Vėlesnis grandinės judėjimas per kanalą apima liumeninio Kar2p (dar vadinamo BiP) funkciją, kuri yra 70 kD šilumos šoko baltymų (Hsp70) šeimos narys ER spinduliuose (Vogel ir kt., 1990 Brodsky ir Schekman) 1993). Bent jau perkėlimo substrato prepro-α faktoriaus (ppαF, 165 aminorūgščių) atveju Kar2p gali veikti kaip molekulinis reketas, perkeliantis polipeptido grandinę per membraną (Matlack ir kt., 1999). Jis jungiasi prie įeinančios polipeptidinės grandinės ir neleidžia jai nuslysti per kanalą.
Citozoliniai chaperonai, susiję su potransliaciniu baltymų perkėlimu, apima Hsp70 ir jo kofaktorių, J baltymą Ydj1p (Chirico ir kt., 1988 Deshaies ir kt., 1988 Zimmermann ir kt., 1988 m. Caplan ir kt., 1992 Becker ir kt., 1996). Eksperimentai Saccharomyces cerevisiae parodė, kad atitinkamų genų funkcijų praradimo mutantai veikia kai kurių baltymų translokaciją (Deshaies ir kt., 1988 Caplan ir kt., 1992 Becker ir kt., 1996). Be to, biocheminiai eksperimentai parodė, kad Hsp70 gali susieti su substratu ppαF ir gali stimuliuoti jo posttransliacinę translokaciją in vitro (Chirico ir kt., 1988 Chirico, 1992). Nežinoma, ar kiti chaperonai, išskyrus Hsp70 - Ydj1p sistemą, sąveikauja su transliacijos perkėlimo substratais. Tačiau labai svarbu, kad citozoliniai baltymai savaime nėra būtini perkėlimo procesui. Citozolinių faktorių surišimo ir išsiskyrimo reikalavimą galima apeiti denatūruojant substratą karbamidu, o perkėlimo procesą galima atkurti išgrynintais komponentais, nesant jokių citozolinių baltymų (Chirico ir kt., 1988 Matlack ir kt., 1999). Be to, norint perkelti į ER ir mitochondrijas, reikalinga Hsp70 - Ydj1p sistema. Taigi gali būti, kad citozoliniai chaperonai gali išlaikyti tik laisvai sulankstytus polipeptidus ir neturėti specifinės sąveikos nei su nukreipimo signalais, nei su translokacijos mechanizmais membranoje.
Nors galima įsivaizduoti, kad posttransliacinis perkėlimo substratas sąveikauja su tais pačiais citozoliniais chaperonais, kaip ir citozolyje likusi polipeptidinė grandinė, gali būti tam tikrų skirtumų. Nustatyta, kad polipeptidams, kuriems trūksta signalų sekų, nustatyta, kad Hsp70 ir Hsp40 (žinduolių citozolinis J baltymas) siejasi su kylančiomis grandinėmis, susietomis su ribosomomis (Frydman ir kt., 1994 Frydman ir Hartl, 1996 Eggers ir kt., 1997 Pfund ir kt., 1998). Be to, buvo pranešta, kad chaperonino turintis beuodegio komplekso polipeptido 1 (TCP1) kompleksas (TRIC/CCT apžvalgą žr. Kim ir kt., 1994) sąveikauja su ribosomomis susietomis besiformuojančiomis grandinėmis (Frydman ir kt., 1994 Frydman ir Hartl, 1996 McCallum). ir kt., 2000), skirtingai nei bakterinis homologas GroEL, kuris suriša tik užbaigtus polipeptidus (Netzer ir Hartl 1998). Ribosomų surištos, bet ne viso ilgio polipeptidinės grandinės taip pat sąveikauja su atsirandančiu polipeptidu susietu kompleksu (NAC) (Wiedmann ir kt., 1994). Nors sisteminis sąveikos su citozoliniais baltymais tyrimas nebuvo atliktas po transliacijos translokacijos substratų, situacija gali būti visiškai kitokia. Polipeptidinės grandinės sintezės metu signalo seka greičiausiai sąveikauja su signalo atpažinimo dalele (SRP), nors sąveika gali būti silpnesnė nei su labiau hidrofobinėmis signalų sekomis, kurios nukreipia substratus į kotransliacijos translokacijos kelią (Ng ir kt., 1996). Taigi SRP gali blokuoti kitų citozolinių baltymų susiejimą su polipeptido grandine, ypač tol, kol jis vis dar yra susietas su ribosoma. Be to, gali būti, kad gali būti citozolinių baltymų, kurie, nors ir nėra būtini translokacijai, specifiškai atpažįsta signalo seką ir tam tikru momentu pakeičia SRP. Nepriklausomai nuo to, ar citozolinės sąveikos partneriai yra vienodi polipeptidams su ir be signalų sekų, yra specifinis klausimas, kaip citozoliniai baltymai išsiskiria po transliacijos baltymų perkėlimo.
Čia mes naudojome sisteminį nuotraukų susiejimo metodą, kad zonduotų citozolinių baltymų sąveiką su translokacijos substratais ankstyvosiose jų transliacijos translokacijos mielėse stadijose, kol jie prisijungs prie Sec komplekso. Mūsų rezultatai rodo, kad posttransliacinis substratas, susintetintas retikulocitų lizato sistemoje, sąveikauja su SRP ir NAC tol, kol yra susijęs su ribosoma. Baigęs vertimą, jis sąveikauja su keliais citozoliniais chaperonais, įskaitant Hsp70 ir TRiC/CCT, ir todėl greičiausiai turi tuos pačius sąveikos partnerius kaip ir polipeptidas, neturintis signalo sekos. Tiesą sakant, nepavyko aptikti jokio specifinio citozolinio receptoriaus, skirto potransliacinių substratų signalų sekoms. Citozolinių baltymų išsiskyrimas iš translokacijos substrato vyksta spontaniškai, o Sec kompleksas nevaidina aktyvaus vaidmens. Prisijungusi prie Sec komplekso, polipeptido grandinė nėra susijusi su jokiu citozoliniu baltymu, paaiškinančiu, kaip vėliau gali įvykti jo translokacija per membraninį kanalą, netrukdant citozoliniams baltymams.
Biologija 171
Pasibaigus šiam skyriui, galėsite atlikti šiuos veiksmus:
- Apibūdinkite fermentų vaidmenį metabolizmo keliuose
- Paaiškinkite, kaip fermentai veikia kaip molekuliniai katalizatoriai
- Aptarkite fermentų reguliavimą įvairiais veiksniais
Medžiaga, padedanti įvykti cheminei reakcijai, yra katalizatorius, o specialios molekulės, katalizuojančios biochemines reakcijas, yra fermentai. Beveik visi fermentai yra baltymai, sudaryti iš aminorūgščių grandinių, ir jie atlieka svarbią užduotį - sumažinti cheminių reakcijų aktyvinimo energiją ląstelės viduje. Fermentai tai daro prisijungdami prie reaguojančių molekulių ir laikydami jas taip, kad cheminės jungties nutraukimo ir jungčių formavimo procesai vyktų lengviau. Svarbu atsiminti, kad fermentai nekeičia reakcijos’s ∆G. Kitaip tariant, jie nekeičia, ar reakcija yra egzergoninė (spontaniška), ar endergoninė. Taip yra todėl, kad jie nekeičia reagentų ir#8217 arba produktų ir laisvos energijos. Jie tik sumažina aktyvavimo energiją, reikalingą pereinamajai būsenai pasiekti ((pav.)).
Fermento aktyvios vietos ir substrato specifiškumas
Cheminiai reagentai, prie kurių jungiasi fermentas, yra fermento substratai. Gali būti vienas ar daugiau substratų, priklausomai nuo konkrečios cheminės reakcijos. Kai kuriose reakcijose vieno reagento substratas suskaido į kelis produktus. Kituose dviejuose substratuose gali susidaryti viena didesnė molekulė. Du reagentai taip pat gali įsijungti į reakciją, abu tampa modifikuoti ir išeina iš reakcijos kaip du produktai. Fermento vieta, kurioje substratas jungiasi, yra aktyvi fermento vieta. Čia vyksta „veiksmas“. Kadangi fermentai yra baltymai, aktyvioje vietoje yra unikalus aminorūgščių liekanų derinys (taip pat šoninės grandinės arba R grupės). Kiekvienai liekanai būdingos skirtingos savybės. Jie gali būti dideli arba maži, silpnai rūgštūs arba baziniai, hidrofiliniai arba hidrofobiniai, teigiamai arba neigiamai įkrauti arba neutralūs. Unikalus aminorūgščių liekanų, jų padėties, sekų, struktūrų ir savybių derinys sukuria labai specifinę cheminę aplinką aktyvioje vietoje. Ši specifinė aplinka tinka, nors ir trumpai, surišti su konkrečiu cheminiu substratu (arba substratais). Dėl šio įspūdį primenančio fermento ir jo substratų atitikimo (kuris prisitaiko, kad geriausiai atitiktų pereinamąją būseną ir aktyviąją vietą), fermentai yra žinomi dėl savo specifiškumo. „Geriausiai tinka“ dėl formos ir aminorūgščių funkcinės grupės pritraukimo prie substrato. Kiekvienam substratui yra specialiai pritaikytas fermentas, taigi ir kiekvienai cheminei reakcijai yra lankstumo.
Tai, kad aktyvios teritorijos yra labai tinkamos tam tikroms aplinkos sąlygoms, taip pat reiškia, kad jos yra veikiamos vietinės aplinkos įtakos. Tiesa, padidinus aplinkos temperatūrą paprastai padidėja reakcijų greitis, katalizuojamas fermentų ar kitaip. Tačiau temperatūros padidinimas ar sumažinimas už optimalaus diapazono ribų gali paveikti chemines jungtis aktyvioje vietoje taip, kad jos yra mažiau tinkamos substratams surišti. Aukšta temperatūra ilgainiui fermentus, kaip ir kitas biologines molekules, denatūruos, o tai keičia natūralios medžiagos savybes. Taip pat vietinės aplinkos pH taip pat gali turėti įtakos fermentų funkcijai. Aktyviosios vietos aminorūgščių liekanos turi savo rūgščių ar šarminių savybių, kurios yra optimalios katalizei. Šios liekanos yra jautrios pH pokyčiams, kurie gali pakenkti substrato molekulių prisijungimui. Fermentai geriausiai tinka tam tikram pH diapazonui, o, kaip ir temperatūros atveju, ekstremalios aplinkos pH vertės (rūgštinės arba šarminės) gali sukelti fermentų denatūravimą.
Sukeltas pritaikymas ir fermentų funkcija
Daugelį metų mokslininkai manė, kad fermentų ir substratų surišimas vyksta paprastu „užrakinimo ir rakto“ būdu. Šis modelis tvirtino, kad fermentas ir substratas puikiai dera vienu metu. Tačiau dabartiniai tyrimai palaiko rafinuotesnį požiūrį, kurį mokslininkai vadina sukeltu tinkamumu ((pav.)). Šis modelis išplečia užrakto ir rakto modelį, aprašydamas dinamiškesnę fermento ir substrato sąveiką. Susijungus fermentui ir substratui, jų sąveika sukelia nedidelį fermento struktūros poslinkį, kuris patvirtina idealų surišimo tarp fermento ir substrato pereinamosios būsenos susitarimą. Šis idealus surišimas padidina fermento gebėjimą katalizuoti jo reakciją.
Kai fermentas suriša savo substratą, jis sudaro fermento ir substrato kompleksą. Šis kompleksas sumažina reakcijos aktyvinimo energiją ir skatina greitą jos progresavimą vienu iš daugelio būdų. Iš esmės fermentai skatina chemines reakcijas, kuriose dalyvauja daugiau nei vienas substratas, sujungdami substratus optimalia kryptimi. Atitinkama vienos molekulės sritis (atomai ir ryšiai) yra gretinama su kitos molekulės atitinkama sritimi, su kuria ji turi reaguoti. Kitas būdas, kuriuo fermentai skatina substrato reakciją, yra sukurti optimalią aplinką aktyvioje vietoje reakcijai vykti. Tam tikros cheminės reakcijos geriausiai gali vykti šiek tiek rūgščioje arba nepolinėje aplinkoje. Cheminės savybės, atsirandančios dėl tam tikro aminorūgščių liekanų išdėstymo aktyvioje vietoje, sukuria puikią aplinką specifiniams fermento substratams reaguoti.
Jūs sužinojote, kad aktyvinimo energija, reikalinga daugeliui reakcijų, apima energiją, susijusią su manipuliavimu cheminėmis jungtimis arba šiek tiek iškreipimu, kad jos galėtų lengvai nutrūkti ir leisti kitiems reformuotis. Fermentiniai veiksmai gali padėti šiam procesui. Fermentų ir substratų kompleksas gali sumažinti aktyvinimo energiją, sukreipdamas substrato molekules taip, kad palengvintų ryšių nutraukimą ir padėtų pasiekti pereinamąją būseną. Galiausiai, fermentai taip pat gali sumažinti aktyvavimo energiją, dalyvaudami pačioje cheminėje reakcijoje. Aminorūgščių liekanos gali sudaryti tam tikrus jonus arba chemines grupes, kurios iš tikrųjų sudaro kovalentinius ryšius su substrato molekulėmis, kaip būtiną reakcijos proceso etapą. Tokiais atvejais svarbu prisiminti, kad pasibaigus reakcijai fermentas visada grįš į pradinę būseną. Viena iš pagrindinių fermentų savybių yra ta, kad katalizuojamų reakcijų metu jie nesikeičia. Kai fermentas katalizuoja reakciją, jis išskiria savo produktą (-us).
Metabolizmo kontrolė per fermentų reguliavimą
Atrodytų idealu turėti scenarijų, pagal kurį visi užkoduoti fermentai organizmo genome egzistuotų gausiai ir veiktų optimaliai visomis ląstelių sąlygomis, visose ląstelėse ir visą laiką. Tiesą sakant, tai toli gražu nėra. Įvairūs mechanizmai užtikrina, kad taip neatsitiktų. Ląstelių poreikiai ir sąlygos skiriasi priklausomai nuo ląstelės ir laikui bėgant keičiasi atskirose ląstelėse. Skrandžio ląstelių reikalingi fermentai ir energijos poreikiai skiriasi nuo riebalų kaupimo ląstelių, odos ląstelių, kraujo ląstelių ir nervų ląstelių. Be to, virškinimo ląstelė daug sunkiau apdoroja ir suskaido maistines medžiagas per tą laiką, kuris yra arti valgio, palyginti su daugeliu valandų po valgio. Kadangi šie ląstelių poreikiai ir sąlygos skiriasi, skiriasi ir skirtingų fermentų kiekiai ir funkcionalumas.
Kadangi biocheminių reakcijų greitį valdo aktyvinimo energija, o fermentai mažina ir nustato cheminių reakcijų aktyvinimo energiją, santykinis įvairių fermentų kiekis ląstelėje ir veikimas galiausiai lemia, kurios reakcijos vyks ir kokiu greičiu. Šis nustatymas yra griežtai kontroliuojamas. Tam tikroje ląstelių aplinkoje aplinkos veiksniai, tokie kaip pH ir temperatūra, iš dalies kontroliuoja fermentų aktyvumą.Yra ir kitų mechanizmų, kuriais ląstelės kontroliuoja fermentų aktyvumą ir nustato įvairių biocheminių reakcijų greitį.
Molekulinis fermentų reguliavimas
Fermentai gali būti reguliuojami tokiu būdu, kuris skatina arba sumažina jų aktyvumą. Yra daug skirtingų molekulių, kurios slopina arba skatina fermentų funkciją, ir tam yra įvairių mechanizmų. Pavyzdžiui, kai kuriais fermento slopinimo atvejais inhibitoriaus molekulė yra pakankamai panaši į substratą, todėl gali prisijungti prie aktyviosios vietos ir tiesiog blokuoti substrato prisijungimą. Kai taip atsitinka, fermentas yra slopinamas konkurenciniu slopinimu, nes inhibitoriaus molekulė konkuruoja su substratu dėl aktyvios vietos surišimo ((pav.)). Arba, nekonkurencinio slopinimo atveju, inhibitoriaus molekulė prisijungia prie fermento kitoje vietoje nei alosterinė vieta, surišimo vieta toli nuo aktyviosios vietos ir vis tiek sugeba blokuoti substrato prisijungimą prie aktyviosios vietos.
Kai kurios inhibitorių molekulės jungiasi prie fermentų toje vietoje, kur jų prisijungimas sukelia konformacinius pokyčius, kurie sumažina fermento afinitetą jo substratui. Šio tipo slopinimas yra alosterinis slopinimas ((pav.)). Daugiau nei vienas polipeptidas apima daugumą allosteriškai reguliuojamų fermentų, tai reiškia, kad jie turi daugiau nei vieną baltymo subvienetą. Kai alosterinis inhibitorius prisijungia prie fermento, visos aktyvios baltymų subvienetų vietos šiek tiek pasikeičia taip, kad mažiau efektyviai suriša jų substratus. Yra alosterinių aktyvatorių ir inhibitorių. Allosteriniai aktyvatoriai jungiasi prie fermento vietų, esančių toliau nuo aktyvios vietos, sukeldami konformacinius pokyčius, kurie padidina fermento aktyviosios (-ių) vietos (-ių) afinitetą jo substratui (-ams).
Narkotikų atradimas ieškant pagrindinių fermentų inhibitorių tam tikruose keliuose Fermentai yra pagrindiniai medžiagų apykaitos takų komponentai. Suprasti, kaip veikia fermentai ir kaip jie gali būti reguliuojami, yra pagrindinis daugelio farmacijos vaistų kūrimo principas ((paveikslas)) šiandieninėje rinkoje. Šioje srityje dirbantys biologai bendradarbiauja su kitais mokslininkais, dažniausiai chemikais, kurdami vaistus.
Apsvarstykite, pavyzdžiui, statinus, kurie yra vaistų, mažinančių cholesterolio kiekį, klasė. Šie junginiai iš esmės yra fermento HMG-CoA reduktazės inhibitoriai. HMG-CoA reduktazė yra fermentas, kuris sintetina cholesterolį iš organizmo lipidų. Slopindamas šį fermentą, vaistas sumažina organizme sintezuojamo cholesterolio kiekį. Panašiai acetaminofenas, populiariai parduodamas su prekės pavadinimu Tylenol, yra fermento ciklooksigenazės inhibitorius. Nors jis veiksmingai mažina karščiavimą ir uždegimą (skausmą), mokslininkai vis dar visiškai nesupranta jo veikimo mechanizmo.
Kaip kuriami vaistai? Vienas iš pirmųjų iššūkių kuriant vaistus yra nustatyti konkrečią molekulę, kuriai skirtas vaistas. Statinų atveju HMG-CoA reduktazė yra vaisto taikinys. Tyrėjai nustato tikslus atlikdami kruopščius tyrimus laboratorijoje. Vien tikslo nustatymo nepakanka. Mokslininkai taip pat turi žinoti, kaip taikinys veikia ląstelės viduje ir kokios reakcijos yra klaidingos ligos atveju. Kai mokslininkai nustato tikslą ir kelią, prasideda tikrasis vaistų kūrimo procesas. Šiame etape chemikai ir biologai dirba kartu, kad sukurtų ir sintetintų molekules, kurios gali blokuoti arba suaktyvinti tam tikrą reakciją. Tačiau tai tik pradžia: jei ir kai vaisto prototipas sėkmingai atlieka savo funkciją, jis turi atlikti daugybę bandymų nuo in vitro atlikti eksperimentus su klinikiniais tyrimais, kol jie gali gauti FDA patvirtinimą būti rinkoje.
Daugelis fermentų neveikia optimaliai arba iš viso neveikia, nebent jie būtų laikinai surišti su kitomis specifinėmis nebaltyminėmis pagalbinėmis molekulėmis, laikinai per joninius ar vandenilio ryšius arba visam laikui per stipresnius kovalentinius ryšius. Dviejų tipų pagalbinės molekulės yra kofaktoriai ir kofermentai. Prisijungimas prie šių molekulių skatina optimalią atitinkamų fermentų konformaciją ir funkciją. Kofaktoriai yra neorganiniai jonai, tokie kaip geležis (Fe ++) ir magnis (Mg ++). Vienas iš fermento, kuriam kaip kofaktorius reikalingas metalo jonas, pavyzdys yra fermentas, kuris sukuria DNR molekules, DNR polimerazė, kuriai veikti reikalingas surištas cinko jonas (Zn ++). Koenzimai yra organinės pagalbinės molekulės, kurių pagrindinė atominė struktūra sudaryta iš anglies ir vandenilio, reikalingų fermentų veikimui. Dažniausi kofermentų šaltiniai yra su maistu gaunami vitaminai ((pav.)). Kai kurie vitaminai yra kofermentų pirmtakai, o kiti veikia tiesiogiai kaip kofermentai. Vitaminas C yra daugelio fermentų, dalyvaujančių kuriant svarbų jungiamojo audinio komponentą – kolageną, kofermentas. Svarbus žingsnis skaidant gliukozę, kad būtų gauta energija, yra daugelio fermentų komplekso katalizė, kurią mokslininkai vadina piruvato dehidrogenaze. Piruvato dehidrogenazė yra kelių fermentų kompleksas, kuriam iš tikrųjų reikalingas vienas kofaktorius (magnio jonas) ir penki skirtingi organiniai kofermentai, kad katalizuotų jo specifinę cheminę reakciją. Todėl fermentų funkciją iš dalies reguliuoja daugybė kofaktorių ir kofermentų, kuriuos tiekia dauguma organizmų.
Fermentų suskaidymas
Eukariotinėse ląstelėse molekulės, tokios kaip fermentai, paprastai yra suskirstytos į skirtingus organelius. Tai leidžia reguliuoti dar vieną fermentų aktyvumo lygį. Fermentai, reikalingi tik tam tikriems ląsteliniams procesams, kartais laikomi atskirai kartu su jų substratais, todėl cheminės reakcijos yra efektyvesnės. Tokio fermentų reguliavimo, pagrįsto vieta ir artumu, pavyzdžiai apima fermentus, dalyvaujančius paskutiniuose ląstelių kvėpavimo etapuose, kurie vyksta išskirtinai mitochondrijose, ir fermentus, dalyvaujančius virškinant ląstelių šiukšles ir pašalines medžiagas, esančias lizosomose.
Grįžtamojo ryšio slopinimas metaboliniuose keliuose
Molekulės gali reguliuoti fermentų funkciją įvairiais būdais. Tačiau išlieka pagrindinis klausimas: kas yra šios molekulės ir iš kur jos atsiranda? Kai kurie yra kofaktoriai ir kofermentai, jonai ir organinės molekulės, kaip jūs sužinojote. Kokios kitos ląstelės molekulės užtikrina fermentinį reguliavimą, pavyzdžiui, allosterinį moduliavimą ir konkurencinį bei nekonkurencinį slopinimą? Atsakymas yra tas, kad šiuos vaidmenis gali atlikti įvairios molekulės. Kai kurie iš jų apima farmacinius ir nefarmacinius vaistus, toksinus ir aplinkos nuodus. Galbūt svarbiausi fermentų reguliavimo molekulių šaltiniai, atsižvelgiant į ląstelių metabolizmą, yra patys ląstelių metabolinės reakcijos produktai. Veiksmingiausiu ir elegantiškiausiu būdu ląstelės evoliucionavo taip, kad naudotų savo reakcijas ir produktus, skirtus fermentų aktyvumo slopinimui. Grįžtamojo ryšio slopinimas apima reakcijos produkto naudojimą tolesnei jo gamybai reguliuoti ((pav.)). Ląstelė reaguoja į specifinių produktų gausą, sulėtindama gamybą anabolinių ar katabolinių reakcijų metu. Tokie reakcijos produktai gali slopinti fermentus, kurie katalizavo jų gamybą per aukščiau aprašytus mechanizmus.
Tiek aminorūgščių, tiek nukleotidų gamyba kontroliuojama grįžtamojo ryšio slopinimu. Be to, ATP yra alosterinis kai kurių fermentų, dalyvaujančių cukraus kataboliniame skaidyme, procese, kuris gamina ATP, reguliatorius. Tokiu būdu, kai ATP yra daug, ląstelė gali užkirsti kelią tolesnei jo gamybai. Atminkite, kad ATP yra nestabili molekulė, kuri gali spontaniškai išsiskirti į ADP. Jei ląstelėje būtų per daug ATP, didžioji jo dalis eitų veltui. Arba ADP tarnauja kaip teigiamas allosterinis reguliatorius (allosterinis aktyvatorius) kai kuriems tiems patiems fermentams, kuriuos slopina ATP. Taigi, kai santykinis ATP lygis yra aukštas, palyginti su ATP, ląstelė suaktyvinama gaminti daugiau ATP per cukraus katabolizmą.
Skilties santrauka
Fermentai yra cheminiai katalizatoriai, kurie pagreitina chemines reakcijas esant fiziologinei temperatūrai, sumažindami jų aktyvavimo energiją. Fermentai paprastai yra baltymai, susidedantys iš vienos ar kelių polipeptidinių grandinių. Fermentai turi aktyvią vietą, kuri sukuria unikalią cheminę aplinką, sudarytą iš tam tikrų aminorūgščių R grupių (likučių). Ši unikali aplinka puikiai tinka tam tikrus to fermento cheminius reagentus paversti, mokslininkai vadina substratais, į nestabilius tarpinius produktus, kuriuos jie vadina pereinamosiomis būsenomis. Fermentai ir substratai jungiasi indukuotai, o tai reiškia, kad fermentai šiek tiek pakoreguoja konformaciją, kai liečiasi su substratu, o tai lemia visišką, optimalų surišimą. Fermentai jungiasi prie substratų ir katalizuoja reakcijas keturiais skirtingais būdais: suburia substratus optimalia kryptimi, pažeidžia substratų jungčių struktūras, kad jungtys galėtų lengviau suskaidyti, sudarydamos optimalias aplinkos sąlygas reakcijai įvykti arba tiesiogiai dalyvaudamos cheminė reakcija, suformuojant laikinus kovalentinius ryšius su substratais.
Fermentų veikimas turi būti reguliuojamas taip, kad tam tikru metu tam tikroje ląstelėje katalizuojasi norimos reakcijos, o nepageidaujamos – ne. Fermentus reguliuoja ląstelės sąlygos, tokios kaip temperatūra ir pH. Jie taip pat reguliuojami pagal jų vietą ląstelėje, kartais suskirstyti į skyrius, kad jie galėtų katalizuoti reakcijas tik tam tikromis aplinkybėmis. Fermentų slopinimas ir aktyvinimas per kitas molekules yra kiti svarbūs fermento reguliavimo būdai. Inhibitoriai gali veikti konkurencingai, nekonkurencingai ar alosteriškai. Nekonkurencingi inhibitoriai paprastai yra alosteriniai. Aktyvatoriai taip pat gali sustiprinti fermentų funkciją allosteriškai. Dažniausias metodas, kuriuo ląstelės reguliuoja fermentus metabolizmo keliuose, yra grįžtamojo ryšio slopinimas. Slopinant grįžtamąjį ryšį, metabolizmo kelio produktai yra inhibitoriai (dažniausiai alosteriniai) vienam ar keliems fermentams (dažniausiai pirmajam kelio fermentui), dalyvaujantiems juos gaminančiame kelyje.
Nemokamas atsakymas
Kalbant apie fermentus, kodėl vitaminai reikalingi gerai sveikatai? Pateikite pavyzdžių.
Dauguma vitaminų ir mineralų veikia kaip kofermentai ir kofaktoriai fermentų veikimui. Daugeliui fermentų reikia surišti tam tikrus kofaktorius ar kofermentus, kad jie galėtų katalizuoti jų reakcijas. Kadangi fermentai katalizuoja daugelį svarbių reakcijų, labai svarbu gauti pakankamai vitaminų ir mineralų iš dietos ir maisto papildų. Vitaminas C (askorbo rūgštis) yra kofermentas, būtinas fermentams, kurie gamina kolageną, svarbų viso kūno jungiamojo audinio baltymą, veikti. Magnio jonai (Mg++) yra svarbus kofaktorius, būtinas fermentui piruvato dehidrogenazei, kuris katalizuoja dalį cukraus skaidymo ir energijos gamybai. Vitaminų žmogaus organizmas negali gaminti, todėl jų reikia gauti su maistu.
Paaiškinkite savo žodžiais, kaip fermentų grįžtamojo ryšio slopinimas naudingas ląstelei.
Grįžtamojo ryšio slopinimas leidžia ląstelėms kontroliuoti pagamintų medžiagų apykaitos produktų kiekį. Jei tam tikro produkto yra per daug, palyginti su ląstelės poreikiais, grįžtamojo ryšio slopinimas veiksmingai sumažina to konkretaus produkto gamybą. Apskritai tai sumažina nereikalingų produktų gamybą ir taupo energiją, maksimaliai padidindama energijos vartojimo efektyvumą.
Žodynėlis
Diskusija
Mūsų žiniomis, mes pateikiame pirmuosius tiesioginius Cdc48 ir 26S proteasomos bendradarbiavimo įrodymus skaidant kompaktiškus, gerai sulankstytus baltymus, kur Cdc48 išskaidymas sukuria lanksčias iniciacijos sritis, leidžiančias vėliau apdoroti proteasomų. Mūsų tirpalas nustato, kad Cdc48 • UN ir proteasomos holoenzimas yra minimaliai reikalingi komponentai šiam susietam skaidymui, nepriklausomai nuo šaudyklinių receptorių, tokių kaip Rad23 ar Otu1 deubiquitinazė. Santykinai trumpos, išsišakojusios ubikvitino grandinės ant mūsų modelio substratų, atrodo, išsiskleidžia ir kartu perkeliamos Cdc48, tada gali atsiskleisti greičiau nei pats substratas, o tai leidžia prisijungti prie ubikvitino receptorių, o nestruktūrizuota substrato polipeptido sritis gali sąveikauti su Proteasomos ATPazės variklis. Įdomu tai, kad nustatyta, kad daugumoje mielių tirpstančio lizato baltymų poli-ubikvitino modifikacijų yra iki septynių ubikvitino dalių 32, o tai, remiantis mūsų ir ankstesniais duomenimis 19, turėtų leisti visiškai perkelti Cdc48, o Otu1 nereikia deubikvitinuoti.
Suprojektavome visur esantį substratą taip, kad jam nebūtų jokių jungčių ar lanksčių galų, ir lieka neaišku, kur Cdc48 inicijuoja išsiskleidimą. Naujausi struktūriniai tyrimai parodė, kad JT adapteris padengia ubikvitiną šalia centrinės Cdc48 poros taip, kad atsiskleidimas gali prasidėti proksimalinės ubikvitino dalies segmente, kuris būtų universali translokacijos pradžia, nepriklausomai nuo pritvirtinto substrato polipeptido 19. Remdamiesi savo išvadomis, darome išvadą, kad pradinį atskleidimą turi palengvinti Cdc48 D1 ir (arba) N-galiniai domenai. Išskleidžiant ir siūlant tik D2 domenuose, kaip buvo pasiūlyta anksčiau, substrate turėtų būti lanksti iniciacijos sritis, panašaus ilgio, kaip ir proteasominiam įsitraukimui, o tai akivaizdžiai nėra.
Po visiško išsiskleidimo substratas greičiausiai išsiskiria Cdc48 ir pasklinda į 26S proteasomą, tačiau būsimi tyrimai gali spręsti, ar substrato perdavimui atsiranda tiesioginė šių molekulinių mašinų sąveika. Nors konkuruojančios reakcijos mūsų eksperimentinėmis sąlygomis neleido išmatuoti maksimalaus su Cdc48 susieto proteasomų skilimo greičio, tikimasi, kad substrato pernešimą in vivo palengvins sąveika su šaudykliniais receptoriais Rad23 ir Dsk2, kurie gali stabilizuoti išsiskleidusią substratų būseną ir padidinti jų afinitetą. proteasomai 33,34,35. Be to, su Cdc48 surišta deubikvitinazė Otu1 ir E4 ligazė Ufd2 gali redaguoti ir išplėsti Cdc48 prie substrato prijungtas ubikvitino modifikacijas, kad paskatintų prisijungimą prie proteasomos ir suvaržytų konkuruojantį pakartotinį prisijungimą prie Cdc48 adapterių.
Cdc48 dalyvauja daugybėje procesų, o ne visa jo atsiskleidžianti veikla sukelia degradaciją. Mūsų atkurta sistema leidžia atlikti svarbius būsimus tyrimus, kaip Cdc48 ir proteasoma nusprendžia baltymo likimą, kaip skirtingus ubikvitino pakeitimus atpažįsta Cdc48 adapteriai ir proteasoma, ir kaip šiuos pakeitimus gali redaguoti „Otu1“ ir „Ufd2“, kad pakeistų substrato apdorojimą ir nustatytų sąveikos su šiomis molekulinėmis mašinomis tvarka.
Diskusija
Šiame tyrime nustatėme, kad antrasis pelių kiaušinėlių mejozinis pasiskirstymas buvo susijęs su baltymų, kuriuose buvo D arba KEN dėžutės motyvas, sunaikinimo laikotarpiu, atitinkančiu tiek APC cdc20, tiek APC cdh1 aktyvumą apvaisinimo metu. Po apvaisinimo spermatozoidų sukelta Ca 2+ šuolių serija greitai sukėlė ir securino, ir ciklino B1 sunaikinimą kiaušiniuose. Jų sunaikinimas buvo baigtas tuo metu, kai CDK1 aktyvumas sumažėjo, o antrasis polinis kūnas buvo išspaustas. Kadangi ciklinas B1 ir securinas turi D dėžutę, tai galėjo pablogėti dėl APC cdc20 ir (arba) APC cdh1. Tačiau MII kiaušiniuose pastebėjome, kad cdh1 baltymas buvo fosforilintas, o tai mitozinėse ląstelėse neleidžia jam prisijungti prie APC/C. Cdh1 nesugebėjimas aktyvuoti APC/C MII buvo patvirtintas tiesiogiai naudojant APC cdh1 substratus, kurių neatpažino APC cdc20. Taigi mes panaudojome patį cdc20 ir D-dėžutę mutavusią securin formą, kuri turi KEN dėžutę, kad sukurtume GFP sulietus baltymus, kurie buvo APC cdh1 substratai. Abi šios konstrukcijos iš pradžių buvo stabilios apvaisintose kiaušialąstėse, tačiau jų skilimas prasidėjo staiga praėjus 1–2 valandoms po spermos sukelto Ca 2+ padidėjimo, poliarinio kūno išspaudimo metu. Jų skilimas tęsėsi tol, kol II mejozė buvo baigta ir 1 ląstelių embrione susidarė branduoliai. Todėl apvaisinimo metu nebuvo nedelsiant aktyvuotas APC cdh1, o antrojo polinio kūno ekstruzijos metu pasirodė perėjimas nuo APC cdc20 prie APC cdh1 (tai pavaizduota 8 pav.). Visi APC/C substratai po stabilizavimo pasirodė stabilūs.
APC cdc20 ir APC cdh1 aktyvacijos modelis II mejozės metu. Neapvaisinti MII kiaušinėliai, turintys aukštą CDK1 lygį, turi mažą APC cdc20 ir APC cdh1 aktyvumą. Iš spermos gautas Ca 2+ signalas inicijuoja APC cdc20 aktyvaciją lytinių ląstelių suliejimo metu, kuris yra atsakingas už ciklino B1/sekurino skaidymą ir su tuo susijusį CDK1 aktyvumo praradimą. Šių APC cdc20 substratų skaidymas leidžia formuoti antrąjį polinį kūną ir šiuo metu atsiranda APC cdh1 aktyvumas. APC cdh1 yra atsakingas už KEN dėžės substratų, tokių kaip cdc20, skaidymą. APC cdh1 aktyvumas sumažėja, kai susidaro probranduoliai ir zigota patenka į pirmojo embrioninių ląstelių ciklo S fazę.
APC cdc20 ir APC cdh1 aktyvacijos modelis II mejozės metu. Neapvaisinti MII kiaušinėliai, turintys aukštą CDK1 lygį, turi mažą APC cdc20 ir APC cdh1 aktyvumą. Iš spermos gautas Ca 2+ signalas inicijuoja APC cdc20 aktyvaciją lytinių ląstelių suliejimo metu, kuris yra atsakingas už ciklino B1/sekurino skaidymą ir su tuo susijusį CDK1 aktyvumo praradimą. Šių APC cdc20 substratų skilimas leidžia susidaryti antrąjį polinį kūną ir šiuo metu atsiranda APC cdh1 aktyvumas. APC cdh1 yra atsakingas už KEN dėžutės substratų, tokių kaip cdc20, skilimą. APC cdh1 aktyvumas sumažėja, kai susidaro probranduoliai ir zigota patenka į pirmojo embrioninių ląstelių ciklo S fazę.
APC cdc20 aktyvinimas Ca 2+
Spermatozoidai sukelia ilgalaikę Ca 2+ šuolių seriją, išleisdami į kiaušinį spermos specifinį fosfolipazės C (PLC) šeimos narį PLCζ (Saunders ir kt., 2002). Ši PLC kelia kiaušinių InsP3 lygius, todėl susidaro Ca 2+ smailių traukinys (Jones ir Nixon, 2000). Ca 2+ padidėjimas procese, kurį skatina nuo kalmodulino priklausoma baltymų kinazė II (Markoulaki ir kt., 2003 Markoulaki ir kt., 2004), yra būtinas ir pakankamas veiksnys atnaujinti mejozę po MII sustabdymo (Hyslop ir kt. ., 2004). Nuo D-dėžutės priklausanti ciklino B1 (Nixon ir kt., 2002) ir securino (dabartiniai duomenys) proteolizė prasideda tuo pačiu metu, praėjus vos kelioms minutėms po pirmojo Ca 2+ šuolio. Mes tai suprantame taip, kad E3 ligazės APC cdc20 aktyvacija įvyksta netrukus po to, kai inicijuojamas dygimas, taip pat, kaip įrodyta, kad APC cdc20 yra įjungtas ir būtinas varlių kiaušinių aktyvinimo metu (Lorca ir kt., 1998). Tačiau pelių kiaušiniai taip pat ekspresuoja RFLP4 - E3 ligazę, kurios substratai apima cikliną B1 (Suzumori ir kt., 2003), kurie gali atlikti tą pačią funkciją kaip ir APC cdc20, o mielėse aprašyti nauji cdc20 mejozės variantai (Cooper ir kt., 2000) ir Drosophila (Chu ir kt., 2001). Šie duomenys neatmeta RFLP4 funkcijos pelės mejozėje.Tačiau čia parodome, kad pelių kiaušiniuose yra cdc20, ir anksčiau mes įrodėme, kad Ca 2+ sukeltas ląstelių ciklo atnaujinimas ir ciklino B1 skilimas gali būti užblokuoti suklio kontrolinio taško indukcija (Jones ir kt., 1995 Nixon ir kt. , 2002). Tai patvirtintų APC cdc20 vaidmenį, nes suklio kontrolinio taško aktyvinimas yra stiprus APC cdc20 aktyvumo slopintojas (Yu, 2002). Šį efektą lemia mad2, vienas iš verpstės kontrolinio taško baltymų, kuris specifiškai ir tiesiogiai jungiasi prie cdc20 (Luo ir kt., 2000). Todėl tikėtina, kad RFLP4 gali atlikti specifinį vaidmenį I mejozės metu arba, alternatyviai, prisideda prie sekurino/ciklino B1 skilimo II mejozės metu, kai tik APC/C bus suaktyvintas.
Toliau patvirtinant APC cdc20, atliekantį vaidmenį II mejozės metu, pastebimas pastebėjimas, kad tiek D-dėžės, tiek KEN-dėžės turintys substratai yra skirti proteolizei, kai CDK1 aktyvumas sumažėja antrojo polinio kūno išspaudimo metu. Tai reiškia, kad šiuo metu reikia pereiti nuo APC cdc20 prie APC cdh1 veiklos. Šis perjungimas neįvyksta varlių kiaušiniuose, kuriuose nėra cdh1 baltymo, tačiau šio perjungimo laikas atitiktų tą, kuris buvo gautas iš mitozinių tyrimų su žinduolių ląstelėmis (Hagting ir kt., 2002 Zur ir Brandeis, 2002) ir neigiamo cdh1 reguliavimo. pateikė MPF.
Šiuo metu nežinoma, kaip nuo kalmodulino priklausomos baltymų kinazės II aktyvinimas Ca 2+ lemia APC cdc20 įjungimą. Istoriškai terminas „citostatinis faktorius“ buvo naudojamas apibūdinti kiaušinių aktyvumą, kuris yra atsakingas už MII sulaikymą. Tikėtina, kad citostatinio faktoriaus aktyvumas slopina APC cdc20 aktyvumą. Iš tiesų, kai kurie kandidatai, turintys citostatinio faktoriaus aktyvumą, yra APC cdc20 inhibitoriai. Tai apima „Emi1“, kuris suriša cdc20 ir taip neleidžia cdc20 surišti APC/C (Reimann ir Jackson, 2002), ir įvairius veleno kontrolinio taško komponentus (Schwab ir kt., 2001 Tunquist ir kt., 2003).
Kodėl kai kuriuose kiaušiniuose yra cdh1, o kituose - ne
Reikia atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų galima nustatyti APC cdh1 funkciją ir reguliavimą pelės II mejozės metu, be to, kadangi mes stebėjome jo buvimą visuose oocitų brendimo etapuose, jo vaidmenį pirmajame mejoziniame skyriuje. Gali būti, kad pelės APC cdh1 I mejozės metu yra išjungtas, nes pagal analogiją besiformuojančiose mielėse mejozei būdingas cdh1 inhibitorius apsaugo nuo APC cdh1 aktyvumo pirmojo mejozinio padalijimo metu (Bolte ir kt., 2002). Šis darbas nurodo CDK1 aktyvumo vaidmenį reguliuojant APC cdh1 II mejozės metu, tačiau nieko nežinoma apie fosfatazės cdc14, būtinos cdh1 aktyvavimui, vaidmenį pelių kiaušiniuose. Taigi būsimuose tyrimuose turėtų būti nagrinėjama, kaip cdh1 reguliuoja CDK1 / cdc14 per du mejozinius padalijimus, kuriuos laikinai skiria vos kelios valandos. Mitoziniame skyriuje cdh1 aktyvumas atrodo lengvai nereikalingas, todėl ląstelės vis tiek gali išeiti iš mitozės, jei nėra cdh1. Todėl gali būti, kad cdh1 galima atsisakyti II mejozės užbaigimo procesui. Tačiau buvo nustatyta, kad APC cdh1 atlieka specifines funkcijas vėliau ląstelių cikle G1, jis yra atsakingas už tai, kad G1-S kontrolinis taškas būtų leistinas (Sudo ir kt., 2001) ir užkirstų kelią priešlaikiniam patekimui į S fazę (Bashir ir kt. , 2004 Wei ir kt., 2004). Atrodo, kad APC cdh1 taip pat atlieka funkcijas už ląstelių ciklo ribų, pavyzdžiui, postmitoziniuose neuronuose, kur jis reguliuoja aksonų augimą (Konishi ir kt., 2004), o kai kuriuose tyrimuose nustatyta, kad jo buvimas yra susijęs su ląstelių diferenciacija (Blanco ir kt., 2000). Todėl bus įdomu nustatyti, kokį vaidmenį motinos cdh1 vaidina embrionuose iki zigotinio genomo aktyvavimo.
Dauguma ląstelių dalijimosi, įskaitant tuos, kurie atsiranda ankstyvuose pelių embrionuose ir žinduolių mitoziniuose dalijimuose, turi tarpus tarp ląstelių ciklo, todėl G1 reikia cdh1, kad būtų galima reguliuoti patekimą į S fazę. Tačiau kai kurių rūšių kiaušiniai, pavyzdžiui, Xenopus, C. elegans ir Drosophila, atrodo, kad be spragų fazių. Remiantis dabartiniu APC cdc20 ir APC cdh1 aktyvumo atradimu pelės kiaušinių II mejozės metu, tikriausiai nėra taip, kad embriono ląstelių ciklas iš esmės skiriasi nuo suaugusių ląstelių ląstelių ciklo. Atvirkščiai, kai kurių rūšių kiaušinių ir embrionų cdh1 aktyvumo trūkumas tikriausiai atspindi reikalavimą pagreitinti ląstelių ciklą, kad būtų pasiektas judrus etapas ir išvengta grobuoniškumo.
Γ-sekretazės ir jos substratų dinamika
γ-sekretazė yra intramembraninė aspartilproteazė, katalizuojanti paskutinį daugelio 1 tipo transmembraninių baltymų reguliuojamos intramembraninės proteolizės etapą. Plačiausiai ištirti substratai yra amiloido-β pirmtakų baltymas (APP) ir NOTCH receptoriai. Svarbi sąveikų ir konformacinių pokyčių apibūdinimo technika, leidžianti γ-sekretazei atlikti hidrolizę membranos ribose, yra molekulinės dinamikos modeliavimas skirtingomis laiko ir ilgio skalėmis. Čia apžvelgiame γ -sekretazės ir jos substratų struktūrines ir dinamines savybes, įskaitant modeliavimo ir eksperimentų lankstumo aprašymus. Mes nagrinėjame (1) konformacinį apo fermento ir nesusijusių substratų mėginių ėmimą (pvz., APP, NOTCH1 ir tariamą be substrato integriną β1), (2) substrato įdarbinimo kelius, (3) konformacinius pokyčius, susijusius su atpažinimo komplekso formavimu. , (4) skilimo vietos atsiskleidimas sąveikaujant su aktyvia fermento vieta, (5) substrato apdorojimas po endoproteolizės ir (6) γ-sekretazės slopinimas ir moduliavimas. Baigiame dar neatsakytais klausimais ir siūlome tolesnius tyrimus, siekiant geriau suprasti, kaip γ-sekretazė atrenka ir apdoroja substratus. Šios žinios pagerins gebėjimą selektyviau nukreipti substratus terapinėms reikmėms.
Turinys
A vežėjas nėra atviras vienu metu tiek tarpląstelinei, tiek tarpląstelinei aplinkai. Arba jo vidiniai vartai yra atviri, arba išoriniai. Priešingai, a kanalą gali būti atviras abiem aplinkoms vienu metu, todėl molekulės gali netrukdomai pasklisti. Vežėjai turi surišimo vietas, tačiau poros ir kanalai neturi. [5] [6] [7] Kai kanalas atidaromas, per membraną per sekundę gali prasiskverbti milijonai jonų, tačiau per nešiojamąją molekulę per tą patį laiką paprastai praeina tik nuo 100 iki 1000 molekulių. [8] Kiekvienas baltymas nešiklis yra skirtas atpažinti tik vieną medžiagą arba vieną labai panašių medžiagų grupę. Tyrimai koreliavo specifinių nešiklių baltymų defektus su specifinėmis ligomis. [9]
Aktyvus transportavimas yra medžiagos judėjimas per membraną prieš jos koncentracijos gradientą. Paprastai tai yra skirta kaupti didelę ląstelei reikalingų molekulių, tokių kaip gliukozė ar aminorūgštys, koncentraciją. Jei procesas naudoja cheminę energiją, pvz., adenozino trifosfatą (ATP), jis vadinamas pirminiu aktyviuoju transportu. Antrinis aktyvus transportavimas apima elektrocheminio gradiento naudojimą ir nenaudoja ląstelėje pagamintos energijos. [10] Skirtingai nuo kanalų baltymų, kurie tik pasyviai perneša medžiagas per membranas, nešikliai baltymai gali pernešti jonus ir molekules arba pasyviai per lengvą difuziją, arba per antrinį aktyvų transportavimą. [11] Baltymas nešiklis reikalingas dalelėms perkelti iš mažos koncentracijos sričių į didelės koncentracijos sritis. Šie nešikliai turi receptorius, kurie jungiasi prie konkrečios molekulės (substrato), kurią reikia transportuoti. Perkeliama molekulė arba jonas (substratas) pirmiausia turi surišti nešiklio molekulės surišimo vietoje su tam tikru surišimo afinitetu. Po surišimo ir tuo metu, kai surišimo vieta yra nukreipta vienodai, nešiklis užfiksuos arba uždengs (paims ir išlaikys) substratą savo molekulinėje struktūroje ir sukels vidinį perkėlimą taip, kad anga baltyme būtų nukreipta į kitą pusę plazmos membrana. [12] Nešančiojo baltymo substratas išleidžiamas toje vietoje, atsižvelgiant į jo surišimo afinitetą.
Supaprastinta difuzija – tai molekulių ar jonų perėjimas per biologinę membraną per specifinius transportavimo baltymus ir nereikalauja energijos sąnaudų. Supaprastinta difuzija ypač naudojama didelių polinių molekulių ir įkrautų jonų atveju, kai tokie jonai ištirpsta vandenyje, jie negali laisvai difuzuoti per ląstelių membranas dėl fosfolipidų, sudarančių dvigubus sluoksnius, riebalų rūgščių uodegų hidrofobinės prigimties. Lengvinančiai difuzijai naudojamų nešiklių baltymų tipas šiek tiek skiriasi nuo tų, kurie naudojami aktyviam transportavimui. Jie vis dar yra transmembraniniai nešiklio baltymai, tačiau tai yra uždaryti transmembraniniai kanalai, tai reiškia, kad jie viduje neperkeliami ir nereikalauja ATP, kad veiktų. Substratas paimamas vienoje nešiklio pusėje, o nenaudojant ATP substratas išleidžiamas į ląstelę. Jie gali būti naudojami kaip galimi biomarkeriai.
Atgalinis transportas, arba transporterio apvertimas, yra reiškinys, kai membranos transportavimo baltymo substratai yra perkeliami priešinga kryptimi nei įprastas transporteris. [13] [14] [15] [16] [17] Transporterio apsisukimas paprastai įvyksta, kai membranos transportavimo baltymas yra fosforilinamas tam tikra proteinkinaze, kuri yra fermentas, pridedantis prie baltymų fosfatų grupę. [13] [14]
1: Kanalai/poros Redaguoti
- α-spiraliniai baltymų kanalai, tokie kaip įtampos valdomi jonų kanalai (VIC), ligandų valdomi jonų kanalai (LGIC)
- β statinės porinos, tokios kaip akvaporinas
- kanalus formuojantys toksinai, įskaitant kolikus, difterijos toksinus ir kt
- Neribosomiškai sintetinami kanalai, tokie kaip gramicidinas, kurie eksportuoja fermentus, kurie virškina bakterijų ląstelių sienas ankstyvame ląstelių lizės etape.
Palengvinta difuzija vyksta ląstelės membranoje ir iš jos per kanalus/poras ir nešiklius/nešiklius.
Kanalai yra atviros arba uždaros būsenos. Kai kanalas atidaromas su nedideliu konformaciniu jungikliu, jis yra atviras abiem aplinkoms vienu metu (tarpląstelinis ir tarpląstelinis)
Poros yra nuolat atviros šiai aplinkai, nes jos nevyksta konformacinių pokyčių. Jie visada atviri ir aktyvūs.
2: Elektrocheminio potencialo valdomi transporteriai Redaguoti
Taip pat vadinami baltymų nešikliais arba antriniais nešikliais.
3: Pagrindiniai aktyvūs vežėjai Redaguoti
- 3.A: P-P-obligacijų hidrolizės varomi transporteriai:
- ^Membranos + transportavimas + baltymai JAV nacionalinėje medicinos bibliotekoje Medicinos dalykų antraštės (MeSH)
- ^ Perland, Emelie Bagchi, Sonchita Klaesson, Axel Fredriksson, Robert (2017-09-01). „29 naujų netipinių tirpiklių, turinčių pagrindinį pagalbininką superšeimos tipo, savybės: evoliucinis išsaugojimas, numatoma struktūra ir neuronų bendra ekspresija“. Atviroji biologija. 7 (9): 170142. doi: 10.1098/rsob.170142. ISSN2046-2441. PMC5627054. PMID28878041.
- ^
- Hediger, Matthias A. Romero, Michael F. Peng, Ji-Bin Rolfs, Andreas Takanaga, Hitomi Bruford, Elspeth A. (2004 m. Vasaris). „Tirpių nešiklių ABC: fiziologinės, patologinės ir terapinės žmogaus membranos transportavimo baltymų pasekmės. Įvadas“. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447 (5): 465–468. doi: 10.1007/s00424-003-1192-y. ISSN0031-6768. PMID14624363. S2CID1866661.
- ^ ab
- Perlandas, Emelie Fredriksson, Robertas (2017 m. Kovo mėn.). „Antrinių aktyvių vežėjų klasifikavimo sistemos“. Farmakologijos mokslų tendencijos. 38 (3): 305–315. doi:10.1016/j.tips.2016.11.008. ISSN1873-3735. PMID27939446.
- ^ Sadava, Deividas ir kt. Gyvenimas, biologijos mokslas, 9 -asis leidimas. Leidykla „Macmillan“, 2009. 1-4292-1962-9. p. 119.
- ^
- Cooperis, Geoffrey (2009). Ląstelė: molekulinis požiūris. Vašingtonas, DC: ASM Press. p. 62. ISBN9780878933006.
- ^ Thompson, Liz A. Išlaikė Šiaurės Karolinos biologijos kurso pabaigos testą. American Book Company, Inc. 2007. 1-59807-139-4. p. 97.
- ^
- Assmann, Sarah (2015). „Tirpusis transportas“. Taiz, Lincoln Zeiger, Edward (red.). Augalų fiziologija ir vystymasis. Sinaueris. p. 151.
- ^ Sadava, David ir kt. Gyvenimas, biologijos mokslas, 9 -asis leidimas. Macmillan Publishers, 2009. 1-4292-1962-9. p. 119.
- ^ ab Ashley, Rūta. Hannas, Gary. Han, Seong S. Ląstelių biologija. „New Age International Publishers“. 8122413978. p. 113.
- ^ Taizas, Linkolnas. Zeigleris, Eduardo. Augalų fiziologija ir raida. Sinauer Associates, 2015. 978-1-60535-255-8. 151 p.
- ^ Kentas, Michaelas. Pažangi biologija. Oxford University Press US, 2000. 0-19-914195-9. 157–158 psl.
- ^ ab
- Bermingemo DP, Blakely RD (2016 m. spalio mėn.). „Nuo kinazės priklausomas monoamino neurotransmiterių transporterių reguliavimas“. Pharmacol. Rev. 68 (4): 888–953. doi:10.1124/pr.115.012260. PMC5050440. PMID27591044.
- ^ ab
- Miller GM (2011 m. Sausis). „Atsirandantis su aminu susijusių pėdsakų 1 receptoriaus vaidmuo funkciškai reguliuojant monoamino transporterius ir dopaminerginį aktyvumą“. Neurochemijos žurnalas. 116 (2): 164–176. doi:10.1111/j.1471-4159.2010.07109.x. PMC3005101. PMID21073468.
- ^
- Scholze P, Nørregaard L, Singer EA, Freissmuth M, Gether U, Sitte HH (2002). „Cinko jonų vaidmuo atvirkštiniame transporte, kurį tarpininkauja monoamino transporteriai“. Biologinės chemijos žurnalas. 277 (24): 21505–13. doi: 10.1074/jbc.M112265200 . PMID11940571.
- ^
- Robertsonas SD, Matthiesas HJ, Galli A (2009). "Atidžiau pažvelgti į amfetamino sukeltą atvirkštinį dopamino ir norepinefrino pernešėjų transportavimą ir prekybą". Molekulinė neurobiologija. 39 (2): 73–80. doi: 10.1007/s12035-009-8053-4. PMC2729543. PMID19199083.
- ^
- Kasatkina LA, Borisova TA (2013 m. lapkritis). „Glutamato išsiskyrimas iš trombocitų: egzocitozė, palyginti su glutamato transporterio pasikeitimu“. „International Journal of Biochemistry & amp Cell Biology“. 45 (11): 2585–2595. doi:10.1016/j.biocel.2013.08.004. PMID23994539.
- ^ Sherwood, Lauralee. 7-asis leidimas. Žmogaus fiziologija. Nuo ląstelių iki sistemų. Cengage Learning, 2008. p. 67
- ^ Rao, PN, Levine, E ir kt. Riboflavino nešiklio baltymo kiekio padidėjimas sergant krūties vėžiu. Cancer Epidemiol Biomarkers Ankstesnis 8 tomas Nr. 11. 985–990 p
- (ABC transporteris), pvz., MDR, CFTR ("V" susijęs su vakuoliu). („P“, susijęs su fosforilinimu), pavyzdžiui:
4: Grupiniai translokatoriai Redaguoti
Grupiniai translokatoriai suteikia specialų mechanizmą cukrui fosforilinti, kai jie patenka į bakterijas (PEP grupės perkėlimas)
5: Elektronų nešikliai Redaguoti
Transmembraniniai elektronų pernešėjai membranoje apima dviejų elektronų nešiklius, tokius kaip disulfidinių ryšių oksidoreduktazės (DsbB ir DsbD E. coli), taip pat vieno elektrono nešiklius, tokius kaip NADPH oksidazė. Dažnai šie redokso baltymai nelaikomi transportiniais baltymais.
Kiekvienas nešiklis baltymas, ypač toje pačioje ląstelės membranoje, yra būdingas vienam molekulių tipui arba šeimai. Pavyzdžiui, GLUT1 yra pavadintas baltymas nešiklis, randamas beveik visose gyvūnų ląstelių membranose, pernešantis gliukozę per dvisluoksnį sluoksnį. Kiti specifiniai nešikliai baltymai taip pat padeda organizmui veikti svarbiais būdais. Citochromai veikia elektronų transportavimo grandinėje kaip elektronų nešikliai. [10]
Daugybė paveldimų ligų yra susijusios su nešiklio baltymų defektais tam tikroje medžiagoje ar ląstelių grupėje. Cisteinurija (cisteinas šlapime ir šlapimo pūslėje) yra tokia liga, apimanti defektinius cisteino nešiklio baltymus inkstų ląstelių membranose. Ši transportavimo sistema paprastai pašalina cisteiną iš skysčio, skirto šlapimui, ir grąžina šią nepakeičiamą aminorūgštį į kraują. Kai šis nešiklis veikia netinkamai, didelis kiekis cisteino lieka šlapime, kur jis yra santykinai netirpus ir linkęs nusėsti. Tai yra viena iš šlapimo akmenų priežasčių. [18] Buvo įrodyta, kad kai kurie vitaminų nešiklio baltymai yra per daug išreikšti pacientams, sergantiems piktybine liga. Pavyzdžiui, įrodyta, kad krūties vėžiu sergančių žmonių riboflavino nešiklio baltymo (RCP) kiekis yra žymiai padidėjęs. [19]
Anderle, P., Barbacioru, C., Bussey, K., Dai, Z., Huang, Y., Papp, A., Reinhold, W., Sadee, W., Shankavaram, U. ir Weinstein, J. (2004). Membranų pernešėjai ir kanalai: transporto priemonės vaidmuo vėžio cheminiam jautrumui ir cheminiam atsparumui. Vėžio tyrimai, 54, 4294-4301.
MEDŽIAGOS IR METODAI
Ląstelių kultūros
COS-1 ląstelės, HeLa ir Vero ląstelės buvo laikomos DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) standartinėmis sąlygomis. Transfekcijos buvo atliktos naudojant 1-2 μg atitinkamų vektorių, kaip aprašyta anksčiau (Chen ir Okayama, 1987 Raggo ir kt., 2002). Kur nurodyta, brefeldinas A (galutinė koncentracija 1 μg / ml) buvo pridėta prie ląstelių praėjus ~ 24 valandoms po transfekcijos, o kultūros buvo toliau inkubuojamos 4–8 valandas. Atliekant tyrimus, nagrinėjančius išsiskleidusio baltymo atsako indukcijos poveikį, DTT buvo pridėta į normalią terpę, laikantis paveikslėlių legendose nurodytos koncentracijos ir laiko.
Plazmidės
Anksčiau buvo aprašyta vektoriaus (pJS6), kuriame yra Lumano (CREB3) koduojanti seka, konstrukcija, šalia kurios N -galo yra SV5 epitopo žyma, o C gale - hemagliutinino (HA) žyma. ir kt., 2002). CREB4 kodavimo seka buvo sustiprinta iš HeLa cDNR bibliotekos („Marathon Ready cDNA BD Biosciences Clontech“, Palo Alto, CA), naudojant pradmenis AGATCTATGGATCTCGGAATCCCTGACCC ir CTCGAGCATCTCATCTG CATGCAGCACGG, kuriuose BglII ir XhoI vieta buvo įtraukta atitinkamai į 5 ′ ir 3 ′ pradmenis, kad būtų palengvinti tolesni klonavimo etapai. Pabrauktas ATG žymi iniciatorių metioniną, o 3′ pradmuo sukurtas taip, kad paskutinis koduojantis tripletas kadre nuskaitytų C-galo žymą po tolesnių klonavimo etapų. Tada amplifikuotas fragmentas buvo virškinamas BglII ir XhoAš ir įkišau į BamLabas ir XhopJS6 I vietos, sukuriančios konstrukciją, kuri išreiškė nepažeistą CREB4 (pJS23), pažymėtą N gale ir C gale. Naudojant gimtąjį BamHI svetainė tik pasroviui nuo CREB4 pradžios vietos, a BamHI-XhoI fragmentas taip pat buvo klonuotas tarp BamLabas ir XhoI pJS6 svetainės, sukuriančios vektorių, išreiškiantį CREB4 versiją, kurioje nėra pirmųjų 22 liekanų (pJS24 CREB.ΔN1).
Chimera, susidedanti iš CREB4 (1-275) N-galinio domeno, sujungto su Luman transmembraniniais ir C-galiniais domenais, buvo sukurta virškinant pJS23 su BlpAš, natūrali unikali vieta prieš pat tariamą transmembraninio domeno apdorojimą T4 polimeraze, siekiant pašalinti 3′ plėtinius ir virškinimą su XhoI. Tai pašalino CREB4 transmembraninį ir C-galinį domeną (276-395 liekanos). Fragmentas (EkologiškasRV-XhoI) iš pJS6, turinčio Luman transmembraninę ir C-galinę uodegą (220-371 liekanos), buvo įterpta, kad būtų sukurtas pJS42 (CH2). Chimera, susidedanti iš CREB4 (1-324) N-galinio domeno ir transmembraninės srities, sujungtos su CREB3 (258-371) C-galiniu liumeniniu domenu, buvo sukurta amplifikuojant CREB4 N galą ir transmembraninį domeną naudojant pradmenis AGATCTATGGATCTCGGAATCCCCTGACCC ir AGATCTAGACCCAGCTTCTGGTCGAC. Tai buvo klonuota tarp BamHI N gale ir vidiniame BlpI pJS6 svetainė, skirta sukurti vektorių pJS43 (CH3). Buvo sukurta papildoma chimera (pJS66, CH6), kurioje buvo CREB4 N galas, įskaitant transmembranines ir S1P vietas, susietas su Lumano liumeniniu domenu. Tam C-galo Lumano fragmentas buvo amplifikuotas naudojant pradmenis CTCGAGGCCCCTCCCCGTGAGGACCCTTAC ir GATCCTCGAG GCCTGAGTATC TGTCCAG ir klonuotas į XhoI pJS60 svetainę, kad sukurtume chimerą, susidedančią iš N-galinių 344 CREB4 liekanų, po kurių yra Luman 269-371 liekanos. Galiausiai buvo sukurta abipusė chimera, turinti CREB3 N galą su transmembraniniu domenu ir CREB4 C galu (pJS58, CH4), pakeičiant EkologiškasRV-XhoI pJS6 fragmentas su a BlpAš-XhoI fragmentas iš pJS23.
Dėl delecijos mutantų CREB4.ΔTM (pJS32) buvo viso ilgio, tačiau jame buvo vidinė delecija, kad būtų pašalintas numanomas transmembraninis domenas (281-313 liekanos). Kitos ištrynimo konstrukcijos turėjo baltymo N-galinę dalį CREB.ΔTMC1, sutrumpintą 276 liekanoje ir neturinčią transmembraninės ir C-galinės srities CREB4. ΔC1, sutrumpintos 319 liekanoje, įskaitant transmembraninę sritį, bet neturinčią tariamos S1P vietos 335-338 padėtyje CREB4.ΔC2, sutrumpintas 344 liekanoje ir turintis N galą bei transmembraninį domeną ir spėjamą S1P vietą. 1-344 likučiai buvo amplifikuoti naudojant pradmenis AGATCTATGGATCTCGGAATCCCTGACCC ir CTCGAGTGTTACGTCCTTGTGGGTCAGG, o gauta cDNR buvo klonuota tarp BamLabas ir XhoI pJS23 svetainės. CREB4.ΔC1 buvo pagamintas virškinant pJS23 Salaš ir XhoAš, gydydamasis su Klenowu ir religatuoju. Jame yra 1-319 CREB4 liekanos ir septynios liekanos (HKGEPAS) prieš naują stop kodoną. Visos konstrukcijos buvo patvirtintos seka ir jų struktūros yra apibendrintos atitinkamuose paveikslėliuose.
CREB 4 ir GAL4 DNR surišimo domeno sintezės buvo sukurtos naudojant GAL4 DNR surišimo domeną pM1 (Sadowski ir kt., 1992). CREB4 buvo amplifikuotas iš pJS23, naudojant pradmenis GAATTCATGGATCTCGGAATCCCTGAC ir CTCGAGTTACAGGCTGGCATAGTCAGGC. Šis produktas, kurio sudėtyje yra viso ilgio CREB4 su HA žyme prie C galo pridėta ir termino kodono, buvo suardytas EkologiškasRI ir XhoAš ir įterpiau tarp EkologiškasRI ir SalI pM1 svetainės, kad gautų pJS55, išreiškiantį GAL4 DNR surišimo domeną, sujungtą su viso ilgio CREB4. Norint gauti GAL4 suliejimą tik su CREB4 N-galiniu regionu, pJS44 (CREB.ΔTMC1) buvo suvirškintas IndasIII ir XbaI izoliuoti N-galines liekanas 1-276, kurios buvo klonuotos tarp IndasIII ir XbaI pJS55 svetainės, skirtos gaminti pJS62.
Sukurtas vektorius, išreiškiantis žaliai fluorescencinio baltymo (GFP) -CREB4 sulietą baltymą. Įterpdami fragmentą (NdeAš-BamHI), kurioje yra GFP kodavimo seka iš pEGFP-C1 (BD Biosciences Clontech) į pJS23, kad būtų sukurtas vektorius, ekspresuojantis CREB4.ΔN1 sulietą baltymą su GFP N gale (pJS51). The BglII-BlpTada nepažeisto CREB4 fragmentas buvo perkeltas į BamLabas ir BlppJS51 I vietos, ekspresuojančios nepažeistą GFP-CREB4 sulietą baltymą su GFP N gale (pJS52).
Norint sukurti OASIS ekspresijos vektorių, cDNR (IMAGE ID 4856946) buvo suardoma BamSveiki. CDNR klone yra vietinis BamHI vieta OASIS 17 liekanoje ir a BamHI plazmidės vektoriuje. 1,5 kb BamTada HI fragmentas, apimantis 17 liekanas iki C-galinės liekanos (519), buvo perkeltas į pJS6, kad būtų sukurtas tarpinis vektorius pJS6OAS1. Norėdami sukurti išraiškos vektorių taip, kad OASIS būtų tokia pati C-galo HA žyma kaip ir kitose konstrukcijose, pradmenys GGTCACCAACAAGATCTCCAGACC, kuriuose yra BstEII svetainė ir CTCGAGGGAGAGTTTGATGGTGG, kurioje yra XhoI vieta buvo naudojama koduojančios srities 3′ galui sustiprinti (354–519 liekanos), kad sritis būtų nuskaityta kadre, kai įterpiama į pJS6OAS1. cDNR fragmentas suardomas su BstEII ir XhoTada buvau įkištas tarp BstpJS6OAS1 EII (Oasis) ir XhoI (vektoriaus) vietose, kad būtų sukurtas antrasis tarpinis vektorius pJS6OAS2. Norėdami užbaigti klonavimą, OASIS koduojančios srities 5 ′ galas buvo amplifikuotas iš „Image cDNA“ klono, naudojant pradmenis (AGATCTATGGACGCCGTCTTGG) ir (TCCGGACTCTCTTCAAGGCCTTC). Šis 874 bp fragmentas buvo virškinamas BglII ir BspEI ir klonavo tarp BamHI ir gimtoji BspPJS6OAS2 EI vietos, kad būtų sukurtas konstruktas, išreiškiantis nepažeistą OASIS su SV5 epitopu N gale ir HA epitopu C gale (pJS22).
CREB-H ekspresijos vektoriaus konstravimo strategija buvo tokia pati, kaip aprašyta aukščiau CREB4 iš HeLa cDNR bibliotekos naudojant pradmenis CGCGGATCC.ATGAATACGGATTTAGCTGC ir ACGCGTCGACCAGCTCGTCTCCCGCCGCCT. Fragmentas BamHI-SalBuvau klonuotas į BamHI-XhoI pJS6 (pSM20) svetainės. Konstrukciją, ekspresuojančią ATF6 (p3XFLAG-CMV-ATF6) ir N-galo variantą 1-373, maloniai pateikė dr. Ron Prywes (Biologijos mokslų departamentas, Kolumbijos universitetas, Niujorkas, NY). S1P ekspresijos vektorius maloniai pateikė dr. Joseph Goldstein (Teksaso universiteto Molekulinės genetikos departamentas, Pietvakarių medicinos centras, Dalasas, TX).
Mutagenezė
S1P skilimo vietos mutacija CREB4 buvo atlikta naudojant QuikChange rinkinį (Stratagene, La Jolla, CA). CREB4 viduje 335-RNIL-338 seka yra ~ 20 liekanų pasroviui nuo transmembraninio regiono. CREB4 (pJS50) arba sutrumpinto CREB4.ΔC2 (pJS67) mutantinė versija, turinti vieną aminorūgšties pakaitalą (R335G) šiame motyve, buvo sukurta naudojant pradmenis GGAGTGACTTCCGGAAAATATCCTGACCCACAAGG ir CCTTGTGGGTCAGGATATTTCCGGAAGTCACTCC. Tėvų plazmidės pJS24 arba pJS60 buvo denatūruotos ir inkubuojamos su pradmenimis pagal gamintojo instrukcijas. Užbaigus reakciją, mėginys virškinamas DpnI pašalinti tėvų plazmidės šabloną ir tada transformuoti. Mutacijos įterpimas į šią konstrukciją, kaip ir į visas konstrukcijas, buvo patvirtintas atliekant plazmidės seką.
Imunofluorescencija
Ant dengiamųjų stiklelių išaugintos ląstelės buvo transfekuotos 2 μg atitinkamo ekspresijos vektoriaus. Praėjus maždaug 30 valandų po transfekcijos, ląstelės buvo plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) ir 15 minučių fiksuojamos metanolyje -20 ° C temperatūroje. Užblokavus PBS, kuriame yra 10% veršelio vaisiaus serumo, buvo uždėti pirminiai antikūnai, praskiesti blokuojančiu tirpalu. Tai apėmė monokloninius antikūnus SV5 (1/10000) prieš SV5 žymą ir anti-FLAG M2 (1/1000 Stratagene) ir polikloninius anti-GFP (1/500 Research Diagnostics, Flandrija, NJ), antikalretikuliną (1/500). , Calbiochem, San Diego, CA) ir anti-β-Cop (1/100 Affinity Bioreagents, Golden, CO). Po plovimo kelis kartus pakeitus PBS, antriniai antikūnai, konjuguoti su „Alexa 488“ arba „Alexa 543“ („Invitrogen“), buvo praskiesti 1/200. Po 20 minučių inkubacijos stikleliai vėl buvo nuplauti ir sumontuoti Mowiol (Sigma Chemical, Poole, Dorset, Jungtinė Karalystė). Lokalizacijos tyrimams CREB4 taip pat buvo kotransfekuotas su plazmide (sustiprintu geltonu fluorescenciniu baltymu [EYFP]-Golgi BD Biosciences Clontech), kuri išreiškia β-galaktoziltransferazės, sujungtos su geltonu fluorescenciniu baltymu, Golgi nukreipimo signalą. Fluorescenciniai vaizdai buvo gauti naudojant Zeiss LSM410 lazerinį skenavimo konfokalinį mikroskopą. Vaizdai buvo reguliariai gauti naudojant „Plan-apochromat 63“ alyvos panardinimo objektyvą, skaitinę diafragmą 1,4 ir priartinimo koeficientus nuo 1 iki 8 LSM 410 gavimo programinėje įrangoje.
Liuciferazės tyrimai
COS ląstelės buvo transfekuotos skirtingais ekspresijos ir tiksliniais vektoriais, o ląstelių lizatai buvo paruošti praėjus 24 arba 48 valandoms po transfekcijos, pridedant Glo lizės buferio (Promega, Madison, WI). Firefly luciferazės aktyvumas buvo nustatytas naudojant Bright-Glo tyrimo sistemą, kaip aprašyta gamintojo (Promega).
Atliekant GAL4 sintezės eksperimentus, 2 μg komercinio tikslinio vektoriaus, turinčio penkias GAL4 surišimo vietas, pFR-LUC (Stratagene), buvo kotransfekuotas įvairiais kiekiais (0, 0,25, 1 arba 4 μg) pM1 (tuščias vektorius, išreiškiantis GAL4 DNR vien rišantis domenas), pJS55 (GAL4-CREB4) arba pJS62 (GAL4-CREB4.ΔTMC1).
Kituose aktyvinimo tyrimuose natūralių CREB4 ir variantų aktyvumas buvo lyginamas su ATF6, naudojant vektorius pJS23 (CREB4), pJS44 (CREB4.ΔTMC1, 1-276 liekanos), p3XFLAG-CMV-ATF6 ir pCGNATF6 (1-373). Šiuos du vektorius maloniai pateikė dr. Ron Prywes ir jie buvo aprašyti anksčiau (Wang ir kt., 2000). Jie buvo kartu transfekuoti tiksliniais vektoriais, turinčiais kelias ATF6 surišimo vietas, 5XATF6-GL3 (2 μg) arba vektoriais, turinčiais vietinių ER chaperonų promotorių, tokių kaip GRP78, pGL3-GRP78 promotorius (0, 5 μg). Šis vektorius, kurį maloniai pateikė dr. Mori (HSP tyrimų institutas, Kioto tyrimų parkas, Kiotas, Japonija), buvo aprašytas anksčiau (Yoshida ir kt., 1998).
Western Blotting
Transfekuotų ląstelių kultūros (1–2 × 105 ląstelės) buvo plaunamos šaltu PBS, o visi lizatai buvo paruošti pridedant 200 μl SDS įkrovimo buferio. Mėginiai buvo trumpai apdoroti ultragarsu ir virinami prieš elektroforezę. Lygus visų baltymų kiekis buvo frakcionuotas naudojant SDS-PAGE ir perkeltas į „Hybond-C“ membranas („GE Healthcare“, „Little Chalfont“, Bekingemsyras, Jungtinė Karalystė). Membranos buvo užblokuotos PBS, turinčiu 5% neriebaus pieno ir 0,1% Tween 20. Pirminiai antikūnai, praskiesti blokuojančiu tirpalu, buvo anti-SV5 (1/10000) ir anti-FLAG M5 (1/1000 Sigma Chemical). Baltymų juostos buvo aptiktos standartinėmis chemiliuminescencijos aptikimo procedūromis
Nuorodos
S1 pav. Antikūno, atpažįstančio DCas ir DCas mutantus, apibūdinimas rodo normalų raumenų susidarymą ir neuronų ląstelių likimo nustatymą. (A.,B) Antikūno, sukurto prieš labai konservuotą žinduolių p130Cas peptidą, atpažįstantį DCas, apibūdinimas. Mes ėmėmės kelių skirtingų metodų, kad apibūdintume atpažintą antikūną Drosophila Cas. Pirmiausia bandėme sukurti antikūnus prieš Cas, imunizuodami peles a Drosophila Cas sulietas baltymas. Kaip papildomas metodas, kadangi regionai Drosophila Cas buvo labai konservuoti su stuburiniais Cas ir daugeliu Drosophila baltymai dažnai kryžmiškai reaguoja su žinduolių antikūnais (pvz., Colville ir kt., Miller ir Benzer, 1983), mes gavome visus paskelbtus stuburinių Cas antikūnus, kurie atpažino labai konservuotą epitopą Drosophila Cas. Tada paėmėme „Myc“ pažymėtą visą ilgį DCas, subklonavo jį į žinduolių ekspresijos vektorių (pRK5), per daug ekspresavo audinių kultūros ląstelėse ir ištyrė mūsų DCas antiserumus ir stuburinių Cas antikūnus dėl jų gebėjimo atpažinti DCas Western blot. Išbandėme devynis skirtingus komerciškai prieinamus antikūnus ir savo antiserumus. Nors mūsų Drosophila Cas antiserumai neatpažino Drosophila Cas, mes nustatėme vieną antikūną, kuris atpažino pernelyg išreikštą Drosophila Myc DCas, išreikštas 293 ląstelėse. (A) Lizatai iš 293 ląstelių, transfekuotų Myc DCas, buvo tiriami, ar nėra imuninės spalvos juostos, atitinkančios tokį patį dydį kaip Myc DCas baltymas, vaizduojamas naudojant antikūną prieš Myc (1 juosta). Juosta (rodyklė) buvo lizatuose iš 293 ląstelių, transfekuotų Myc DCas (3 juosta), kurios nebuvo kontrolinėse 293 ląstelėse (2 juosta), kai jos buvo nublizgintos fosfo410-p130Cas (Cas) antikūnu. Taip pat stebimos juostos, kurios greičiausiai yra endogeniniai žinduolių Cas baltymai. (B) Drosophila embrionai, išreiškiantys DCas (Myc DCas) arba DCas, kuriems trūksta SH3 domeno (Myc-ΔSH3 DCas nepaskelbtas), naudojant ELAV-GAL4 vairuotojas arba DCas P1 – GAL4 LOF mutantų linija buvo genotipuota ir atlikta vakarietiška analizė naudojant antikūnus, sukurtus prieš Myc arba Cas (phospho410-p130Cas). Myc antikūnas atpažįsta Myc DCas, išreikštą visuose neuronuose, naudojant ELAV-GAL4 vairuotojas (1 juosta). Fosfo410-p130Cas antikūnas atpažįsta panašaus dydžio juostą, kai Myc DCas yra išreikštas visuose neuronuose (2 juosta). Myc antikūnas atpažįsta Myc-DCas, išreikštą a DCas P1 mutantinis fonas naudojant DCas P1 -GAL4 vairuotojas (3 juosta). Fospho410-p130Cas antikūnas atpažįsta Myc DCas, išreikštas DCas P1 mutantinis fonas naudojant DCas P1 -GAL4 vairuotojas (4 juosta). Myc antikūnas atpažįsta Myc-ΔSH3 DC, išreikštas a DCas P1 mutantinis fonas naudojant DCas P1 -GAL4 vairuotojas (5 juosta). Fosfo410-p130Cas antikūnas atpažįsta Myc-ΔSH3 DCas, išreikštą DCas P1 mutantinis fonas naudojant DCas P1 -GAL4 vairuotojas (6 juosta). Molekulinė masė pateikiama kDa. (C-E) Stiprintuvo gaudyklės linijos, išreiškiančios DCas pagal jos endogeninį modelį, apibūdinimas. Norėdami toliau apibūdinti DCas baltymų pasiskirstymą, pasinaudojome P-elemento stiprintuvo gaudyklės linija, kurioje a Gal4 promotoriaus elementas įterptas į DCas genas pasroviui nuo vertimo pradžios vietos (DCas P1 -Gal4, žr. 1A pav.). Vieta DCas P1 -Gal4 pasiūlė, kad Gal4 gali būti išreikštas kontroliuojant endogeninį DCas promotorius, leidžiantis įvertinti DCas baltymų pasiskirstymą. Norėdami išbandyti šią idėją, sukūrėme „Myc“ pažymėtą viso ilgio filmą DCas transgenas, kontroliuojamas UAS promotoriaus (UAS-Myc DCas). Naudodami Gal4-UAS sistemą, pirmiausia nustatėme, kad kada UAS- Myc DCas buvo išreikštas visuose neuronuose, naudojant neuronui būdingą vairuotoją Elav-Gal4, Myc DCas imuninis dažymas buvo pastebėtas CNS ir motoriniuose aksonuose visoje jų aksonų trajektorijoje ir raumenų inervacijos vietose. (C) 16/17 etapo filė embriono, išreiškiančio Myc DCas, paruošimas, kontroliuojamas panneuronų ELAV-GAL4 reklamuotojas (ELAV- GAL4/+ UAS- Myc DCas/+), imuniškai nuspalvintas Myc antikūnais, rodo, kad Myc DCas ekspresija visuose neuronuose lemia Myc DCas lokalizaciją motoriniuose aksonuose (žvaigždutėse) ir ISNb (juodos rodyklės) bei SNa (atviros rodyklės) nervuose. (D, E) Mes kirtome savo UAS- Myc DCas linija su DCas P1 -Gal4 linija ir stebimas Myc DCas imuninis dažymas komisiniuose ir išilginiuose CNS aksonuose, motoriniuose aksonuose ir jų raumenų inervacijos vietose bei segmentų ribose raumenų pritvirtinimo vietose. (D) 15 stadijos embrionas, ekspresuojantis Myc DCas pagal endogeninį DCas skatintojas, kaip skatina DCas P1 P-elementas GAL4 stiprinimo spąstai (DCas P1 -GAL4/+ UAS- Myc DCas/+), imuniškai nudažytas antikūnu prieš Myc. Myc DCas ekspresija pastebima CNS neuronų grupėse (n), aksonuose, užimančiuose priekinius (A) ir užpakalinius (P) plyšius, išilginiuose jungiamuosiuose (L) ir motorinių nervų šaknyse (žvaigždutės). (E) „Myc DCas“ išraiška, kurią skatina endogeninis DCas promotorius taip pat pastebimas raumenų pritvirtinimo vietose (rodyklių galvutės) ir ISNb nervus inervuojančiuose 6 ir 7 raumenyse (rodyklė). Šie rezultatai rodo, kad besivystančioje CNS išreikštas „Myc DCas“ lokalizuojasi į CNS ir motorinių aksonų projekcijas ir tvirtai palaiko idėją, kad vystymosi metu neuronai išreiškia endogenines DCas. (F-L) Normalus raumenų formavimasis ir neuronų ląstelių likimo nustatymas DCas mutantai. β1 integrinas (mano) nulinės mutacijos yra mirtinos embrionui ir sukelia visišką raumenų atsiskyrimą (Leptin ir kt., 1989 Wright, 1969). Į α2 integrinas (jeigu) mutantai, raumenys normaliai vystosi per 17 stadiją, praeityje, kai įvyko mūsų vertinami embrioninio variklio ir CNS ašies nukreipimo įvykiai, o po to jie atsiskiria nuo raumenų prisirišimo vietų, bet vis tiek išlieka ištempti (Hoang ir Chiba, 1998 Prokop ir kt., 1998). Mes matome panašius rezultatus, kai matėme pagrindinių raumenų trūkumus, kaip vertinama pagal Nomarski optiką (pvz. α2 integrinas mutantai) šie segmentai nebuvo įtraukti į mūsų aksonų valdymo defektų analizę. Į α1 integrinas (meu) mutantai, raumenys normaliai vystosi ir prisitvirtina embriogenezės metu, o mutantai miršta lervų stadijose (Brower ir kt., 1995 Roote ir Zusman, 1995). Kadangi DCas yra labai išreikštas raumenų prijungimo vietose, be nervų sistemos, mes ištyrėme, ar raumenų organizavimo ir (arba) neuronų ląstelių likimo nustatymo defektai gali prisidėti prie matomų ašių nukreipimo defektų DCas mutantai. Laukinio tipo Drosophila embrionai turi segmentiškai pasikartojantį raumenų modelį, kurį galima vizualizuoti naudojant raumenų miozino antikūnus, kai jie prisitvirtina prie epidermio raumenų prisitvirtinimo vietose (Bate, 1993). (F-I) Raumenų skaidulų organizavimas Drosophila embrionai, vaizduojami naudojant antikūną (FMM5) (Kiehart ir Feghali, 1986), būdingą raumenų miozinui, kuriame nurodytos pasirinktos raumenų pritvirtinimo vietos (tarp rodyklių galvų). (F-G) Įprasta raumenų skaidulų struktūra, kaip matyti iš dviejų laukinio tipo embriono pusrutulių (F) ir esant didesnei galiai, atskleidžiantys 6, 7, 12 ir 13 raumenis (G). (H-I) DCas LOF mutantai, raumenų vientisumas, žiūrint su Nomarski optika, rodo, kad raumenų formavimasis nebuvo sutrikdytas (žr. 3 ir 4 pav.). Taip pat pastebimas normalus raumenų skaidulų modelis DCas LOF mutantas („DCas Df“ (3L) „Exel6083“ /„DCas Df“ (3L) „Exel6083“ ) embrionai, nudažyti raumenų miozino antikūnu (H), įskaitant 6, 7, 12 ir 13 raumenų morfologiją ir pritvirtinimą (I). Šie rezultatai atitinka mūsų gebėjimą išgelbėti aksonų valdymo defektus, pastebėtus DCas LOF mutantuose su specifine DCas išraiška neuronui (žr. 3 pav. I, 4 J pav. ir S2 pav. papildomoje medžiagoje). (J-L) Aksono nukreipimo defektai taip pat gali atsirasti dėl neuronų praradimo ventraliniame nervo laide arba pasikeitus neuronų diferenciacijai ar specifikacijai (Landgraf ir kt., 1999 Thor ir kt., 1999). Todėl mes ištyrėme ventralinio nervo laido neuronų organizaciją DCas mutantai. DCas mutantuose, naudojant Fas2 antikūną ir Nomarski vaizdą, nenustatyta jokių nervų laido ląstelių morfologijos pakitimų (duomenys nerodomi). Toliau mes ištyrėme DCas mutantai dėl specifinių motoneuronų buvimo ar nebuvimo.Visų pirma, kadangi matome aksonų nukreipimo defektus DCas mutantų, kuriuose ISNb aksonai lieka sužavėti ISN aksonais, paklausėme, ar šie aksonų valdymo defektai yra ISNb neuronų pavertimo ISN neuronais rezultatas. Lygiai praleistas (Eve) baltymas yra puikus ISN neuronų žymeklis, nes jis yra išreikštas maždaug 16 ląstelių viename pilvo pusiausvyros segmente, įskaitant šešis neuronus (vieną aCC, vieną RP2, keturis CQ/U neuronus), kurie sukelia aksonus kurie sudaro ISN nervą (Doe ir kt., 1988 Landgraf ir kt., 1997 Landgraf ir kt., 1999 Patel ir kt., 1989). Ievos lygių keitimas veikia šių neuronų aksonų trajektorijas (Doe ir kt., 1988 Landgraf ir kt., 1999). (J) Du iš šių ISN neuronų (aCC, raudonas RP2, žalias) schematiškai parodyti trijuose laukinio tipo segmentuose. Drosophila embrionas (strėlių antgaliai). (K) Normalus aCC (raudonos rodyklės galvutės) ir RP2 (žalios rodyklės galvutės) neuronų papildas yra DCas mutantai („DCas Df“ (3L) „Exel6083“ /„DCas Df“ (3L) „Exel6083“ ). (L) Embrionai, kuriuose didelis Myc DC kiekis (+++) yra išreikštas visuose neuronuose, naudojant ELAV-GAL4 vairuotojas laukinio tipo fone (neuroniniai DCas GOF žr. 5 pav., S2 pav. papildomoje medžiagoje ir 1 lentelė) taip pat rodo normalų aCC (raudonos rodyklės galvutės) ir RP2 (žalios rodyklės galvutės) neuronų komplemento skaičių. Mastelio juostos: 20 μm C 13 μm D 7 μm E G, 10 μm F-I J, 5 μm J-L.
S2 pav. Cas yra labai išreikštas žinduolių nugaros smegenyse, o DCas mutantai turi CNS aksonų valdymo defektus. (A-E) Cas baltymai yra labai išreikšti žinduolių nugaros smegenyse. P0 žiurkės nugaros smegenų imuninis dažymas buvo atliktas naudojant standartinius metodus (Terman ir kt., 2000). P0 žiurkių jaunikliai buvo perfuzuoti, nugaros smegenys ir juos supantis stuburas buvo pašalintas, o pjūviai buvo supjaustyti 20 μm ant kriostato. Tada ant stiklelio pritvirtintos sekcijos buvo imuniniu būdu nudažytos pasirinktu antikūnu, įskaitant monokloninį antikūną, sukurtą prieš žiurkės p130Cas (8G4-E8 klonas, 1:400 Upstate Biotechnology), monokloninį antikūną, sukurtą prieš pelės Sin (13 klonas, 1:400, BD Transduction Labs). ), kuris taip pat atpažįsta žiurkių nuodėmes ir polikloninius antikūnus, būdingus kelioms tirozino fosforilintoms p130Cas formoms: fosfo-p130Cas (Tyr249), #4014, Lot #1, 1: 100, Cell Signaling Technologies phospho-p130Cas (Tyr410), #4011, 1 dalis, 1: 200, ląstelių signalizacijos technologijos). Papildomi antikūnai, sukurti prieš Cas šeimos baltymų narius, įskaitant pelių monokloninius anti-p130Cas (21 klonas, 1: 400, BD transdukcijos laboratorijos), pelių monokloninius anti-p130Cas (CAS-14, 1: 400, Chemicon International), triušių polikloninius anti-Cas (N-17, Lot#I101, 1:500 Santa Cruz Biotechnology), triušio polikloninis anti-fosfo-p130Cas phospho-p130Cas (Tyr165), #4015, 1 partija, 1:100, ląstelių signalizacijos technologijos ir goat nustatyta, kad polikloninis anti-p130Cas (S-20, Lot#B282, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology) duoda panašius rezultatus. (A-D) Gretimos sekcijos, paimtos P0 žiurkės nugaros smegenų lumbo-sakraliniu lygiu, imuniškai nudažytos antikūnais, atpažįstančiais skirtingus Cas šeimos narius. DF, nugaros funiculus dLF, dorsolateral funiculus vLF, ventrolateral funiculus VF, ventral funiculus cc, centrinis kanalas dr, nugaros šaknis nr, nervinė šaknis. (A) Žiurkės monokloninis antikūnas, atpažįstantis visus tris žiurkių Cas šeimos narius (8G4-E8 klonas), rodo, kad Cas baltymai yra stipriai išreikšti žiurkės nugaros smegenų pilkojoje ir baltojoje medžiagoje. Imunitetų neuronų buvo visose Rexedo sluoksniuose. (B) Didelės galios regiono vaizdas, nurodytas A gretimame skyriuje, imunizuotas polikloniniu antikūnu (fosfo249-p130Cas), nukreiptu prieš fosforilintą p130Cas formą. Nurodyti pažymėti neuronai (rodyklių galvutės) ir jų procesai (rodyklės). (C) Didelės galios nugaros smegenų srities vaizdas, nurodytas A, iš gretimos sekcijos, nusidažęs kitu polikloniniu antikūnu (fosfo410-p130Cas), nukreiptu prieš fosforilintą p130Cas formą. Parodyta „Lamina IX“ ir joje yra labai tikėtina, kad, atsižvelgiant į vietą ir ląstelių kūno dydį, imuniškai nudažyti motoneurono ląstelių kūnai (juodų taškų apskritime) ir jų aksonai (rodyklės). (D) Didelės galios nugaros smegenų srities vaizdas, nurodytas A punkte, iš gretimos sekcijos, nudažytos monokloniniu antikūnu, specifiniu Efs/Sin (13 klonas). Stiprus imuninis dažymas pastebimas ventraliniame funikulyje ir nurodomi atrinkti imuniškai nusidažę neuronai (rodyklių galvutės balta rodyklė, CNS vidurinė linija). (E) Žiurkės viršutiniai gimdos kaklelio gangliono (SCG) neuronai buvo pašalinti, atskirti ir kultivuoti naudojant standartinius metodus (Qian ir kt., 1998). Tada šių SCG neuronų lizatai buvo surinkti ir paleisti SDS-PAGE, o Vakarų analizė buvo atlikta naudojant standartinius metodus. Tada Western blot buvo nudažytas naudojant antikūnus, kurie atpažįsta p130Cas, CasL ir Sin (Cas, N-17, 1:500 Santa Cruz Biotechnology). Cas, CasL ir Efs / Sin (rodyklės) yra išreikšti SCG neuronais. (F-P) DCas LOF ir GOF mutantai turi CNS aksonų valdymo defektus. (F) Laukinio tipo ir „DCas Df“ (3L) „Exel6083“ /+ embrionų, naudojant 1D4 antikūną, aptinkami trys (pažymėti 1, 2, 3 A) pagrindiniai išilginiai aksonų takai. Šie takai paprastai yra tolygiai išdėstyti ir gana vienodo storio (atviros rodyklės F, I ir J rodo į trečiąją išilginę jungtį). (G) Aksonai, prisidedantys prie trečio išilginio colio DCas LOF mutantiniai embrionai yra plonesni nei įprasta, nepertraukiami ir dažnai jų nėra (rodyklė). (H) aksonai, kurie sudaro trečią išilginę in α1 integrinas (meu M6) mutantai yra nenormalios išvaizdos arba dažnai jų nėra (rodyklė). (I, J) DCas ekspresija išgelbėja pastebėtus CNS defektus DCas mutantai. (I) „Myc DCas“ išraiška pagal DCas P1 -GAL4 vairuotojas atkuria trečią išilginę jungtį DCas mutantai (UAS- Myc DCas/+ Df(3L)ED201/DCas P1 ) (atviros rodyklės). (J) „Myc DCas“ neuroninė išraiška naudojant ELAV-GAL4 vairuotojas taip pat atkuria trečią išilginę jungtį DCas mutantai (ELAV-GAL4/UAS- Myc DCas DCas Df(3L)Exel6083 /„DCas Df“ (3L) „Exel6083“ ) (atviros rodyklės). (K-P) Myc DCas per didelė ekspresija visuose neuronuose, naudojant pan-neuroną ELAV-GAL4 vairuotojas dramatiškai veikia CNS ašines trajektorijas. Buvo ištirti trys skirtingi „Myc DCas“ ekspresijos lygiai: per didelė ekspresija naudojant vieną abiejų Myc DCas reporteris ir ELAV-GAL4 tvarkyklė (+ 1 lentelė), abiejų abiejų kopijų perraiška Myc DCas ir ELAV-GAL4 (++) ir dviejų abiejų kopijų perteklius Myc DCas ir ELAV-GAL4 aukštesnėje temperatūroje (29°C), kad sukeltų aukštesnius Myc DCas ekspresijos lygius (+++). (KL) Išnagrinėjus CNS aksonus embrionuose, per daug ekspresuojančiuose DCas visuose neuronuose, naudojant žymeklį, žymintį visus komisinius ir išilginius aksonus, BP102 (Seeger ir kt., 1993), pastebimas ryškus skirtumas nuo įprastos į kopėčias panašios CNS aksonų išvaizdos laukinio tipo embrionuose. Dėl negimdinės DCas neuronų ekspresijos atsiranda sutrikusių išilginių jungčių ir nenormalių plyšių, fenotipas yra gana panašus į tą, kuris pastebėtas nesant plyšio receptoriaus žiedinės sankryžos (Robo) arba padidėjus Netrin receptoriaus Frazzled/DCC signalui (Bashaw ir Goodman, 1999 Kidd et al., 1998 Seeger ir kt., 1993). (K) Laukinio tipo embrione aksonai kerta vidurinę liniją priekinėje (A) ir užpakalinėje (P) komisūroje, čia vizualizuojama naudojant BP102 monokloninį antikūną. (L) Per didelė „Myc DCas“ ekspresija visuose neuronuose laukinio tipo fone, naudojant ELAV-GAL4 vairuotojas 29 o C temperatūroje (+++), todėl padidėja ir nenormalus komisinių aksonų (rodyklių) kirtimas, taip pat ploni ir sutrikdyti išilginiai (L) jungtys. (M-P) Fasciclin II ekspresuojančių 1D4 teigiamų CNS išilginių jungčių tyrimas DCas GOF mutantai rodo, kad, kaip ir DCas LOF mutantai, atokiausi 1D4 teigiami išilginiai jungiamieji elementai yra plonesni kai kuriuose segmentuose, nenutrūkstami kituose, o kai kuriais atvejais susilieja su vidurine 1D4 teigiama išilgine dalimi. Be to, mes nustatėme, kad išilginiai sujungimai, kurie paprastai yra tolygiai išdėstyti abiejose CNS vidurio linijos pusėse, dažnai susilieja su šia atstumiančia vidurinės linijos barjera. Mes taip pat pastebėjome, kad vidurinės išilginės jungties aksonai dažnai nukrypo ir persikirto CNS vidurio liniją, taip pat, kad trys išilginiai jungiamosios jungtys kartais susilieja į vieną korpusą. Aksonai taip pat sustojo išilginėse jungtyse ir aksonams išeinant iš ventralinio nervo laido, todėl susiliejo nenormalios iškyšos, besitęsiančios nuo CNS. Todėl, DCas Dėl GOF atsiranda didelių CNS aksonų kelio defektų, kurių dauguma atitinka hiperfasculiaciją. (M-P) Visų pirma, padidėjus „Myc DCas“ (++ arba +++) neuronų ekspresijai, trijų 1D4 teigiamų išilginių jungčių aksonai buvo neįprastai sužavėti vienas kitu. Šie defektai buvo tai, kad trečiosios išilginės jungtys (M, rodyklės) nėra aksonų arba jų nėra, nenormalus ašių kirtimas vidurio linijoje (M, atvira rodyklės galvutė), dideli neįprastai susižavėję aksonų ryšuliai (NO, mažos rodyklės) ir hiperfaskuliuoti aksonai CNS (O, rodyklės galvutė) arba periferijoje (N, P, rodyklės antgaliai). Mastelio juostos: 40 μm A 20 μm B 20 μm C, C, D 6 μm F, F-J 13 μm K, K-L15 μm M, M-P.
Bashaw, G. J. ir Goodman, C. S. (1999). Chimeriniai aksonų valdymo receptoriai: plyšio ir netrino receptorių citoplazminiai domenai nurodo trauką ir atstūmimą. Ląstelė97, 917-926.
Bate, M. (1993). Mezoderma ir jos dariniai. Į Drosophila melanogaster vystymasis, (red. M. Bate ir A. Martinez-Arias), 1013-1090 p. „Cold Spring Harbor“, Niujorkas: „Cold Spring Harbor Press“.
Brower, D. L., Bunch, T. A., Mukai, L., Adamson, T. E., Wehrli, M., Lam, S., Friedlander, E., Roote, C. E. ir Zusman, S. (1995). Nelygiaverčiai reikalavimai PS1 ir PS2 integrinui prie Drosophila ląstelių prijungimo: alfa PS1 integrino subvieneto genetinė analizė. Vystymasis121, 1311-1320.
Colville, T., Hingorani, R., Flores-Saaib, R., Kosman, D., Bier, E., Campos, R., Wilson, M., Stall, A. ir Voland, J. R. Proteomikos metodas, skirtas nustatyti specifinius kryžmiškai reaktyvius anti-žmogaus antikūnus prieš Drosophila baltymus. www.bdbioscience.com/pdf/kitas/991A.pdf.
Doe, C. Q., Smouse, D. ir Goodman, C. S. (1988). Neuronų likimo kontrolė Drosophila segmentacijos genu buvo net praleista. Gamta333, 376-378.
Hoang, B. ir Chiba, A. (1998). Genetinė integrino vaidmens analizė atliekant aksonų nukreipimą Drosophila. J. Neurosci.18, 7847-7855.
Kidd, T., Brose, K., Mitchell, K. J., Fetter, R. D., Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. ir Tear, G. (1998). Žiedinė sankryža kontroliuoja aksonų kirtimą per CNS vidurinę liniją ir apibrėžia naują evoliuciškai konservuotų orientacinių receptorių pošeimį. Ląstelė92, 205-215.
Kiehart, D. P. ir Feghali, R. (1986). Citoplazminis miozinas iš Drosophila melanogaster. J. Cell Biol.103, 1517-1525.
Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M. ir Bate, M. (1997). Drosophila embrioninių pilvo motorinių neuronų kilmė, vieta ir projekcijos. J. Neurosci.17, 9642-9655.
Landgraf, M., Roy, S., Prokop, A., VijayRaghavan, K. ir Bate, M. (1999). lygiai praleistas lemia Drosophila motorinių aksonų dorsalinį augimą. Neuronas22, 43-52.
Leptin, M., Bogaert, T., Lehmann, R. ir Wilcox, M. (1989). PS integrinų funkcija Drosophila embriogenezės metu. Ląstelė56, 401-408.
Miller, C. A. ir Benzer, S. (1983). Monokloninių antikūnų kryžminės reakcijos tarp Drosophila ir žmogaus smegenų. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV80, 7641-7645.
Patel, N. H., Schafer, B., Goodman, C. S. ir Holmgren, R. (1989). Segmentų poliškumo genų vaidmuo Drosophila neurogenezės metu. Genes Dev.3, 890-904.
Prokop, A., Martin-Bermudo, M. D., Bate, M. ir Brown, N. H. (1998). PS integrinų ar laminino A nebuvimas turi įtakos tarpląsteliniam ademijos sukibimui, bet ne tarpląsteliniam susiliejimui, hemiadherenams ir neuromuskulinėms jungtims Drosophila embrionuose. Dev. Biol.196, 58-76.
Qian, X., Riccio, A., Zhang, Y. ir Ginty, D. D. (1998). Naujų Trk receptorių substratų identifikavimas ir apibūdinimas besivystančiuose neuronuose. Neuronas21, 1017-1029.
Roote, C. E. ir Zusmanas, S. (1995). PS integrinų funkcijos, susijusios su audinių sukibimu, migracija ir formos pokyčiais ankstyvo embriono vystymosi metu Drosophila. Dev. Biol.169, 322-36.
Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco ir Goodman, C. S. (1993). Mutacijos, turinčios įtakos Drosophila augimo kūgio valdymui: genai, reikalingi nukreipti link vidurinės linijos arba nuo jos. Neuronas10, 409-426.
Terman, J. R., Wang, X. M. ir Martin, G. F. (2000). Perpjautų nugaros smegenų taisymas įvairiais vystymosi etapais Šiaurės Amerikos oposume Didelphis virginiana. Brain Res. Bull.53, 845-855.
Thor, S., Andersson, S. G., Tomlinson, A. ir Thomas, J. B. (1999). LIM-homeodomain kombinatorinis kodas, skirtas pasirinkti motorneurono kelią. Gamta397, 76-80.
Wrightas, T. R. F. (1969). Embrioninio mutanto mirtino miosferoido fenogenetika D. melanogaster. J. Exp. Zoolas.143, 77-99.