We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
MOKYMOSI TIKSLAI
Apibūdinkite endocitozę, įskaitant fagocitozę, pinocitozę ir receptorių sukeltą endocitozę.
Endocitozė yra aktyvios transporto rūšis, perkelianti į ląstelę daleles, tokias kaip didelės molekulės, ląstelių dalys ir net visos ląstelės. Yra įvairių endocitozės variantų, tačiau visi jie turi bendrą bruožą: ląstelės plazminė membrana įsiskverbia, sudarydama kišenę aplink tikslinę dalelę. Kišenė susitraukia, todėl dalelė patenka į naujai sukurtą tarpląstelinę pūslelę, susidariusią iš plazminės membranos.
Fagocitozė
Fagocitozė ("ląstelių valgymo" būsena) yra procesas, kurio metu ląstelė pasisavina dideles daleles, tokias kaip ląstelės arba gana didelės dalelės. Pavyzdžiui, kai mikroorganizmai įsiveržia į žmogaus kūną, baltųjų kraujo kūnelių rūšis, vadinama neutrofilu, per šį procesą pašalins įsibrovėlius, supančią ir apimantį mikroorganizmą, kurį vėliau sunaikina neutrofilas.
Ruošiantis fagocitozei, dalis į vidų nukreiptos plazmos membranos paviršiaus yra padengta baltymu, vadinamu klatrinu, kuris stabilizuoja šią membranos dalį. Tada padengta membranos dalis tęsiasi nuo ląstelės kūno ir supa dalelę, galiausiai ją apgaubdama. Kai pūslelė, kurioje yra dalelė, patenka į ląstelę, klatrinas atsiskiria nuo membranos ir pūslelė susilieja su lizosoma, kad suskaidytų medžiagą naujai suformuotame skyriuje (endosomoje). Kai iš vezikulinio turinio skilimo pašalinamos prieinamos maistinės medžiagos, naujai suformuota endosoma susilieja su plazmine membrana ir išskiria jos turinį į tarpląstelinį skystį. Endosominė membrana vėl tampa plazmos membranos dalimi.
Pinocitozė
Endocitozės variacija vadinama pinocitoze. Tai pažodžiui reiškia „ląstelių gėrimas“ ir buvo pavadintas tuo metu, kai buvo daroma prielaida, kad ląstelė tikslingai imasi tarpląstelinio skysčio. Tiesą sakant, tai yra procesas, kuris priima molekules, įskaitant vandenį, kurio reikia ląstelėms iš tarpląstelinio skysčio. Pinocitozė sukelia daug mažesnę pūslelę nei fagocitozė, ir pūslelei nereikia susilieti su lizosoma.
Potocitozė, pinocitozės variantas, yra procesas, kurio metu plazmos membranos citoplazminėje pusėje naudojamas dengiantis baltymas, vadinamas caveolinu, kuris atlieka panašią funkciją kaip klatrinas. Plazmos membranos ertmės, sudarančios vakuolius, be kaveolino, turi membraninius receptorius ir lipidų plaustus. Vakuolės arba pūslelės, susidariusios caveolae (vienaskaitoje caveola), yra mažesnės nei esant pinocitozei. Potocitozė naudojama mažoms molekulėms įnešti į ląstelę ir pernešti šias molekules per ląstelę, kad jos išsiskirtų kitoje ląstelės pusėje, procesas vadinamas transcitoze.
Receptorių sukelta endocitozė
Tikslinė endocitozės variacija, žinoma kaip receptorių sukelta endocitozė, naudoja plazmos membranoje esančius receptorių baltymus, kurie turi specifinį prisijungimo prie tam tikrų medžiagų afinitetą. Esant receptorių sukeltai endocitozei, kaip ir fagocitozei, klatrinas yra prijungtas prie plazmos membranos citoplazminės pusės. Jei junginio įsisavinimas priklauso nuo receptorių sukeltos endocitozės ir procesas yra neveiksmingas, medžiaga nebus pašalinta iš audinių skysčių ar kraujo. Vietoj to jis liks tuose skysčiuose ir padidės koncentracija. Kai kurias žmonių ligas sukelia receptorių sukeltos endocitozės nesėkmė. Pavyzdžiui, cholesterolio forma, vadinama mažo tankio lipoproteinais arba MTL (dar vadinama „bloguoju“ cholesteroliu), pašalinama iš kraujo dėl receptorių sukeltos endocitozės. Sergant žmogaus genetine liga, šeimine hipercholesterolemija, MTL receptoriai yra sugedę arba jų visai nėra. Šios būklės žmonių kraujyje yra pavojingas gyvybei cholesterolio kiekis, nes jų ląstelės negali išvalyti MTL dalelių iš jų kraujo.
Nors receptorių sukelta endocitozė sukurta tam, kad į ląstelę patektų specifinių medžiagų, kurios paprastai randamos tarpląsteliniame skystyje, kitos medžiagos gali patekti į ląstelę toje pačioje vietoje. Gripo virusai, difterija ir choleros toksinas turi vietas, kurios kryžmiškai reaguoja su normaliomis receptorių surišimo vietomis ir patenka į ląsteles.
Pagrindiniai klausimai
- Endocitozę sudaro fagocitozė, pinocitozė ir receptorių sukelta endocitozė.
- Endocitozė į ląstelę perneša daleles, kurios yra per didelės, kad pasyviai kirstų ląstelės membraną.
- Fagocitozė yra didelių maisto dalelių įsisavinimas, o pinocitozė - skystos dalelės.
- Receptorių sukelta endocitozė naudoja specialius receptorių baltymus, kurie padeda pernešti dideles daleles per ląstelės membraną.
Pagrindinės sąlygos
- endosomas: Endocitinė vakuolė, per kurią endocitozės metu internalizuotos molekulės patenka į lizosomas
- neutrofilų: Ląstelė, ypač baltieji kraujo kūneliai, sunaudojantys svetimus įsibrovėlius kraujyje.
Endocitozė ir egzocitozė
Makromolekulių, tokių kaip baltymai ar polisacharidai, judėjimas į ląstelę arba iš jos vadinamas birių krovinių gabenimas. Yra dviejų rūšių masinis transportas, egzocitozė ir endocitozėir abiem reikia energijos (ATP).
Į egzocitozė, medžiagos yra eksportuojama išeina iš ląstelės per sekrecines pūsleles. Šiame procese Golgi kompleksas supakuoja makromolekules į transportines pūsleles, kurios keliauja į plazmos membraną ir susilieja su ja. Dėl šios susiliejimo pūslelė išsilieja iš ląstelės. Egzocitozė yra svarbi pašalinant atliekas iš ląstelės ir išskiriant ląstelinius produktus, tokius kaip virškinimo fermentai ar hormonai.
Endocitozėkita vertus, yra medžiagų judėjimo procesas į ląstelė. Yra trys endocitozės tipai: fagocitozė, pinocitozė, ir receptorių sukelta endocitozė. Į fagocitozė arba „ląstelinis valgymas“, ląstelės plazminė membrana supa makromolekulę ar net visą ląstelė iš ekstraląstelinės aplinkos ir pumpurai išsijungia, kad susidarytų maisto vakuolė arba fagosoma. Tada naujai suformuota fagosoma susilieja su lizosoma, kurios hidroliziniai fermentai virškina viduje esantį „maistą“.
Į pinocitozė arba „ląstelinis gėrimas“, ląstelė sugeria skysčio lašus, suspausdama ir suformuodama pūsleles, kurios yra mažesnės nei fagocitozėje susidariusios fagosomos. Kaip ir fagocitozė, pinocitozė yra nespecifinis procesas, kurio metu ląstelė pasisavina bet kokias ištirpusias medžiagas, kurios yra ištirpusios jos apgaubiančiame skystyje.
Skirtingai nuo fagocitozės ir pinocitozės, receptorių sukelta endocitozė yra itin selektyvus medžiagų įvežimo į ląstelę procesas. Šią specifiką tarpininkauja receptorių baltymai esančių depresinėse ląstelių membranos vietose, vadinamose dengtos duobės. Padengtų duobių citozolinis paviršius yra padengtas kailio baltymai. Receptorių sukeltos endocitozės metu ląstelė paims tarpląstelinę molekulę tik tada, jei ji prisijungs prie specifinio receptoriaus baltymo ląstelės paviršiuje. Prisirišus, dengta duobė, ant kurios yra surištas receptoriaus baltymas invaginuojaarba susispaudžia, kad susidarytų padengta pūslelė. Panašiai kaip ir nespecifinės fagocitozės virškinimo procesas, ši dengta pūslelė susilieja su lizosoma, kad suvirškintų absorbuotą medžiagą ir išleistų ją į citozolį. Žinduolių ląstelės naudoja receptorių sukeltą endocitozę, kad patektų į ląsteles cholesterolį. Cholesterolio kiekis kraujyje paprastai randamas lipidų-baltymų kompleksuose, vadinamuose mažo tankio lipoproteinai (MTL). MTL jungiasi prie specifinių receptorių baltymų ląstelės paviršiuje, taip sukeldami jų įsisavinimą receptorių sukeltos endocitozės būdu.
Prieigos parinktys
Gaukite visą žurnalo prieigą 1 metams
Visos kainos yra NET kainos.
PVM bus pridėtas vėliau kasoje.
Mokesčių apskaičiavimas bus baigtas atsiskaitymo metu.
Gaukite ribotą laiką arba visą prieigą prie straipsnio „ReadCube“.
Visos kainos yra NET kainos.
Intraląstelinis prekybos tinklas ir PHBHHx nanodalelių autofagija ir jų poveikis vaistų pristatymui
3-hidroksibutiratas-ko-3-hidroksiheksanoatas (PHBHHx), natūraliai susidaręs dėl biologiškai skaidžių polihidroksialkanoatų, kuriuos sintezuoja bakterijos, yra patraukli medžiaga vaistams tiekti dėl savo kontroliuojamų fizinių savybių, netoksiškumo, draugiškumo aplinkai, suyrančių savybių ir gero biologinio suderinamumo. . Tačiau retai buvo tiriami tarpląstelinės prekybos tinklo keliai, ypač PHBHHx nanodalelių (NP) autofagijos mechanizmas. Šiame dokumente mes sėkmingai paruošėme NP, naudojamą tirpiklio perkėlimo metodą, ir ištyrėme autofagijos kelius ir kitus tarpląstelinės prekybos mechanizmus, pagrįstus NP, padedant Rab baltymams. Mes nustatėme, kad NP buvo internalizuotos ląstelėse daugiausia per klatrino endocitozę ir caveolino endocitozę. Be klasikinių kelių, mes atradome du naujus kelius: mikropinocitozės ankstyvosios endosomos (EE) -mikropinocitozės-lizosomos kelią ir EE-liposomų-lizosomų kelią. NP buvo pristatytos į ląsteles per endocitozę perdirbančias pūsleles ir GLUT4 egzocitozės pūsleles. Panašiai kaip ir kitos nanodalelės, NP taip pat sukėlė tarpląstelinę autofagiją ir tada buvo suskaidytos per endolizosominius kelius. 3-MA ir CQ buvo naudojami kaip autofagijos inhibitoriai, siekiant išvengti NP skilimo per lizosomas, blokuojant endolizosominius kelius. Naviko apimtys ir svoris žymiai sumažėjo, kai kartu buvo naudojami autofagijos inhibitoriai ir cheminiai vaistai, supakuoti į NP.
Interesų konflikto pareiškimas
Autoriai neskelbia konkuruojančių interesų.
Skaičiai
PHBHHx NP SEM apibūdinimas…
PHBHHx NP SEM apibūdinimas ( A ) PHBHHx DLS dydžio pasiskirstymas…
Konfokalūs endocitozės kelių vaizdai.…
Konfokaliniai endocitozės kelių vaizdai. MCF-7 ląstelėse NP patenka į ląsteles ...
Konokalinės mikroskopinės endocitozės nuotraukos ...
Endocitozės takų konfokalinės mikroskopijos nuotraukos. ( A ) MCF-7 ląstelės buvo transfekuotos ...
Konfokalinė mikroskopija tiria autofagijos sukeltą…
Konfokalinė mikroskopija tiria NP sukeltą autofagiją. (A) EGFP-LC3 ląstelės buvo kultivuojamos su…
Konfokalinės mikroskopijos nuotraukos, slopinančios…
Konfokalinės mikroskopijos nuotraukos, slopinančios NP autofagiją. ( A , B )…
Autofagijos inhibitorius CQ padidino ...
Autofagijos inhibitorius CQ padidino vaistų naviko slopinimo poveikį, slopindamas autofagiją ...
4 dalis. Aktino surinkimas pumpurinėse mielėse
00: 00: 07.21 Sveiki.
00:00:08.21 Aš esu Davidas Drubinas. Esu Kalifornijos universiteto Berklio profesorius ir pirmininkas.
00: 00: 13.17 Ir šiame ketvirtame segmente norėčiau jums papasakoti apie mūsų tyrimus apie aktino surinkimą
00: 00: 18.05 pumpuruojančiose mielėse.
00:00:19.28 Šiuose tyrimuose pagrindinis dėmesys buvo skiriamas vykstantiems surinkimo ir išmontavimo procesams
00:00:25.14 šiose žievės aktino dėmėse, kurios yra klatrino sukeltos endocitozės vietos.
00: 00: 33.17 Tai vėlgi yra šio endocitinio kelio, augančio mielėse, santrauka.
00: 00: 39.14 Ir internalizavimo etapas, membranos invaginacija ir pūslelės susidarymas,
00: 00: 45.06 vairuoja aktino ir. po kurio iškart seka aktino išardymas.
00: 00: 51.18 Taigi, aktinas renkasi labai nuspėjamu laiku šiuo keliu, maždaug aštuonias sekundes.
00:00:56.20 Ir tada jis pradeda ardyti kitas aštuonias sekundes.
00: 01: 01.04 Kadangi tai vyksta taip nuspėjamai, mes nustatėme, kad tai labai geras procesas
00: 01: 06.28, kad būtų galima išsiaiškinti mechanizmus, kurie yra susiję su surinkimo reguliavimu
00: 01: 13.10 ir aktino gijų išardymas.
00: 01: 16.00 Ir tai atsitinka kaip Arp2/3 tarpininkaujantis aktino surinkimo kelias.
00: 01: 21.04 Dabar daugelis laboratorijų atliko gražius biocheminius tyrimus dėl „Arp2/3“
00: 01: 27.17 aktino surinkimo kelias, įskaitant Pollardo ir Carlierio laboratorijas ir kt.
00: 01: 34.11 Ir šią schemą padarė Dyche Mullins Pollardo laboratorijoje. kai jis buvo Pollardo laboratorijoje.
00: 01: 40.16 Ir tai tikrai gražiai apibendrina svarbiausius šio proceso įvykius
00:01:46.25 Arp2/3 kompleksas sudaro aktino gijų sąranką, o vėliau gijos laikui bėgant sensta
00: 01: 55.15 ir išardomi, jie auga, todėl auga, o tai svarbu jėgos generavimui,
00: 02: 03.04 ribojant baltymus, tada jie vėl perdirbami. naujiems aktino surinkimo etapams
00: 02: 10.28 „Arp2/3“ komplekse.
00: 02: 12.28 Ir taip Carlier laboratorijos tyrimai, atkuriantys Listeria judrumą, apie kurį aš kalbėjau
00:02:22.06 mano pirmame segmente, parodė, kad čia yra keletas esminių pagrindinių žingsnių.
00:02:29.06 Vienas iš jų yra aktino citoskeleto, kurį tarpininkauja kofilinas, išardymas
00:02:34.09 arba kartais. kuris kartais vadinamas aktino depoliarizuojančiu faktoriumi arba ADF.
00: 02: 39.09 Čia yra gijų dangtelis.
00: 02: 41.01 Gijos turi likti trumpos, kitaip jos negali atsispirti gniuždymo jėgoms
00: 02: 45.13 plazminė membrana.
00: 02: 47.01 Ir tada, žinoma, yra šio tinklo branduolis, kurį sudaro „Arp2/3“ kompleksas.
00: 02: 51.13 Ir tai buvo visi žingsniai, kurie buvo pripažinti esminiais atkuriant listerijų judrumą.
00: 02: 58.16 Taip pat yra žingsnių, kurie yra svarbūs genetinių organizmų mutacijų metu,
Pavyzdžiui: 00: 03: 03.11
00:03:05.00 Ir tai yra žingsniai, kurie didžiąja dalimi mano. mano laboratorija daugiausia dėmesio skyrė aktino studijoms
00:03:11.25 surinkimas ir išmontavimas.
00:03:12.25 Taigi, pirmiausia norėčiau pradėti kalbėti apie išmontavimo procesą.
00:03:17.07 Atminkite, kad aktinas kaupiasi kaip ATP-aktinas.
00: 03: 20.09 Kai gijos sensta, jos ilgainiui tampa ADP-aktinu.
00: 03: 23.20 Ir tada jie tampa substratais, kuriuos gali suskaidyti ar atskirti baltymas kofilinas.
00: 03: 31.00 Taigi, prieš kurį laiką Anne Moon, kaip mano laboratorijos absolventė, kartu su Paulu Janmey,
00:03:37.10 kai jis atostogavo Berklyje, frakcionavo mielių ekstraktus ir ieškojo veiklos
00:03:43.06, kurie turėjo įtakos aktino tirpalų klampumui, ir jie išgrynino mielių kofiliną.
00: 03: 49.20 Pekka Lappalainen prisijungė prie laboratorijos kaip doktorantė ir atliko mutacijas kofilin,
00:03:54.15 ir sugebėjo parodyti, kad gyvoje ląstelėje kofilinas yra būtinas
00:04:00.11 aktino citoskeletas.
00: 04: 02.11 Galiausiai, mes bendradarbiavome su Ambergo laboratorija, kai Avi Rodal buvo abiturientė laboratorijoje,
00: 04: 06.26 ir parodė, kad baltymas, vadinamas Aip, sąveikauja su kofilinu, kad išardytų
00:04:12.28 aktino gijos.
00: 04: 14.18 Taigi, kai Voytek Okreglak įstojo į laboratoriją kaip magistrantas, jis norėjo studijuoti
00: 04: 20.18 kofilino funkcija šio aktino sukelto endocitinio kelio kontekste pumpuruojančiose mielėse.
00: 04: 26.27 Taigi jis sugebėjo pažymėti kofiliną žaliu fluorescenciniu baltymu, kuris yra nuostabus
00:04:31.27 nes kofilinas yra tik 14 kD baltymas.
00:04:35.18 Bet jis surado vidinę kilpą, kur galėtų atlikti GFP integraciją, ir padarė funkcinį kofiliną.
00: 04: 43.12 Taigi jis sugebėjo pažvelgti į kofilino dinamiką gyvose mielių ląstelėse.
00: 04: 46.10 Taigi, tai yra šių ląstelių endocitinės vietos, kuri buvo pažymėta, montažas
00:04:54.06 taigi jie išreiškia aktino žymeklį raudonai ir kofiliną žalia spalva.
00: 04: 59.03 Ir jūs galite pamatyti, kad aktinas pradeda kauptis endocitinėje vietoje, o tada
00:05:03.10 su maždaug trijų su puse sekundės vėlavimu cofilin įdarbinamas į tą svetainę.
00: 05: 08.02 Ir tai atitinka kofilino prisijungimą prie ADP aktino, o ne prie ATP aktino.
00:05:14.14 Taip pat labai dramatiškai galite pamatyti šiame kimografe ant ląstelės paviršiaus,
00: 05: 18.20 kur mes matome aktino surinkimą endocitinio kelio pabaigoje, kur jis yra.
00: 05: 22.13 jis pradeda kauptis ant paviršiaus ir tada juda iš paviršiaus į vidų
00: 05: 28.04.
00:05:29.04 Ir kofilinas prisijungia prie aktino tik po to, kai aktinas ir pūslelė pradeda internalizuotis
00: 05: 34.18 į kamerą.
00: 05: 36.28 Voyteko studijose jis sugebėjo pateikti įrodymų, kad kofilinas iš tikrųjų yra
00: 05: 42.12 traukia ADP aktinas, o ne ATP aktinas.
00: 05: 46.27 Gerai, tada jis norėjo giliau pasinerti į tai, kaip veikia kofilinas.
00: 05: 55.15 aktino išmontavimo ir surinkimo metu.
00:05:57.04 Ir jis pasinaudojo Marko Kaksoneno pastebėjimu prieš kelerius metus,
00: 06: 02.09 kartu su Yidi Sun laboratorijoje, tai yra, kai mes žiūrime į baltymo mutantą
00: 06: 08.06, vadinamas Sla2, kuris jungiasi prie aktino ir klatrino, pastebime, kad aktino uodegos stabiliai susiejamos
00: 06: 15.13 su endocitinėmis vietomis.
00:06:16.15 Taigi, tai yra mielių ląstelės paviršius, o ten yra krūva aktino uodegų.
00: 06: 22.06 išsirikiavęs ant vieno paviršiaus.
00: 06: 23.14 Ir tai. tai iš tikrųjų sukuria aktino tinklą, kuris daugeliu atžvilgių primena lamellipodium
00: 06: 29.05 žinduolių ląstelių, nes Marko galėjo paimti lazerį ir išbalinti liniją
00: 06: 35.16 mielių ląstelė, ir kai jis tai padarė, čia linija teka iš paviršiaus į
00:06:41.21 ląstelės viduje, kaip ir žinduolių ląstelėje prie lamellipodiumo.
00: 06: 48.03 Taigi jis galėjo išmatuoti greitį, o srautas buvo apie 45 nanometrus per sekundę.
00: 06: 53.06 Taigi, „Voytek“ norėjo naudoti šiuos tinklus kaip sistemą kofilino funkcijai tirti.
00:06:58.22 Taigi jis įtraukė kofilino mutantus į šį foną, kuris sukuria šiuos aktino tinklus.
00:07:05.13 Ir pirma. Tačiau pirmas dalykas, kurį jis padarė, buvo pažvelgti į pažymėtą kofiliną ir paklausti:
00:07:11.21 kur tas kofilinas šiuose tinkluose?
00:07:14.15 Taigi, jis galėjo vienodai pažymėti visą tinklą aktiną surišančiu baltymu.
00: 07: 19.18 Tačiau pažymėtas kofilinas buvo perkeltas tolyn nuo krašto, kur buvo renkamas naujas aktinas,
00: 07: 25.00 ir buvo senesnėje tinklo dalyje.
00:07:27.00 Ir tai matote sujungime, čia, kur kofilinas yra aktino tinklo dalyje
00:07:33.06 tai seniausia, atokiau nuo paviršiaus, kur yra praturtintas ADP-aktinas.
00: 07: 37.26 Taigi dabar, kai jis atliko mutacijas kofilin ir įtraukė jas į šį foną
00:07:42.20 šios uodegos. taigi, be. su laukinio tipo kofilinu, uodegos išsikišusios nuo paviršiaus
00:07:48.16 kameros nedideliu atstumu į kameros vidų, čia ir čia.
00:07:54.04 Bet kai jis padarė kofilino mutacijas, uodegos pradėjo kauptis paviršiuje,
00:07:59.24 ir jie tęsėsi per visą paviršių iki kito kameros galo.
00: 08: 03.16 Ir čia, motinos ląstelėje, uodegos susirenka. tęsiasi iki galo
00: 08: 08.15 iš vienos kameros pusės į. į kitą.
00:08:10.27 Taigi kofilinas buvo svarbus aktino tinklams apversti.
00:08:14.27 Ir jis galėjo parodyti, kad kofilino mutantų uodegos tapo itin ilgos.
00: 08: 20.13, palyginti su ląstelėmis su laukinio tipo kofilinu.
00:08:22.26 Ir taip pat srauto greitis per šį tinklą buvo labai lėtas, kai mutantas.
00: 08: 28.16, kai mutantai buvo pagaminti kofilin.
00:08:29.17 Taigi, kofilinas buvo svarbus dinaminiam aktino tinklų surinkimui ir išardymui gyvose ląstelėse.
00: 08: 37.06 Taigi, kaip. kokia buvo cofilino svarba šiam endocitiniam keliui?
00:08:41.05 Anksčiau antrajame šios serijos pokalbyje parodžiau, kad endocitinės pūslelės
00:08:47.10 labai greitai susilieja su endosomomis po to, kai jos susidaro, vadovaujamos aktino gijų.
00:08:54.02 Voytek nustatė, kad kai kofilinas yra sugedęs, šis žingsnis tampa. sutrinka.
00: 09: 01.00 Taigi jis padarė išvadą, kad šiose endocitinėse vietose ATP-aktinas, parodyta raudonai,
00: 09: 07.17 susirenka, kad paskatintų membranos invaginaciją, ATP hidrolizuojasi iki ADP,
00:09:12.10 ir tada ateina kofilinas ir išardo aktino tinklą.
00:09:16.17 Tada pūslelė lieka be aktino ir gali susilieti su endosomomis.
00:09:21.22 Kai kofilinas yra mutantas, aktinas neišyra ir šie tolesni procesai
00: 09: 27.03 endocitinio kelio sutrikimas.
00: 09: 29.15 Taigi, kai Avi Rodal buvo mano laboratorijos absolventė, į mus kreipėsi Davidas Ambergas,
00:09:34.08 kuris padarė įdomų pastebėjimą.
00: 09: 36.20 Jis rado šį baltymą, kurį jis pavadino Aip1, su aktinu sąveikaujančiu baltymu.
00:09:42.00 Jis rado jį dviejų hibridų ekrane kaip baltymą, kuris jungiasi su aktinu.
00: 09: 46.06 Jis taip pat nustatė, kad jis jungiasi su kofilinu.
00: 09: 49.04 Ir kadangi mes dirbome su kofilinu ir aktinu, jis priėjo prie mūsų ir paklausė, ar galime
00: 09: 52.22 bendradarbiaukite ir pabandykite sužinoti ką nors apie tai, ką Aip1 gali daryti ir ar gali
00:09:57.06 dirbti kartu su cofilin.
00: 10: 00.01 Taigi, štai Avi atliktas tyrimas.
00: 10: 03.16 Ir šiame tyrime galite pridėti kofilino prie aktino gijų.
00:10:10.11 Ir kofilinas nutrauks aktino siūlus, bet gijos vis tiek granulės
00: 10: 16.14 ultracentrifugoje, nes aktinas buvo suskaidytas į trumpus fragmentus, bet jie vis tiek
00: 10: 21.08 oligomerai, kurie granuliuos.
00: 10: 23.11 Buvo tikrai įdomu tai, kad kai Avi pridėjo Aip1 prie reakcijos, kurioje buvo kofilino ir aktino,
00:10:30.03 dabar aktinas visiškai persikėlė į supernatantą.
00: 10: 35.08 Ir ji galėjo matyti šiuos efektus net esant žemai stechiometrijai, pvz., 1:10, ir buvo
00: 10: 40.10 net efektas akivaizdus esant 1:50 lygiui.
00:10:44.00 Taigi, Aip1 dirbo kartu su cofilin, kad sumažintų trumpus aktino fragmentus į, tikėtina,
00: 10: 53.26 aktino monomerai, kurių negalima granuliuoti ultracentrifuguojant.
00: 10: 57.06 „Voytek“ norėjo toliau tirti „Aip1“ funkcijos mechanizmą ir tai, ką jis veikia viduje
00:11:03.28 kamerą.
00:11:05.09 Ir jis padarė tikrai įdomų pastebėjimą ir nustebino, visiškai netikėtą,
00:11:11.05, kai jis analizavo Aip1 ląstelių fenotipą.
00: 11: 14.21 Nes, skirtingai nuo kofilino mutantų, nors Aip1 turėjo labai dramatišką poveikį šiems biocheminiams
00: 11: 20.05 tyrimai, in vivo efektas buvo daug subtilesnis.
Norėdami pamatyti efektą, jis turėjo apdoroti ląsteles latrunkulinu A, šiuo monomerą rišančiu vaistu.
00: 11: 29.06 Tai, ką jis rado, buvo nuostabu - tai kelias minutes po to, kai jis apdorojo kamerą
00:11:34.13 latrunkulinas A, jie vis tiek gali surinkti aktiną, gerai?
00:11:39.04 Per tą laiką aktino struktūros apskritai išnyko iš ląstelės, nes
00: 11: 44.14 monomerus sugeria latrunkulinas, bet net po kelių minučių po ląstelių apdorojimo
00: 11: 50.07 -tai endocitiniai reiškiniai su kailio baltymu, po kurio seka aktino pliūpsnis -
00: 11: 55.13 jie tęsėsi keletą minučių.
00:11:58.22 Vis tiek galėtume gauti tvirtą aktino rinkinio pliūpsnį, kad paskatintume endocitinę internalizaciją.
00:12:03.13 Pagalvojome, kaip tai gali atsitikti tokiomis sąlygomis, kai latrunkulinas A depolimerizuojasi
00:12:09.00 dauguma ląstelės struktūrų ir sugėrė aktino monomerus?
00: 12: 13.06 Taigi mes sukūrėme hipotezę.
00: 12: 15.26 Mūsų hipotezė buvo ta, kad yra kelias aktino oligomerų surinkimui. oligomerai
00: 12: 22.17 ląstelėje ir kad šie oligomerai yra atsparūs latrunkulino A poveikiui.
00: 12: 28.04 Taigi, kaip jis galėjo tai parodyti?
00:12:30.01 Taigi, paaiškėjo, kad Emilis Reisleris iš UCLA sukūrė tikrai gražią techniką
00: 12: 35.18 žiūrėdamas į aktino oligomerus.
00: 12: 37.23 Jis nustatė, kad jei įvedėte cisteiną 41 -oje aktino vietoje, galite pridėti
00:12:44.24 bet kuris iš daugelio kryžminių jungčių agentų ir skersinio susiejimo aktino gijų, kad oligomerai
00:12:50.11 buvo išsaugotos, kai naudojote neredukuojančius gelius.
00:12:54.05 Ir štai, Voytek atliko biocheminį tyrimą, kuriame panaudojo šį triuką.
00: 12: 59.26 Ir jis nustatė, kad net pridėdamas vis didesnį kofilino kiekį savo tyrime, jis vis tiek galėjo
00:13:05.19 matai daug oligomerų jo reakcijoje naudojant šį kryžminį ryšį.
00: 13: 12.02 Taigi kofilino nepakako oligomerams suskaidyti į monomerus.
00:13:17.04 Tačiau Aip1 pridėjimas labai sumažino oligomerų skaičių ir labai padidino
00: 13: 24.02 monomerų skaičius.
00: 13: 25.14 Taigi, Aip1 sinergizavo su kofilinu, kuriame kofilinas suskaidė aktiną, bet kartu
00: 13: 30.20 jie sugebėjo gaminti aktino monomerus.
00: 13: 33.15 Be to, gyvoje ląstelėje, kai Voytekas išreiškė šį aktino variantą, jis sugebėjo parodyti
00: 13: 40.14, kad monomerų telkinys buvo išeikvotas ir oligomerų telkinys padidėjo Aip1 nulinių mutantų.
00: 13: 48.00 Taigi mes padarėme išvadas iš šių tyrimų. paprastai mes galvojame apie surinkimo procesą
00: 13: 52.15 kaip vyksta griežtai per monomerinį aktiną, bet tai buvo žinoma jau kurį laiką
00: 13: 59.02 aktino oligomerai gali atkaitinti in vitro.
00:14:01.10 Ir ką parodė Voytek. yra du dalykai: vienas, kad „Aip1“ yra atsakingas už konvertavimą
00: 14: 06.06 trumpi aktino fragmentai į aktino monomerus ir, du, kad aktino oligomerai gali tvirtai
00: 14: 12.28 susirenka į gyvą kamerą.
00:14:15.17 Taigi, toliau norėjome ištirti šią ribojimo veiklą, kuri atsiranda po to, kai gijų branduoliai
00: 14: 22.01, naudojant Arp2/3 kompleksą, kuris kontroliuoja jų pailgėjimą.
00:14:26.17 Ir jūs prisiminsite, kad ribos nustatymas buvo svarbus, būtinas Listeria judėjimui.
00: 14: 31.20 Ir kai Alphee Michelot įstojo į laboratoriją kaip postdoktoras, jis sugebėjo parodyti. jis sugebėjo
00: 14: 37.11 gaminti Listeria tipo judesius, dedant mielių WASP baltymą ant mikrosferų
00:14:43.11 ir įterpiant jas į koncentruotą mielių ekstraktą.
00: 14: 46.18 Šios sferos tada surinks aktino uodegas, kurios jas išstums per ekstraktą.
00: 14: 51.04 Taigi, dabar mes turime sistemą, kurioje galėtume derinti genetiką ir biochemiją, kad
00:14:56.26 tirti mechanizmus, tokius kaip gijų uždengimas.
00:15:00.17 Taigi kilo galvosūkis dėl baltymų ribojimo, o tai buvo
00: 15: 06.11 manoma, kad tai būtina procesams, kai buvo atstatytos tokios sistemos kaip „Carlier Listeria“
00:15:14.02 iš grynų komponentų.
00: 15: 15.17 Kapsulės baltymai, kofilinas ir Arp2/3 buvo pagrindiniai komponentai.
00: 15: 22.04 Gerai?
00: 15: 23.23 Bet kai į judrumo procesus buvo žiūrima visu ląstelės sudėtingumu arba ekstraktais,
00:15:32.04 dažnai buvo labai subtilūs efektai.
00:15:33.24 Ir tai galioja mielių ląstelėse.
00:15:35.15 Kai pašaliname ribinį baltymą, stebėtina, kad aktino surinkimas vyksta labai tvirtai ir endocitozė
00: 15: 42.02 vis dar pasitaiko, šis veiksmas. labai nuo aktino priklausomas procesas.
00:15:46.18 Taigi, kas atsitiko?
00: 15: 48.28 Ir vėl, štai, tai rodo Carlier laboratorijos, kurioje ribojamas baltymas, rezultatus
00:15:53.18 buvo vienas iš esminių baltymų jų atkurtoje sistemoje.
00: 15: 59.02 Taigi mes iškėlėme hipotezę.
00:16:00.23 Ir mes iškėlėme hipotezę, kad visame citoplazmos komplekse gali būti
00: 16: 06.11 daug funkcijų, kurios kontroliuoja aktino gijų augimą.
00:16:09.17 Ir mes manėme, kad mielės yra ideali sistema ieškant tų alternatyvių mechanizmų,
00: 16: 16.11, nes galite padaryti vadinamąjį sintetinį mirtiną ekraną, kuriame padarote vieno geno mutaciją
00: 16: 21.25 ir tada, jei yra genų, kurie atlieka nereikalingas ar sutampančias funkcijas, galite juos rasti
00: 16: 27.00, kai gaminate dvigubus mutantus.
00:16:29.01 Mes susitikome su Constanzo ir Boone Toronte ir pradėjome ten.
00: 16: 34.22 Kapitono baltymas yra heterodimeras, pagamintas iš Cap1 ir Cap2.
00: 16: 40.00 Padedamas Boone laboratorijos, atliko genetinį tyrimą ir rado mutantus
00: 16: 45.03 palei vidurį, čia viskas buvo. turėjo sintetinius fenotipus su ribojančio baltymo mutantais.
00: 16: 50.19 Ir tai buvo visi kandidatai į naujus veiksnius, kurie kontroliuoja gijų pailgėjimą.
00:16:55.16 Ir štai mūsų draugas Aip1, taip pat abp1, genas, kurį radome prieš keletą metų laboratorijoje.
00: 17: 02.24 Ir paaiškėja, kad Abp1 sukuria kompleksą su Aim3, o Aip1 asocijuojasi su kofilinu.
00: 17: 09.18 Taigi, kai mes panaudojome Alphee in vitro tyrimą, vienas mutantas bet kuriame iš šių baltymų, įskaitant
00:17:16.15 ribojantis baltymas Aim3, Abp1 neturėjo įtakos gebėjimui formuoti aktino uodegas, kurios
00: 17: 22.09 išstumtų karoliukus per. per mielių ekstraktą.
00: 17: 25.09 Čia mes fluorescenciniu būdu pažymėjome aktiną, kad galėtume matyti varomąsias uodegas
00: 17: 29.23 karoliukai.
00:17:30.27 Tačiau baltymų mutantai, kurie buvo genetiškai susiję kaip pertekliniai, sukėlė visišką
00: 17: 36.23 prarandama galimybė formuoti šias uodegas ir varyti karoliukus per ekstraktą,
00: 17: 42.21, tai buvo įrodymas, kad šiuose pailgėjimo reguliavimo mechanizmuose yra perteklius.
00:17:49.04 Taigi, kai pažvelgėme į tai, kur Aip1 ir ribojantis baltymas yra tinkluose, kuriuos galime suformuoti
00: 17: 55.20 mielių ląstelėse, šie aktino tinklai, kurie susirenka ląstelės paviršiuje
00:18:00.22 ir tada patekę į ląstelės vidų, kai pažymėjome Aip1 su GFP, nustatėme, kad Aip1 buvo
00:18:07.22 buvo perkeltas į senesnę aktyvaus tinklo dalį ir tai, kai pažymėjome ribinį baltymą,
00:18:14.14 ribojantis baltymas buvo naujesnėje tinklo dalyje.
00:18:18.28 Ir tai buvo prasminga, nes uždengiamasis baltymas uždarė siūlus, kai jie pradėjo.
00:18:24.06 netrukus po jų surinkimo, o Aip1 dirbo su kofilinu, kad gaubtų gijas
00:18:29.16 po to, kai jie buvo nupjauti, kad jie negalėtų atkaitinti arba suformuoti branduolio
00: 18: 34.04 nauji siūlai.
00: 18: 35.12 Taigi, ką mes padarome iš šių eksperimentų, derindami genetiką ir biochemiją,
00: 18: 41.21 yra tai, kad normalioje laukinio tipo ląstelėje yra bent trys valdymo mechanizmai
00: 18: 47.00 aktino gijų augimas.
00: 18: 48.09 Čia yra ribojantis baltymas, parodyta geltonai.
00: 18: 50.22 Yra šis „Abp1“ baltymas, kuris veikia su purpurine spalva „Aim3“.
00:18:55.22 Ir tada yra Aip1, žalia spalva.
00: 18: 58.22 Ir tas Aip1 ir ribojantis baltymas užima skirtingas tinklo dalis.
00:19:02.22 Kai pašaliname vieną iš šių baltymų, kiti baltymai gali įsitraukti ir aprūpinti
00: 19: 08.04 pakankamai apribojimo veiklos, kad valdytumėte tinklą.
00: 19: 11.06 Bet kai mes darome konkrečius porinius derinius, visas tinklas sugenda dėl
00: 19: 16.13 gebėjimas. nes ląstelės nebeturi galimybės valdyti. asamblėja
00: 19: 22.02 jų aktinų tinklo.
00:19:24.24 Gerai, taigi grįžtant prie šios Mullinso ir Pollardo sukurtos diagramos.
00: 19: 33.28 paskutinis žingsnis, į kurį mūsų laboratorija sutelkė dėmesį, yra šių aktinų tinklų branduoliai, gerai?
00: 19: 40.06 „Arp2/3“ komplekse.
00: 19: 43.14 Ir tada, kai pažvelgsime į mūsų diagramą, kurioje apibendrinta metų darbo dalis, siekiant išsiaiškinti šį endocitą
00: 19: 49.26 pumpurinių mielių kelias, mes nustatėme daugybę skirtingų veikiančių modulių
00: 19: 54.27 skirtingos funkcijos skirtingu laiku ir padėtyje šiuose endocitiniuose įvykiuose.
00:19:59.28 Ir vieną iš šių modulių vadiname WASP/miozino moduliu, nes jame yra mielių WASP,
00:20:05.10 vadinamas Las17, jame yra 1 tipo miozino ir dar pusšimtis papildomų baltymų.
00: 20: 11.24 Ir tai yra baltymai, kurie sukuria aktino gijų junginį ir sukuria jėgas
00:20:18.02 ant tų. ant tų aktino gijų.
00: 20: 20.16 Taigi mus labai sudomino keli klausimai.
00: 20: 24.22 Jūs žinote, kaip aktino agregatas sukuria jėgas, kurios panaudojamos invaginuoti
00:20:29.04 membrana?
00:20:30.04 Kokios veiklos reikia?
00: 20: 31.24 Ir tada, kodėl visas šis kelias toks sudėtingas?
00:20:34.27 Kodėl jums reikia tiek daug baltymų, kad susidarytų pūslelė?
00: 20: 37.25 Ir mes manėme, kad gera vieta pradėti ieškoti šiame WASP/miozino modulyje,
00:20:41.23 kuriame yra daug baltymų, kurie buvo visi. visi turėjo kelis domenus.
00: 20: 46.08 Ir ar galėtume sužinoti, kokios esminės funkcijos yra atliekamos.
00:20:51.17 šis WASP/miozino modulis?
00:20:53.24 Taigi, įrodymas, kad tai tikrai galioja. kad tai tikrai tinkama vadinti moduliu
00: 21: 01.13 ateina iš Rong Li darbo, kai jos postdoc Soulard sugebėjo išvalyti didžiąją dalį
00: 21: 08.08 baltymai šiame modulyje kaip kompleksas.
00:21:11.05 Ir taip, Ericas Lewellynas ir Rossas Pedersenas ir. ir kiti mano laboratorijoje susirinko ir nusprendė
00: 21: 18.02, kad sužinotumėte, ar jie galėtų distiliuoti visų šiame modulyje esančių baltymų veiklą ir
00: 21: 23.00 sužinokite, kokia yra esminė endocitozės veikla.
00:21:26.10 And so, they made deletion mutations of whole genes, they deleted domains of proteins,
00:21:31.16 they made an artificial fusion protein, which is shown here.
00:21:35.15 What they found is that all you needed to drive this actin-mediated endocytic event
00:21:42.10 were a couple domains from a type 1 myosin, and a couple domains from the yeast WASP protein.
00:21:50.08 And that was sufficient.
00:21:52.08 This protein, this artificial synthetic protein, could replace all of the other proteins in
00:21:57.00 the module and make productive endocytic vesicles.
00:22:00.11 So, what are the activities, then, that are contained in this module?
00:22:04.08 There are four activities and they're shown here.
00:22:08.03 One activity is the so-called nucleation promoting factor activity, the ability to activate
00:22:14.03 the Arp2/3 complex.
00:22:15.08 That is absolutely essential to nucleate actin filaments for productive endocytic events.
00:22:20.11 The second is a myosin motor activity.
00:22:23.01 A myosin motor activity is essential for productive endocytic events.
00:22:27.05 You also need a so-called TH1 domain that binds to acidic phospholipids.
00:22:33.05 Finally, a proline-rich domain was needed in this synthetic molecule, because that proline-rich domain
00:22:40.23 is required to recruit this molecule to the endocytic site.
00:22:46.20 And that was very interesting to us, the need for proline-rich domain to concentrate the.
00:22:52.20 this machinery for assembling actin and making forces on actin at the endocytic sites,
00:22:59.08 because work from Michael Rosen's lab had shown that proline-rich motifs can interact in a mult.
00:23:06.09 when they're in a multivalent state with SH3 domains in a multivalent state to make
00:23:12.06 liquid droplets in solution, okay?, in biochemical studies.
00:23:16.16 And we wondered whether something like this might be occurring during the endocytic pathway
00:23:22.01 of yeast.
00:23:23.01 In fact, if you look at the proteins in the WASP/myosin module, and upstream from it,
00:23:29.04 many of these proteins -- there's a huge enrichment -- have SH3 domains and proline-rich domains,
00:23:35.15 and they're multivalent.
00:23:37.02 They have many of these -- multiple SH3 domains, multiple proline-rich domains.
00:23:41.09 And so we hypothesized that some kind of condensation reaction in the living cell is responsible
00:23:48.02 for distilling down and concentrating this machinery in the WASP/myosin complex and
00:23:54.19 bringing it to the endocytic site to nucleate this burst of actin assembly.
00:23:59.26 And so, some years ago, we found a master regulator of endocytosis in yeast.
00:24:05.22 There's a protein kinase called Prk1.
00:24:08.18 What happens is there's a burst of actin assembly at the plasma membrane, the actin recruits
00:24:13.17 this kinase, and the kinase feeds back and turns off actin assembly.
00:24:20.17 We made a so-called analog-sensitive allele of Prk1 kinase using a technology that
00:24:26.14 Kevan Shokat at UCSF developed.
00:24:28.17 And so that gave us a chemical switch, where we could turn on and off the kinase.
00:24:32.02 And so, remember, this kinase causes the actin nucleation to stop.
00:24:37.21 And so when we inhibit the kinase, the actin nuclea. the new actin sites can be assembled
00:24:43.06 that they can't be disassembled.
00:24:45.18 And so here we've done that, and we've added this inhibitor right now.
00:24:50.04 And now, what happens is new sites assemble but they can't disassemble.
00:24:53.19 And what happens is they start to all collect together and fuse with each other, with a
00:24:59.00 behavior that looks very much like liquid droplets.
00:25:01.13 There was another big fusion event.
00:25:03.15 Now, if we take a cell where we've treated it with the inhibitor and allowed these
00:25:08.04 large droplet-like structures to form -- made from actin and actin binding proteins --
00:25:13.22 and now we wash out the inhibitor, what we find is that immediately this structure dissolves.
00:25:19.22 Again, behavior that looks like a liquid droplet.
00:25:22.28 So, trying to explore this network, Yidi Sun, a specialist in the lab who's been involved
00:25:29.14 in many of the studies I've talked about today, decided to dissect this network of SH3/proline-rich
00:25:35.04 motif interactions.
00:25:37.10 And she looked through it and used literature and used her evidence from her own studies,
00:25:43.02 and was able to find that there were two sites that she could perturb in this very complex
00:25:49.02 network that would dissociate the endocytic machinery from the actin assembly machinery.
00:25:55.10 And these cuts prevented the type-1 myosin and the WASP protein from being recruited
00:26:00.14 to endocytic sites.
00:26:01.27 Interestingly, all of these proteins have homologues in mammalian cells.
00:26:06.26 And the ones -- Pan1 and Sla1 -- that are responsible for recruiting the actin machinery
00:26:11.18 to endocytic sites, in these cells, have a homologue called intersectin in mammalian cells.
00:26:17.15 So, we think the principles that were learned from Yidi's studies are likely to apply
00:26:20.18 in mammalian cells.
00:26:21.21 So, what happens when you snip these two specific interactions?
00:26:26.24 What happens is really fascinating.
00:26:29.09 The endocytic sites assemble on the surface of the yeast cell, shown in green,
00:26:34.01 but the actin, now shown in red, is completely uncoupled from the endocytic sites.
00:26:38.15 It still assembles, but it assembles on these internal rocket tail-like structures that
00:26:42.24 look a lot like these Listeria that swim around inside the cell.
00:26:46.13 So, Lis. so, Yidi was able to uncouple actin assembly from the formation of the endocytic sites.
00:26:52.09 She was able to restore this by artificially recruiting these WASP or myosin proteins
00:26:58.10 back to the endocytic site.
00:27:00.15 Now, what's really interesting here is that in a wild-type cell the WASP protein accumulates
00:27:08.10 over time -- the fluorescence intensity monitors the accumulation of WASP --
00:27:13.02 but while WASP is accumulating there's no actin assembly.
00:27:16.17 It's not until you get to a certain level, when suddenly there's a burst of actin assembly.
00:27:22.13 It seems to occur in sort of an all-or-nothing or switch-like manner.
00:27:26.10 When Yidi made the mutation, so WASP no longer gets recruited to the site, and then put in
00:27:30.18 an artificial way of recruiting it, again, you needed WASP to rise to a certain level,
00:27:36.03 you needed more -- which wasn't surprising, because it had lost its multivalency --
00:27:40.20 before, again, there was this sudden burst of actin assembly.
00:27:44.01 And so, from this, what we think is that this. that there may be a phase transition involving
00:27:50.04 these multivalent linker proteins that concentrate the WASP and the myosin together
00:27:57.07 at these endocytic sites, and that only when the concentration gets high enough is there a burst of
00:28:02.27 actin assembly.
00:28:03.27 And so, for these studies I went through a lot of work that covered a lot of former members.
00:28:11.06 current and former members of lab, and they are all listed here.
00:28:15.10 And that's the last of my four segments.
- Part 1: Introduction: Actin, Endocytosis and the Early Days of Yeast Cell Biology
Turinys
Although receptors and their ligands can be brought into the cell through a few mechanisms (e.g. caveolin and lipid raft), clathrin-mediated endocytosis remains the best studied. Clathrin-mediated endocytosis of many receptor types begins with the cargo ligands in the luminal compartment of the vesicle binding to receptors on the cell membrane. The cargo ligand and receptor will then recruit adaptor proteins and clathrin triskelions to the outside membrane of the cell around where budding will form. Budding of the plasma membrane then occurs, forming a clathrin-coated pit. [1] Other receptors can nucleate a clathrin-coated pit allowing formation around the receptor. A mature pit will be cleaved from the plasma membrane through the use of membrane-binding and fission proteins such as dynamin (as well as other BAR domain proteins), [2] forming a clathrin-coated vesicle that then uncoats and typically fuses to a sorting endosome. Once fused, the endocytosed cargo (receptor and/or ligand) can then be sorted to lysosomal, recycling, or other trafficking pathways. [1]
The function of receptor-mediated endocytosis is diverse. It is widely used for the specific uptake of certain substances required by the cell (examples include LDL via the LDL receptor or iron via transferrin). The role of receptor-mediated endocytosis is well recognized up take downregulation of transmembrane signal transduction but can also promote sustained signal transduction. [3] The activated receptor becomes internalised and is transported to late endosomes and lysosomes for degradation. However, receptor-mediated endocytosis is also actively implicated in transducing signals from the cell periphery to the nucleus. This became apparent when it was found that the association and formation of specific signaling complexes via clathrin-mediated endocytosis is required for the effective signaling of hormones (e.g. EGF). Additionally it has been proposed that the directed transport of active signaling complexes to the nucleus might be required to enable signaling, due to the fact that random diffusion is too slow, [4] and mechanisms permanently downregulating incoming signals are strong enough to shut down signaling completely without additional signal-transducing mechanisms. [5]
Using fluorescent or EM visible dyes to tag specific molecules in living cells, it is possible to follow the internalization of cargo molecules and the evolution of a clathrin-coated pit by fluorescence microscopy and immuno electron microscopy. [6] [7]
Since the process is non-specific, the ligand can be a carrier for larger molecules. If the target cell has a known specific pinocytotic receptor, drugs can be attached and will be internalized.
To achieve internalisation of nanoparticles into cells, such as T cells, antibodies can be used to target the nanoparticles to specific receptors on the cell surface (such as CCR5). [8] This is one method of improving drug delivery to immune cells.
Long-Range Membrane Properties
3.1.3 Caveolae
Caveolae are complex plasma membrane structures whose properties appear to place them between coated pits and lipid rafts ( Chapter 8 ). They are small (50–100 nm) invaginated membrane structures that superficially resemble coated pits ( Fig. 11.9 , [32] ). In fact, in 1955, Yamada [33] proposed the descriptive name “caveolae” which is Latin for little caves. Caveolae were first described by the electron microscopist George Palade in 1953 and are abundant in many vertebrate cell types, especially endothelial cells and adipocytes where they may account for 30–70% of the total plasma membrane surface area. Caveolae however, are not a universal feature of all cells as they are totally absent in neurons. Like lipid rafts, caveolae are partially characterized by being enriched in sphingolipids and cholesterol and also participate in signal transduction processes [34,35] . In fact caveolae are often described as being “invaginated lipid rafts” that differ primarily by the presence of a family of marker proteins called caveolins. But, similar to coated pits, caveolae may also play a role in endocytosis.
Figure 11.9 . Transmission electron micrographs of endothelial caveolae.
Supplementary Information
(RTKs). A family of plasma membrane proteins (
60 genes in humans) that function as high affinity binding sites for growth factors and cytokines and transduce signals intracellularly through their intrinsic tyrosine kinase activity.
G protein-coupled receptors
(GPCRs). A vast family of plasma membrane receptors (more than 800 genes in humans) characterized by seven transmembrane regions. They transduce signals through a variety of modes, among which the best characterized is the coupling with heterotrimeric G proteins.
A family of proteins that act as multifunctional scaffolding proteins, regulating the trafficking and signalling of transmembrane receptors, particularly of GPCRs. They are involved in receptor desensitization, endocytosis and ubiquitylation. They can also function as positive effectors of GPCRs through their scaffolding abilities. The arrestin family comprises visual arrestins, β-arrestins (non-visual arrestins) and α-arrestins.
The three members of the human AKT serine-threonine protein kinase family are often referred to as protein kinase Bα (PKBα), PKBβ and PKBγ. These proteins are phosphorylated by phosphoinositide 3-kinase (PI3K). AKT–PI3K forms a key component of many signalling pathways that involves the binding of membrane-bound ligands such as RTKs.
Epsin family of endocytic adaptor proteins
A family of endocytic proteins composed of three paralogs: EPN1, EPN2 and EPN3, characterized by the presence of an epsin N-terminal homology domain involved in phosphoinositide binding at the plasma membrane, ubiquitin binding motifs and motifs that bind to clathrin, AP2 and other endocytic proteins. They are involved in both clathrin-mediated endocytosis, where they play a role in clathrin-coat assembly and cargo recruitment, and in the non-clathrin endocytosis of epidermal growth factor receptor.
(EMT). A process, of great relevance in embryogenesis, through which epithelial cells lose polarity and cell–cell adhesion contacts (sessile state) to acquire characteristics of migratory mesenchymal-like cells. In physiology, typically, after migrating, these cells re-acquire an epithelial phenotype through the opposite process of mesenchymal–epithelial transition.
Type I transmembrane proteins belonging to the tumour necrosis factor/nerve growth factor superfamily. They are activated upon binding to various agonists (such as FASLG, TNFA or TRAIL). They typically trigger the so-called apoptotic extrinsic pathway, yet they can also activate multiple alternative signalling pathways with opposing outcomes (survival/proliferation versus cell death) depending on the cell context.
Small flask-shaped invaginations of the plasma membrane (50–80 nm) that can be morphologically identified by the presence of coat-like proteins (caveolins) and that are particularly abundant in tissues involved in lipid homeostasis or subjected to mechanical challenges like adipocytes, muscle cells and endothelial cells.
A protein involved in the formation of focal adhesions that links surface structures (integrins) to the actin cytoskeleton (through binding to F-actin).
Cell-to-matrix adhesion structures involved in the transmission and regulation of signals between the extracellular matrix and the intracellular environment. They are large and dynamic protein complexes established through integrins (which bind to the extracellular matrix), vinculin, F-actin and several regulatory components (up to 100 different proteins, according to the state of the cell). Focal adhesions have roles in signal transduction, cell motility, cell cycle regulation and several other cellular phenotypes. They represent one of the main sensors/effectors in cellular mechanosensing.
A class of proteins that bind specifically to β-galactoside sugars such as N-acetyl-lactosamine. Galectins are secreted in the extracellular space, where they encounter galactose-containing glycoproteins and glycolipids. The binding of galectins to glycosylated proteins, such as CD44 and α5β1 integrin, triggers galectin oligomerization, which allows their interaction with glycosphingolipids and the generation of plasma membrane curvature, leading to the formation of clathrin-independent endocytic carriers.
During angiogenesis, new vessels that sprout from existing ones are guided by a leader cell that drives the extension of the sprout and senses the environment for guidance cues.
Signalling mediated by the activation of the extracellular signal-regulated kinases (ERKs, also called mitogen-activated protein kinases or MAPKs). This signalling is mediated by the sequential activation of the small GTPase RAS and a cascade of kinases (RAF, MEK and ERK1,2) that transduce a signal from a receptor, located on the cell surface or on endosomes, to regulate a number of fundamental biological functions, including cell proliferation, differentiation and migration.
A family of serine/threonine protein kinases that includes six members in mammals. They serve as targets for the small GTPases CDC42 and RAC and have been implicated in a wide range of biological activities.
A lipid phosphatase (phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphate 3-phosphatase). It catalyses the conversion of PI(3,4,5)P3 to PI(4,5)P2, thereby antagonizing the action of PI3K and the activation of AKT. It represents one of the most frequently lost tumour suppressors in human cancers.
AMP-activated protein kinase or 5’ adenosine monophosphate-activated protein kinase. It is a heterotrimeric protein complex endowed with serine/threonine kinase activity that regulates the energy metabolism, mostly acting on glucose and fatty acid metabolism.
A member of RHO subfamily of small GTPases that plays a central role in controlling the activity of protein complexes that are necessary to remodel the actin cytoskeleton during migration.
A member of a class of MAPKs that are responsive to stress stimuli, such as cytokines, ultraviolet irradiation, heat shock and osmotic shock, and are involved in cell differentiation, apoptosis and autophagy.
JNK (or c-Jun N-terminal Kinase) is a member of a family of protein kinases, which play a central role in stress signalling pathways implicated in gene expression, neuronal plasticity, regeneration, cell death and regulation of cellular senescence.
A subfamily of small GTPases that includes more than 70 members in mammals and regulates several key steps of membrane trafficking, including vesicle formation, vesicle movement along actin and tubulin networks, and membrane fusion.
This term broadly defines a vast group of proteins (frequently unrelated) that all possess Guanine Nucleotide Exchange Factor activity, that is, the ability to convert G proteins from an inactive GDP-bound to an active GTP-bound form.
Jammed epithelial monolayers
The dynamics of epithelia has been described in terms of jamming transitions. During this transition, collective motion ceases, cells can no longer exchange neighbours, and monolayers become static and rigid, displaying a behaviour similar to that of ensembles of dense and packed inactive particles such as coffee in a chute or sand in a pile.
Central region of the thin cytoplasmic bridge that connects cells at the end of cytokinesis. It consists mostly of microtubules, together with various other types of proteins (400–500). It functions as a platform to mediate abscission, the process of severing the intercellular bridge. It is also endowed with numerous other functions, including the determination of cell fate and asymmetric post-abscission signal transduction.
A key component of a pentameric actin nucleation promoting complex that acts downstream of the GTPase RAC and is necessary for activating the Arp2/3 complex for the generation of branched actin networks.
A cell-to-cell junction formed by a multiprotein complex. This type of junction is established through homotypic interactions between adhesion molecules (occludins, claudins, JAMs) present on the surface of abutting cells. Tight junctions mark the border between the apical and the basolateral surfaces in epithelial cells and control the formation of functionally distinct apical domains. They are also present in endothelial cells and astrocytes and establish the blood–brain barrier. One of their major function is to seal the epithelia by preventing the leakage of water and small molecular weight solutes.
A seven-subunit complex that, upon activation, promotes the branched elongation of the actin network by binding to the side of mother filaments.
A multiprotein complex composed of three members originally identified in Drosophila melanogaster, Crumbs, Pals1 and PatJ. This complex plays a key role in specifying the apical plasma membrane domain of epithelial cells and in controlling cell shape in both invertebrates and vertebrates.
A process in which molecules are transported across cellular barriers. It involves the endocytosis of molecules (typically plasma membrane proteins or extracellular molecules captured through interaction with surface receptors) at one side of the cell and their vesicle-mediated transport to another side, where they are released through exocytosis. It contributes to the establishment of apical–basal cell polarity by transferring transmembrane proteins between distinct plasma membrane domains. It is involved in many other processes, for instance, in the crossing of the blood–brain barrier.
An octameric protein complex involved in vesicle trafficking, specifically in the tethering and spatial targeting of vesicles to the plasma membrane prior to vesicle fusion.
A 36-kDa calcium-dependent, phospholipid-binding protein that functions in promoting the exocytosis of intracellular proteins to the extracellular space.
CDC42 apical polarity complex
CDC42 is a highly conserved RHO-family GTPase that regulates cell polarity in many eukaryotes. It directly interacts with PAR6 and regulates, through this protein, the activity of the atypical protein kinase C (aPKC).
BAR domains are banana-shaped protein domains capable of sensing membrane curvature by binding preferentially to positively curved membranes and named after three proteins in which they were originally identified: BIN1 (bridging interactor 1), AMPH (amphiphysin) and Rvs167 (the yeast homolog of amphiphysin). In contrast to the banana-shaped BAR domains, the I-BAR (which stand for inverse BAR) domain is a zeppelin-shaped structure with convex geometry, thus generating negative membrane curvature.
Cadherin-based cell-to-cell junctions present in epithelial and endothelial cells, frequently in a more basal position with respect to tight junctions.
A process in which the volume of a closed system does not change. It is synonym of isovolumetric.
Į Drosophila melanogaster, the ventral part of the embryo that forms during gastrulation and gives rise to the segmented trunk of the animal (gnathal, thoracic, abdominal segments). It includes the mesoderm, ventral ectoderm and dorsal epidermis but excludes the dorsal-most tissue of the embryo, the amnioserosa.
Į Drosophila melanogaster, a short-lived extraembryonic tissue with a critical role in dorsal closure and other early developmental morphogenetic events.
A cluster of cells that migrate from the anterior tip of the Drosophila melanogaster egg chamber to the border of the oocyte at stage 9 of oogenesis. These cells perform a stereotypical collective migration on the intervening nurse cells and reach the oocyte. They are required for the formation of the micropyle, the eggshell structure through which sperm enters the egg.
Thin membrane protrusion present at the leading edge of migrating cells, mostly constituted by a flat network of actin.
A process characterizing filamentous multimeric protein structures within the cell and mostly used in reference to filamentous actin (F-actin). When actin subunits (G-actin) are constantly added at one end of the filament and removed from the opposite one, the net effect is the treadmilling of the filament which is used, for instance, to generate motion. The term is also used, more generally, for other biological processes in which the treadmilling of molecules or organelles occurs.
A temporary group of cells established during vertebrate development, which forms after gastrulation at the border between the neural plate and the surrounding ectoderm. After closure of the neural tube (due to the folding of the neural plate into itself), the neural crest runs along the roof plate of the neural tube. At this stage, neural crest cells undergo EMT and migrate to the periphery, where they give origin to various cell lineages.
An abnormal accumulation of fluid in the abdominal cavity frequently caused by liver disease or cirrhosis, cancers (specifically ovarian and colon cancer), and heart failure.