Informacija

Branduolinės transfekcijos metodai – branduolinis transportavimas

Branduolinės transfekcijos metodai – branduolinis transportavimas

We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

af vY My xq wC hE mk cl qU al Li Xm fu SP yv We

Skaitau ENCODE darbus, o tai mane gerokai išmuša iš komforto zonos šiuolaikinių laboratorinių metodų požiūriu. Rizikuodamas užduoti klausimą, į kurį gali būti nuodugniai atsakyta kur nors kitur internete, tikėjausi trumpo paaiškinimo apie branduolinę transfekciją.

Whiteld ir kt., jie aprašo tiesioginį transkripcijos faktoriaus surišimo vietos veiksmingumo žmogaus ląstelėse tyrimą. Norėdami tai padaryti, jie transfekuoja luciferazės plazmidę, tikriausiai į ląstelės branduolį (nes vėliau jie pastebi, kad luciferazės plazmidė yra transkribuota).

Perskaitę medžiagas ir metodus ir patekę į papildomą failą, jie atskleidė savo transfekcijos protokolą. Atrodo, kad svarbūs reagentai yra šie:

FuGene 6

neliposominė kompozicija, skirta plazmidės DNR transfekuoti į įvairias ląstelių linijas, pasižyminčias dideliu efektyvumu ir mažu toksiškumu.

(Iš Promega svetainės.)

Lipofektaminas LTX

efektyvus reagentas plazmidės tiekimui ir baltymų ekspresijai

(Iš „Invitrogen“ svetainės.)

PLUS reagentas

PLUS™ reagentas naudojamas kartu su transfekcijos reagentais, tokiais kaip Lipofectamine™, siekiant sustiprinti transfekciją prilipusiose ląstelių linijose.

(Iš „Invitrogen“ svetainės.)

Matyt, protokolas yra sujungti DNR plazmidę su transfekcijos reagentu, palaukti kelias minutes, tada pridėti ląstelių ir inkubuoti 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Tai viskas, ko reikia, kad plazmidė patektų į branduolį.

Pasikonsultavau su Wikipedia ir Strachan bei Read's Human Molecular Genetics 4-uoju leidimu, bet negalėjau atsakyti į savo klausimą apie šią techniką.

Manau, kad aš gana aiškiai suprantu, kaip šie reagentai gali prasiskverbti pro ląstelės lipidų membraną, bet aš nelabai suprantu kaip po to DNR pereina į branduolį.

Human Molecular Genetics 4-ajame leidime galiu rasti tik vieną pastraipą apie plazmidės perkėlimą per branduolinę membraną, 704 psl.: „Plazmidinės DNR pernešimas į nesidalijančių ląstelių branduolį yra labai neefektyvus, nes plazmidinė DNR dažnai negali patekti į branduolinės membranos poras. Įvairūs metodai gali būti naudojami siekiant palengvinti branduolio patekimą, pavyzdžiui, konjuguoti specifines DNR sekas arba baltymų sekas (branduolinės lokalizacijos sekas), kurios, kaip žinoma, palengvina branduolio patekimą, arba sutankinti DNR iki pakankamai mažo dydžio, kad galėtų praeiti pro branduolio poras.

Tačiau Whiteld et. medžiagų ir metodų skyriuje nieko nėra. visose minima bet kuri iš šių technikų. Esu tikras, kad jie būtų minėję, jei jų plazmidėje būtų DNR konjugacijos seka, taigi taip negali būti. Galbūt šie reagentai netiesiogiai apima tam tikrą DNR tankinimo polikaciją, pvz., PEG-CK30?

Ar citoplazma nėra itin priešiška vieta DNR plazmidėms? Ar jie neturėtų tiesiog blaškytis citoplazmoje, kol bus suvirškinti?

O galbūt šie vektoriai prasiskverbia į branduolį mitozės metu? (Tai teorija, kuri man ką tik kilo svarstant Strachano citatoje pateiktą „neskirstymo“ kvalifikaciją.)

Kadangi šis klausimas dokumente nėra nagrinėjamas, galiu tik manyti, kad atsakymas yra elementarus ir tai, ką turėtų žinoti profesionalus ląstelių biologas. Man pritrūko akivaizdžių tolesnių žingsnių atsakymui rasti, todėl iš anksto atsiprašau, kad jo paklausiau.


Mano bandymas rasti atsakymą rodo, kad niekas nežino, kaip DNR patenka į branduolį.

Šiame gana neseniai pateiktame dokumente pranešama apie bandymus sekti DNR patekimo ir perdavimo į branduolį kelią.

Le Bihanas ir kt. (2010) Katijoninių lipidų/DNR lipopleksų veikimo mechanizmo in vitro tyrimas nanometriniu mastu. Nucl. Acids Res. 39:1595-1609

Naudota technika buvo perdavimo elektronų mikroskopija. Plazmidinės DNR + katijoninių lipidų (lipopleksų) kompleksai buvo pažymėti silicio dioksido pagrindu pagamintomis nanodalelėmis, kad būtų galima vizualizuoti.

Autoriai aprašo transfekcijos kelią su penkiais etapais:

(i) lipopleksų prisijungimą prie ląstelės paviršiaus;
ii) lipopleksai patenka į ląsteles daugiausia endocitozės būdu (negalima atmesti tiesioginio susiliejimo su ląstelės membrana);
(iii) DNR išsiskyrimas į citozolį;
(iv) pernešimas per citozolį; ir
v) DNR patekimas į branduolį ir branduolio transkripcija.

Autoriai galėjo atlikti kiekvieną iš pirmųjų keturių žingsnių, bet:

mūsų duomenys rodo, kad nanodalelės yra arti branduolio, bet ne jo viduje.

Jie spėlioja, ką tai gali reikšti, tačiau nesiremia jokiais anksčiau paskelbtais duomenimis. Mano išvada, kad atsakymas į jūsų klausimą yra toks, kaip sakiau savo atsakymo pradžioje: niekas nežino, kaip transfekuota DNR patenka į branduolį.


Zabneris ir kt (J. Biol. Chem., 1995, 270, 18997-19007) stebėjo lipidų-DNR komplekso susidarymą ir įsisavinimą, kuris, kaip nustatyta, daugiausia vyksta dėl endocitozės. Dot blot eksperimentas rodo, kad ląstelės (50 % populiacijos) užėmė 60 % DNR. Pastebėta, kad DNR ir baltymų kompleksas nusėdo perinuklearinėje citoplazmoje ir sudarė reguliariai supakuotų kanalėlių seriją. Jie taip pat patikrino, ar endosomos, turinčios kompleksą, nesusiliejo su lizosoma.

Dalis DNR išeina iš endosomos (tai yra žinomas mechanizmas, padidinantis endocitoze pagrįstų transfekcijų efektyvumą) ir gali būti perimtas branduolyje. Kai jie lygino reporterio geno ekspresiją tiesiogiai suleidus į branduolį ir tiesiogiai suleidus į citoplazmą, pastarojoje ekspresijos nepastebėta (pagal Capecchi (Cell, 1980), raiškos santykis yra apie 1000:1. PDF galima rasti Jutos universiteto svetainėje). Tai reiškia, kad DNR pasisavinimas iš citoplazmos branduolyje yra labai neefektyvus.
Mažesnis lipidų kiekis baltymo-DNR komplekse padidina efektyvumą.

Jūsų klausimas buvo iš dalies atsakytas. Kaip visa ta DNR ląstelė patenka į branduolį? Dažniausiai taip nėra. Jis kaupiasi aplink branduolį. Tačiau dalį laisvos DNR pasiima branduolys. Tai tikriausiai buvo Deano grupės atspirties taškas.

Vaughanas ir dekanas (Mol.Ther., 2006, 13(2) 422-428) pasiūlė, kad plazmidės būtų transportuojamos į branduolį su mikrotubulu susijusio motorinio baltymo Dynein pagalba. Jie pastebėjo, kad mikrotubulų tinklo funkcionalumo sutrikimas slopina ekspresiją. Kai plazmidės buvo švirkščiamos tiesiai į ląstelių branduolius, tai neturėjo jokio poveikio. Dabar mikrovamzdeliai transportuoja medžiagas motorinių baltymų pagalba, iš kurių Dynein transportuoja daiktus į branduolį. Pastebėta, kad Dynein veikimo slopinimas sumažino ekspresiją. Dynino prisijungimo prie plazmidės mechanizmas nežinomas. (Dirbau su dyneinu; tai sudėtinga, kai kalbama apie surišimo mechanizmus. Visas neigiamo krūvio N terminalas yra netvarkingas.)
Jei perskaitytumėte šio straipsnio diskusiją, paaiškėtų, kad procesas yra chaotiškas. Kuo daugiau DNR pasiskirsto citoplazmoje aplink branduolį, tuo daugiau jos pasisavina branduolys.

Čia nėra branduolinės lokalizacijos signalo. Mesika ir kt (Human Gene Ther., 2005) padidino plazmidės ekspresijos efektyvumą, surišdami plazmides prie baltymo su NLS. Tai nėra natūralus procesas. Vaughanas ir Deanas spėliojo, kad DNR taikymo seka (pvz. SV40, CMV ir kt.) jungiasi prie baltymų, turinčių NLS arba turinčius adapterius, jungiančius dyneiną (pvz., transkripcijos faktorius), kurie gali padėti plazmidei įsisavinti branduolį. Tai taip pat gali paaiškinti seka pagrįstą skirtingą plazmidžių įsisavinimą. Nė vienas iš šių mechanizmų nebuvo eksperimentiškai patikrintas.

[Aš irgi tuo domėjausi. Įkyrėjau daug senjorų ir ieškojau atsakymų internete. Ir tada radau šį klausimą. Ačiū kad klausiate]


Tai klausimas, kuris retkarčiais iškyla, kai doktorantai ar podoktorantai aptaria transfekciją. Tikėtinas atsakymas, kuriam neturiu patvirtinančios literatūros, yra toks: jei terpėje yra transfekcijos kompleksas, kai ląstelės dalijasi, gali būti, kad jos gali patekti į branduolį po mitozės, kai branduolinė membrana vis dar formuojasi. tai prieiga prie transkripcijos mechanizmo branduolyje.


DNR transfekcija

Pagrindiniai žodžiai

Svetimų DNR molekulių įvedimas į kultivuojamas ląsteles.

Taikymas pagal genus

Geno modifikavimas specifiniu ir kryptingu būdu per homologinę rekombinaciją su DNR segmentu. Galimas pritaikymas apima genų ekspresijos pašalinimą arba geno mutacijos korekciją.

Homologinė rekombinacija

Vieno DNR segmento pakeitimas kitu, remiantis tikslia arba artima jų tapatybe.

Neigiamas pasirinkimas

Augimo sąlygų taikymas, pašalinantis tas ląsteles, kurios ekspresuoja atrankos žymenį.

Teigiamas pasirinkimas

Specifinių augimo sąlygų taikymas, dėl kurio selektyviai pašalinamos ląstelės, kuriose nėra egzogeninio genetinio elemento (selekcijos žymeklio), suteikiančio atsparumą.

RNR trukdžiai (RNAi)

Genų funkcijos po transkripcijos sumažinimo procesas, naudojant nekoduojančias RNR molekules, tokias kaip maža trukdanti RNR (siRNR).

Stabili transfekcija

Transfekcija, kai svetima DNR yra įtraukta į šeimininko genomą, sukuriant ilgalaikę genetinę modifikaciją.

Laikinoji transfekcija

Transfekcija, kai plazmidinė DNR nėra fiziškai įtraukta į genomą ir yra išlaikoma kaip epizoma, sukurianti trumpalaikę svetimos DNR geno ekspresiją.


SĖKMINGAS PRISTATYMAS.

įtakos turi keli bendri veiksniai. nukleino rūgšties tipas ir tikslinė ląstelė. ląstelių tankis, susiliejimas ir perėjimo skaičius.

Laiko juosta 1982 m. Buvo sukurtas alternatyvus nukleino rūgščių pristatymo į sunkiai transfekuojamas ląsteles metodas, pagrįstas elektros krūvio naudojimu nukleino rūgščiai tiekti į ląsteles. Elektroporacija remiasi elektriniu lauku, kad laikinai padidintų ląstelių pralaidumą, reiškinį, vadinamą elektropermeabilizacija . Pirmąjį elektroporacijos panaudojimą DNR pristatymui 1982 m. Pademonstravo Eberhardas Neumannas. Neumann ir rsquos darbas parodė, kad tam tikro lauko stiprumo elektriniai impulsai paskatino DNR prasiskverbimą per ląstelės membraną ir kaupimąsi ląstelėje. Elektroporacija pasirodė esanti labai veiksminga tiekiant nukleino rūgštis į įvairias ląsteles, įskaitant sunkiai transfekuojamas ląsteles. Tačiau elektrinio lauko naudojimas sukelia didelį citotoksiškumą. Nepaisant šio apribojimo, elektroporacija yra veiksmingas būdas tiekti nukleino rūgštis į ląsteles, kurios yra atsparios cheminei transfekcijai, ir į pirmines ląsteles, kurios aktyviai nesidalija.

Nors elektroporacija gali būti labai veiksminga transfekcijos priemonė, cheminės transfekcijos priemonės buvo išplėstos, siekiant suteikti alternatyvą nepageidaujamam viruso transdukcijos poveikiui ir toksiškam, daug laiko reikalaujančiam elektroporacijos pobūdžiui. Kadangi cheminis tiekimas paprastai priklauso nuo elektrostatinės sąveikos tarp katijoninių junginių ir neigiamai įkrauto nukleorūgščių pagrindo, transfekcijos reagentai paprastai yra sudaryti iš katijoninių lipidų ir (arba) katijoninių polimerų, kurie sudaro elektrostatinius kompleksus su nukleino rūgštimis.

Ankstyvas pavyzdys, kai transfekcijai buvo naudojami lipidai, yra technika, vadinama lipofekcija, kuri naudoja dirbtinius dvigubus lipidų sluoksnius, žinomus kaip liposomos, sukurtos naudojant katijoninius ir pagalbinius lipidus, kad padėtų nukleorūgštims patekti į ląsteles . Katijoniniai lipidai (lipidai su teigiamai įkrautomis galvos grupėmis) gali susijungti atskirai arba su neutraliais arba pagalbiniais lipidais, sudarydami mažas vienasluoksnes pūsleles. DNR gali spontaniškai sąveikauti su šiomis pūslelėmis, sudarydama lipidų-DNR kompleksus iš teigiamai įkrautos katijoninio lipido grupės su neigiamai įkrautomis fosfatų grupėmis DNR.

Lipofekcija yra veiksmingas genų pristatymo būdas įvairiems ląstelių tipams, tačiau šis metodas dažnai siejamas su dideliu toksiškumu ląstelėms. Liposominės kompozicijos taip pat gali būti nestabilios terpėje, kurioje yra serumo, kuris paprastai reikalingas produktyviam ląstelių augimui. Ištyrus mažiau toksiškus genų pristatymo būdus, buvo naudojami kiti cheminiai metodai, kurie sumažina nepageidaujamą citotoksinį poveikį ir savo ruožtu padidino nukleorūgščių tiekimo sėkmę.

Arba katijoniniai polimerai gali sudaryti nukleino rūgšties ir polimero kompleksus (ty polipleksus) per elektrostatinę sąveiką tarp teigiamai įkrauto polimero ir neigiamai įkrautos nukleorūgšties. Ši sąveika tarp polimero polikatijonų, kuriuos sudaro azoto liekanos, ir neigiamai įkrautų nukleorūgšties fosfatų grupių, vadinama N/P santykiu.

Kintantys N/P santykiai gali turėti įtakos kondensacijai nukleorūgšties ir grynojo paviršiaus krūvio arba zeta potencialo. Kondensacija apsaugo nukleino rūgštį nuo skilimo per nukleazes . Grynasis teigiamas zeta potencialas nukreips kompleksą į neigiamai įkrautą ląstelės membraną , kuris veda prie transfekcijos komplekso įsisavinimo ląstelėse per endocitozę.

Siekiant išvengti tarpląstelinio skilimo endocitinėje mašinoje, šie transfekcijos kompleksai turi išeiti iš endosomos ir nukleorūgštį pristatyti į citoplazmą (mRNR, siRNR/miRNR) arba branduolį (plazmidės DNR arba shRNR, jungiančius vektorius). Kadangi citoplazma yra gimtoji RNR molekulių, tokių kaip mRNR/siRNR/miRNR, veikimo vieta, patekimas į citoplazmą užtikrina funkcionalumą, tačiau norint veiksmingai funkcionuoti, plazmidinė DNR turi patekti į branduolį. Aktyviai besidalijančios ląstelės transfekuoja efektyviau nei nesidalijančios ląstelės, nes branduolio apvalkalo skilimas ląstelių dalijimosi metu skatina DNR pernešimą į branduolį. Todėl pirminės ląstelės (t. y. ląstelės, paimtos iš gyvo audinio), kurios aktyviai nesidalija, yra labai nepalankios transfekcijai.

Sėkmingas nukleino rūgščių tiekimas priklauso nuo kelių bendrų veiksnių. Atsižvelgiant į eksperimento pobūdį, kai kurių aspektų keisti negalima (pvz., Nukleorūgšties tipo ir tikslinės ląstelės). Tačiau kitus veiksnius, tokius kaip ląstelių tankis, susiliejimas ir perėjimo skaičius, galima lengviau valdyti, lengvai išbandyti ir optimizuoti, kad būtų padidintas efektyvumas. Papildomi svarstymai apima toksiškumą ląstelėms, netikslinį poveikį ir imunologinius atsakus, kurie gali turėti įtakos eksperimento rezultatams. Pristatymo metodo pobūdis (cheminis ar fizinis) turės didelį poveikį genų ekspresijai dėl pristatymo efektyvumo ir poveikio ląstelių sveikatai bei gyvybingumui. Todėl būtina pasirinkti tokį pristatymo būdą, kuris sukeltų mažiausiai trikdžių.

Tyrimai, skirti didinti transfekcijos efektyvumą, reikalauja išsamių ir išsamių ląstelių biologijos ir ypač tarpląstelinių procesų, turinčių įtakos egzogeninėms nukleino rūgštims, tyrimus. Cheminės transfekcijos atveju šios sąveikos padiktuojamos per ląstelės paviršiuje esančius receptorius, elektrostatinius krūvius tarp katijoninių junginių ir anijoninių membranų komponentų, praėjimą per membraną endosominiais takais ir galutinį pabėgimą iš endosomos, kad būtų išvengta degradacijos prieš pasiekiant atitinkamą tarpląstelinę vietą. .

Įžvalgos, leidžiančios pasiekti didesnį elektroporacijos efektyvumą, apima membranos struktūros supratimą kartu su optimaliais impulsų parametrais kiekvienam unikaliam ląstelių tipui. Be to, siekiant užtikrinti saugų nukleorūgščių patekimą per citozolį ir tarpląstelines pūsleles, reikia apsvarstyti apsaugą nuo hidrolizinių fermentų ir pabėgimą iš endosominių skyrių.

Kadangi ląstelių tipų, kurie yra idealūs tyrimų modeliai, repertuaras ir toliau plečiasi link sunkiai transfekuojamų ląstelių tipų, įskaitant pirmines ląsteles ir kamienines ląsteles, reikia veiksmingesnių nukleorūgščių tiekimo reagentų ir metodų. Šių ląstelių tipų genetinio fono pokyčiai gali imituoti keletą ligų būsenų ir gali būti modeliai nustatant šių ligų mechanizmus. Geresni transfekcijos metodai gali leisti nuodugniai ištirti genų funkciją ir gali tapti žingsniu kelyje į genų terapiją individualizuotoje medicinoje.


RNR apyvarta eukariotuose: specializuotų ir kokybės kontrolės RNR skilimo kelių analizė

Ligang Wu , Joel G. Belasco , Methods in Enzymology , 2008 m.

1 būdas: ląstelių transfekcija plazmidėmis, koduojančiomis reporterį ir miRNR

Optimalūs ląstelių kultūros ir transfekcijos metodai gali labai priklausyti nuo ląstelių linijos ir juos empiriškai turėtų nustatyti tyrėjas. Norint gauti nuoseklius rezultatus, geriausia plazmidės DNR paruošti transfekcijai naudojant plazmidės midi-prep arba maxi-prep rinkinį (pvz., Qiagen HiSpeed ​​Plasmid Midi Kit), o ne plazmidės mini paruošimo rinkinį. Visada kotransfekuokite luciferazės reporterio geną su genu, koduojančiu vidinį standartą (pvz., β-galaktozidazė) ir trūksta miRE, kad būtų galima normalizuoti duomenis.

Naudojant DNR transfekciją norint ištirti miRNR sumažintą reguliavimą, reporterio mRNR ir miRNR gamybos iš transfekuotų genų lygis yra labai svarbus, nes šioms RNR neturi būti leidžiama prisotinti ląstelių mechanizmų, reikalingų miRNR funkcijai. Be to, reporterio geno ekspresijos slopinimo laipsnį turi apriboti miRNR koncentracija ląstelėse. Šių kriterijų atitikties sąlygas galima nustatyti empiriškai, titruojant reporterių ir miRNR koduojančių plazmidžių, naudojamų transfekcijai, kiekius, siekiant nustatyti diapazoną, kuriame reporterio sumažinimo laipsnis (represijų santykis) priklauso nuo miRNR koncentracijos, bet ne. reporterio koncentracija.

Auginkite 293T ląsteles pilnoje auginimo terpėje, kurioje yra penicilino / streptomicino. Vieną dieną prieš transfekciją 293T ląsteles tripsinizuokite ir atskieskite iki 1 × 105 ląstelių/ml pilnoje auginimo terpėje, kurioje nėra antibiotikų. Į kiekvieną 12 šulinėlių plokštelės šulinėlį (22 mm skersmens šulinėliai) padėkite po 1 ml ląstelių, kad ląstelės transfekcijos metu susilietų 30–40 %.

Kiekvienam 12 šulinėlių plokštelės šuliniui atskieskite 1 μg plazmidinės DNR (20 ng luciferazės reporterinės plazmidės, kurioje yra miRE, arba neigiamos kontrolinės plazmidės, kurioje nėra miRE, + 950 ng plazmidės, koduojančios miRNR arba jos delecijos variantą, ne + 30 ng plazmidės, koduojančios β-galaktozidazės) 100 μl Opti-MEM I sumažinto serumo terpės (Invitrogen). Atskieskite 2 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 100 μl Opti-MEM I terpės ir inkubuokite 5 minutes kambario temperatūroje. Atskiestą DNR sumaišykite su praskiestu Lipofectamine 2000, švelniai sumaišykite ir inkubuokite 20 min. Įlašinkite visą DNR-Lipofectamine 2000 mišinio tūrį į ląsteles vienoje 12 šulinėlių plokštelės, kurioje yra visa auginimo terpė, duobutėje. Švelniai pakratykite indą, kad pasiskirstytumėte tolygiai.

Inkubuokite 36–48 valandas 37 °C temperatūroje drėgnoje 5% CO2 inkubatoriuje prieš paimant ląsteles ir atliekant reporterio tyrimus. Pakeiskite augimo terpę, jei reikia ilgesnio auginimo laiko.


Kircheis, R ir kt. Ląstelę surišančių ligandų sujungimas su polietileniminu tiksliniam genų pristatymui. Gene Ther. 4,409–418 (1997).

Boussif, O. ir kt. Universalus vektorius genų ir oligonukleotidų perkėlimui į ląsteles kultūroje ir in vivo: polietileniminas. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 92, 7297–7301 (1995).

Nielsen, P.E., Egholm, M., Koch, T., Christensen, J.B. ir Buchardt, O. Fotolizinis DNR skilimas nitrobenzamido ligandais, sujungtais su 9-aminoakridinais, suteikia DNR polimerazės substratus nuo bangos ilgio priklausančioje reakcijoje. Biologinis junginys. Chem. 2, 57–66 (1991).

Bukrinskis, M.I. & amp; Haffar, O.K. ŽIV-1 branduolio importas: matricos baltymas vėl yra centre, šį kartą kartu su Vpr. Mol. Med. 4, 138–143 (1998).

Knudsenas, H. ir Nielsenas, P.E. Dupleksą ir tripleksą formuojančių PNA antisensinės savybės. Nucleic Acids Res. 24, 494–500 (1996).

Sebestyenas, M.G. ir kt. DNR vektoriaus chemija: kovalentinis signalinių peptidų prijungimas prie plazmidės DNR. Nat. Biotechnol. 16, 80–85 (1998).

Yoneda, Y. ir kt. Ilgas sintetinis peptidas, turintis branduolio lokalizacijos signalą ir su juo besiribojančias SV40 T-antigeno sekas, efektyviai nukreipia IgM transportavimą į branduolį. Exp. Ląstelė. Res. 201, 313–320 (1992).

Zanta, M.A., Belguise-Valladier, P. & Behr, J. Genų pristatymas: pakanka vieno branduolio lokalizacijos signalo peptido, kad perneštų DNR į ląstelės branduolį. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 96, 91–96 (1999).

Mujumdar, R.B., Ernst, L.A., Mujumdar, S.R., Lewis, C.J. & amp. Wagoner, A.S. Cianino dažų žymėjimo reagentai: sulfoindocianino sukcinimidilo esteriai. Biologinis junginys. Chem. 4, 105–111 (1993).

Miyamoto, Y. ir kt. Skirtingi branduolio lokalizacijos signalo (NLS) atpažinimo būdai pagal tris skirtingas NLS receptorių klases. J. Biol. Chem. 272, 26375–26381 (1997).

Michaud, N. & amp Goldfarb, D. S. Dauguma branduolinių baltymų yra importuojami vienu būdu. Exp. Cell Res. 208, 128–136 (1993).

Xiao, C.Y., Hubner, S. & amp; Jans, D.A. SV40 didelio naviko antigeno branduolio importą reguliuoja dvigrandė nuo DNR priklausoma baltymų kinazės vieta (serinas 120), besiribojanti su branduolio lokalizacijos seka. J. Biol. Chem. 272, 22191–22198 (1997).

http://www.pbio.com/cat/synth/pna/pnacycle.htm. PerSeptive Biosystems, Inc., peptidų nukleorūgščių (PNA) sintezė: individuali PNA sintezė.

Judumo poslinkio tyrimas naudojant mažo jonų stiprumo PAGE. Trumpi protokolai molekulinėje biologijoje 2-asis leidimas (red. Ausubel, F.M. ir kt.). 12–5-12–6. 2-asis leidimas Greene Publishing Associates ir John Wiley and Sons, NY. (1992).


Epstein-Barr viruso BFLF2 nukleocitoplazminio transportavimo mechanizmų apibūdinimas

Fonas/tikslai: Epstein-Barr virusas (EBV) BFLF2, herpes simplex viruso 1 (HSV-1) UL31 homologas, yra labai svarbus veiksmingam viruso DNR pakavimui ir pirminiam išėjimui per branduolio membraną. Tačiau mes vis dar nežinome jo tarpląstelinio transportavimo mechanizmų.

Metodai: Tarprūšiniai heterokarionų tyrimai buvo naudojami BFLF2 nukleocitoplazminiam perkėlimui aptikti, o mutacijų analizė, plazmidės transfekcijos ir fluorescencinės mikroskopijos tyrimai buvo atlikti siekiant nustatyti BFLF2 funkcinę branduolio lokalizacijos seką (NLS) ir branduolio eksporto seką (NES) gyvose ląstelėse. Be to, BFLF2 branduolinis importas ir eksportas buvo įvertintas konfokalinės mikroskopijos, bendro imunoprecipitacijos ir imunobloto tyrimais.

Rezultatai: Buvo patvirtinta, kad BFLF2 juda tarp branduolio ir citoplazmos. Buvo įrodyta, kad du numatomi NES yra neveikiantys, tačiau įrodėme, kad BFLF2 branduolinis eksportas buvo tarpininkaujamas per transporterį, susijusį su antigeno apdorojimu (TAP), bet ne nuo chromosomų srities palaikymo 1 (CRM1) priklausomo kelio. Be to, buvo nustatytas vienas funkcinis NLS, 22RRLMHPHHRNYTASKASAH40, o aa22-23, aa22-25, aa28-30 ir aa37-40 vaidino svarbų vaidmenį BFLF2 branduolinėje lokalizacijoje. Be to, BFLF2 branduolinis importas buvo įrodytas naudojant Ran-, importin α7-, importin β1- ir transportin-1 priklausomą mechanizmą, kuriam nereikia importo α1, α3 ir α5.

Išvada: Šie darbai yra svarbūs tolesniam BFLF2 funkcijų tyrimui EBV infekcijos metu, taip pat tolimesnėms įžvalgoms apie naujų antivirusinių vaistų taikinių ir vakcinos nuo EBV kūrimą.

Raktiniai žodžiai: BFLF2 Importin Branduolinio eksporto signalas (NES) Branduolinio lokalizavimo signalas (NLS) Branduolinio transportavimo Ran-GTP.


Genų pristatymo strategijos

Kalcio fosfato transfekcija

The kalcio fosfato metodas DNR transfekcijos yra vienas iš paprasčiausių ir pigiausių cheminio genų pristatymo metodų (11.5 pav.). Šis metodas reikalauja dviejų cheminių tirpalų: kalcio chlorido, kuris yra kalcio jonų šaltinis, ir HEPES buferinio fiziologinio tirpalo (HBS), kuris yra fosfato jonų šaltinis. Pirmiausia kalcio chlorido tirpalas sumaišomas su DNR, kurią reikia transfekuoti, o tada pridedama HBS. Kai abu tirpalai sujungiami, teigiamai įkrauti kalcio jonai ir neigiamai įkrauti fosfato jonai sudaro smulkias nuosėdas. Kalcio jonai taip pat sukelia DNR nuosėdas iš tirpalo. Po kelių minučių tirpalas su nuosėdomis tiesiogiai pridedamas prie kultūros ląstelių. Dėl proceso, kuris nėra visiškai suprantamas, ląstelės paima dalį nuosėdų, o kartu su jomis ir DNR. Manoma, kad DNR nuosėdos į ląsteles patenka endocitozės būdu, tačiau tikslus mechanizmas lieka paslaptimi. Šis metodas geriausiai tinka vieno sluoksnio ląstelėms, kad DNR nuosėdos tolygiai padengtų ląsteles.

11.5 pav. Kalcio fosfato transfekcija.

Mokslininkas maišo DNR, kalcio chloridą ir HEPES buferinį druskos tirpalą. Cheminės reakcijos metu susidaro DNR-kalcio fosfato nuosėdos, kurios gali praeiti pro ląstelės membraną ir pristatyti DNR į branduolį.

Kalcio fosfato metodo naudojimo pranašumai yra tai, kad jis yra gana paprastas, patikimas ir pigus. Jis naudingas trumpalaikei ekspresijai arba stabilių ląstelių linijų kūrimui iš įamžintų ląstelių (14 skyrius). Pagrindinis trūkumas yra tas, kad neuronų transfekcijos efektyvumas yra mažas (1–3%), o šis metodas visiškai neveikia nepažeisto audinio neuronų transfekcijai. Kai kurios įamžintos ląstelių linijos, tokios kaip HEK 293T ir HeLa ląstelės (14 skyrius), pasižymi dideliu transfekcijos efektyvumu (90–100%), o tai yra viena iš priežasčių, kodėl jie visur naudojami gyvybės moksluose.


Transgeninių gyvūnų kūrimo metodai

Šis metodas apima tiesioginį pasirinkto geno konstrukto (vieno geno arba genų derinio) iš kito tos pačios rūšies nario arba kitos rūšies nario mikroinjekciją į apvaisintos kiaušialąstės probrandulį.

Tai vienas iš pirmųjų metodų, kuris pasirodė esąs veiksmingas žinduoliams. Įvesta DNR gali lemti per didelę arba nepakankamą tam tikrų genų ekspresiją arba visiškai naujų genų ekspresiją gyvūnų rūšiai (18.2 pav.).

Tačiau DNR įterpimas yra atsitiktinis procesas, ir yra didelė tikimybė, kad įvestas genas neįsiterps į šeimininko DNR vietą, kuri leis jo ekspresijai. Manipuliuota apvaisinta kiaušialąstė perkeliama į recipientės patelės ar globėjos, kuri buvo paskatinta veikti kaip recipientas, kiaušidę, poruojantis su vazektomizuotu patinu.

Pagrindinis šio metodo pranašumas yra jo pritaikymas įvairioms rūšims. Kiti transfekcijos metodai apima dalelių bombardavimą, ultragarsą ir elektroporaciją.

Metodas Nr. 2. Cheminė transfekcija:

Yra keletas gyvūnų ląstelių cheminės transfekcijos metodų, tačiau visi jie pagrįsti panašiais principais. Kalcio fosfato sukeltas DNR įsisavinimas apima bendrų nuosėdų susidarymą, kurį absorbuoja endocitozė. Apie žinduolių ląstelių gebėjimą paimti egzogeninę DNR iš kultivuojamos terpės pirmą kartą buvo pranešta 1962 m.

Smulkios DNR ir kalcio fosfato bendro nuosėdų susidarymas (turi būti paruoštas šviežias) palengvina DNR įsisavinimą endocitozės būdu. Kai kurie į ląstelę patenkantys DNR fragmentai gali pasiekti branduolį ir integruotis.

Tokių genų ekspresija suteikia transfekciją. Kalcio nuosėdų metodo transformacijos dažnis paprastai yra mažas (1-2%), todėl DNR įpakavimui į šiuos nešiklius naudojami tirpūs kompleksai (polipleksai) arba liposomos ir lipopleksai (fuzogeninis) fosfolipidas. Pageidaujamas genas yra perkeliamas į plazmidę ir gali būti naudojamas tiesiogiai cheminei transfekcijai arba įterpiamas į bakteriją, kad būtų pristatytas į žinduolio ląstelę. Todėl mielių ląstelės su pašalinta ląstelių sienele (sferoplastas) buvo naudojamos YAC DNR įvesti į pelę, naudojant liposomas ir embrionines kamienines ląsteles YAC transgeninėms pelėms gaminti.

Metodas Nr. 3. Retrovirusinis genų perkėlimas:

Siekiant padidinti ekspresijos tikimybę, genų perkėlimas tarpininkaujamas naudojant nešiklį arba vektorių, dažniausiai virusą arba plazmidę. Retrovirusai dažniausiai naudojami kaip vektoriai genetinei medžiagai perkelti į ląstelę, pasinaudojant jų gebėjimu tokiu būdu užkrėsti ląsteles-šeimininkes. Palikuonys, gauti šiuo metodu, yra chimeriniai, ty ne visos ląstelės turi retrovirusą. Transgeno perdavimas galimas tik tuomet, kai retrovirusas integruojasi į kai kurias lytines ląsteles ir sudaro rPIC kompleksą (18.3 pav.).

Taikant bet kurį iš šių metodų, gyvų gyvūnų, turinčių transgeną, sėkmės rodiklis yra labai mažas. Su sąlyga, kad genetinė manipuliacija nesukelia aborto, rezultatas yra pirmoji gyvūnų karta (F1), kurią reikia ištirti dėl transgeno ekspresijos. Priklausomai nuo naudojamos technikos, F1 karta gali sukelti chimerų.

Kai transgenas yra integruotas į lytines ląsteles, vadinamosios gemalo linijos chimeros yra veisiamos 10–20 kartų, kol gaunami homozigotiniai transgeniniai gyvūnai ir transgenas yra kiekvienoje ląstelėje. Šiame etape embrionai, turintys transgeną, gali būti užšaldyti ir saugomi vėlesniam implantavimui.

Buvo gauta daug pranešimų ir transgeninių augalų panaudojimo žemės ūkyje, daugiausia siekiant naudos gamintojui. Tačiau genetiškai modifikuotų gyvulių realizavimas buvo daug lėtesnis. Transgeninių gyvūnų gamyboje daugiausia dėmesio buvo skiriama modelių (pvz., pelių) kūrimui pagrindiniams ir medicininiams tyrimams.

Kalbant apie komerciniu požiūriu svarbias gyvulių rūšis, darbas buvo susijęs su specializuotais ne žemės ūkio tikslais, tokiais kaip farmacijos gamyba ir ksenotransplantacija, ir, mažesniu mastu, pritaikytais žemės ūkio tikslais, siekiant pagerinti gyvūnų auginimo savybes ir gyvūnų maisto produktus. Šiuo atveju vienam iš svarbiausių gamybinių gyvūnų, melžiamų karvių, buvo padidintas atsparumas įprastai ir dažnai niokojančiai pieno liaukų infekcijai, o tai gali būti naudinga tiek gamintojui, tiek gyvūno gerovei.

Metodas Nr. 4. Viruso vektorius:

Virusai turi natūralų gebėjimą absorbuotis į šeimininko ląstelių paviršių ir užkrėsti. Ši savybė gali būti panaudota tiekiant rDNR į gyvūnų ląsteles. Virusinė sistema efektyviai perduodama, gerai ekspresuojama ir greitai replikuojasi šeimininko ląstelėse. Buvo sukurtos kelios virusinių vektorių klasės, skirtos naudoti žmogaus genų terapijoje, ir mažiausiai aštuonios buvo naudojamos klinikiniuose tyrimuose.

Bendrosios virusinio vektoriaus savybės yra šios:

1. Transgenas gali būti įtrauktas į viruso vektorius kaip papildomas genas arba kaip tam tikrų viruso genomo genų pakaitalas ligavimo arba homologinės rekombinacijos būdu. Jei virusas gali plisti savarankiškai, jis vadinamas nepriklausomu pagalbininku. Jei esminiai viruso genai pakeičiami transgenu, virusui reikalingas replikacijos genas Trans padėtyje (kitas virusas, panašus į dvejetainius vektorius), o virusas vadinamas ‘priklausomas nuo pagalbininko’.

2. Būtina užkirsti kelią viruso pagalbininko replikacijai ir rekombinacijai. Ikozaedriniai virusai, tokie kaip adenovirusai ir retrovirusai, supakuoja savo genomą į iš anksto suformuotą kapsidą, jų tūris fiksuojamas su tam tikru kiekiu DNR gali būti supakuota. Strypo formos bakulovirusai sudaro kapsidą aplink genomą, todėl tokių dydžio apribojimų nėra. Idealaus viruso nėra, kiekvienas turi savų privalumų ar trūkumų.

Adenovirusai yra DNR virusai, kurių linijinis dvigrandis genomas yra apytiksliai. 36 kb. Jie naudojami genų perkėlimui, nes pasižymi tam tikromis naudingomis savybėmis, pavyzdžiui, stabilumu, dideliu svetimos DNR pajėgumu, plačiu šeimininkų diapazonu, apimančiu nesidalijančias ląsteles, ir gebėjimą gaminti didelio titro atsargas (iki 10 11 pfu/ml). Jie tinka trumpalaikei ekspresijai besidalijančiose ląstelėse, nes neefektyviai integruojasi į genomą.

Adenovirusai taip pat naudojami kaip genų terapijos vektoriai, nes virusus efektyviai pasisavina ląstelės in vivo, o iš adenovirusų gautos vakcinos buvo naudojamos žmonėms, tačiau apie šalutinį poveikį nebuvo pranešta. Bakulo virusai turi didelius dvigrandžius DNR genomus. They efficiently infect arthropods, particularly insects. Nuclear polyhedrosis viruses, a group of baculoviruses, have an unusual infection cycle that involves the production of nuclear occlusion bodies. These are pro-teinaceous particles in which the virions are embedded allowing the virus to survive harsh environmental conditions such as desiccation.

Baculo-viruses are mainly used for high level transient protein expression in insects and insect cells. Two baculoviruses have been extensively developed as vectors, namely the Autographa calofornica multiple nuclear polyhedrosis virus and the Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus.

Method # 5. DNA Packaged inside a Bacterium (Bactofection):

Generally, Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of DNA is a common practice in plant system. It has been shown by Kunik and co -workers (2001) that this bacterium can transfer DNA in cultured human cells. It was established in mid-1990 that several bacteria infect human cells and undergo lysis releasing plasmid in host cells e.g., Salmonella spp., Listeria spp. and Shigella spp. The plasmid DNA then finds its way to the host cell nucleus, where it is integrated in the genome and expressed.

Another method of DNA transfer is by conjugation [the transfer of DNA through a pilus (plural pilli)]. This pilus is formed by bacterial cell. When live bacteria are used, it is necessary that the bacteria are attenuated. This is because the gene transfer system uses the natural ability of bacteria to infect eukaryotic cells. The bacteria may multiply and destroy host cells.

Application Possibilities for Gene Transfer:

In recent years, several application possibilities for gene transfer in domestic animals have been discussed. Until now it has been possible to influence only traits that are based on a single gene or on a limited number of genes. There are only a very limited number of traits of interest to breeders, which are based on a single gene. Various markers used to identify the transgenic animals are presented in Table 18.1.

In these authors’ well-known experiments, growth, one of the classical quantitative traits in animal breeding, was changed to become a quasi-qualitative trait through the transfer of a single growth hormone gene which was related to a feedback independent regulation mechanism. Similar consequences can be expected by application of somatotropins in dairy cattle.

As far as gene transfer in cattle is concerned, there are realistic prospects that it will be possible to influence positively different production traits. Traditional selection programmes using conventional breeding techniques have achieved important results and will continue to do so.

However, it seems preferable to concentrate the very expensive and complex technique of gene transfer to fields which until now could only be improved with limited success through conventional breeding programmes, such as breeding for increased disease resistance.


Įvadas

In the cytoplasm, a cargo containing a classical NLS that consists of a short stretch of basic amino acids is recognized by importin (karyopherin) α and forms a stable ternary complex with importin (karyopherin) β. The complex interacts with the nuclear pore complex, which is mediated by importin β and is translocated into the nucleoplasm. In the nucleus, a Ras-related small nuclear GTPase, Ran, is localized mainly as the GTP-bound form, and the nuclear RanGTP causes the dissociation of the complex by binding to importin β. These transport factors are recycled back to the cytoplasm to transport the next karyophile into the nucleus (Adam and Gerace, 1991 Görlich and Mattaj, 1996 Jans et al., 2000). In this fashion, Ran appears to be important for the loading and unloading of cargoes on transport receptors, and thus plays a key role in determining the directionality of nuclear transport (Yoneda et al., 1999).

A variety of cellular stresses affect multiple aspects of cellular physiology, and an important part of the cellular stress response involves the translocation of stress-responsible factors from the cytoplasm to the nucleus. However, how these factors are translocated into the nucleus in response to stress or how the nuclear transport pathways are regulated in stressed cells is unclear.

In this paper, we report that importin α accumulates in the nucleus in response to cellular stresses including UV irradiation, oxidative stress, and heat shock stress, resulting in the inhibition of classical nuclear import. We demonstrated that the decrease in nuclear RanGTP levels actually triggers the accumulation of importin α in the nucleus by suppressing nuclear export. Moreover, we show that both nuclear retention and the importin β/Ran-independent nuclear import of importin α are also involved in its rapid nuclear accumulation.


Materials And Methods

Plasmid constructs

pTet-On was purchased from Clontech Laboratories, Inc., pVitro2 was purchased from Invivogen, pCMV5-CymR and pCMV-CuO were purchased from Qbiogene, and pCMV–lamin B1 and pCMV–lamin A were purchased from Open Biosystems. pCMV-CuO–lacI-mCherry was constructed by cloning lacI-mCherry fragment (mCherry was a gift from R. Tsien [University of California, San Diego, La Jolla, CA] and was initially PCR amplifed) into pCMV-CuO. pCMV-CuO–lacI-mCherry–lamin B1 was constructed by cloning lamin B1 into pCMV-CuO–lacI-mCherry. pSV2-YFP–lamin A was obtained by cloning lamin A into pSV2-YFP-C1 (Janicki et al., 2004). pVitro2–Tet-On + MS2-YFP was made by sequential cloning of Tet-On and MS2-YFP into pVitro2 dual promoter vector. pCMV–MS2-YFP, pSV2-YFP–RNA poly II, pSV2-YFP-SF2/ASF, and pYFP-rtTA-N1 plasmids were previously described (Janicki et al., 2004). pCMV–H2A-YFP and pSV2-YFP–LAP2β were subcloned by S. Janicki (The Wistar Institute, Philadelphia, PA).

Cell culture and transfection

Cells were grown in DME supplemented with penicillin-streptomycin (Invitrogen) and 10% tet system–approved FBS (Clontech Laboratories, Inc.). Transient transfection was performed on cells growing on glass coverslips using Fugene 6 reagent (Roche) as per the manufacturer's protocol or by electroporation (Janicki et al., 2004) using a Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories). Because immediate addition of cumate (Qbiogene) drug seemed to decrease transfection efficiency, 200 μg/ml cumate was added 2 h after transfection and cells were left for 12 h for expression before processing for imaging.

Development of stable cell lines

Parental U2OS-2-6-3 cells (Janicki et al., 2004) grown in DME supplemented with 100 μg/ml each of penicillin-streptomycin and hygromycin B (Invitrogen) and 10% tet system–approved FBS were transfected with 2 μg pCMV5-CymR using Fugene 6. Stable clones were selected in 400 μg/ml G418 drug (Invitrogen) for 10 d. 100 individual colonies were picked and expanded. Although the clones were being frozen, each clone was seeded on coverslips, transfected with pCMV-CuO–lacI-mCherry, treated in the absence or presence of cumate (control), and screened by visual examination for absence of fluorescence, respectively, with a fluorescence microscope (Axioplan 2i Carl Zeiss, Inc.) using a 40×/1.3 NA oil immersion objective lens (planApo-Neofluar). Images were captured using a charge-coupled device camera (Orca Hammamatsu) and OpenLab Software (Improvision). By this visual screen, the best clone, which expressed the highest CymR repressor and hence negative fluorescence in the absence of cumate, was labeled as the U2OS-2-6-3–CymR repressor clone. The repressor clone was then subjected to a second round of transfection as before, but in parallel with pCMV-CuO–lacI-mCherry and pCMV-CuO–lacI-mCherry–lamin B1, and then selected as before but in the presence of 1 μg/ml puromycin (Sigma-Aldrich) for 7 d. 100 individual colonies for each transfection were picked, expanded, and screened by visual examination as before. The best clones, which gave no expression in the absence of cumate but optimum expression in the presence of cumate, were considered to be tightly regulated and were labeled as U2OS-2-6-3–CymR–lacI-mCherry (control cells) and U2OS-2-6-3–CymR–lacI-mCherry–lamin B1 (targeting cells). To make a targeting line stably expressing histone H2A-YFP, targeting cells were transfected with pCMV–H2A-YFP as before. 2 d after transfection, H2A-YFP–expressing fluorescent cells were sorted using a FACSVantage SE cell sorter with DiVa option (Becton Dickinson), using a helium-neon laser at 488 nm to generate the stable targeting line H2A-YFP.

Cell synchronization

On day 0, targeting cells were subjected to serum starvation in 0.5% FBS for a period of 48 h in 10-cm dishes to synchronize cells at G0 phase of cell cycle. On day 2, after 48 h of serum starvation, culture medium was replaced with fresh medium containing 10% FBS (to release from G0 phase) and 2 mM hydroxyurea (commonly used for G1/S-phase block) for a period of 20 h. To prepare asynchronous cells, targeting cells were treated as previously described but in the absence of hydroxyurea. At the end of 20 h, dishes containing G1/S-blocked cells or asynchronous cells were trypsinized and plated separately on glass coverslips with or without hydroxyurea, respectively. The plated cells were then allowed to attach to coverslips for a period of 4 h, and then induced with cumate to express the targeting fusion. After 12 h of cumate induction, both G1/S-blocked and asynchronous cells were fixed and DNA was stained with HOECHST 33342 (Invitrogen).

Imunofluorescencija

Cells were rinsed once briefly with PBS and fixed for 15 min in 2% formaldehyde in PBS, pH 7.4, at room temperature. Fixed cells were permeabilized in PBS containing 0.5% Triton X-100 and 1% normal goat serum for 5 min on ice. After permeabilization, rabbit polyclonal anti–lamin B1 (N. Chaudhary and G. Blobel, Rockefeller University, New York, NY) primary antibody was added (1:500) for 1 h at room temperature. Cells were rinsed briefly with PBS containing 1% normal goat serum, and then incubated with anti–rabbit IgG Alexa Fluor 486 (Invitrogen) secondary antibody (1:1,000) for 1 h at room temperature. When required, DNA was stained with HOECHST 33342 for 5 min. Immunolabeled cells or formaldehyde-fixed cells expressing fluorescent proteins in cumate (+) and Dox (−/+) conditions were mounted in medium containing 10% PBS, pH 8.0, plus 1 mg/ml paraphenylenediamine. Cells were observed on a DeltaVision RT system (Applied Precision) as in Quantitation of RNA synthesis at the locus. Z stacks at 0.2-μm intervals were collected and deconvolved using SoftWoRx 2.50 software (Applied Precision).

Live-cell deconvolution microscopy

For time-lapse imaging of transcriptional activation, targeting cells grown on coverslips were transiently transfected with pVitro2–Tet-On + MS2-YFP and induced with cumate as before. Cells were then placed in an FCS2 chamber (Bioptechs), and phenol red–free Leibovitz's L15 (live cell) medium (Invitrogen) containing cumate was perfused into the chamber from a syringe. A second syringe with live-cell medium containing 200 μg/ml cumate and1 μg/ml Dox was also attached to the FCS2 chamber through an additional inlet (initially closed). The whole setup was mounted on a restoration microscope system (DeltaVision RT Applied Precision) equipped with an inverted microscope (1X-70 Olympus), rapid shutters, and a 60×/1.4 NA oil immersion objective lens (planApo Olympus) using CFP/YFP/mCherry filters (Chroma Technology Corp.), a cooled charge-coupled device camera (Photometrics Cool SNAP HQ Roper Scientific) in a thermally insulated temperature-controlled chamber at 37°C. To minimize photosensitivity/phototoxicity from blue light during live-cell imaging, our DeltaVision RT has a sharp cut-off (long-pass) filter at ∼420 nm. Z stacks (0.4 μm, 1×1 binning) of transcriptionally inactive cells with a plastered locus (mCherry channel), a uniform diffuse nucleoplasmic signal (YFP channel) with no peroxisomal signal (CFP channel), were collected at 0 min. Immediately after imaging, live-cell medium with cumate and Dox from the second syringe was perfused into the FCS2 chamber and corrected for any z drift before the next time frame of imaging began at 20 min, and imaging was continued with an occasional perfusion of fresh medium. For time-lapse imaging during mitosis, targeting cells H2A-YFP were grown on coverslips and preinduced with 70 μg/ml cumate for 2–3 h and then placed in an FCS2 chamber, and live-cell medium containing 70 μg/ml cumate was perfused into the chamber from a syringe. To minimize the exposure of cells to fluorescent light, cells showing a nontargeted spherical locus at around G2/M phase were chosen by visualization of the H2A-YFP chromatin pattern and nuclear size and imaged through mitosis. Z stacks (0.4 μm, 2×2 binning) were collected (mCherry and YFP channel) every 10 min with occasional perfusion of fresh medium. Z stacks were deconvolved using SoftWoRx 2.50. In-focus sections of deconvolved images were projected, saved in tif format, and processed using Photoshop 7.0 (Adobe) and Illustrator 10.0 (Adobe). tif images from the time series were then combined using QuickTime Pro (Apple) to make videos.

Quantitation of RNA synthesis at the locus

Control cells or targeting cells grown on live-cell coverslips were transiently transfected with pVitro2–Tet-on + MS2-YFP and induced for 12 h with cumate for targeting fusion expression. The transfected cells were then imaged in the mCherry and YFP channels in Dox (−) condition (0 h), followed by imaging in Dox (+) condition every 20 min for a total period of 5 h. Raw images were then projected and the mean fluorescence intensity of the locus and of the whole nuclei were extracted using edit polygon and edit 2D polygon finder programs in SoftWoRx 2.50. The ratio of fluorescence intensity of the locus to the entire nucleus (mean values) was expressed as a percentage and was plotted against time of Dox induction.

Online supplemental material

Fig. S1 shows that the expressed targeting fusion is associated with the lac operator DNA at the targeted locus at the nuclear periphery. Fig. S2 shows serial z sections, which show targeting of the locus to the nuclear periphery. Video 1 shows that targeting of the locus to the lamina occurs at the end of mitosis. Video 2 shows serial z sections at a single time point, which show that the locus is targeted to the nuclear periphery. Video 3 shows that the targeted locus at the nuclear lamina remains targeted upon passage through mitosis. Video 4 shows transcription from the targeted locus at the lamina.

Žiūrėti video įrašą: Reactorbody kalba apie baltymus (Lapkritis 2024).