Informacija

9.5: Hibridizacija situacijoje - biologija

9.5: Hibridizacija situacijoje - biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

5.5 Hibridizacija vietoje

Savo vietoje hibridizacija (ISH) yra hibridizacijos rūšis, kuriai naudojama paženklinta papildoma DNR, RNR arba modifikuota nukleorūgščių grandinė (t. y. zondas), kad lokalizuotų specifinę DNR ar RNR seką audinio dalyje ar dalyje (savo vietoje) arba jei audinys pakankamai mažas (pvz., augalų sėklos, Drosophila embrionuose), visame audinyje (visame ISH kalne), ląstelėse ir cirkuliuojančiose naviko ląstelėse (CTC). Tai skiriasi nuo imunohistochemijos, kuri paprastai lokalizuoja baltymus audinių skyriuose.

In situ hibridizacija naudojama norint atskleisti specifinių nukleorūgščių sekų vietą chromosomose arba audiniuose, o tai yra esminis žingsnis siekiant suprasti genų organizaciją, reguliavimą ir funkciją. Pagrindinės šiuo metu naudojamos technologijos apima savo vietoje hibridizacija su mRNR oligonukleotidais ir RNR zondais (ir radioaktyviais, ir haptenais pažymėtais), analizė su šviesos ir elektronų mikroskopais, visas montavimas savo vietoje hibridizacija, dvigubas RNR ir RNR plius baltymo aptikimas ir fluorescencija savo vietoje hibridizacija, siekiant aptikti chromosomų sekas. DNR ISH gali būti naudojamas chromosomų struktūrai nustatyti. Pavyzdžiui, fluorescencinė DNR ISH (FISH) gali būti naudojama medicininėje diagnostikoje, siekiant įvertinti chromosomų vientisumą. RNR ISH (RNA savo vietoje hibridizacija) naudojamas RNR (mRNR, lncRNR ir miRNR) išmatuoti ir lokalizuoti audinių sekcijose, ląstelėse, ištisuose kalnuose ir cirkuliuojančiose naviko ląstelėse (CTC). Savo vietoje hibridizaciją išrado Mary-Lou Pardue ir Joseph G. Gall.

5.28 pav. Laukinio tipo hibridizacija in situ Drosophila embrionai skirtingose ​​vystymosi stadijose, kad gautų RNR iš geno, vadinamo kuprotu.

Nuotrauka Ninos


Hibridizacijos histochemijai mėginių ląstelės ir audiniai paprastai apdorojami, kad būtų užfiksuoti tiksliniai transkriptai ir padidintas zondo prieinamumas. Kaip minėta aukščiau, zondas yra arba pažymėta komplementari DNR, arba, dabar dažniausiai, komplementari RNR (ribozondas). Zondas hibridizuojasi su tiksline seka aukštesnėje temperatūroje, o tada zondo perteklius nuplaunamas (po išankstinės hidrolizės naudojant RNazę, jei RNR zondas yra nehibridizuotas, perteklinis). Tirpalo parametrus, tokius kaip temperatūra, druska ir (arba) ploviklio koncentracija, galima manipuliuoti, kad būtų pašalinta bet kokia ne identiška sąveika (t. Y. Tik tikslios sekos atitiktys liks surištos). Tada zondas, pažymėtas radioaktyviosiomis, fluorescencinėmis arba antigenu pažymėtomis bazėmis (pvz., digoksigeninu), yra lokalizuojamas ir kiekybiškai įvertinamas audinyje, naudojant atitinkamai autoradiografiją, fluorescencinę mikroskopiją arba imunohistochemiją. ISH taip pat gali naudoti du ar daugiau zondų, paženklintų radioaktyvumu arba kitomis neradioaktyviosiomis etiketėmis, kad vienu metu aptiktų du ar daugiau nuorašų.

RNR (mRNR, lncRNR ir miRNR) gali būti naudojama alternatyvi technologija, šakotosios DNR tyrimas. savo vietoje hibridizacijos tyrimai su vienos molekulės jautrumu, nenaudojant radioaktyvumo. Šis metodas (pvz., „ViewRNA“ tyrimai) gali būti naudojamas norint vizualizuoti iki keturių taikinių viename tyrime, o jautriems ir specifiniams signalams generuoti naudojamas patentuotas zondo dizainas ir bDNR signalo stiprinimas. Mėginiai (ląstelės, audiniai ir CTC) yra fiksuojami, tada apdorojami, kad būtų galima pasiekti RNR taikinį (RNR demaskavimas). Tiksliniai zondai hibridizuojasi su kiekviena tiksline RNR. Vėlesnis signalo stiprinimas priklauso nuo specifinės gretimų zondų hibridizacijos (atskiri oligonukleotidai [oligos], kurie jungiasi vienas šalia kito su RNR taikiniais). Tipiškame taikinio specifiniame zonde bus 40 oligonukleotidų, todėl 20 oligo porų jungiasi greta taikinio, kad būtų galima aptikti mRNR ir lncRNR, ir 2 oligos arba viena pora miRNR aptikimui. Signalo stiprinimas pasiekiamas nuosekliais hibridizacijos etapais. Pirminio stiprintuvo molekulė hibridizuojasi su kiekviena tikslinės RNR oligo pora, tada kelios stiprintuvo molekulės hibridizuojasi su kiekvienu išankstiniu stiprintuvu. Tada keli žymėjimo zondo oligonukleotidai (konjuguoti su šarmine fosfataze arba tiesiogiai su fluoroforais) hibridizuojasi su kiekviena stiprintuvo molekule. Visiškai surinkta signalo stiprinimo struktūra „Medis“ turi 400 surišimo vietų etikečių zondams. Kai visi taikiniams būdingi zondai prisijungia prie tikslinio mRNR transkripto, to vieno transkripto signalo amplifikacija įvyksta 8000 kartų. Atskiros, bet suderinamos signalo stiprinimo sistemos leidžia atlikti multipleksinius tyrimus. Signalą galima vizualizuoti naudojant fluorescencinį arba šviesaus lauko mikroskopą.


Viso kalno naudojimas savo vietoje hibridizacija, siekiant iliustruoti genų ekspresijos reguliavimą

Beatriz Llamusí ir Verónica Muñoz-Soriano vienodai prisidėjo prie šio darbo.

Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitet de València, Valensija, Ispanija

Beatriz Llamusí ir Verónica Muñoz-Soriano vienodai prisidėjo prie šio darbo.

Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitet de València, Valensija, Ispanija

Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitat de València, Valensija, Ispanija

INCLIVA sveikatos tyrimų institutas, Valensija, Ispanija

Adresas korespondencijai: Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitat de València, València, Ispanija. paštas: [email protected] Ieškokite daugiau šio autoriaus darbų

Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitat de València, Valensija, Ispanija

INCLIVA sveikatos tyrimų institutas, Valensija, Ispanija

Beatriz Llamusí ir Verónica Muñoz-Soriano vienodai prisidėjo prie šio darbo.

Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitat de València, Valensija, Ispanija

Beatriz Llamusí ir Verónica Muñoz-Soriano vienodai prisidėjo prie šio darbo.

Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitat de València, Valensija, Ispanija

Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitat de València, Valensija, Ispanija

INCLIVA sveikatos tyrimų institutas, Valensija, Ispanija

Adresas korespondencijai: Genetikos katedra, Biologijos fakultetas, Universitat de València, València, Ispanija. Paštas: [email protected] Ieškokite daugiau šio autoriaus straipsnių


Džozefas Galas

Josephas Gallas yra Carnegie mokslo instituto profesorius ir yra ląstelių biologijos srities lyderis. Didžiąją savo karjeros dalį jis praleido tyrinėdamas branduolį ir jo turinį ir daug prisidėjo prie mūsų supratimo apie chromosomų struktūrą ir funkcijas. Gall, žymus mikroskopininkas, yra vienas iš… Continue Reading


9.5: Hibridizacija situacijoje - biologija

Hibridizacija in situ (ISH) yra tam tikras tipas hibridizacija kuri naudoja pažymėtą komplementarią DNR arba RNR grandinę (t. y. zondą), kad lokalizuotų specifinę DNR arba RNR seką in audinio dalis arba dalis (savo vietoje), arba, jei.
Visas straipsnis >>>

FISH (fluorescencija in situ hibridizacija) yra citogenetinis . MeSH Fluorescence+ in+ Situ+ Hibridizacija. Informacija apie FISH pluoštą iš Olympus Corporation.
Visas straipsnis >>>

Į situ hibridizacija. Ab dažymas. TUNEL dažymas. Kremzlės dažymas. Embrionų skirstymas. visam kalnui in situ hibridizacija puikiai tinka.
Visas straipsnis >>>

Naudojant in situ hibridizacija, galima lokalizuoti genų ekspresiją į . Pirmasis žingsnis in situ hibridizacija yra zondo tipo pasirinkimas. .
Visas straipsnis >>>

Sprendimai, skirti in situ hibridizacija . Parengimas Į Situ Hibridizacija buferis: . Po to in situ hibridizacija baigta, nuplaukite dengiamuosius stiklelius 0,05M .
Visas straipsnis >>>

IN SITU HIBRIDIZACIJA VIENGRUODĖJŲ RNR ZONDŲ SU ARABIDOPSIS GĖLIŲ AUDINIU . Meyerowitz (1987) Į situ hibridizacija į RNR augalų audiniuose. Augalas.
Visas straipsnis >>>

Į situ hibridizacija yra galinga technika, kuri gali būti labai informatyvi. . Kai atlieka in situ hibridizacija pirmą kartą dažnai pageidautina .
Visas straipsnis >>>

Daugiaspalvė fluorescencija in situ hibridizacija (ŽUVYS), paprasčiausia forma, gali . Į situ hibridizacija rinkiniai ir fluorescenciniu būdu pažymėti zondai yra parduodami.
Visas straipsnis >>>

RPA/RNAi/Į Situacija Hibridizacija Tyrimo šerdis. IN SITU HIBRIDIZACIJA yra vaizdo gavimo metodas, skirtas vizualizuoti mRNR ekspresiją audiniuose ir ląstelėse. .
Visas straipsnis >>>

Į situ hibridizacija - metodas. Metodų lentelė. atnaujinta - 2003 m. sausio 18 d. SOX3. galima atlikti in situ hibridizacija ant balintų embrionų atrodo.
Visas straipsnis >>>

Faktų lapas apie fluorescenciją in situ hibridizacija (FISH), paskelbė Nacionalinis žmogaus genomo tyrimų institutas. . in situ hibridizacija (ŽUVYS) .
Visas straipsnis >>>

Imunohistochemijos šaltinių sąrašas internete. Apima imunofermentų metodų, imunofluorescencijos ir in situ hibridizacijos.
Visas straipsnis >>>

Į situ hibridizacija santrauka su 7 puslapiais enciklopedijos įrašų, esė, santraukų, tyrimų informacijos ir kt. . straipsniai apie Į situ hibridizacija. .
Visas straipsnis >>>

Procedūros, skirtos Į Situ Hibridizacija į chromosomas, ląsteles ir audinių skyrius. Į situ hibridizacija į žmogaus metafazių chromosomas naudojant DIG-, biotiną arba .
Visas straipsnis >>>

. Praktinė fluorescencijos alternatyva in Situ Hibridizacija aptikti HER-2/neu . Fluorescencija in situ hibridizacija (FISH) šiuo metu yra laikomas auksu.
Visas straipsnis >>>


Hibridizacija in situ

hibridizacija in situ
geno vietos nustatymas pridedant specifinius radioaktyvius geno zondus ir aptinkant radioaktyvumo vietą chromosomoje po hibridizacijos
Šaltinis: Jenkins, John B. 1990. Human Genetics, 2nd Edition. Niujorkas: Harper & Row.

fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH)
Genetinio žymens chromosomoje vizualizavimo metodas, naudojant fluorescenciniu būdu pažymėtą polinukleotidinį zondą, kuris hibridizuojasi su geno lokusu chromosomoje ir nurodo jo vietą mitozės (metafazės) metu. (taip pat žr. tarpfazių branduolių kartografavimą) .

Situacijos hibridizacija
In situ hibridizacija yra laboratorinis metodas, kai vienos grandinės DNR arba RNR seka, vadinama zondu, leidžia sudaryti papildomas bazines poras su DNR ar RNR, esančiomis audinio ar chromosomos mėginyje.

Hibridizacija in situ
Genų kartografavimo metodas, apimantis pažymėto klonuoto geno mėginio hibridizavimą su didele DNR molekule (dažniausiai chromosoma), dažnai ląstelėje.

in situ hibridizacija DNR arba RNR zondo naudojimas norint aptikti papildomas DNR sekas, auginamas eukariotų ląsteles arba bakterijų klonus.

In situ hibridizacija Klonuotų DNR sekų kartografavimo metodas hibridizuojant tiesiogiai su metafazinėmis chromosomomis ir analizuojant mikroskopu (žr. 10 skyrių).
Žr. In situ Hibridizavimas MGI žodyne.

Hibridizacija in situ Šis metodas skirtas specifinei RNR, esančiai histologiniuose mėginiuose, aptikimui. Audinys ruošiamas ypač atsargiai, kad nesuardytų RNR. Ląstelės fiksuojamos ant mikroskopo stiklelio, leidžiama hibridizuotis su zondu, po to plaunamos ir padengiamos fotografine emulsija.

in situ hibridizacija – nukleorūgščių sekų vietos nustatymas ląstelėje ar organizme.
induktoriaus genas – genas, koduojantis lac operono represorinį baltymą, kai laktozė jungiasi su represoriaus baltymu, indukuojamas lac operonas.

Fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH) reiškia fluorescenciniu būdu pažymėto zondo naudojimą hibridizuotis su citogenetiniais ląstelių preparatais.
Be standartinių preparatų FISH taip pat galima atlikti: .

Fluorescencinės in situ hibridizacijos (FISH) technika naudojama DNR sekoms chromosomose nustatyti ir identifikuoti bei chromosomų defektams aptikti, ji gali būti naudojama tiriant ir aptinkant bakterijų patogenus žmogaus žarnyne, pvz., Enterococcusspp, ši technika yra paprasta ir efektyvi kaip ir .

Hibridizacija in situ
DNR arba RNR zondo naudojimas norint nustatyti komplementariosios DNR sekos buvimą klonuotose bakterinėse arba kultivuojamose eukariotų ląstelėse. (ORNL)
In vitro
Tyrimai, atlikti ne gyvame organizme, pavyzdžiui, laboratorijoje. (ORNL)
In vivo
Tyrimai, atlikti su gyvais organizmais. (ORNL) .

FISH – fluorescencinė in situ hibridizacija: metodas, skirtas unikaliai identifikuoti visas chromosomas arba chromosomų dalis, naudojant fluorescuojančią DNR. 5' - galas - polinukleotido galas su laisva (arba fosforilinta arba uždaryta) 5' - hidroksilo grupės transkripcija / transliacija prasideda nuo šio galo.

(fluorescencijos in situ hibridizacija): vienas iš modernesnių citogenetikos metodų, kuriame naudojama fluorescencija pažymėta chromosomai būdinga DNR, zondai, skirti aptikti translokacijas, inversijas, delecijas, amplifikacijas ir kitus struktūrinius ar skaitinius chromosomų anomalijas.

Hibridizacija in situ: aptinka nuorašo buvimą
MS2 žymėjimas: į geną įtraukiant RNR kamieno kilpas, tokias kaip MS2, jos įtraukiamos į naujai susintetintą RNR.

Vienas iš jų vadinamas „in situ hibridizacija“. Vienas dalykas, kurį būčiau labai norėjęs žinoti, kai iš pradžių tyrinėjau antenpedijos mutantą vaisinėse muselėse, yra tai, kur organizme išreiškiami tam tikri genai. In situ hibridizacija leidžia ištirti, kur organizme naudojami skirtingi genai.

Niko vertimas yra dažniausiai naudojamas zondų žymėjimo in situ hibridizacijai metodas. Jis gavo savo pavadinimą iš viengrandžių įtrūkimų, atsirandančių dėl DNR, apdorotos DNR, ir slapyvardis „išvertė“ tam tikrą atstumą, priklausomai nuo polimerazės procesyvumo.
Gauta iš "" .

Taikant šią naujesnę techniką, keli skirtingi vienai chromosomų porai būdingi zondai, turintys skirtingą fluorescencinių dažų rinkinio kiekį, yra hibridizuojami su chromosomomis taikant metodą, vadinamą fluorescencine in situ hibridizacija (FISH).

Jei asmens charakteristikos aiškiai rodo Williamso sindromą, gydytojas gali paskirti testą, kuriame naudojamas metodas, vadinamas FISH (fluorescencinė in situ hibridizacija). Jei gydytojas nėra toks tikras dėl diagnozės, jis gali paskirti testą, kuriame, be 7 chromosomos, apžiūrimos ir kitos chromosomos.

Naudojamos ląstelės ir audiniai bei identifikavimo metodai: juostų sudarymo metodai, didelės skiriamosios gebos juostų sudarymas ir fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH) ir mikrodelecija
Chromosomų anomalijos: autosomos ir lytinės chromosomos
P 188-202, 314, 334-5, 400-5
T 9, 10 sk.

Sujungus klonuotą DNR su fluorescenciniais dažais ir hibridizuojant fluorescenciniu būdu pažymėtą DNR tiesiogiai su chromosomų preparatais arba ištisomis ląstelėmis, fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH) leidžia greitai, efektyviai ir patikimai identifikuoti visas chromosomas arba chromosomų fragmentus.


Savo vietoje Parafino įterptų suaugusiųjų koralų mėginių hibridizacijos metodai

Šio protokolo tikslas yra atlikti savo vietoje hibridizacija ant suaugusių koralų mėginių, kurie buvo įterpti į parafiną ir supjaustyti ant stiklinių stiklelių. Tai kokybinis metodas, naudojamas RNR antisensinio zondo erdvinei raiškai vizualizuoti parafinu įterptuose audiniuose.

Abstraktus

Koralai yra svarbūs vandenyno bestuburiai, kurie yra labai svarbūs bendrai vandenynų ir žmonių sveikatai. Tačiau dėl žmogaus poveikio, pavyzdžiui, kylančios vandenyno temperatūros ir vandenynų rūgštėjimo, koralams kyla vis didesnė grėsmė. Norint įveikti šiuos iššūkius, ląstelių ir molekulinės biologijos pažanga pasirodė esanti labai svarbi diagnozuojant koralų sveikatą. Pakeitus kai kuriuos metodus, dažniausiai naudojamus žmonių medicinoje, būtų galima žymiai pagerinti tyrėjų gebėjimą gydyti ir išsaugoti koralus. Norėdami tai išspręsti, protokolas, skirtas savo vietoje hibridizacija, daugiausia naudojama žmonių medicinoje ir evoliucinėje vystymosi biologijoje, buvo pritaikyta naudoti suaugusiems koralams, patiriantiems stresą.

Šio metodo tikslas – vizualizuoti RNR zondo erdvinę raišką suaugusiųjų koralų audinyje, kuris buvo įterptas į parafiną ir išpjautas ant stiklinių stiklelių. Šis metodas skirtas parafino pašalinimui ir mėginio rehidratacijai, mėginio išankstiniam apdorojimui, kad būtų užtikrintas mėginio pralaidumas, inkubavimui prieš hibridizaciją, RNR zondo hibridizacijai ir RNR zondo vizualizavimui. Tai yra galingas metodas, kai naudojami nemodiniai organizmai, siekiant išsiaiškinti, kur yra išreikšti specifiniai genai, o protokolą galima lengvai pritaikyti kitiems nemodiniams organizmams. Tačiau metodas yra ribotas tuo, kad jis pirmiausia yra kokybinis, nes išraiškos intensyvumas gali skirtis priklausomai nuo vizualizavimo etape sunaudoto laiko ir zondo koncentracijos. Be to, reikia kantrybės, nes šis protokolas gali užtrukti iki 5 dienų (ir daugeliu atvejų ilgiau), priklausomai nuo naudojamo zondo. Galiausiai, nespecifinis fono dažymas yra įprastas, tačiau šį apribojimą galima įveikti.

Įvadas

Koralai yra labai svarbūs ekosistemos kūrėjai ir svarbūs biologinei įvairovei vandenynuose ir žmonių sveikatai 1, 2, 3. Jiems gresia pavojus dėl klimato kaitos ir kitų antropogeninių stresorių, o daugelis koralų rūšių laikomos itin nykstančiomis. Taigi, norint diagnozuoti streso patiriančius koralus, reikia didelių ląstelių ir molekulinių įrankių. Be to, mažai suprantama, kur genai yra išreikšti suaugusiųjų koralų audiniuose, todėl mažai suprantamos šių genų funkcijos. Norėdami išspręsti šią problemą, pritaikėme savo vietoje hibridizacijos (ISH) protokolas, dažniausiai naudojamas žmonių medicinoje ir evoliucinėje vystymosi biologijoje, skirtas naudoti suaugusių koralų į parafiną įterptiems audinių mėginiams. Šis metodas yra galingiausias, kai naudojamas suaugusiems koralams, kurie patyrė stresą, pavyzdžiui, karščio stresą. Tačiau šis metodas gali būti naudojamas įvairiuose koralų audiniuose ir gyvenimo etapuose ir neapsiriboja tik karščio patiriamais koralais 4, 6, 7 . Be to, šis metodas gali būti naudojamas bet kokio metazoano audiniuose ar ląstelėse, jei yra informacijos apie cDNR seką.

Šio metodo tikslas – vizualizuoti RNR zondus suaugusiųjų koralų audinyje, kuris buvo išsaugotas, įterptas į parafiną ir išpjautas ant stiklelių. Šis metodas yra galingas diagnostikos įrankis, leidžiantis vizualizuoti nukleino rūgštis suaugusių koralų audiniuose. Iš pradžių šis metodas buvo sukurtas medicininei diagnostikai, o nuo tada tapo populiaria priemone tokiose srityse kaip vystymosi biologija ir evoliucinė vystymosi biologija8, 9, 10. ISH taip pat yra kritinis metodas, ypač ne modelių sistemose, kai yra genominės ir transkriptominės sekos duomenų, tačiau erdviniai genų ekspresijos modeliai nežinomi. Diagnostikos darbui ne modelių sistemose šis metodas yra galingas, nes jis gali nurodyti, kurios ląstelės ir audiniai išreiškia dominantį geną, ir gali paskatinti tikslingesnius terapinius metodus8, 9, 10, 11, 12. Galiausiai, šis metodas yra kokybinis ir galingesnis, kai jis derinamas su kiekybiniais genų ekspresijos duomenimis 11 .

Šiame dokumente aprašytas metodas bus įdomus tyrėjams, kurie jau sukūrė digoksigeninu (DIG) pažymėtą RNR zondą (tiek sensorinius, tiek antisensinius zondus) ir dabar yra pasirengę atlikti savo vietoje zondų hibridizavimas su mėginiu. Norint atlikti šį metodą, kiekvienam tiriamam zondui reikės dviejų nuoseklių parafininio koralinio audinio pjūvių. Viena sekcija bus naudojama jutimo zondui, o kita – antisensiniam zondui. Jutimo zondas bus kontrolė, rodanti nespecifinį surišimą. Jei jutimo zonde pastebimas dažymas, antisensinis zondas nėra specifinis dominančiai RNR. Zondai gali būti sukurti bet kuriam išreikštam genui. Šiame protokole naudojami keli pavyzdžiai, kurie anksčiau buvo išreikšti karščio streso metu koraluose: FBJ pelių osteosarkomos viruso onkogeno homologas B (Fos-B), aktyvatoriaus baltymas (AP1) ir naviko nekrozės faktoriaus receptorius 41 (TNFR 41). 11 . Pirmenybė teikiama ISH naudojant DIG pažymėtus RNR zondus, o ne naudojant radioaktyviuosius zondus, nes juos tvarkyti yra daug saugiau 10. Be to, šis metodas yra labai jautrus ir gali būti naudojamas įvairiems audiniams ir embrionams, ne tik nuo karščio patiriamų suaugusių koralų13, 14, 15, 16.

Būtina prenumerata. Rekomenduokite „JoVE“ savo bibliotekininkui.

Protokolas

Įspėjimas: atlikite šiuos veiksmus po dūmų gaubtu.

  1. Dezinfekuokite plonu pjūviu pagamintą stiklelį su 100% ksilenu po gaubtu stikliniuose „Coplin“ indeliuose 10 min. Nenaudokite plastikinių „Coplin“ stiklainių, nes ksilenas tirpdo plastiką. Prieš naudodami Coplin stiklainius sterilizuokite autoklave.
  2. Paruoškite keturis sterilius stiklinius Coplin indelius, kuriuose yra: 100 % etanolio, 80 % etanolio, 70 % etanolio ir 60 % etanolio. Praskieskite etanolį vandeniu be RNazės.
    1. Perkelkite stiklelius į sterilų stiklinį Coplin indelį su 100 % etanoliu ir pamerkite 10 min. Po 10 minučių ištuštinkite stiklinį Coplin indelį ir pakeiskite nauju 100 % etanoliu. Dar kartą pamirkykite stiklelius 10 min.
    2. Skaidrės perkeliamos į sterilų stiklinį Coplin indelį su 80% etanoliu 1 min.
    3. Skaidrės perkeliamos į sterilų stiklinį Coplin indelį su 70% etanoliu 1 min.
    4. Perkelkite stiklelius į sterilų stiklinį Coplin indelį su 60% etanoliu 1 min.

    2. Objektyvo paruošimas RNR zondo hibridizacijai

    1. Toliau skalbkite kambario temperatūroje, jei nenurodyta kitaip. Plaukite kambario temperatūros orbitos purtyklėje lėtu greičiu. Objektyvų plovimui naudokite sterilius stiklelių pašto dėžutes, kuriose telpa iki penkių stiklelių.
    2. Perkelkite skaidres į sterilų skaidrių siuntiklį su 18 ml 1x fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Nuplaukite 5 minutes kambario temperatūroje.
    3. Išpilkite 1x PBS ir nedelsdami apdorokite stiklelių audinį proteinaze K, kad zondas prasiskverbtų į audinį. Į stiklelių pakuotę įpilkite maždaug 18 ml proteinazės K tirpalo (žr 1 lentelė darbinio tirpalo koncentracijai). Inkubuokite 37 ir 176 °C temperatūroje 15 min. Nekratykite.
      1. Kol stikleliai inkubuojami, paruoškite prehibridizacijos buferį (Prehybe Buffer). „Prehybe Buffer“ 10 minučių padėkite į verdančio vandens vonią, tada 5 minutes atvėsinkite ledo vonioje. Prehybe Buffer receptą žr 1 lentelė.
      2. Sustabdykite proteinazės K reakcijos virškinimą išpildami proteinazės K tirpalą ir nedelsdami į stiklelių pakuotę įpilkite 18 ml 0,2 % glicino-PBS tirpalo. Leiskite stikleliui 5 min. kambario temperatūroje.
      3. Išpilkite 0,2% glicino-PBS tirpalą ir į kiekvieną stiklelio pakuotę įpilkite 18 ml 2x natrio citrato (SSC) tirpalo. Plaukite stiklelius 2x SSC 10 minučių kambario temperatūroje, purtydami 100–150 aps./min.

      3. Skaidrių išankstinė hibridizacija ruošiantis RNR zondo hibridizacijai

      1. Kol stikleliai plaunami 2x SSC, įsigykite naują sterilų stiklelių pakuotę ir į stiklelių pakuotę įpilkite maždaug 18 ml Prehybe Buffer. Įstatykite stiklelių siuntiklį į hibridizacijos krosnį hibridizacijos temperatūroje.
        PASTABA: Hibridizacijos temperatūra priklausys nuo naudojamo zondo, bet paprastai svyruoja nuo 50 iki 60 ir#176C.
      2. Baigę 2x SSC plovimą, išpilkite 2x SSC ir 1 valandai įdėkite stiklelius į stiklelių pakuotę į Prehybe buferį hibridizacijos krosnyje.

      4. RNR zondo hibridizacija

      1. Kol stikleliai inkubuojami su Prehybe Buffer hibridizacijos krosnyje, paruoškite hibridizacijos zondo tirpalą.
        1. Kiekvieną zondą praskieskite hibridizacijos buferiu (0,5 µL zondo su 24,5µL hibridizacijos buferio).
          PASTABA: Hibridizacijos buferio receptą rasite 1 lentelė. Zodo paruošimo ir koncentracijos pavyzdį galima rasti Traylor-Knowles ir kt. 11 .
        2. Atskiestą zondą padėkite ant 86–90 °C temperatūros bloko 12 minučių, tada 1 minutę atvėsinkite ant ledo.
        1. Įdėkite mėginius į stiklelio drėgmės kamerą su 4x SSC + 50% formamido tirpalu kameros apačioje.
        2. Kai zondai pridedami prie visų skaidrių, stiklelio drėgmės kamerą įdėkite į hibridizacijos krosnį mažiausiai 24 valandoms, esant hibridizacijos temperatūrai 50-60 ir#176C. Inkubacijos laikas gali skirtis priklausomai nuo zondo koncentracijos, bet turi trukti mažiausiai 24 valandas.
        1. Nuimkite dengiamuosius stiklelius nuo kiekvieno stiklelio, būkite atsargūs, kad neišstumtumėte audinio. Į 1000 µL pipetę įpilkite 1000µL 2x SSC tirpalo ir švelniai nuplaukite stiklelį.
        2. Įdėkite stiklelį į sterilų stiklelių dėklą su 18 ml 2x SSC tirpalo 5 min. kambario temperatūroje. Išpilkite tirpalą ir pakeiskite jį 18 ml šviežio 2x SSC. Dar kartą pakartokite inkubaciją 5 minutes kambario temperatūroje, švelniai purtydami.
        3. Išpilkite 2x SSC tirpalą. Įpilkite 18 ml 1x SSC tirpalo ir 5 minutes plaukite kambario temperatūroje. Išpilkite 1x SSC tirpalą ir pakeiskite jį 18 ml šviežio 1x SSC. Pakartokite inkubaciją 5 minutes kambario temperatūroje, švelniai purtydami.
        4. Išpilkite 1x SSC. Įpilkite 18 ml 0,5x SSC ir plaukite 10 minučių 42 °C temperatūroje nekratydami. Išpilkite 0,5x SSC ir pakeiskite jį 18 ml šviežio 0,5x SSC. Dar kartą skalbkite 10 minučių 42 °C ir 176 °C temperatūroje nekratydami.

        5. RNR zondo vizualizacija

        PASTABA: zondui vizualizuoti kūrimo proceso metu bus naudojama BM violetinė spalva. Tačiau prieš šį veiksmą reikia kelis kartus nuplauti, kad mėginiai būtų paruošti dažymui.

        1. Plaukite stiklelius 18 ml šarminės fosfatazės buferio (AP-buferio) be MgCl2 1 min. Išpilkite AP buferį be MgCl2ir įpilkite 18 ml 1x Boehringer-Mannheim blokuojančio buferio, praskiesto maleino rūgšties buferiu. Inkubuokite mažiausiai 1 valandą kambario temperatūroje stiklelių pakuote, švelniai purtant.
          PASTABA: naudojamas „Boehringer-Mannheim“ blokuojantis buferis ir maleino rūgšties buferis buvo iš anksto pagaminti ir įsigyti „DIG Wash and Block Buffer Set“ (galima įsigyti prekyboje).
          1. Arba galima inkubuoti per naktį 4 °C temperatūroje. Ilgesnis blokavimo laikotarpis sumažins nespecifinio surišimo atsiradimą.

          Būtina prenumerata. Rekomenduokite JoVE savo bibliotekininkui.

          Reprezentatyvūs rezultatai

          Užpildžius šį protokolą, bus identifikuotos ląstelės ir audiniai, kurie ekspresuoja dominantį RNR zondą. Tipiški šio protokolo rezultatai yra AP-1, FosB ir TNFR41. Šie rezultatai, kuriuos anksčiau paskelbė „Traylor-Knowles“ ir kt. 11 parodyta RNR zondų erdvinė išraiška suaugusiems koralams, kurie buvo paveikti karščio. Pateikiami du skirtingų dažymo tipų pavyzdžiai figūra 1. 1A pav yra difuzinio audinių dažymo pavyzdys. Dėmė randama visame audinyje, ne tik konkrečiose ląstelėse. Čia antisensinio AP-1 ekspresija randama visame epidermyje ir burnos gastrodermoje 11 (1A pav). Dažymas yra difuzinis ir nėra atskirtas iki vieno konkretaus ląstelių tipo. Šio tipo dažymui ypač svarbu tuo pačiu metu atlikti jutimo kontrolę, nes kai kuriuos rezultatus gali lemti nespecifinis dažymas.

          Antrasis dažymo tipas yra specifinis ląstelėms, kai dėmė randama tik tam tikruose ląstelių tipuose. Abu FosB (1B pav) ir TNFR41 (1C pav) parodykite šio tipo dažymą. Abu šie zondai buvo naudojami suaugusių koralų, kurie buvo veikiami karščio, audinių mėginiuose 11. Anti-sense skydelyje pastebimas purpurinis dažymas. TNFR41 buvo išreikštas įvairių tipų cnidocituose - ląstelių tipų šeimoje, kuri randama tik cnidarianuose (figūra 1). Konkrečiai, jis nudažo nematocitus, gaminančius mikrobazinius mastigoforo organelius (nematocistus), ir spirocitus, gaminančius spirocistas – visa tai randama koralų audinių epidermyje. Nematocitų taip pat yra kituose koralų audinių sluoksniuose, pavyzdžiui, kalikodermėje, tačiau dėl šio konkretaus mėginio pjūvio šios informacijos nepavyko surinkti. FosB taip pat dažė cnidocitus ir buvo būdingas tiek spirocitams, tiek nematocitams. Abiejų šių zondų jutiminė kontrolė nerodė dažymo, o tai rodo, kad antisensinio zondo dažymas iš tiesų buvo specifinis. Tai tik dviejų tipų tipiniai dažymo metodų rezultatai (difuzinis audinių dažymas ir specifinis dažymas ląstelėms), kurie gali būti naudojami naudojant skirtingų tipų zondus. Dėl šio kintamumo labai svarbu naudoti jutimo kontrolę, kad būtų galima nustatyti nespecifinį dažymą.


          1 paveikslas: reprezentatyvus ISH rezultatas, nudažęs specifines ląsteles. (A) Pirmajame skydelyje zondo AP-1 jutimo valdymas rodo, kad stiklelyje yra mažai dėmių. Antrame skydelyje AP-1 antisensorinis zondas rodo, kad dažymas šiuo zondu yra difuzinis visame audinyje. Dėmė būdinga burnos gastrodermiui ir epidermiui. Naudojant šį dažymo tipą, labai svarbu atlikti jutimo kontrolę, kad būtų užtikrinta, jog stebimas dažymas yra specifinis. (B) FosB zondo jutiklio valdymas pirmame skydelyje rodo nedaug dažų. Antrajame skydelyje FosB priešprasminis zondas rodo spirocitams ir nematocitams būdingą dažymą, o visame epidermyje ir burnos gastrodermyje yra difuzinis dažymas. (C) Pirmajame skydelyje TNFR 41 zondo jutimo valdiklis rodo, kad ant stiklelio yra nedaug dėmių. Antrame skydelyje TNFR 41 antisensinis zondas rodo specifinį dažymąsi spirocituose, nematocituose ir mikroblastiniuose mastigoforuose. Santrumpos: spirocitai (SP), simbiodiumas (SY), nematocitas (NE), mikrobaziniai mastigoforai (MM), simbiontų turinti gastroderminė ląstelė (SU). Šis paveikslas buvo atkurtas gavus leidimą 11 . Spustelėkite čia, norėdami pamatyti didesnę šios figūros versiją.

          Pastaba: Visi skiedimai turi būti atliekami steriliu vandeniu be RNazės autoklave dengtuose stikliniuose induose.
          Prehybe buferis (50 ml) PAPILDYTI
          Foramidas 25 ml
          20X SSC (pH 4,5) 12,5 ml
          20 mg/ml heparino 0,1 ml
          50X Denhardts 5 ml
          20% Tween-20 0,5 ml
          20% SDS 0,5 ml
          10 mg/ml lašišos spermos DNR (denatūruojama prieš pridedant) 2 ml
          Vanduo be RNazės 4,4 ml
          Pastaba: Tirpalą galima pasigaminti vienkartinėje 50 ml tūbelėje. Lašišos spermatozoidai turi būti denatūruojami 5 minutes pavirinus ant kaitinimo bloko prieš dedant į tirpalą.
          Hibridizacijos buferis (47 ml) PAPILDYTI
          Foramidas 25 ml
          20X SSC (pH 4,5) 12,5 ml
          20 mg/ml heparino 0,1 ml
          50X Denhardts 5 ml
          20% Tween-20 0,5 ml
          20% SDS 0,5 ml
          10 mg/ml lašišos spermos DNR (denatūruojama prieš pridedant) 2 ml
          Vanduo be RNazės 1 ml
          Pastaba: Tirpalą galima pasigaminti vienkartinėje 50 ml tūbelėje. Lašišos spermatozoidai turi būti denatūruojami 5 minutes pavirinus ant kaitinimo bloko prieš dedant į tirpalą.
          10X PBS (1,0 l) PAPILDYTI
          18,6 mM NaH2PO4 2,56 g
          84,1 mM Na2HPO4 11,94 g
          1750 mM NaCl 102,2 g
          Pastabos: Sumaišykite fosfatus maždaug 800 ml vandens, kad gautumėte 1,0 l tūrio. Patikrinkite pH. Tai turėtų būti 7,4 ir#177 0,4. Kitu atveju sureguliuokite pH iki 7,4 naudodami HCl NaOH. Įpilkite NaCl ir likusį vandenį. Sureguliavus pH, autoklave.
          20X SSC (1,0 l) PAPILDYTI
          3 M NaCl 175,3 g
          0,3 M Na citratas 88,2 g
          Pastabos: Sumaišykite apie 800 ml vandens, kuriame nėra RNazės, iki 1,0 l tūrio. Sureguliuokite pH iki 4,5 ir autoklave.
          Šarminės fosfatazės (AP) buferis be MgCl2 (50 ml) PAPILDYTI
          1 M NaCl 5,0 ml
          1 M Tris, pH 9,5 5,0 ml
          20% Tween-20 1,25 ml
          Vanduo be RNazės 38,75 ml
          Pastabos: Paruoškite prieš pat naudojimą 50 ml tūbelėje.
          Šarminės fosfatazės (AP) buferis (100 ml) PAPILDYTI
          1 M NaCl 10,0 ml
          1 M MgCl2 5 ml
          1 M Tris, pH 9,5 10 ml
          20% Tween-20 2,5 ml
          Vanduo be RNazės 72,5 ml
          Pastabos: Paruoškite prieš pat naudojimą 50 ml tūbelėje. Po kelių valandų tirpalas taps drumstas ir nebeveiks fermentinės reakcijos.
          AP substrato sprendimas PAPILDYTI
          AP buferis 25 ml
          NBT 82,5 ul
          BCIP 82,5 ul
          Pastabos: galima naudoti vietoj BM Purple. Paruoškite prieš pat naudojimą 50 ml tūbelėje. Šį tirpalą laikykite tamsoje, uždengdami mėgintuvėlį į foliją ir paruošdami esant silpnam apšvietimui.
          Proteinazės K pradinis tirpalas (10 mg/ml) PAPILDYTI
          Proteinazė K 10 mg
          Vanduo be RNazės 10 ml
          Pastabos: Padalinkite alikvotą ir laikykite -20 °C ir 176 °C temperatūroje.
          Proteinazės K darbinis tirpalas PAPILDYTI
          Proteinazės K pradinis tirpalas 90 ul
          1X PBS 18 ml
          Pastabos: Norėdami gauti geriausius rezultatus, padarykite prieš pat naudojimą.
          0,2% glicino-PBS tirpalas PAPILDYTI
          10X PBS 45 ml
          Vanduo be RNazės 405 ml
          Glicinas 1 g
          Pastabos: Paruošti autoklavuotame stikliniame inde. Maišykite kambario temperatūroje ant standesnės plokštelės, kol glicinas visiškai ištirps.
          Boehringer-Mannheim blokuojantis buferis (30 ml) (DIG plovimo ir blokavimo buferio rinkinio dalis) PAPILDYTI
          10x blokavimo tirpalas 3 ml
          1x maleino rūgšties buferis 27 ml
          Pastabos: Norėdami gauti geriausius rezultatus, padarykite prieš pat naudojimą. Ištekliaus blokavimo tirpalas ir maleino rūgšties buferis buvo naudojami iš “DIG Wash and Block -Buffer Set".
          4X SSC ir#821250% formamido (30 ml) PAPILDYTI
          20X SSC 6 ml
          50% formamido 24 ml
          Pastabos: Paruoškite prieš pat naudojimą 50 ml tūbelėje. Paruoškite po laboratoriniu gaubtu.
          Glycerol Mounting Media ADD
          50 mM Tris, pH 8.4 80 µL
          Glycerol 20 µL

          Table 1: Stock solutions for performing savo vietoje hybridization. The table is a list of the different stock solutions needed for this protocol. Total amounts are estimated for performance of approximately 2 slide mailers. It is advised to adjust total amounts based on the amount of slides that are being processed.

          Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

          Diskusija

          The method described in this protocol has been modified from previous work in medical and evolutionary developmental research 8 , 9 , 10 , 12 , 17 . This protocol focuses on the nuances of an savo vietoje hybridization with a DIG-labeled RNA anti-sense probe on adult corals, which have been preserved and embedded in paraffin. This method can be easily transferred to samples of organisms beyond corals that have also been paraffin-embedded. Lastly, this method can be performed during different life stages of corals (pvz., larva) or within cell cultures, but the exact protocol may differ since those types of samples are not always paraffin-embedded 5 , 6 .

          There are several critical steps in this protocol, including the proteinase K treatment, hybridization of the probe, and color development of the probe. During the proteinase K treatment, timing is very important. If the treatment is longer than suggested, tissues can become degraded and damaged. Additionally, the stopping of the proteinase K reaction should be performed at the full time point specified. It is also critical to keep the sample at a constant hybridization temperature, as lowering of the temperature can cause non-specific binding of the probe and complicate results. When washing off the probe, it is important to take each slide out of the hybridization oven one at a time, rather than all at once, to ensure that the slides do not hybridize with the probe at a low temperature. Also, thorough washing of the slides after the probe hybridization will help prevent non-specific binding. Lastly, color development of the probe is one of the most critical yet subjective steps of this process. The color development can be easily overdone or stopped too soon. This step requires patience and vigilance to ensure that over-staining of the slides does not occur.

          Troubleshooting this protocol can be a daunting process due to the number of steps involved. If the protocol yields negative results, then it is best to start by examining the probe to make sure that it is the anti-sense (and not the sense) probe. Additionally, if the solutions are old, it is worth remaking or replacing them so they are fresh when performing this protocol. Modifications, such as the lengths of hybridization and blocking, can be implemented to increase the chances of probe hybridization or reducing amounts of background and non-specific staining. Due to the high number of steps in this protocol, it may be easy to lose track therefore, it is important to stay organized and track which parts of the protocol have been completed. Additionally, it is critical to ensure that no steps are skipped, and that time is not cut down during the incubations and washes. A good rule of thumb is to allow for longer rather than shorter washes to ensure that all slides are cleaned thoroughly.

          The biggest limitation of this method is that the results are not quantifiable. This is a qualitative method that, in concert with other methods such as histology, transcriptomics, and proteomics, is very informative. Due to variations in hybridization times as well as the subjective times during visualization, quantifying the intensity of the staining is not easily accomplished. It is tempting to say that a probe is more highly expressed if it shows greater intensity, but due to the variations in this protocol (such as the amount of time allowed for color development), gene expression amounts cannot be determined.

          This technique is not a new method in biology however, it is one not performed very often on adult corals. The use of this method on adult corals is very powerful because it anchors gene expression data to a tissue or a cell type 11 . Transcriptomics and genomics have become popular and powerful tools in coral biology however, these methods are generally done on homogenates of the whole animal. This makes it challenging to identify which parts of the coral are expressing the genes of interest, and thus more challenging to understand the actual mechanisms. Through the use of ISH along with gene expression data, a more holistic approach to where and to what extent genes are expressed can be achieved. This will greatly help in the understanding of the mechanisms responsible for different stress response pathways in adult corals.


          In situ hybridization technology-Shanghai Medicilon

          In situ hybridization (insituhybridization) uses a specific labeled nucleic acid of known base sequence as a probe to specifically detect the nucleic acid in tissues and cells in accordance with the principle of complementary base pairing in situ to form a hybrid, which is then labeled with The corresponding monitoring system of the substance can locate the nucleic acid in the cell in situ by immunohistochemistry. In situ hybridization can be divided into intracellular and tissue section in situ hybridization according to the test substance according to the probes and nucleic acid detection, it can be divided into DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA hybridization. According to different labeling methods, it can be divided into radioactive probes and non-radioactive probes.
          The basic methods include: fixation, sectioning, hybridization, color development and other main steps.

          (1) The material is fixed with the specimen

          1. Material extraction: The material used for in situ hybridization should be as fresh as possible. In order to prevent the degradation of RNA, the material should be taken quickly, and the material should be fixed or frozen as soon as possible after the material is taken.
          2. The tissues or cells that are fixed for in situ hybridization must be fixed. The purpose of fixation is to ① maintain the original structure of the cell morphology ② maximize the preservation of the level of DNA or RNA in the cell ③ make the probe easy to enter the cell or tissue .
          3. Fixatives: Common fixatives include 10% formaldehyde, 4% paraformaldehyde, glacial acetic acid-alcohol mixed solution, Bouin’s fixative, etc. These fixatives have different advantages and disadvantages, so the best fixative should be selected according to the specific experimental object.
          4. Fixing method After taking tissue samples, quickly put them into fixative solution for 2 to 4 hours. The size of the sampled tissue is 1cm×1cm×0.5cm, which should not be too large. If necessary, the animal tissue can be perfused and fixed, and then the tissue is taken into 20% sucrose according to the requirements, overnight at 4 ℃, and the next day can be frozen and sliced.

          (2) Preparation of sections and cell specimens

          1. Slide processing Because in situ hybridization is generally performed on slides, slides must be kept clean and free of any nuclease contamination. Generally, the glass slide can be soaked in washing powder overnight, rinsed with running water, soaked in acid for 4-8 hours, then rinsed with running water, and washed with double distilled water 2 to 3 times. Bake in 160℃ oven for 2~4h. It can also be sterilized by autoclaving at 15 pounds for 20 minutes to eliminate the nuclease on the slide.
          2. Tissue sectioning and pretreatment
            (1) Frozen section: fresh tissue can also be placed in liquid nitrogen for rapid quenching after taking the material. After freezing section, 4% paraformaldehyde is fixed for 5 to 10 minutes, and can also be stored at -70°C until use. Before hybridization, the slices were quickly returned to room temperature and dried, washed three times with 0.1mol PBS, washed with 2×SSC for 10 minutes, and added with pre-hybridization solution and incubated at room temperature for 1 hour.
            (2) Paraffin section: After the tissue is fixed, conventional paraffin embedded sections can be stored for a long time and can be used for in situ hybridization at any time. Before hybridization, slices were dewaxed 2 times with xylene for 10min each time ②washed with pure alcohol 2 times with 5min each time ③air dried for 5min ④ gradient alcohol rewashed 95%, 80%, 70% for 1min each ⑤0. Wash 3 times with 1 mol PBS for 5 minutes each time ⑥ 2×SSC for 10 minutes ⑦ add prehybridization solution dropwise and incubate for 1 hour at room temperature in a wet box.
            (3) Cultured cells: add 200 μl of a cell suspension with a concentration of 1×105/m1 to each slide, and air-dry for 1 to 2 minutes to prepare a cell smear, or directly use a cultured cell cover slip. The above cell pieces were fixed with alcohol or paraformaldehyde for 5 minutes, and the remaining steps were the same as frozen sections.

          (3) Reagent preparation
          Gloves are required during the preparation of the solution. The liquid preparation uses ultra-clean water. The bottles used are baked at 160 ℃ for 4 hours. The main purpose is to remove RNase.

            DEPC water Add DEPC to ultrapure water at a concentration of 1‰, mix thoroughly and let stand overnight, autoclave for 15

          (4) Hybridization and color development

          1. Hybridization Add the labeled probe to the pre-hybridization solution to become the hybridization solution (probe concentration is 1μg/m1). After the section is briefly immersed in 2×SSC, the hybridization solution is added dropwise and incubated in the built-in wet box at 37℃ or 42℃ overnight. Then, it was immersed in 2×SSC at room temperature for 1 h, l×SSC at room temperature for 1 h, 0.5×SSC at 37°C for 30 min, and 0.5×SSC at room temperature for 30 min. Be careful not to dry the sections when adding the hybridization solution.
          2. Color development The following steps are carried out at room temperature.
            (1) Buffer I was washed for 1 min.
            (2) Incubate the sections with buffer I containing 2% normal sheep serum and 0.3% TritonX-100 for 30 min.
            (3) Dilute goat anti-Dig antibody with buffer I containing 1% normal sheep serum and 0.3% TronX-100.
            (4) Drop the antibody dilution onto the slices, cover with parafilm, and incubate at 4°C in a wet box overnight.
            (5) Wash with buffer I for 10 minutes.
            (6) Buffer II was washed for 10 minutes.
            (7) Add color developing solution, cover with parafilm, incubate at room temperature for 2 to 20 hours in the dark, and examine at any time. When the color development is satisfactory, add buffer III to stop the color development.
            The coloring solution is prepared immediately before use, and its formula is: ① NBT 45μl ② X-Phospllate solution 35μl ③ Levamisole 2.4mg ④ Buffer II is added to 10ml.
            (8) Conventional dehydration, transparency and sealing.
            Results: The positive hybridization signal was purple-blue particles.

          (5) In situ hybridization control test
          As with the immunohistochemical staining control, in order to prove the accuracy of the in situ hybridization experiment operation and the specificity of the experimental results, a series of control experiments need to be set up. For the setting and significance of various control experiments, please refer to the in situ hybridization monograph. Only a few commonly used control experiments are introduced below.


          Sensitive whole mount savo vietoje localization of small RNAs in plants

          Small RNAs, such as microRNAs (miRNAs), regulate gene expression and play important roles in many plant processes. Although our knowledge of their biogenesis and mode of action has significantly progressed, we still have comparatively little information about their biological functions. In particular, knowledge about their spatio-temporal expression patterns rely on either indirect detection by use of reporter constructs or labor-intensive direct detection by savo vietoje hybridization on sectioned material. None of the current approaches allows a systematic investigation of small RNA expression patterns. Here, we present a sensitive method for savo vietoje detection of miRNAs and siRNAs in intact plant tissues that utilizes both double-labeled probes and a specific cross-linker. We determined the expression patterns of several small RNAs in diverse plant tissues.

          Filename apibūdinimas
          tpj13270-sup-0001-FigS1.pdfPDF document, 1 MB Figure S1. miRNA detection in embryos with and without clearing.
          tpj13270-sup-0002-MethodS1.pdfPDF document, 172.4 KB Method S1. Detailed protocol for whole mount savo vietoje hybridization of small RNAs.
          tpj13270-sup-0003-Legends.docxWord document, 13.8 KB

          Atkreipkite dėmesį: leidėjas nėra atsakingas už bet kokios pagalbinės informacijos, kurią pateikia autoriai, turinį ar funkcionalumą. Visos užklausos (išskyrus trūkstamą turinį) turi būti nukreiptos į atitinkamą straipsnio autorių.


          Išvada

          GeneCount provides reliable DNA copy numbers, both when based on the tumor cell fractions determined by flow cytometry and those estimated by the method. Accurate data are also achieved in translocated chromosomal regions, as demonstrated for the t(1418) translocation involving BCL2. Our method is the only one to provide genome-wide information of absolute DNA copy numbers. Moreover, the method represents a significant improvement compared to existing methods in the study of gene dosages and intratumor copy number heterogeneities. The robustness of GeneCount implies that the method can be utilized widely in the genomic exploration of both hematopoietic and solid tumors, addressing DNA copy number aspects in a reliable manner, regardless of possible translocations. This may lead to improved assays for disease classification and outcome prediction and aid the identification of efficient targets for new cancer therapies.


          Notes

          Always run a Sense probe in parallel with the Antisense probe to ensure specificity of the reaction (at least the first time for any tissue/probe set).
          All Day 1 and Day 2 procedures should (ideally) be performed in RNase-free conditions.
          Unlike many NBT/BCIP reagents, this color product is stable through the ethanol/xylene dehydration and mounting procedure. However, it may fade after several months of storage and may exhibit some crystaline precipitation that is not desired.


          Žiūrėti video įrašą: JEDAN DAN U MESECU URADITE ČIŠĆENJE ORGANIZMA SA JABUKAMA NA OVAJ NAČIN (Spalio Mėn 2022).