Informacija

Namų darbų problemos - Literatūros mokymosi modulis Fermentų slopinimas - KAT: RAKTAS - Biologija

Namų darbų problemos - Literatūros mokymosi modulis Fermentų slopinimas - KAT: RAKTAS - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tyrimo dokumentas: Šie klausimai yra pagrįsti šio straipsnio duomenimis, grafikais ir skaičiais: Naftochinono sukeltas lizino acetiltransferazės KAT3B/p300 slopinimas, netoksiškų inhibitorių sintezės pagrindas. doi: 10.1074/jbc.M113.486522

FONAS

Dviguba DNR yra polianionas, nes kiekvienas stuburo fosfatas yra neigiamai įkrautas. Norėdami supakuoti jį į branduolio chromosomą, DNR yra kompleksuojama su įvairiais baltymais. Pirmajame pakavimo etape DNR apvyniojama aplink teigiamai įkrautų histonų baltymo šerdį, suformuojant nukleozomą. Nukleozomos dydis yra maždaug RNR polimerazės dydžio.

Nukleosoma: Jmol14 (Java) | „JSMol“ (HTML5)

A. Kad RNR polimerazė transkribuotų DNR, supakuotą į nukleozomą, kas gali atsitikti su nukleozomų kompleksu?

DNR turi atsiskleisti nuo tuometinės nukleozomos histono šerdies, kad būtų galima susieti transkripcijos faktorius ir galiausiai RNR polimerazę prie DNR reguliuojančių regionų (promotoriaus ir kt.). Priešingu atveju nuo DNR priklausanti RNR polimerizacija neįvyks.

B. Ląstelės fenotipas priklauso nuo ląstelės DNR sekos ir tos ląstelės ekspresuojamų genų pogrupio. Atsiradusi epigenetikos sritis apibūdina, kaip kiti veiksniai nei DNR seka kontroliuoja ląstelių fenotipą ir bruožų paveldimumą. Pagrindiniai genų transkripcijos epigenetinio reguliavimo bruožai yra chromatino pertvarkymas, pakavimas ir kovalentinis DNR modifikavimas. Chromatino pakavimas DNR lygiu: histono sąveika yra labai svarbi. Šių sąveikų pagrindas yra kovalentinio lizino (K) šoninių baltymų modifikavimo būsena, kurią sukelia histono acetilazės (HAT), kurios dar vadinamos lizino acetilazės (KAT) ir histono deacetilazės (HDAC). Žemiau parodytos dvi cheminės lizino šoninių grandinių modifikacijos histonuose.

a. Pateikite cheminį paaiškinimą, kodėl b struktūra nebus acetilinama KAT.

Lys epsilon amino grupė veikia kaip nukleofilas, kai užpuolė acetilo CoA elektrofilinį karbonilą C. Protonuotas aminas nėra nukleofilinis.

b. Kas gali turėti įtakos histono lizino šoninių grandinių KAT modifikacijai DNR transkripcijos kompetencijai nukleosomose?

Lys pKa vandeniniame tirpale yra apie 9,0. Baltyme jis gali skirtis nuo to, bet esant fiziologiniam pH, jis daugiausia būtų protonuotas su teigiamu krūviu. Acetilinimo metu histono Lys šoninės grandinės prarastų bet kokį teigiamą krūvį, susilpnindamos kuloninę sąveiką su DNR, o tai paskatintų DNR atsiskyrimą nuo nukleosomos histono šerdies. Tai padidintų DNR transkripcijos kompetenciją.

1,4-naftochinono dariniai yra natūraliai esantys junginiai, esantys Plumbago ir Diospyros augalų gentyse ir turintys įvairią biologinę veiklą. Vienas iš tokių darinių, plumbaginas, yra stiprus tam tikros lizino acetiltransferazės, KAT p300 lizino acetiltransferazių 3B/3A (p300/CBP), stiprus inhibitorius. Kai kurie inhibitoriai yra toksiški ląstelėms, nes jie reaguoja su laisvomis RSH grupėmis ląstelėse ir sukuria reaktyvias deguonies rūšis (ROS). Idealus vaistas būtų netoksiškas ir veiksmingas konkretaus fermento inhibitorius / aktyvatorius. Tyrėjai susintetino plumbagino darinį (PTK1), kuris slopina p300 ir pasižymi daug mažesniu to plumbagino toksiškumu. Kaip tai veikia?

1A pav.: Norėdami ištirti plumbagino toksiškumą, tyrėjai ištirpino jį tirpiklyje DMSO + N-acetilcisteinas (NAC), kuris sugeria ROS. Jie pridėjo šiuos reagentus prie trijų skirtingų žmogaus ląstelių linijų, SHSY-5Y, HEK293 ir HeLa S3, kaip parodyta žemiau.

a. Kokį poveikį plumbaginas padarė toksiškumui ląstelėms?

Plumbagino pridėjimas prie ląstelių (2 eilutė) aiškiai keičia ląstelių morfologiją, savybes ir skaičių. Galima daryti išvadą, kad tai sukelia ląstelių mirtį.

b. Kokį poveikį NAC turėjo plumbagino ląstelių poveikį?

Iš 1A paveikslo C eilutės aišku, kad NAC apsaugo nuo plumbagino citotoksinio poveikio arba trukdo jam.

c. Ką tyrėjai atliko tik DMSO?

Prieš dedant į ląsteles, plumbaginas buvo ištirpintas DMSO. Norėdami nustatyti bet kokį pastebėtą ląstelių poveikį, kuris nebuvo kilęs iš DMSO, jie atliko šį eksperimentą. Šiame eksperimente kontrolė buvo DMSO, „transporto priemonė“, kuri nešė vaistą.

1B pav. Įrodyta, kad dėl DNR oksidacinio pažeidimo ar pertraukų vienas iš histonų H2AX yra fosforilinamas kinazės pI3K. Ląstelės buvo apdorotos taip, kaip aprašyta toliau (Plu = plumbaginas_ ir atliekama SDS-poliakrilamido gelio elektroforezė. Po elektroforezės ant viršaus buvo uždėta nitroceliuliozės membrana, o gelyje esantys baltymai elektroforezuojami į membraną (metodas, vadinamas Western blotting. Atskiras baltymas juosta buvo vizualizuota pridedant antikūnus, atpažįstančius fosforilintą H2AXg arba histoną H3 (be pakeitimų), po to reagentus, kurie sukuria tamsią juostą.

Kai Plumbagin buvo pridėta prie ląstelių be NAC (raudonos dėžutės juostos), buvo stiprus H2AX gama fosforilinimas. Pridėjus NAC, buvo išvengta fosforilinimo, kuris atsirado su Plu, nesant NAC. Trečioji eilutė yra kita kontrolė, užtikrinanti, kad tas pats mėginių kiekis buvo pakrautas į gelį. Tikimasi, kad per trumpą eksperimento laiką H3 nepasikeis.

1C pav. Kokį poveikį plumbaginas turėjo histono acetilinimui? Imunoblotai buvo atlikti po gydymo plumbaginu, esant arba nesant NAC nurodytose ląstelių linijose, kaip nurodyta aukščiau, naudojant antikūnus, atpažįstančius acetilintą Lys 9 ant H3 (H3K9) arba histoną H3 (be modifikacijos). Ar Plu slopina H3K9 acetilinimą? Kaip NAC veikia Plumbagin poveikį acetilinimui?

Atrodo, kad Plu sumažina juostų intensyvumą, kai pridedamas be NAC. Tai rodo, kad Plu tam tikru mechanizmu slopina H3K9 acetilinimą. Kaip ir ankstesniame eksperimente, atrodė, kad NAC visiškai prieštarauja Plu poveikiui, nes jis neleido Plu mažinti acetilinimo (palyginkite raudonas ir žalias dėžes). NAC slopino Plu slopinamąjį poveikį H3K9 acetilinimui.

1D pav. Kitas H3K9 acetilinimo inhibitorius, izgarcinolis (IsoGar), buvo tiriamas naudojant Western blotting metodą. Ar NAC turėjo tokį patį poveikį ląstelių, apdorotų IsoGAr, H3K9 acetilinimui, kaip ir Plu, parodyta 1C paveiksle?

PATARIMAS | ANS

Priešingai nei Blumgartin, kitas inhibitorius IsoGar aiškiai slopina H3K9 acetilinimą, tačiau NAC šio slopinimo nepanaikina (žr. toliau pateiktas raudonas juosteles).

Atrodo, kad NAC elgiasi skirtingai, kai yra du acetilinimo inhibitoriai. Šie rezultatai suteikia dvi jo poveikio galimybes. • ROS gali sumažinti histonų acetilinimą, o NAC, mažindamas ROS, atstatyti acetilinimą. • Arba plumbaginas reaguoja su NAC RSH, o tai sumažina jo poveikį KAT ir atkuria acetilinimą.

Nubraižykite animacinių filmų modelius, kurie atspindėtų šiuos du skirtingus scenarijus, naudodami liniją su rodykle, nurodančią veiklos aktyvavimą ar skatinimą, ir liniją su buku galu, rodančiu slopinimą. Taip pat naudokite šiuos simbolius:

Tyrėjai nenustatė, kad ROS padidėtų naudojant išgrynintą KAT ląstelėje, kurioje nėra in vitro, laisvųjų radikalų. Kuris iš jūsų modelių yra labiau tikėtinas?

Aukščiau pateiktas B modelis, nes A modelis padidintų ROS, pvz., Peroksidą ar superoksidą


2AB pav. Norėdami supaprastinti šių poveikių tyrimą, tyrėjai atliko in vitro (be ląstelių) tyrimai, kurių metu nebūtų gaminamas ROS (superoksidas, vandenilio peroksidas). Jie ištyrė du skirtingus KAT, p300 (A) ir CBP (B), naudodami HeLa ląstelių šerdies histonus, su 100 μm plumbaginu (5–7 juostos A ir B), esant arba nesant NAC, DTT ir kito redukuojančio agento Trolox (8 juosta). Kokia NAC ir DTT dalis atrodo svarbi jų poveikiui plumbagino slopinimui.

5 ir 7 juostos bei 5 ir 8 juostos rodo, kad tiek NAC, tiek DTT (abiejuose yra tiolių) mažina blumbagino slopinamąjį poveikį KAT aktyvumui. 5 ir 8 juostos rodo, kad Trolox, kuris neturi tiolio grupės, nepalengvina blumbagino slopinimo.


3A pav. Šie duomenys rodo cheminę NAC ir DTT reakciją su plumgartinu. Bendra 1,4-naftochinono darinių struktūra, įskaitant plumgartiną, parodyta žemiau kartu su NAC ir DTT.

3B pav.; Tiolio grupė NAC greičiausiai reaguos su sp2 C, galiausiai sukuriant produktą, kuris, jei įmanoma, išlaiko konjugaciją. Nubraižykite mechanizmą, rodantį, kaip NAC gali reaguoti su toliau pateikta struktūra, ir parodykite galutinius produktus.


4 A pav. Buvo išbandyti įvairūs 1,4-naftochinono dariniai, siekiant išsiaiškinti jų poveikį p300 aktyvumui, esant ir nesant NAC. Viena, įstatymas, kurio struktūra pateikta žemiau, neparodė slopinančio poveikio, kaip parodyta žemiau. Pateikite tikėtiną šio stebėjimo cheminį paaiškinimą.

Lawsone gali egzistuoti šiomis tautomerinėmis formomis, todėl greičiausiai nereaguos su tioliu C3.

4C pav. Jei jie reaguoja su laisvais tioliais, naftochinono dariniai turėtų turėti įtakos laisvųjų tiolių koncentracijai in vitro tyrimuose. Vieno tokio tyrimo rezultatai pateikti žemiau.

Palyginkite šį grafiką su toliau pateiktu grafiku. Kokią išvadą galite padaryti?

Lawson, kaip prognozuojama iš jo struktūros, nereaguoja su tioliais, todėl negali reaguoti su plumbaginu.


5 pav (neparodyta): Autoriai naudojo UV-Vis ir fluorescencinę spektroskopiją, kad ištirtų NAC poveikį 1,4-naftochinono analogų spektrams. Kokį tikėtiną poveikį tikėtumėte pastebėti teisės aktų spektre?

Nėra, nes Lawsone nereaguoja su tiolio turinčiu NAC


6A pav. Galutinis tyrėjų tikslas buvo sukurti 1,4-naftochinono darinį, kuris nebūtų citotoksinis, o tai tikriausiai atsiranda dėl jo sąveikos su laisvais tioliais. Jie sintezavo PTK1, kaip parodyta žemiau. Kodėl ši reakcija sukurtų potencialų inhibitorių, kuris nereagavo su laisvaisiais toliais ląstelėse?

Jis turi metilą C3, kuris slopintų jo reakciją su laisvaisiais tioliais

6B PAVEIKSLAS. Tyrėjai ištyrė PTK1 poveikį HeLa šerdies histonų P300 acetilinimui su skirtingomis PTK1 koncentracijomis, jei nebuvo ir nebuvo NAC (B pav.), Taip pat laisvo tiolio buvimą esant arba be PTK1 (C pav.).

Ką galite padaryti iš šių grafikų?

Kaip ir tikėtasi, PTIK1 slopina P300 acetilinimą be NAC pridėjimo poveikio.

6D pav. Toliau pateiktame paveikslėlyje parodytas UV spindulių matomas PTK1 absorbcijos spektras, esant arba nesant NAC?

Kokias išvadas galite padaryti?

PTK1 nereaguoja su NAC, kaip tikėtasi.

6E pav. Toliau pateiktame paveikslėlyje parodyta ląstelių lizatų imunoblotinė analizė (IB) po 24 valandų apdorojimo PTK1 naudojant H3K9 acetilinimo antikūnus. Naudojamos PTK1 koncentracijos nurodytos E paveiksle. Klaidų juostos, S.D. Kokias išvadas galite padaryti iš dėmių?

PTK1 veikia kaip stiprus H3K9 acetilinimo inhibitorius in vivo.


7. Kaip PTK1 gali slopinti p300 KAT aktyvumą. Fermento kinetinė analizė būtų naudinga. Fermentas turi du substitus - acetil -CoA ir histonus. Ankstesni tyrimai parodė, kad substratai jungiasi prie p300 pagal užsakytą mechanizmą. Nekonkurencinis inhibitorius PTK1 gali prisijungti prie laisvo fermento, taip pat prie substrato surištos formos, todėl gali atsirasti nutraukiamas trivietis kompleksas. T

Tarkime, kad grįžtamasis inhibitorių elgesys buvo panašus į vieno ir kelių substratų reakcijas. Štai keletas paprastų taisyklių, taikomų dvigubiems abipusiams brėžiniams (1/v vs 1/[S}), kai 1 substratas yra pastovus:

Nuolydis keičiasi, kai:

  • I ir S jungiasi prie tos pačios fermento formos (pavyzdžiui, E suriša ir S, ir I) OR
  • Aš susieju su E forma (horizontalioje linijoje), kuri yra prijungta prie formos, kurią suriša S, ir aš pirmiausia surišu (pavyzdžiui, aš susieju su E, o paskui - S).

Y perėmimas pasikeičia, kai:

  • I ir S jungiasi su skirtingomis fermento formomis, nebent aš pirmiausia jungiuosi, o I ir S jungiasi greitai.

7 paveikslas AB: 7 A ir B paveiksluose pavaizduoti p300 KAT dvigubi abipusiai arba „Lineweaver-Burk“ brėžiniai (1/v prieš 1/[S]), kai vienas substratas yra fiksuotas, o kitas kinta esant skirtingai fiksuotai inhibitoriaus PTK1 koncentracijai.

  • 7A paveiksle šerdies histonų koncentracija buvo pastovi 1,7 μm, tuo pačiu didinant pažymėto izotopo koncentraciją [3H]acetil-CoA nuo 1 iki 8 μm, kai PTK1 nėra (jokio inhibitoriaus) arba jo koncentracija didėja (15, 20, 25, 35 ir 45 μm). Inhibitorių koncentracijos didėjimo kryptis rodoma raudona rodykle.
  • 7B paveiksle: p300 KAT aktyvumo slopinimas PTK1 buvo tiriamas esant fiksuotai [3H] acetil-CoA (1,6 μm) ir didėjančios šerdies histonų koncentracijos (5–70 nm), jei nėra (nėra inhibitoriaus) arba didėja PTK1 koncentracija (15, 20, 25, 35 ir 45 μm).

Pagal analogiją su vieno substrato reakcijomis, parodytomis toliau pateiktose susietose cheminėse lygtyse, kokio tipo slopinimą rodo PTK1?

Atrodo, kad tai nekonkurencinis kiekvieno substrato slopinimas. Vieno substrato fermento nekonkurenciniam slopinimui būdingi dvigubai abipusiai brėžiniai, kurie skiriasi nuolydžiu ir susikerta x ašyje. Tai pasakytina, kad inhibitorius nekeičia Km, bet tariamas Vm sumažėja. Ši analizė yra šiek tiek supaprastinta.


Žiūrėti video įrašą: მთაწმინდის მთვარე (Sausis 2023).