Informacija

Ar Protokadherino gama klasterio nuorašai laikomi atskirais genais?

Ar Protokadherino gama klasterio nuorašai laikomi atskirais genais?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

[email protected] genų klasteris dalijasi egzonais ir todėl yra viena kitos izoformos. Tačiau HUGO ir Ensembl juos laiko atskirais genais.

„Genas“ apibrėžiamas kaip „kartu transkribuotų egzonų lokusas“ (Venter 2001), ir šis lokusas aiškiai atitinka šį apibrėžimą be jokių neaiškumų. Taigi kodėl šie nuorašai laikomi atskirais genais?


Sakyčiau, kad jie laikomi skirtingais genais, nes kiekviena izoforma yra kontroliuojama savo promotoriaus.


Įvadas

Jūrų žinduoliai yra klasikinis konvergencinės evoliucijos pavyzdys, kai sausumos žinduoliai prisitaiko prie jūros aplinkos. Antrinio prisitaikymo prie jūros aplinkos metu jūrų žinduoliai susidūrė su panašiais aplinkos iššūkiais, dėl kurių tolimuose taksonuose atsirado bendrų morfologinių ar fiziologinių ypatybių. Pavyzdžiui, jie patyrė panašius odos ir galūnių pokyčius, o vėliau tapo racionalūs 1,2. Prisitaikantys požymiai, susiję su hipoksija, yra bendri jūrų žinduolių bruožai.

Jūrų žinduoliai apima tris būrius: banginių (banginių, delfinų ir jūrų kiaulių), irklakojų (ruonių, jūrų liūtų ir vėplių) ir sirenų (lamantų ir dugongų) 4 . Jie išsivystė į vandenyną įvairiomis linijomis. Banginiai ir sirenos atsirado maždaug prieš 40–50 milijonų metų (mya) atitinkamai iš Cetartiodactyla ir Afrotheria 5. Irklakojai mėsėdžių tarpe atsirado maždaug po 20 milijonų metų 5 . Tai reiškia, kad skirtingi molekuliniai pokyčiai įvyko skirtingose ​​linijose, o tai galėjo sukelti skirtingus fenotipinius pokyčius. Tačiau dauguma tyrimų, susijusių su jūrų žinduoliais, buvo sutelkti į konvergencinę evoliuciją, nors kai kurie jūrų žinduolių prisitaikymai prie vandens gyvenimo būdo įvairiose rūšyse skiriasi 5 .

Irklakojai, susidedantys iš trijų šeimų (Phocidae, Otariidae, ir Odobenidae) skiriasi nuo kitų jūrų žinduolių 6. Dauguma nerokštų yra pusiau vandens, skirtingai nei kiti jūrų žinduoliai, visą gyvenimą praleidžiantys vandenyje 4, o jų galūnės yra pakeistos kaip plekšnės, varančios jas tiek vandenyje, tiek sausumoje 7. Be to, išskyrus riešutus, kurie yra vienintelė išlikusi šeimos rūšis Odobenidae, visi irklakojai turi kailinius 8 . Šios skirtingos savybės nebuvo pakankamai apibūdintos molekuliniu lygmeniu. Nors neseniai buvo surinktas juodųjų kačių ruonių genomo projektas 9, evoliuciniai ir biologiniai vienaspėdžių aspektai nebuvo ištirti. Iš tiesų, Weddell ruonių (šeimos Phocidae) nebuvo baigtas (http://software.broadinstitute.org/allpaths-lg/blog/?p=647). Be to, daugumoje filogenetinių tyrinių su antakiais buvo naudojamos ribotos žymenų sekos, tokios kaip mitochondrijų genomo 10,11,12.

Lyginamoji genomika leidžia ištirti tolimų rūšių konvergenciją. Pavyzdžiui, konvergenciniai vokalo mokymosi aminorūgščių pokyčiai buvo nustatyti sekvenuojant 48 paukščių genomus 13 . Panašiai ir Parkeris ir kt. 14 pranešė apie 200 konvergencinių lokusų echolokuojančių žinduolių genomuose. Nors yra daugiau tyrimų, įrodančių su fenotipine konvergencija susijusių sekų konvergenciją, atrodo, kad molekulinė konvergencija link fenotipinės konvergencijos, bent jau jūrų žinduolių, yra neįprasta. Analizuodamas 22 žinduolių genomus, įskaitant trijų jūrų žinduolių genomus, Foote ir kt. Pasiūlė, kad tam pačiam fenotipui pasiekti gali būti naudojami skirtingi molekuliniai keliai. Tyrime apie Hox genų šeimą žinduoliuose, tik dalis svetainių turėjo teigiamus atrankos parašus, kuriuos turi trys nepriklausomos jūrų žinduolių linijos16. Vietoj sekos lygio, genų lygio konvergencija buvo pateikta kaip plačiai paplitęs požymis, kai buvo naudojami evoliucijos tempai 2 . Todėl atskirose žinduolių linijose yra funkcinio ar aukštesnio lygio konvergencija, o skirtingos jūrų žinduolių linijos fenotipinei konvergencijai pasiekti naudojo skirtingus molekulinius kelius.

Čia sukonstravome trijų dviejų irklinių šeimų rūšių genomus: Phoca largha (Phocidae) ir Callorhinus ursinus ir Eumetopias jubatus (Otariidae) (S1 pav. Ir papildoma pastaba S1). Mes nustatėme genus su teigiamu atrankos parašu, kurie buvo bendri trims irklakojams, bet kurių nėra kitiems žinduoliams, kurie greičiausiai yra susiję su unikaliais irklakojų bruožais. Be to, buvo ištirti skirtingi molekuliniai pokyčiai, galintys atsirasti tik irklapėdžių linijoje per fenotipinę jūrų žinduolių konvergenciją.


Protokadherinas-1: epitelio barjero disfunkcija sergant astma ir egzema

Astma ir egzema atsiranda dėl genetinio jautrumo ir aplinkos poveikio sąveikos. Per pastaruosius du dešimtmečius genetiniai tyrimai leido identifikuoti kelis jautrumo genus, padidindami mūsų supratimą apie biologinius kelius, vedančius į šias ligas.

Daugelis astmai ir egzemai jautrių genų yra išreikšti kvėpavimo takų gleivinės ir odos epitelio ląstelėse [1]. Epitelis yra pirmoji gynybos linija nuo alergenų ir invazinių mikrobų. Pastaruoju metu epitelio vientisumo praradimas laikomas svarbiu mechanizmu, sukeliančiu astmą [2] ir egzemą [3].

Šiame numeryje Europos kvėpavimo žurnalas, M ortensen ir kt. [4] praneša apie genetinių variantų ryšį su genu, koduojančiu protokadheriną-1 (PCDH1) su astma, švokštimu ir egzema (ankstyvoje) vaikystėje Danijos gimimo kohortos tyrime COPSAC (Copenhagen Studies on Asthma in Childhood). Jų tyrimai taip pat rodo genų ir aplinkos sąveiką PCDH1 su pasyviu dūmų poveikiu ankstyvoje vaikystėje vystantis astmai. Šie tyrimai apima ankstesnius duomenis, apie kuriuos pranešta PCDH1 polimorfizmų, susijusių su jautrumu astmai [4–7] ir egzemai [4, 6, 8]. Atsižvelgiant į pakartotą asociaciją PCDH1 abiejų ligų atveju šis genas gali prisidėti prie biologinio kelio, kuris yra bendra abiejų ligų priežastis. Čia apibendrinsime sukauptus duomenis apie PCDH1 astmos ir egzemos polimorfizmą, ir bandyti interpretuoti šiuos genetinius duomenis, atsižvelgiant į PCDH1 ekspresiją ir funkciją, kuri prisideda prie epitelio vientisumo.

1993 m. PCDH1 iš pradžių buvo identifikuotas S ano ir kt. [9] kaip protokadherinas-42 ir buvo pranešta, kad pelės fibroblastų L-ląstelių tyrime jis sukelia ląstelių sukibimą po negimdinės membranos ekspresijos. PCDH1 yra nesuskirstytų protokadherino genų δ1 pogrupio narys. PCDH1 būdingi septyni tarpląstelinio kadherino (EC) pasikartojimai, transmembraninis domenas ir trys evoliuciškai konservuoti motyvai (CM1–3) tarpląstelinėje uodegoje, kurie, kaip buvo pasiūlyta, dalyvauja tarpląsteliniuose signalizacijos procesuose [10]. The PCDH1 genas apima 25 kb 5q31–33 chromosomoje ir koduoja du pagrindinius nuorašus, kuriuose yra trys arba penki egzonai, naudojant alternatyvų sujungimą. Trijų egzonų izoforma nekoduoja citoplazminių domenų CM1–3, esančių penkių eksonų izoformoje. Neseniai bronchų epitelio ląstelėse buvo nustatytas šeštasis egzonas ir alternatyvi 1 egzono ekspresija [11], tuo tarpu PCDH1 odos epitelio ekspresija iki šiol nebuvo plačiai apibūdinama.

2009 m. PCDH1 buvo identifikuotas kaip vaikų ir suaugusiųjų bronchų hiperreaktyvumo (BHR) ir astmos jautrumo genas. Vėliau buvo įrodyta, kad PCDH1 ekspresuojamas kvėpavimo takų epitelio ląstelėse [5, 9] ir odoje [12]. Keturiuose genetinės asociacijos tyrimuose apie PCDH1 paskelbta iki šiol, PCDH1 genų variantai buvo siejami su BHR, astma, egzema, nealergine vaikystės astma ir laikinu ankstyvu švokštimu (1 lentelė) [4–6, 8]. Tačiau atliekant didelio masto astmos asociacijos tyrimus, susijusius su genomu, pvz., Konsorciumo tyrimas GABRIEL [7], PCDH1 nebuvo pranešta, kad genomo masto reikšmingumo lygmenyje jis būtų susijęs su astma, kuri apibrėžiama kaip savarankiškai pranešta „astmos kada nors“ diagnozė. Mūsų nuomone, šie prieštaringi rezultatai gali būti paaiškinti astmos nevienalytiškumu.

Astma yra lėtinė nevienalytė kvėpavimo takų liga, turinti skirtingus ligos potipius, kuriai būdingas specifinis kvėpavimo takų simptomų, tokių kaip kosulys ir švokštimas, atsiradimas. M ortensenas ir kt. [4] konkrečių ligų potipių išilginėje analizėje praneša, kad PCDH1 genų variantai buvo susiję su specifiniais laikinais švokštimo ir kosulio simptomų epizodais bei su astmos atsiradimu. Be to, būdingi kvėpavimo takų simptomų modeliai ankstyvoje vaikystėje, tokie kaip trumpalaikiai ankstyvi kvėpavimo simptomai ir pasikartojantys varginantys simptomai, buvo susiję su skirtingais PCDH1 polimorfizmai. Šios specifinės sąsajos su ligos subfenotipais galėjo būti praleistos atliekant asociacijos analizę „Ar kada nors sirgote astma? kaip rezultato parametras.

Apibendrinant galima pasakyti, kad skirtingos asociacijos analizės nustato įvairius genetinius signalus PCDH1 geną, tai rodo bendras vaizdas, kuris pradeda ryškėti PCDH1 genų funkcija yra susijusi su astma, BHR ir egzema ankstyvame gyvenime. Svarbu tai, kad nustatyta, kad pasyvios rūkymo sąveikos genai yra svarbūs PCDH1 su astma dviejose populiacijose [4, 5]. Šie duomenys rodo, kad indėlis PCDH1 Astmos genų variantai gali išryškėti, kai tiriami tinkamoje aplinkos aplinkoje. Norint pateikti patikimesnius šių asociacijų įrodymus, reikalinga gerai veikianti, bendradarbiaujanti kohortų metaanalizė ankstyvame amžiuje (1 lentelė). Galiausiai tai rodo, kad nėra ryšio su specifiniu ar bendru IgE kiekiu arba su alergine astma [6] PCDH1 yra svarbus ne IgE sukeltiems jautrumo ligoms mechanizmams. Vadinasi, indėlis PCDH1 jautrumas astmai nepriklauso nuo IgE (1 lentelė).

Sukaupti iki šiol surinkti duomenys rodo, kad PCDH1 turi daugybę su astma ir egzema susijusių genetinių signalų, kurių mes dar visiškai nesuprantame, be aiškaus dominuojančio polimorfizmo, kuris daugelyje tyrimų yra susijęs su astma ar egzema. Siekiant suprasti šių asociacijų tarpusavio ryšį, pastebėtą skirtingiems PCDH1 vieno nukleotido polimorfizmus (SNP), apsvarstėme ryšį tarp šių SNP (LD). LD yra apibrėžiamas kaip lengvatinis specifinių SNP derinių pasireiškimas populiacijoje dėl jų paveldėjimo dėl artimo fizinio artumo. Neseniai atliktame Vokietijos gyventojų tyrime T oncheva ir kt. [6] ištyrė galimybę, kad asociacijos PCDH1 sergančius astma sukėlė LD su netoliese esančiu citokinų spiečiumi 5q31–33 chromosomoje, tačiau taip nebuvo. Mūsų atlikta baltaodžių asmenų LD modelio analizė neatskleidė tvirtų LD tarp įvairių SNP įrodymų (1 pav.), o tai rodo, kad šie SNP neatspindi vieno genetinio signalo, bet, matyt, individualiai, nepriklausomai prisideda prie jautrumo ligoms.

Protokadherino-1 genas, vieno nukleotido polimorfizmo (SNP) padėtis ir ryšių disbalansas (LD): padėtis etaloniniame konteksteHomo sapiens), remiantis genominiais duomenimis. LD diagramos rodomos r 2 reikšmėmis. Kuo stipresnis LD, tuo tamsesni kvadratai r 2 = 0 yra balti, o r 2 = 1 - juodi. LD sklypai buvo sukurti naudojant „Haploview“ (4.2 versija) programinę įrangą, naudojant SNP duomenis iš „HapMap Project“ (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) CEU populiacijai. Paryškintas tipas reiškia SNP, kurie taip pat rodomi 1 lentelėje.

Kitas kelių identifikavimo paaiškinimas PCDH1 Įvairiuose tyrimuose SNP, nepriklausomai susijęs su astma ir egzema, yra kelių SNP buvimas PCDH1 genas, turintis įvairų funkcinį poveikį. Pirma, labai specifiniai SNP gali sąveikauti su aplinkos veiksniais, tokiais kaip pasyvus dūmų poveikis. Antra, kiti SNP gali turėti bendresnį poveikį, pavyzdžiui, reguliuodami PCDH1 genų ekspresija. Svarbu suprasti, kad SNP, išbandyti pradiniame K oppelmano tyrime ir kt. [5] buvo tik geną koduojančiuose regionuose. Per pastaruosius metus tapo vis aiškiau, kad nekoduojantys SNP gali turėti svarbų reguliuojantį poveikį genų ekspresijai (veikdami kaip ekspresijos kiekybinių požymių lokusai (eQTL)). Dabartinis M ortenseno leidinys ir kt. [4] prideda tolesnio nekodavimo susiejimą PCDH1 astmos ir egzemos polimorfizmai (1 lentelė), tuo tarpu nė viena iš pradinių asociacijų šiame tyrime nebuvo pakartota. Taigi, eQTL tyrimai šiuo klausimu PCDH1 Todėl skubiai reikia SNP plaučių ir odos audiniuose, kad būtų galima įvertinti jų funkcinę svarbą. Trečia, koduojantys SNP gali turėti bendrą poveikį, paveikdami PCDH1 baltymų funkciją. Koduojantis SNP Ala514Thr priskiriamas PCDH1 baltymo EB domenui, kuris yra suderinamas su galimu poveikiu ląstelių ir ląstelių adhezijai, kurį reikia toliau tirti. Iki šiol nėra duomenų apie bet kurio su astma ir egzema susijusių SNP funkcinį poveikį. Galiausiai, pridėjus sudėtingumo PCDH1, jo išraišką taip pat tikriausiai reguliuoja epigenetiniai mechanizmai, apimantys genų metilinimą, atsižvelgiant į tai, kad 1A egzonas yra identifikuotas kaip CpG sala, galimai metilinta [11].

Taigi, kaip PCDH1 prisideda prie astmos ir egzemos? Mes hipotezuojame, kad PCDH1 disfunkcija prisideda prie epitelio barjero funkcijos defekto, pastebėto tiek astmos, tiek egzemos metu, reguliuojant epitelio ląstelių diferenciacijos ir (arba) atstatymo procesą. Pirminės bronchų epitelio ląstelių diferenciacijos metu PCDH1 mRNR ir baltymų ekspresija yra nepaprastai padidinta, o tai rodo PCDH1 vaidmenį siekiant arba palaikant kvėpavimo takų epitelio galutinę diferenciaciją [11]. PCDH1 ekspresijos reguliavimas odoje epidermio diferenciacijos metu iki šiol nebuvo apibūdintas, nors PCDH1 ekspresija yra ryškiai sukelta pirminiuose keratinocituose vėlyvo remonto proceso metu po įbrėžimo [12]. Panašus vaidmuo epidermio diferenciacijoje anksčiau buvo nustatytas daugeliui egzemos genų atliekant genetinius tyrimus. Apskritai, mes siūlome PCDH1 vaidmenį epitelio diferenciacijoje ir atstatant astmą ir egzemą.

PCDH1 gali perduoti tarpląstelinį signalą. Iki šiol nebuvo pranešta apie pasroviui kelius ar PCDH1 sąveikos partnerius, susijusius su astma ar egzemos patogeneze. Be to, duomenys apie skirtingą PCDH1 išraišką sergant astma ar egzema prieš vis dar trūksta sveikos kontrolės. Reikalingi būsimi tyrimai, galintys patvirtinti PCDH1 funkcinį vaidmenį astmoje ir egzemoje, naudojant kontroliuojamus eksperimentinius metodus, tokius kaip mažos trukdančios RNR arba genetiškai modifikuoti pelių modeliai, kurie šiuo metu yra kuriami. Šiuose tyrimuose taip pat reikia atsižvelgti į galimybę, kad poveikis aplinkai gali turėti įtakos PCDH1 raiškai, o cigarečių dūmų poveikis yra ypač svarbus. Akivaizdu, kad norint išspręsti funkcinį poveikį, reikia daugiau tyrimų PCDH1 SNP ir jų svarba kvėpavimo takų ir odos epitelio ląstelių biologijai. Šie tyrimai galiausiai patvirtins pradinius genetinius atradimus ir galbūt suteiks užuominų apie būsimas naujas terapines astmos ir egzemos intervencijas.


Rezultatai

Astrocitai išreiškia daugybę γ-Pcdh

Mes sutelkėme dėmesį į besivystančias nugaros smegenis, kurios subręsta anksčiau nei smegenys ir kuriose geriausiai apibūdinamos γ-Pcdh sutrikimo pasekmės (Wang ir kt., 2002b Weiner ir kt., 2005 Prasad ir kt., 2008). Kiekvieno γ-Pcdh baltymo 6 tarpląstelinio kadherino pasikartojimus, transmembraninį domeną ir proksimalinį citoplazminį domeną koduoja vienas iš 22 didelių „kintamųjų“ (V) egzonų, kurių kiekvienas yra sujungtas į tris „pastovius“ (C) kodus bendras 125 aminorūgščių C-galinis domenas (Wu ir Maniatis, 1999 Tasic ir kt., 2002 Wang ir kt., 2002a). Naudojant an savo vietoje hibridizacijos (ISH) zondo prieš C egzonus, mes nustatėme, kad, be visur esančios ekspresijos pilkojoje medžiagoje, PCdh-γ transkriptai yra išreikšti naujagimio nugaros smegenų baltosios medžiagos ląstelėmis (1 pav.) B). Dvigubos etiketės fluorescencinis ISH (1 pav B, įterptas) ir imunofluorescencija tiek naujagimių, tiek suaugusiųjų nugaros smegenyse (1 pav.) C,D) parodė, kad daugelis šių ląstelių buvo GFAP teigiami astrocitai, kurie pratęsia radialinius procesus, kuriuose yra γ-Pcdhs. Bendra išraiška PCdh-γ genai su PLP genas, oligodendrocitų žymeklis, nebuvo pastebėtas dvigubai žymint fluorescencinį ISH naujagimių skyriuose (duomenys nerodomi). Atrodė, kad GFAP teigiami astrocitai pilkojoje medžiagoje taip pat turi γ-Pcdh baltymų, tačiau dėl visur esančios neuronų γ-Pcdh lokalizacijos visame neuropilyje buvo sunku nustatyti jų tarpląstelinę lokalizaciją (žr. toliau ir 2 pav., kad būtų galima atlikti tolesnę analizę). tai). Astrocitai, išauginti iš naujagimio nugaros smegenų (1 pav.) G) ir žievė (duomenys nerodomi) išreikšti daugybiniai Pcdh-γ genai, 20 iš 22 tikėtinų susijungusių transkriptų, aptinkami astrocitinės RNR RT-PGR.

Astrocitai ekspresuoja kelis γ-Pcdhs. Savo vietoje hibridizacija (ISH) naudojant a PCdh-γ C egzono riboprobe (parodyta diagramoje A) atskleidė baltosios medžiagos (rodyklių antgalių) ir pilkosios medžiagos ekspresiją naujagimių nugaros smegenyse ( B). Dvigubas ženklinimas su a GFAP riboprobe parodė, kad daugelis šių ląstelių buvo astrocitai ( B, įdėklas rodo didesnį padidinimą). Imunofluorescencija patvirtino γ-Pcdh baltymo ekspresiją GFAP teigiamuose astrocituose naujagimiams ( C) ir suaugęs ( D) nugaros smegenys. Imuninis dažytų astrocitų dažymas ( E) ir nugaros smegenų sekcijos ( F) parodė, kad γ-Pcdh baltymai kolokalizuojasi su ezrinu ir Glt-1a, abu perisinapsinių astrocitų procesų žymenimis. Atvirkštinės transkriptazės (RT) -PCR analizės aptiko 20 iš 22 galimų išraiškų PCdh-y sujungtos transkripcijos kultivuotuose nugaros smegenų astrocituose ( G). Mastelio juostos: B, 100 μm (įdėta, 10 μm) C, D, 25 μm E, 3 μm F, 4 μm.

γ-Pcdh baltymai lokalizuojasi perisinapsiniuose astrocitų procesuose. A, Scheminė schema PCdhfcon3 sąlyginis mutantinis alelis, kuriame su GFP sulietas C egzonas 3 yra šalia loxP vietų. V egzonų A – C pogrupiai yra mėlynos spalvos, o 3 C egzonai yra raudoni. B, „Cre-ER Pcdh“fcon3/+ pelėms sušvirkšta tamoksifeno ( B, dešinėje), Cre iškirpimas lėmė visur esančios γ-Pcdh-GFP imunofluorescencijos praradimą, pastebėtą neinjektuotoms arba Cre-ER neigiamoms pelėms ( B, kairėje). Tačiau GFP pažymėti γ-Pcdhs išliko aptikti nedaugelyje GFAP teigiamų pilkosios medžiagos protoplazminių astrocitų ( B). CRodomas atskiros dvigubai imuninės sistemos kriosekcijos didesnis padidinimo vaizdas. D, E, Konfokalinė imuninės sistemos analizė „Cre-ER Pcdh“fcon3/+ nugaros smegenų pjūviai parodė, kad astrocitinė γ-Pcdh punkcija (nudažyta tiek GFP, tiek γ-Pcdh uždarytomis rodyklių galvutėmis, geltona sujungtuose vaizduose) gali lokalizuotis tiesiai šalia neuronų γ-Pcdh sinaptinėje taške (nudažyta tiek fagotui, tiek γ-Pcdh rodyklių antgaliai, rausvai raudonos spalvos sujungtuose vaizduose). F, G, Imuninis dažymas GFP ir presinapsiniams bei postsinapsiniams žymenims patvirtino, kad astrocitiniai γ-Pcdhs dažnai buvo uždedami ir (arba) apvyniojami aplink sinapsinius terminalus. Dideli vaizdai yra pavienių plokštumų iš z-sukrauna statmenus skerspjūvius per visą z-dėmės baltose linijose nurodytose vietose rodomos dešinėje ir apačioje. H, Kelių tokių perisinaptinių kontaktų pėdsakai nurodytose dėžutėse F ir G yra pateikiami. Mastelio juostos: B, 100 μm C, 6 μm D, E, 1 μm F, G, 2 μm.

Γ-Pcdhs lokalizuojasi perisinapsiniuose astrocitų procesuose

Astrocitų kultūrose γ-Pcdh baltymai buvo sutelkti ląstelių ir ląstelių jungtyse ir mažuose, į filopodiją panašiuose procesuose, kuriuose taip pat buvo ezrino (1 pav.). E), perisinaptinių astrocitų procesų žymeklis in vivo (Derouiche ir Frotscher, 2001). γ-Pcdh baltymai plačiai kolokalizavosi su kitu šių procesų žymekliu, glutamato transporteriu Glt-1a (Rothstein ir kt., 1994 Cholet ir kt., 2002), nugaros smegenyse in vivo (1 pav F). Norėdami aiškiau nustatyti astrocitinių γ-Pcdh ląstelių lokalizaciją, sukūrėme genetinį metodą, naudodami sąlyginį mutantinį alelį, vadinamą PCdhfcon3 , kurioje C egzono 3-GFP suliejimą papildo loxP vietos (2 pav.) A). Visur esantis homozigotinis pašalinimas PCdhfcon3 alelio rezultatas yra fenokopija PCdhdel/del -nuliniai mutantai (Prasad ir kt., 2008) dėl GFP susiliejimo, heterozigotiniai PCdhfcon3/+ pelės taip pat gali būti naudojamos pranešti apie Cre aktyvumą fenotipiškai normaliuose audiniuose.

Mes kirtome PCdhfcon3 pelėms, turinčioms transgeninę liniją, ekspresuojančią Cre-estrogen receptorių (Cre-ER) sulietą baltymą, kuris gali lokalizuotis branduolyje tik susijungus sintetiniam ligandui tamoksifenui (Guo ir kt., 2002). Po tamoksifeno injekcijos „Cre-ER Pcdh“fcon3/+ heterozigotinių pelių, mes nustatėme, kad GFP pažymėtas egzonas buvo pašalintas iš beveik visų nugaros smegenų ląstelių. Tačiau nedidelis skaičius izoliuotų pilkosios medžiagos ląstelių išvengė ekscizijos ir taip išlaikė GFP pažymėtus γ-Pcdh baltymus (2 pav. B). Šios ląstelės turėjo protoplazminių astrocitų morfologiją ir išreiškė GFAP (2 pav.) C), bet ne neuronų žymeklis NeuN (žr. papildomą S2 pav., kurį galima rasti www.jneurosci.org kaip papildomą medžiagą). Naudodami konfokalinę mikroskopiją, norėdami ištirti šių heterozigotinių pelių, nudažytų antikūnais prieš GFP ir sužadinančius bei slopinančius sinaptinius žymenis, skyrius, mes galėtume atskirai vizualizuoti astrocitinius γ-Pcdhs ir nedviprasmiškai nustatyti jų ryšį su sinapsėmis fenotipiškai normaliame audinyje.

Šios analizės patvirtino, kad astrocitiniai γ-Pcdh dažnai buvo susitelkę taškuose, esančiuose tiesiai greta sinaptinių kontaktų nugaros smegenyse (2 pav. F,G), taip pat hipokampe, kur astrocitų pogrupis taip pat išvengė Cre ekscizijos (papildomas S2 pav., prieinama www.jneurosci.org kaip papildoma medžiaga). Šios perisinapsinės punkcijos buvo glaudžiai susijusios su sužadinančiomis (86% iš 198 pridėtų sinapsinių taškų) ir slopinamosiomis (87% iš 247 pridėtų sinapsinių taškų) sinapsių ir dažnai atrodė, kad tarp jų apvyniojamos arba susikerta (2 pav.). F – H). Panašios analizės, kuriose „Cre-ER Pcdh“fcon3/+ sekcijos buvo trigubai imuninės nudažytos antikūnais prieš GFP (norint aptikti astrocitinius γ-Pcdh), pastovų domeną (norint aptikti visus γ-Pcdhs) (žr. papildomą S1 pav., galima rasti www.jneurosci.org kaip papildomą medžiagą), ir presinapsinis žymeklis fagotas identifikavo γ-Pcdh teigiamą sinaptinę tašką, esančią greta astrocitinio GFP/γ-Pcdh dvigubo teigiamo taško (2 pav.). D,E). Kartu šie rezultatai rodo, kad γ-Pcdhs yra tinkamai išdėstyti, kad tarpininkautų lipniems kontaktams tarp neuronų sinapsių ir perisinapsinių astrocitų procesų.

Astrocitiniai γ-Pcdhs yra labai svarbūs besivystančių neuronų sinaptogenezei in vitro

Norėdami nustatyti, ar astrocitiniai γ-Pcdh vaidina svarbų vaidmenį sinaptogenezėje, pradėjome modifikuodami ankstesniame darbe naudotą kokultūros sistemą, kurioje embrioniniai stuburo interneuronai auga ant astrocitų vejos, diferencijuodami ir suformuodami visiškai subrendusias sinapses per ~ 9 d (Weiner ir kt., 2005). Vietoj mišrių kultūrų, paruoštų iš tų pačių gyvūnų, mes atskirai sukūrėme naujagimių nugaros smegenų astrocitų monosluoksnį, ant kurio vėliau buvo padengti interneuronai iš E13 nugaros smegenų: tai leido mums savarankiškai kontroliuoti kiekvieno tipo ląstelių genotipą. Neuronai neišgyvena astrocitų preparato (duomenys neskelbtini), išvengiant bet kokio susirūpinimo, kad nepageidaujamo genotipo interneuronai gali būti perkelti į kultūrą. Tačiau priešinga komplikacija - astrocitų perkėlimas padengiant interneurono preparatą - yra įmanoma. Todėl norėdami įsitikinti, kad nėra netinkamo genotipo astrocitų, sukūrėme WT astrocitų bandomąsias kokultūras su neuronais iš PCdhfusg/+ pelėms, turinčioms tą pačią C egzono 3-GFP sintezę kaip ir PCdhfcon3 alelis (Wang ir kt., 2002b) (3 pav.). A). Šiose kultūrose tik TuJ1 teigiami neuronai buvo teigiami GFP, patvirtinantys, kad mūsų metodas leido visiškai atskirti astrocitų ir neuronų genotipą. Mes taip pat patvirtinome, kad γ-Pcdhs gali lokalizuotis šių kultūrų perizinaptiniuose procesuose in vivo, atvirkščiai, sukultūrinus laukinio tipo neuronus su astrocitais, paruoštais iš PCdhfusg/+ pelės. Šių kultūrų konfokalinė mikroskopija parodė astrocitinių γ-Pcdh puncta buvimą šalia daugelio sužadinamųjų ir slopinamųjų sinapsių (3 pav. B – D).

A–C, Skirtingų genotipų nugaros smegenų interneuronų ir astrocitų kokultūros. Neuronų kultūros iš PCdhfusg pelės su laukinio tipo astrocitais buvo nudažytos antikūnais prieš nurodytus baltymus ( A). Tik TuJ1 teigiami neuronai išreiškė GFP pažymėtus γ-Pcdh, o tai rodo, kad kultivavimo sistema leido veiksmingai atskirti neuronų ir astrocitų genotipus be perkėlimo. Laukinio tipo neuronų kokultūros su astrocitais iš PCdhfusg pelės, nudažytos GFP ir slopinančios ( B) arba jaudinantis ( C) sinaptiniai žymenys parodė, kad astrocitiniai γ-Pcdhs yra lokalizuoti daugelyje vietų, esančių greta sinaptinių galų in vitro, kaip pastebėta in vivo. Dideli vaizdai yra pavienių plokštumų iš z-sukrauti statmenus skerspjūvius per visą plotą z-dėmės baltose linijose nurodytose vietose rodomos dešinėje ir apačioje. D, Kelių tokių perisynaptinių kontaktų pėdsakai nurodytose dėžėse B ir C yra pateikiami. Mastelio juostos: A, 20 μm B, C, 2 μm.

Tada mes sukūrėme kultūras, kuriose astrocitai arba neuronai buvo paruošti iš nulinio mutanto PCdhdel/del pelės (Wang ir kt., 2002b Weiner ir kt., 2005 Prasad ir kt., 2008) [atitinkamai „astro-null“ (astrocyte-null) ir „neuron-null“] ir palygino sinapogenezės progresavimą kultūrų, palyginti su bendromis kultūromis, kuriose abu ląstelių tipai buvo normalūs („kontrolė“). Mes nepastebėjome jokių akivaizdžių išgyvenamumo, augimo greičio, morfologijos ar GFAP ekspresijos skirtumų tarp kontrolinių ir mutantinių astrocitų monosluoksnių. Neuronų diferenciacija ir neuritų išaugimas, čia įvertintas imuniniu dažymu žymenims MAP2 (4 pav.). O) ir TuJ1 (duomenys nerodomi) taip pat buvo neatskiriami visų tipų kultūrose, atitinkantys mūsų platų ankstesnį normalios neurogenezės, diferenciacijos ir aksonų augimo demonstravimą. PCdh-γ-null mutantinės pelės (Wang ir kt., 2002b Prasad ir kt., 2008).

Astrocitiniai γ-Pcdh yra labai svarbūs sinaptogenezei besivystančiose neuronų kultūrose. Embrioninių stuburo interneuronų, augančių tiesiai virš susiliejusio astrocitų viengubo sluoksnio, kultūros buvo paruoštos taip, kad nebūtų astrocitų (astro-null), neuronų (neuron-null) arba nė vieno (kontrolė). PCdh-γ-nulis ir sinaptogenezė, stebima kiekybiškai įvertinant presinapsinių ir postsinapsinių žymenų pozicijų tankį (t. y. tokių sinaptinių kontaktų skaičių tam tikroje srityje), kai neuronai subrendo nuo 6 iki 9 d in vitro (DIV). Kai astrocitai buvo mutantiniai, tiek sužadinamųjų, tiek slopinamųjų sinapsių skaičius žymiai sumažėjo po 6 DIV ( B, H, M, N), palyginti su kontrolinėmis kultūromis ( A, G, M, N), nors šiek tiek atsigavo 9 DIV ( E, K, M, N). Kai neuronai buvo mutantai, sinapsių tankis smarkiai sumažėjo tiek 6, tiek 9 DIV ( C, F, , L–N). Neuronų diferenciacija ir išgyvenimas, stebimas kiekybiškai įvertinus MAP2 imuninio dažymo plotą, nesiskyrė trijose kultūros sąlygose ( O). M-O duomenys pavaizduoti kaip kontrolinių verčių procentas. Grafikai M – O reiškia reikšmes ± SEM nuo 22 iki 44 laukų iš 6 kultūrų per laiko tašką. *p & lt 0,05 ***p & lt 0,001. Mastelio juosta (in L): A – L, 2 μm.

Kontrolinėse kultūrose sinapsių (apibrėžtų pagal poziciją ir dalinį presinapsinių ir postsinapsinių punktų sutapimą) jau buvo 6 d. in vitro (DIV) ir padidėjo 9 DIV (4 pav.). A,D,G,J,M,N). Tačiau astro-null kultūrose 6 DIV susiformavo nedaug sinapsių: sužadinimo sinapsės sumažėjo 77% (n = 22 laukai iš 6 kultūrų p < 0,001) ir slopinančias sinapses 39 % (n = 33 laukai iš 6 kultūrų p & lt 0,001) (4 pav B,H,M,N). Iki 9 DIV sinapsių tankis astro-null kultūrose atsigavo link kontrolinio lygio, nors slopinamųjų sinapsių skaičius vis tiek buvo žymiai sumažėjęs (4 pav.). E,K,M,N). Neuroninėse kultūrose tiek sužadinimo, tiek slopinamųjų sinapsių susidarymas drastiškai sumažėjo abiejų 6 DIV metu (iš viso 67% n = 44 laukai iš 12 kultūrų p < 0,001) ir 9 DIV (iš viso 80 proc n = 44 laukai iš 12 kultūrų p & lt 0,001) (4 pav C,F,,L – N). Šie rezultatai rodo, kad astrocitiniai γ-Pcdh yra labai svarbūs sinapsių susidarymui arba stabilizavimui besivystančiose kultūrose, tačiau galiausiai sinaptogenezė gali tęstis, jei patys neuronai išreiškia γ-Pcdh.

Astrocitinė γ-Pcdh snaptogenezės kontrolė priklauso nuo kontakto

Nors γ-Pcdhs gali tarpininkauti homofiliniam sukibimui ne nervų ląstelių linijose (Obata ir kt., 1995 Frank ir kt., 2005), lieka neaišku, ar tai vienintelis jų veikimo mechanizmas nervų sistemoje. Norėdami paklausti, ar γ-Pcdh praradimas astrocituose gali turėti antrinį poveikį sinaptogeninių išskiriamų faktorių išsiskyrimui, surinkome audinių auginimo terpę, kurią sąlygojo arba kontrolė (WT), arba PCdh-γ-null [nokautas (KO)] astrocitai. KO kultūrų terpėse (ACM) buvo žinomos sinaptogeninės molekulės TSP-2 (Christopherson ir kt., 2005) lygiai, nesiskiriantys nuo WT ACM (5 pav.). A). Atsižvelgiant į tai, pridedant koncentruoto WT arba KO ACM, kiekybiškai panašus sinapogenezės skatinimas kontrolinėse kultūrose (5 pav.) B), tai rodo PCdh-γ mutacija nesutrikdo snaptogeninių veiksnių astrocitų sekrecijos. Be to, koncentruotas WT ACM negalėjo visiškai išgelbėti sumažėjusio sinapsių tankio, pastebėto astro-nulio kultūrų (5 pav.). C), tai rodo PCdh-γ mutacija sutrikdo kitus, tikėtina, nuo kontakto priklausančius mechanizmus.

Astrocitiniai γ-Pcdhs reguliuoja sinaptogenezę per nuo kontakto priklausomą mechanizmą. Astrocitų kondicionuojama terpė (ACM) buvo surinkta iš astrocitų kultūrų, gautų iš WT arba PCdhdel/del pelės (KO). Vienodo ACM kiekio Western blot analizė neparodė jokio pastebimo skirtumo tarp išskiriamų trombospondino-2 (TSP-2) genų tipų ( A). Koncentruoto WT arba KO ACM pridėjimas prie kontrolinių kokultūrų, kurių ilgis viršija 6 DIV, vienodai reikšmingai padidino sinapsių tankį (t. y. sinapsinių kontaktų skaičių apibrėžtoje srityje), palyginti su kontroline terpe ( B), taigi WT ir KO ACM yra lygiaverčiai savo sinaptogeniniu stiprumu. Koncentruoto WT ACM pridėjimas negalėjo visiškai išgelbėti sinapsės tankio sumažėjimo, pastebėto astro-null kultūrose ( C). Be to, sinapsių tankio skirtumas tarp kontrolės ir astro-nulio kultūrų išliko, kai neuronai buvo padengti ant astrocitų, kurie buvo pritvirtinti paraformaldehidu ( D). Duomenys pavaizduoti kaip kontrolinių verčių procentas. Grafikai rodo vidurkius ± SEM iš 12 laukų iš 3 kultūrų per laiko tašką.

Norėdami tiesiogiai įvertinti, ar astrocitiniai γ-Pcdh skatina sinaptogenezę nuo kontakto priklausomu būdu, mes paruošėme kultūrą, kurioje astrocitinis viengubas sluoksnis buvo pritvirtintas paraformaldehidu prieš pridedant interneuronus. Mes, kaip ir kiti, manėme (Yamagata ir kt., 1995 Barker ir kt., 2008), kad ši manipuliacija turėtų pašalinti visus WT ir KO astrocitų ląstelių signalizacijos ar išskiriamų veiksnių išsiskyrimo skirtumus. Šių kultūrų 6 DIV metu sužadinimo ir slopinimo sinapsės buvo žymiai sumažintos, kai buvo astrocitų PCdh-γ-null (5 pav D), dar labiau palaikydamas astrocitinių γ-Pcdh vaidmenį teikiant nuo kontakto priklausomus signalus neuronams, skatinantiems sinapsių susidarymą ar stabilizavimą.

Dėl astrocitų riboto γ-Pcdh praradimo uždelsta sinaptogenezė in vivo

Toliau paklausėme, ar astrocitiniai γ-Pcdh yra svarbūs sinaptogenezei in vivo, naudojant sąlyginę PCdhfcon3 floksuotas alelis ir transgeninė linija, ekspresuojanti Cre rekombinazę, kurią kontroliuoja žmogus GFAP promotorius (Zhuo ir kt., 2001). Kadangi daugelis neuronų yra kilę iš radialinių gliaudinių pirmtakų, galinčių laikinai išreikšti GFAP, ši Cre linija kai kuriuose neuronuose, taip pat astrocituose, pašalina pluoštinius alelius, todėl negali būti naudojama astrocitų specifinei mutacijai daugelyje CNS ( duomenys nerodomi (žr. Zhuo ir kt., 2001). Yra įrodymų, kad nugaros smegenų neuronai nėra kilę iš GFAP+ radialinių gliaudų pirmtakų (Barry ir McDermott, 2005), o tai rodo, kad ten gali būti pasiektas ribotas astrocitų išskyrimas.

Mes tai išsiaiškinome perėję GFAP-Cre pelės su Z/EG pelėms reporteriams, kuriose po Cre ekscizijos visur esanti β-galaktozidazės/neo sulieto baltymo ekspresija pakeičiama GFP ekspresija (Novak ir kt., 2000) (6 pav. A–C). Naujagimiui GFAP-Cre Z/EG dvigubo transgeninio stuburo smegenų, imuninis dažymas parodė, kad visos GFP teigiamos ląstelės buvo GFAP teigiamos ir NeuN neigiamos, tuo tarpu β-galaktozidazės intarpai buvo aptikti tik NeuN teigiamuose neuronuose (6 pav.). B,C). Patvirtinti, kad floksuotas alelis buvo efektyviai pašalinamas iš astrocitų GFAP-Cre Pcdhfcon3 pelėms, mes imuniškai nudažėme dvigubas heterozigotines peles GFP pažymėtu pastoviu egzonu ir pastebėjome, kad buvo prarasta beveik visa γ-Pcdh-GFP kolokalizacija perisinapsiniu astrocitų žymekliu Glt1a (6 pav.). D,E). Tuo įsitikinęs GFAP-Cre poveikį astrocitų specifiniam iškirpimui besivystančiose nugaros smegenyse, mes kiekybiškai įvertinome sinapses skyriuose nuo GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 pelės ir PCdhfcon3/fcon3 kontroliuoti vadus E15, E17 ir P0, per pirmąją didelę sinaptogenezės bangą (May ir Biscoe, 1975 Vaughn, 1989), kurios pradžia sutampa su GFAP+ astrocitų atsiradimu (Lee ir kt., 2003 Stolt ir kt. , 2003 Barry ir McDermott, 2005) (duomenys neskelbtini).

Apribotas astrocitų skaičius PCdh-γ mutacija in vivo. Į GFAP-Cre Z/EG dviguba transgenika visur esanti β-galaktozidazės/neo sulieto baltymo ekspresija pakeičiama GFP ekspresija po Cre pašalinimo. GFAP teigiamos, bet ne NeuN teigiamos ląstelės ekspresuoja GFP, tuo tarpu NeuN teigiamos, bet ne GFAP teigiamos ląstelės ekspresuoja β-gal ( A, didesnio padidinimo pilkosios medžiagos vaizdai B, C), o tai rodo, kad Cre nėra išreikšta nugaros smegenų neuronuose ar jų pirmtakose. Pilkojoje medžiagoje GFAP-Cre PCdhfcon3/+ stuburo smegenų, sumažėja γ-Pcdh-GFP kolokalizacija su Glt1a, o tai patvirtina, kad Cre rekombinazė sugeba efektyviai išpjauti šių pelių astrocitų pluoštą alelį ( D, E). Mastelio juostos: A, 100 μm B, C, 25 μm D, E, 10 μm.

Kadangi žinoma, kad atskiri astrocitai užima nepersidengiančius domenus, kuriuose jie liečiasi su daugeliu neuronų procesų ir sinapsiniais terminalais (Bushong ir kt., 2002 Halassa ir kt., 2007), mes kiekybiškai įvertinome sinapses apskrituose 50 μm skersmens laukuose ir sutelkėme dėmesį į GFAP teigiamus , PCdh-γ mutantiniai astrocitai (7 pav.). REKLAMA). Tiek sužadinimo, tiek slopinančios sinapsės buvo žymiai sumažintos laukuose nuo GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 pelėmis, palyginti su pelėmis iš kontrolinių E15 ir E17 (7 pav.). E). Svarbu tai, kad tarp astroctye apribotų mutantų ir kontrolinių grupių suskaldytų kaspazės-3 teigiamų ląstelių skaičiaus skirtumo nepastebėta, o tai rodo, kad sinapsių tankio sumažėjimą sukėlė ne padidėjęs neuronų apoptozės lygis (papildomas S3 pav., pasiekiamas www. .jneurosci.org kaip papildomą medžiagą). Panašiai kaip sinapsės tankio atsistatymas, stebimas subrendusiose astro-null kokultūrose (4 pav. M,N), nustatėme, kad esant P0, sinapsių skaičius laukuose iš GFAP-Cre PCdhfcon3/fcon3 pelės pasiekė kontrolinį lygį (7 pav.). E papildomas S4 pavB,D, kurią galima rasti www.jneurosci.org kaip papildomą medžiagą). Šis astrocitų apribotas mutanto rezultatas prieštarauja mūsų ankstesniems eksperimentams PCdhdel/del Bax −/− pelėms (Weiner ir kt., 2005 Prasad ir kt., 2008), kurių sinapsės tankis išlieka mažas esant P0. Atsižvelgdami į tai ir su mūsų bendros kultūros eksperimentais (4 pav.), mes taip pat nustatėme reikšmingą sinapsių tankio sumažėjimą, kuris išliko esant P0 Actin-Cre PCdhfcon3 / fcon3 pelėms, kurių neuronai ir astrocitai yra mutantiniai (7 pav.). E papildomas S4 pavC,D, kurią galima rasti www.jneurosci.org kaip papildomą medžiagą). Įspūdingas sutapimas tarp jų in vivo duomenys ir mūsų kokultūros eksperimentai suteikia tvirtą paramą vystymuisi reguliuojamiems astrocitinių ir neuronų γ-Pcdh vaidmenims kontroliuojant sinaptogenezę.

Astrocitinės γ-Pcdh kontroliuoja sinaptogenezę embriono nugaros smegenyse in vivo. Imunitetų sinapsių kiekybinis įvertinimas buvo atliktas 50 μm apskritimuose laukuose, pavaizduotuose nugaros smegenų dalyse nuo GFAP-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 astrocitų riboti mutantai ir kontrolinės medžiagos prie E15, E17 ( REKLAMA) ir P0 (žr. papildomą S4 pav., kurį galima rasti www.jneurosci.org kaip papildomą medžiagą). Į REKLAMA', geltonas persidengimas tarp raudono ir žalio kanalų buvo ištrauktas ir „Adobe Photoshop“ konvertuotas į juodą, kad būtų aiškumo. E, Sinapsių tankis (t. y. tokių sinapsinių kontaktų skaičius 50 μm apskritime) buvo žymiai sumažintas. GFAP-Cre PCdhfcon3 / fcon3 mutantai (pilkos juostos), palyginti su kontrolinėmis grupėmis (baltos juostos) embriono amžiuje, tačiau atsigavo P0, priešingai nei Actin-Cre Pcdhfcon3 / fcon3 mutantai (juodos juostos). Grafikai rodo vidurkius ± SEM iš 18 laukų iš 3 kiekvieno genotipo gyvūnų per laiko tašką. *p < 0,05**p < 0,01 ***p < 0,001.


Diskusija

Serotonerginiai neuronai, kaip ir kiti monoaminerginiai neuronai, projektuoja savo aksonus iš smegenų kamieno, įskaitant raphe branduolius, į daugumą CNS regionų. Tačiau mechanizmas, kuris kontroliuoja pasaulines serotonerginių neuronų projekcijas į jų taikinius, iš esmės nežinomas. Štai mes tai radome PCdha nuorašai buvo stipriai išreikšti raphe branduoliuose nuo embrioninių stadijų iki pilnametystės, todėl ištyrėme serotonerginių projekcijų pasiskirstymą iš šių branduolių keliose pelių linijose, koduojančiose mutantinius Pcdha baltymus.

Pcdha-CR egzonų ištrynimas (PCdha ΔCR/ΔCR pelės) sukėlė nenormaliai pasiskirsčiusias serotoninergines pluoštas daugelyje smegenų sričių P21. Šie nukrypimai taip pat buvo aptikti visiškai išjudinus mutantą PCdha, kuriame Pcdha genų klasteris yra visiškai ištrintas (Okayama A, Hasegawa S, Hirabayashi T, Katori S, Yagi T, neskelbti duomenys). Ankstyvajame postnataliniame gyvenime (prieš susiformuojant galiniams pavėsiniams tiksliniuose regionuose) serotonerginių skaidulų pasiskirstymo modelis Pcdha ΔCR/ΔCR pelės buvo panašios į WT pelių. Tačiau esant P21, serotonerginių aksonų pasiskirstymas PCdha ΔCR/ΔCR pelės buvo iš esmės pakeistos. Tai reiškia, kad aksonai normaliai priartėjo prie tikslinių regionų, tačiau jie nesudarė plačių aksoninių pavėsinių, matomų suaugusioms WT pelėms to paties amžiaus, kai serotonerginės projekcijos yra beveik baigtos.

Lidovas ir Molliveris (1982) pasiūlė serotonerginių ašinių projekcijų ontogenezę suskirstyti į tris laikotarpius: pirma, aksonų pailgėjimas (E13 - E16), antra, selektyvių takų plėtra (E15 - E19) ir trečia, galinio lauko plėtra (E19– P21). Mūsų rezultatai rodo, kad Pcdha baltymai gali veikti paskutiniuoju laikotarpiu, kai vystosi terminalas. The PCdha ΔCR/ΔCR pelėms buvo nedidelis inervuojančių skaidulų tankis kelių tikslinių regionų centrinėje dalyje, pvz., globus pallidus ir substantia nigra, o tai galima paaiškinti nepakankamu serotonerginių skaidulų galiniu arborizavimu, kuris prasiskverbė į taikinių periferiją. Skirtingai nei skaidulų galai, serotonerginiai aksonų pluoštai, tokie kaip medialinis priekinių smegenų pluoštas, atrodė normalūs. PCdha ΔCR/ΔCR pelės (4 pavC,D). Terminalo lauko vystymosi metu serotonerginio terminalo arborizacijos formavimasis priklauso nuo kitų elementų brendimo vietinėje neuronų grandinėje (Lidov ir Molliver, 1982), o tai rodo, kad Pcdha baltymai gali būti įtraukti į sąveiką, skatinančią galinio lauko vystymąsi.

Serotonerginės inervacijos ontogenijos tyrimais buvo pasiūlyti veiksniai, reguliuojantys serotonerginių aksonų augimą ir galutinį arborizavimą. S-100β, Ca 2+ surišantis baltymas, išskiriamas iš astroglijos, veikia kaip augimo faktorius in vitro skatinant serotonerginį dygimą (Azmitia ir kt., 1990 Haring ir kt., 1993), tačiau S-100β-null pelėms rodo normalias serotonergines projekcijas (Nishiyama ir kt., 2002). Iš smegenų gautas neurotrofinis faktorius (BDNF) gali sukelti serotonerginį aksonų augimą suaugusiųjų žievėje (Mamounas ir kt., 1995, 2000), o serotonerginės projekcijos yra normalios jaunesnėms BDNF +/− pelėms, tačiau stebimas laipsniškas serotonerginių skaidulų nykimas. kai jiems yra 12–18 mėnesių (Lyons ir kt., 1999). Taigi išskiriami S-100β ir BDNF baltymai reguliuoja serotoninergines projekcijas, o jų praradimą gali kompensuoti kiti tarpląsteliniai baltymai, bent jau vystymosi pradžioje. Citoplazminis baltymas GAP-43, su augimu susijęs baltymas, yra stipriai išreikštas monoaminerginiuose neuronuose (Bendotti ir kt., 1991 Wotherspoon ir kt., 1997) ir yra serotonerginių projekcijų reguliatorius. GAP-43 nulinės pelės turi nenormalias serotonergines projekcijas, tačiau anomalijos skiriasi nuo mūsų PCdha ΔCR/ΔCR pelėms. Esant P0, keletas serotonerginių skaidulų pelėms, kurių GAP-43 nulinės, pateko į hipokampą (Donovan ir kt., 2002), o PCdha mutantai, atrodo, kad skaidulos pasiekia tikslą beveik įprastai. P21, esančiame PCdha mutantų, serotonerginių aksonų, patenkančių į hipokampo sritį, kiekis buvo normalus, nors jų pasiskirstymas hipokampo subregionuose buvo nenormalus (5 pav.F). Priešingai, pelėms, kurių GAP-43 nėra, serotonerginių aksonų, patenkančių į hipokampo sritį, tankis buvo mažesnis, palyginti su WT pelėmis (Donovan ir kt., 2002). Taigi, reguliuojant serotonergines projekcijas, GAP-43 funkcija gali būti reikalinga ankstyvose vystymosi stadijose, o Pcdha baltymų vaidmuo gali būti reikšmingas tik vėliau.

Neseniai parodėme, kad OSN PCdha ΔCR/ΔCR pelės neįprastai projektuojasi į uoslės lemputę (Hasegawa ir kt., 2008). Uoslės lemputėje Pcdha ΔCR/ΔCR pelėms, aksonai, ekspresuojantys vieną uoslės receptorių (M71 arba MOR23), nesusilieja į vieną glomerulą kiekvienoje uoslės svogūnėlio pusėje, o sudaro kelis mažus glomerulus, kurie išlieka net esant P30 ir P60. WT pelėms besivystančioje uoslės lemputėje pastebimos nenormalios aksoninės projekcijos į mažus daugybinius glomerulus, tačiau šie papildomi glomerulai palaipsniui pašalinami po gimdymo. Todėl OSN projekcijų anomalija PCdha ΔCR/ΔCR pelės atitinka idėją, kad Pcdha baltymai veikia paskutiniame aksoninių projekcijų brendimo etape.

Šiame tyrime negalėjome pasiūlyti tinkamų modelių, paaiškinančių serotonerginių skaidulų fenotipą. PCdha ΔCR/ΔCR pelėms, nes mechanizmas, kaip Pcdha baltymai modifikuoja serotonerginių aksonų augimą ir galutinį arborizavimą, vis dar neaiškus. Šis nežinojimas iš esmės yra dėl to, kad trūksta informacijos apie Pcdha baltymų sukibimo savybes ir tarpląstelinę lokalizaciją. Nors buvo pasiūlyta, kad Pcdha baltymai sąveikauja su β1-integrinu a vert- heterofilinis būdas (Mutoh ir kt., 2004), vert-nepavyko aptikti homofilinio Pcdha baltymų sukibimo (Morishita ir kt., 2006). Be to, nepavyko nustatyti Pcdha baltymų subląstelinės lokalizacijos serotonerginiuose neuronuose ir jų taikiniuose. Formuojantis serotonerginėms galinėms pavėsinėms, dauguma smegenų neuronų išreiškia aptinkamus Pcdha nuorašus. Mūsų imunohistocheminis tyrimas su Pcdha antikūnais rodo intensyvų imunoreaktyvumą serotonerginėse somatose, tačiau nepavyko nustatyti Pcdha baltymų subląstelinės lokalizacijos serotonerginių aksonų tikslinėse srityse. Pcdha imunoreaktyvumas buvo gana tolygiai pasiskirstęs neuropilyje (duomenys nerodomi, Hasegawa ir kt. ., 2008). Norint išsiaiškinti Pcdha baltymų lokalizaciją ląstelėse, reikės atlikti papildomus tyrimus, įskaitant imunoelektroninę mikroskopiją.

Čia parodėme, kad Pcdha baltymų A tipo citoplazminė uodega yra svarbi normaliam serotonerginių projekcijų pasiskirstymui. Pranešama, kad A tipo citoplazminė Pcdhas uodega yra susijusi su neurofilamentu M (Triana-Baltzer ir Blank, 2006). Be to, Pcdha baltymams taikomas matricos metaloproteazės skilimas, po kurio vyksta nuo presenilino priklausoma intramembraninė proteolizė, o suskaidyta A tipo citoplazminės srities dalis iš plazmos membranos persikelia į branduolį (Bonn ir kt., 2007). Todėl A tipo citoplazminis regionas gali atlikti lemiamą vaidmenį perduodant signalą.

Nors Pcdha baltymų perduodami signalai nėra žinomi, naujausios išvados pasiūlė kai kurias galimybes. Pavyzdžiui, buvo pranešta apie panašų nenormalių, sulipusių aksonų fenotipą tinklainės ašims Dscam (Dauno sindromo ląstelių adhezijos molekulės) mutantės pelės (Fuerst ir kt., 2008). Žinduolių DSCAM, Ig super šeimos narys, rodo homofilinį rišimąsi (Agarwala ir kt., 2000), skatina savęs vengimą (izoneuroninį) arborizuojant procesus ir slopina skirtingų neuronų (heteroneuroninių) procesų susižavėjimą (Fuerst ir kt., 2008) . Šis panašumas padidina galimybę, kad Pcdha baltymas gali veikti siekiant išvengti serotonerginių neuronų. A tipo citoplazminė uodega gali perduoti atstumiančius signalus serotonerginiuose neuronuose. Savęs vengimo defektas gali tiesiogiai paveikti serotonerginio aksono augimą ir galutinį arborizaciją. Arba nepakankamas savęs vengimas gali turėti įtakos pasikartojančių serotonerginių neuronų įkaitų, kurie reguliuoja šių neuronų aktyvumą, konfigūracijai, o po to netiesiogiai pakeisti galinius vartus nuo veiklos priklausančių mechanizmų.

Čia mes tai pademonstravome PCdha Molekulės vaidina svarbų vaidmenį nustatant normalias serotonergines projekcijas kiekviename mūsų tirtame smegenų regione. Mes taip pat nustatėme, kad PCdha ΔCR/ΔCR ir PCdha ΔA/ΔA pelių, serotonino kiekis hipokampe buvo žymiai padidėjęs, palyginti su WT. Anksčiau mes pranešėme, kad hipomorfinės Pcdha A tipo mutantinės pelės (PCdha ΔBneo/ΔBneo ), kuriame Pcdha B tipo nuorašai neaptinkami ir Pcdha A tipo nuorašų ekspresijos lygis yra sumažintas, rodo padidėjusį serotonino kiekį hipokampe ir sustiprintą kontekstinę baimę bei nenormalų erdvinį mokymąsi (Fukuda ir kt., 2008). Kartu šie duomenys atitinka idėją, kad nenormalus serotonino kiekis hipokampe atsiranda dėl Pcdha citoplazminės uodegos mutacijų ir kad pakitęs serotonino kiekis gali turėti įtakos elgesiui.

Žmogaus protokadherino genų klasteriai (Pcdha, PCdhb, ir PCdhg) yra 5q31 chromosomoje (Wu ir Maniatis, 1999). Šis lokusas yra susijęs su BD (Lewis ir kt., 2003 Hong ir kt., 2004 Herzberg ir kt., 2006 Kerner ir kt., 2007). Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad reikšmingai padidėjo mažojo alelio homozigotiškumas, kuriame yra vieno nukleotido polimorfizmas, esantis tariamai stiprintuve. PCdha geno, pacientams, sergantiems BD (Pedrosa ir kt., 2008).

Nesvarbu, ar ryšys su BD pasitvirtina, ar ne, nenormali serotonerginė inervacija yra susijusi su daugeliu neuropsichinių sutrikimų, įskaitant depresiją, nerimą, šizofreniją ir autizmą (Baumgarten ir Grozdanovic, 1995 Hen, 1996 Mann, 1998). Čia mūsų pastebėjimas, kad Pcdhas prisidėjo prie tinkamų serotonerginių projekcijų daugumoje, jei ne visose smegenyse, rodo, kad Pcdhas taip pat gali būti susijęs su daugelio neuropsichiatrinių sutrikimų patogeniniais mechanizmais, reguliuodamas serotonergines projekcijas.


Medžiagos ir metodai

Kadherinų identifikavimas ir anotacija B. floridae

Kadherino repertuarui cefalokordate nustatyti buvo naudojamas dvigubas metodas B. floridae (amfioksas arba lancetas). 2 jo genomo versija (2008 m. gegužės mėn.), atsisiųsta iš DOE Jungtinio genomo instituto (JGI: http://genome.jgi-psf.org/), apima 398 pastolius (Putnam ir kt., 2008). Pirma, šešių kadrų amfiokso genomo vertimas buvo ieškomas naudojant penkis esamus paslėpto profilio Markovo modelius (HMM) Pfam duomenų bazėje (Finn ir kt., 2010) ir vieną naujai sukurtą profilį HMM, pagrįstą pirmojo kadherino kartojimo lygiu. (EC1), kurį aprašėme anksčiau (Hulpiau ir van Roy 2009) (papildoma lentelė S1, papildoma medžiaga internete). Visi 1050 reikšmingų domeno įvykių, surūšiuoti pagal pastolius, yra parodyti papildomoje lentelėje S2 (papildoma medžiaga internete) ir apibendrinti papildomoje lentelėje S3 (papildoma medžiaga internete). Antra, 292 kadherino sekos iš įvairių metazoanų taksonų buvo suderintos su amfiokso genomu, naudojant tBLASTn (Johnson ir kt., 2008), siekiant nustatyti galimus ortologus (papildoma lentelė S4 ir apibendrinta papildomoje lentelėje S5, Papildoma medžiaga internete). Galiausiai abiejų analizių rezultatai buvo sujungti, kad būtų gautas visas amfioksijos kadherino superšeimos narių sąrašas (papildoma S1 pav., Papildoma lentelė S6 ir papildoma pastaba S1, papildoma medžiaga internete). Kai kuriais atvejais papildomos genų prognozės naudojant GenScan (Burge ir Karlin 1998) buvo atliktos genominiame regione, kuriame yra numanomi genai, ir aplink jį, o šios prognozės buvo palygintos su turimais RefSeq duomenimis ir JGI genų modeliais. Galiausiai, visų kandidatų genų domenai buvo anotuoti remiantis CD paieška (Marchler-Bauer ir kt., 2009) ir Phobius (Kall ir kt., 2007). Kiekvieno kadherino pakartojimo pradžia ir pabaiga buvo pataisyta rankiniu būdu. Pradžia buvo paimta sukibimo svirties, turinčios konservuotą Glu likutį, pradžioje, nes 11 padėtyje galas buvo DxNDxxPxF motyvas, kuris kartu su Glu11 yra svarbus kalcio surišimui.

Kadherinų identifikavimas ir anotacija N. vectensis

Aukščiau aprašytas metodas kadherinams amfioksuose identifikuoti taip pat buvo naudojamas dvipusio jūros anemono genome. N. vectensis. The N. vectensis genomo surinkimas 1.0 yra 10 804 genomo karkasai (Putnam ir kt., 2007). Profilio HMM analizė davė 1 016 rezultatų (papildoma lentelė S7, papildoma medžiaga internete), kurie buvo sugrupuoti pagal pastolius ir apibendrinti papildomoje lentelėje S8 (papildoma medžiaga internete). 322 dvišalių kadherino sekų tBLASTn analizės rezultatai (292 sekos, išvardytos papildomoje lentelėje S4, Papildoma medžiaga internete, plius 30 iš B. floridae) palyginti su N. vectensis genomas yra išvardyti papildomuose duomenyse (papildoma medžiaga internete) ir apibendrinti papildomoje lentelėje S10 (papildoma medžiaga internete). Visi rezultatai buvo sujungti ir anotuoti į N. vectensis kadherino repertuaras, kaip aprašyta amphioxus (papildomas S2 pav., papildoma lentelė S11 ir papildoma pastaba S2, Papildoma medžiaga internete).

Kadherinų identifikavimas ir anotacija T. adhaerens

Vėlgi, tiek profilio HMM, tiek tBLASTn metodai buvo naudojami siekiant nustatyti tariamus placozoan kadherinus, kuriuos koduoja T. adhaerens genomo. 1.0 versijos leidimo juodraštis T. adhaerens Grell-BS-1999 yra surinktas į 1415 pastolių (Srivastava ir kt., 2008). Tik 196 profilio HMM smūgiai, parodyti papildomoje lentelėje S12 (papildoma medžiaga internete), buvo rasti naudojant šešis HMM, išvardytus papildomoje lentelėje S1 (papildoma medžiaga internete). Ši HMM analizė buvo derinama su 338 metazoaninių kadherinų tBLASTn analize, palyginti su T. adhaerens genomas (žr. sąrašą papildomoje lentelėje S13, Papildoma medžiaga internete). Analizuoti metazoan kadherinai buvo 322 sekos, išvardytos papildomoje lentelėje S9 (papildoma medžiaga internete) ir 16 iš N. vectensis. Rezultatai buvo sujungti ir anotuoti į T. adhaerens kadherino repertuaras, kaip aprašyta aukščiau (papildomas S3 pav., papildoma lentelė S14 ir papildoma pastaba S3, Papildoma medžiaga internete).

Metazoan Cadherin Superfamily narių lyginamasis ir filogenetinis tyrimas

Baltymų domenų porinei homologijos analizei naudojome „pagrindinį vietinio derinimo paieškos įrankį dvi sekas“ (bl2seq) (Johnson ir kt., 2008). Analizė apėmė EB blokų sekų palyginimą, EB pagal EB analizę ir ne EB domenų palyginimą.

Atliekant kelių sekų homologijos analizę, sekos sulygiuotos naudojant ClustalX2 (Larkin ir kt., 2007), naudojant PAM baltymo svorio matricą, tarpo atidarymo baudą 5 ir tarpo išplėtimo baudą 0,05 tiek porų, tiek kelių parametrų nustatymuose.Kaimynų prisijungimo (NJ) medis buvo sukurtas naudojant 1000 įkrovos pakartojimų, o Bajeso išvados (BI) konsensuso medis buvo sukurtas naudojant MrBayes 3 (Ronquist ir Huelsenbeck 2003) (100 000 kartų, mėginių ėmimo dažnis 100 ir deginimas 25%). Abu medžių tipai buvo nupiešti naudojant dendroskopą (Huson ir kt., 2007). NJ medis vaizduojamas kaip radialinė kladograma su įkrovos reikšmėmis, o BI medis – kaip radialinė filograma su Bajeso užpakalinėmis tikimybėmis.

Mes panaudojome „VectorNTI“ (Lu ir Moriyama 2004), kad sukurtume „Clustal W“ išlyginimus 7EC ir 6EC ektodomenuose Ciona intestinalis protokadherinus, taip pat žmogaus protokaderinus. Naudodami VectorNTI AlignX modulį, po atitinkamais sekos derinimo blokais pridėjome baltymų domeno anotacijas. Palyginti atskirus EB domenus iš Ciona protokadherinų su atitinkamomis genominėmis sekomis, atlikome BLAT analizę (Kuhn ir kt., 2009) Kalifornijos universiteto Santa Kruzo genomo naršyklėje (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start). Visos filogenetinio medžio šeimos atrinktų narių visos baltymų sekos buvo panašiai suderintos naudojant VectorNTI Clustal W algoritmą.


Nuorodos

Takeichi M. Dinaminiai kontaktai: adherenų jungčių pertvarkymas, siekiant paskatinti epitelio rekonstrukciją. Nat Rev Mol Cell Biol. 201415:397–410.

Suzuki ST. Protadherinai ir kadherinų superšeimos įvairovė. J Cell Sci. 1996109(t. 11):2609–11.

Sano K, Tanihara H, Heimark RL, Obata S, Davidson M, St JT ir kt. Protokadherinai: didelė su kadherinu susijusių molekulių šeima centrinėje nervų sistemoje. EMBO J. 199312: 2249–56.

Frank M, Kemler R. Protocadherins. Curr Opin Cell Biol. 200214:557–62.

Hulpiau P, van Roy F. Kadherinų superšeimos molekulinė evoliucija. Int J Biochem Cell Biol. 200941:349–69.

Boggon TJ, Murray J, Chappuis-Flament S, Wong E, Gumbiner BM, Shapiro L. C-kadherino ektodomeno struktūra ir pasekmės ląstelių sukibimo mechanizmams. Mokslas. 2002296:1308–13.

Patel SD, Chen CP, Bahna F, Honig B, Shapiro L. Kadherino tarpininkaujama ląstelių ir ląstelių sukibimas: sulipimas kaip šeima. Curr Opin Struct Biol. 200313:690–8.

Morishita H, Umitsu M, Murata Y, Shibata N, Udaka K, Higuchi Y ir kt. Su kadherinu susijusių neuronų receptorių / protokadherino-alfa pirmojo ekstraląstelinio kadherino domeno struktūra atskleidžia kadherinų šeimų įvairovę. J Biol Chem. 2006281:33650–63.

Morishita H, Yagi T. Protokadherinų šeima: įvairovė, struktūra ir funkcija. Curr Opin Cell Biol. 200719: 584–92.

Kim SY, Yasuda S, Tanaka H, ​​Yamagata K, Kim H. Negrupuotas protokadherinas. Ląstelių klijai Migr. 20115:97–105.

Takagi J. Struktūrinis ligandų atpažinimo pagrindas nuo RGD (Arg-Gly-Asp) priklausomų integrinų. Biochem Soc Trans. 200432:403–6.

Mutoh T, Hamada S, Senzaki K, Murata Y, Yagi T. Su kadherinu susijęs neuronų receptorius 1 (CNR1) turi ląstelių adhezijos aktyvumą su beta1 integrinu, tarpininkaujančiu per CNR1 RGD vietą. Exp Cell Res. 2004294:494–508.

Yagi T. Molekuliniai kodai neuronų individualumui ir ląstelių surinkimui smegenyse. Priekinė Mol Neurosci. 20125:45.

Ribich S, Tasic B, Maniatis T. Tolimojo reguliavimo elementų identifikavimas protokadherino-alfa genų grupėje. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006103:19719–24.

Tasic B, Nabholz CE, Baldwin KK, Kim Y, Rueckert EH, Ribich SA ir kt. Promoterio pasirinkimas lemia sujungimo vietos pasirinkimą protokadherino alfa ir gama pre-mRNR sujungimo metu. Mol Cell. 200210:21–33.

Kaneko R, Kato H, Kawamura Y, Esumi S, Hirayama T, Hirabayashi T ir kt. Pcdh-alfa ir Pcdh-gama klasterių alelinis genų reguliavimas, apimantis tiek monoalelinę, tiek dvialelinę ekspresiją atskirose Purkinje ląstelėse. J Biol Chem. 2006281:30551–60.

Hirano K, Kaneko R, Izawa T, Kawaguchi M, Kitsukawa T, Yagi T. Vieno neurono įvairovė, sukurta Protocadherin-beta klasterio pelės centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje. Priekinė Mol Neurosci. 20125:90.

Esumi S, Kakazu N, Taguchi Y, Hirayama T, Sasaki A, Hirabayashi T ir kt. Protokadherino-alfa geno klasterio kintamų egzonų monoalelinė, bet kombinatorinė ekspresija pavieniuose neuronuose. Natas Genetas. 200537:171–6.

Zipursky SL, Sanesas JR. „Chemoaffinity“ peržiūrėtas: dscams, protokadherinai ir nervų grandinės surinkimas. Ląstelė. 2010143:343–53.

Lefebvre JL, Kostadinovas D, Chen WV, Maniatis T, Sanes JR. Protokadherinai tarpininkauja dendritiniam savęs vengimui žinduolių nervų sistemoje. Gamta. 2012488:517–21.

Wu Q, Maniatis T. Įspūdinga didelės žmogaus nervų kadherino tipo ląstelių sukibimo genų šeimos organizacija. Ląstelė. 199997:779–90.

Hayashi S, Takeichi M. Nauji protokadherinų vaidmenys: nuo savęs vengimo iki judrumo stiprinimo. J Cell Sci 2015.

Rubinstein R, Thu CA, Goodman KM, Wolcott HN, Bahna F, Mannepalli S ir kt. Neuronų savęs atpažinimo molekulinė logika per protokadherino domeno sąveiką. Ląstelė. 2015163:629–42.

Thu CA, Chen WV, Rubinstein R, Chevee M, Wolcott HN, Felsovalyi KO ir kt. Vienos ląstelės tapatybė, sukurta kombinatorinės homofilinės alfa, beta ir gama protokadherinų sąveikos. Ląstelė. 2014158:1045–59.

Hirayama T, Yagi T. Sugrupuoti protokadherinai ir neuronų įvairovė. Prog Mol Biol Transl Sci. 2013116:145–67.

Wu Q, Zhang T, Cheng JF, Kim Y, Grimwood J, Schmutz J ir kt. Pelės ir žmogaus protokadherino genų grupių lyginamoji DNR sekos analizė. Genome Res. 200111: 389–404.

Golan-Mashiach M, Grunspan M, Emmanuel R, Gibbs-Bar L, Dikstein R, Shapiro E. CTCF kaip pagrindinio sugrupuotų protokadherino genų reguliatoriaus identifikavimas. Nucleic Acids Res. 201240:3378–91.

Yokota S, Hirayama T, Hirano K, Kaneko R, Toyoda S, Kawamura Y ir kt. Protokadherino-beta genų, esančių už protokadherino-gama klasterio, grupių valdymo srities identifikavimas. J Biol Chem. 2011286:31885–95.

Phillips JE, Corces VG. CTCF: pagrindinis genomo audėjas. Ląstelė. 2009137:1194–211.

Hirayama T, Tarusawa E, Yoshimura Y, Galjart N, Yagi T. CTCF reikalingas nervų vystymuisi ir stochastinei sugrupuotų Pcdh genų ekspresijai neuronuose. Cell Rep. 20122:345–57.

Victoria-Acosta G, Vazquez-Santillan K, Jimenez-Hernandez L, Munoz-Galindo L, Maldonado V, Martinez-Ruiz GU ir kt. Epigenetinis XAF1 geno nutildymas yra susijęs su CTCF surišimo praradimu. Sci Rep. 20155: 14838.

Walker CJ, Miranda MA, O'Hern MJ, McElroy JP, Coombes KR, Bundschuh R ir kt. CTCF ir ZFHX3 mutacijų modeliai ir susiję endometriumo vėžio rezultatai. J Natl Cancer Inst. 2015107.

Katainen R, Dave K, Pitkanen E, Palin K, 0000000246216128 AO, Kivioja T ir kt. CTCF / koheziną surišančios vietos dažnai mutuoja sergant vėžiu. Natas Genetas. 201547:818–21.

Zou Y, Huang MZ, Liu FY, Yang BC, Wang LQ, Wang F ir kt. Pacientų, sergančių įvairiais kiaušidžių karcinomų potipiais, nebuvimas ir taškų mutacijos. Biomed Rep. 20153:33–7.

Remeseiro S, Cuadrado A, Gomez-Lopez G, Pisano DG, Losada A. Unikalus cohesin-SA1 vaidmuo genų reguliavime ir vystyme. EMBO J. 201231:2090–102.

Monahan K, Rudnick ND, Kehayova PD, Pauli F, Newberry KM, Myers RM ir kt. CCCTC surišimo faktoriaus (CTCF) ir kohesino vaidmuo kuriant protokadherino-alfa geno ekspresijos vienos ląstelės įvairovę. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012109:9125–30.

Tan YP, Li S, Jiang XJ, Loh W, Foo YK, Loh CB ir kt. Protokadherino geno ekspresijos reguliavimas keliais neuronus ribojančiais duslintuvo elementais, išsibarsčiusiais genų klasteryje. Nucleic Acids Res. 201038: 4985–97.

Kehayova P, Monahan K, Chen W, Maniatis T. Reguliavimo elementai, reikalingi protokadherino-alfa geno klasterio aktyvavimui ir slopinimui. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011108:17195–200.

Majumder S. REST gerais ir blogais laikais: vaidmenys auglių slopintuvuose ir onkogeninėje veikloje. Ląstelių ciklas. 20065:1929–35.

Wagoner MP, Gunsalus KT, Schoenike B, Richardson AL, Friedl A, Roopra A. Transkripcijos faktorius REST prarandamas sergant agresyviu krūties vėžiu. PLoS Genet. 20106: e1000979.

Huang Z, Bao S. REST ubikvitinacija ir deubikvitinacija bei jos vaidmenys sergant vėžiu. FEBS Lett. 2012586:1602–5.

Robertsonas KD, Wolffe AP. DNR metilinimas sveikatai ir ligoms. Nat Rev Genet. 20001:11–9.

Kawaguchi M, Toyama T, Kaneko R, Hirayama T, Kawamura Y, Yagi T. Ryšys tarp DNR metilinimo būsenų ir atskirų izoformų, koduotų protokadherino-alfa geno klasterio, transkripcijos. J Biol Chem. 2008283:12064–75.

Toyoda S, Kawaguchi M, Kobayashi T, Tarusawa E, Toyama T, Okano M ir kt. Vystymosi epigenetinė modifikacija reguliuoja stochastinę sugrupuotų protokadherino genų ekspresiją, sukurdama vieno neurono įvairovę. Neuronas. 201482: 94–108.

Novak P, Jensen T, Oshiro MM, Watts GS, Kim CJ, Futscher BW. Aglomeracinės epigenetinės aberacijos yra dažnas žmogaus krūties vėžio reiškinys. Cancer Res. 200868:8616–25.

Miyamoto K, Fukutomi T, Akashi-Tanaka S, Hasegawa T, Asahara T, Sugimura T ir kt. 20 genų, nenormaliai metiluotų žmogaus krūties vėžyje, identifikavimas. Int J Vėžys. 2005116:407–14.

Jones S, Zhang X, Parsons DW, Lin JC, Leary RJ, Angenendt P ir kt. Pagrindiniai žmogaus kasos vėžio signalizacijos keliai, kuriuos atskleidė pasaulinė genomo analizė. Mokslas. 2008321: 1801–6.

Vincentas A, Omura N, Hong SM, Jaffe A, Eshleman J, Goggins M. Protoriaus metilinimo, susijusio su genų ekspresijos profiliu kasos adenokarcinomoje, genomo mastu analizė. Clin Cancer Res. 201117:4341–54.

Waha A, Guntner S, Huang TH, Yan PS, Arslan B, Pietsch T ir kt. Epigenetinis protokadherino šeimos nario PCDH-gamma-A11 nutildymas astrocitomose. Neoplazija. 20057:193–9.

Shi H, Guo J, Duff DJ, Rahmatpanah F, Chitima-Matsiga R, Al-Kuhlani M ir kt. Naujų epigenetinių žymenų atradimas ne Hodžkino limfomos atveju. Kancerogenezė. 200728:60–70.

Dallosso AR, Hancock AL, Szemes M, Moorwood K, Chilukamarri L, Tsai HH ir kt. Dažnas ilgo nuotolio epigenetinis protokadherino genų grupių nutildymas 5q31 chromosomoje Wilmso navikoje. PLoS Genet. 20095: e1000745.

Dallosso AR, Osteris B, Green Nors A, Thorsen K, Curry TJ, Owen C ir kt. Ilgalaikis epigenetinis 5q31 chromosomos protokadherinų nutildymas yra susijęs su ankstyvomis ir vėlyvomis gaubtinės ir tiesiosios žarnos naviko formavimosi stadijomis, moduliuojant onkogeninius kelius. Onkogenas. 201231:4409–19.

Severson PL, Tokar EJ, Vrba L, Waalkes MP, Futscher BW. Nenormalios DNR metilinimo aglomeratai yra susiję su toksinių medžiagų sukelta piktybine transformacija. Epilepsija. 20127: 1238–48.

Yu JS, Koujak S, Nagase S, Li CM, Su T, Wang X ir kt. PCDH8, žmogaus PAPC homologas, yra kandidatas krūties vėžio naviko slopintuvas. Onkogenas. 200827: 4657–65.

Zhang D, Zhao W, Liao X, Bi T, Li H, Che X. Dažnas protokaderino 8 nutildymas promotoriaus metilinimo būdu, kandidatas į naviką, slopinantis žmogaus skrandžio vėžį. Oncol Rep. 201228:1785–91.

Lin YL, Wang YL, Ma JG, Li WP. Protokadherino 8 (PCDH8) promotoriaus metilinimo klinikinė reikšmė neinvaziniam šlapimo pūslės vėžiui. J Exp Clin Cancer Res. 201433:68.

Leshchenko V. V., Kuo PY, Shaknovich R, Yang DT, Gellen T, Petrich A ir kt. Viso genomo DNR metilinimo analizė atskleidžia naujus mantijos ląstelių limfomos vaistų kūrimo tikslus. Kraujas. 2010116:1025–34.

Yu B, Yang H, Zhang C, Wu Q, Shao Y, Zhang J ir kt. Didelės skiriamosios gebos PCDH10 metilinimo lygių lydymosi analizė skrandžio, gaubtinės ir tiesiosios žarnos ir kasos vėžio atvejais. Neoplazma. 201057:247–52.

Yu J, Cheng YY, Tao Q, Cheung KF, Lam CN, Geng H ir kt. Protokadherino 10, naujo naviko slopintuvo, metilinimas yra susijęs su prasta pacientų, sergančių skrandžio vėžiu, prognoze. Gastroenterologija. 2009136:640–51.e1.

Heitzer E, Artl M, Filipits M, Resel M, Graf R, Weissenbacher B ir kt. Skirtingos II stadijos gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu sergančių pacientų išgyvenamumo tendencijos yra susijusios su PCDH10, SPARC ir UCHL1 promotoriaus metilinimo būsena. Modas Patholas. 201427:906–15.

Danese E, Minicozzi AM, Benati M, Montagnana M, Paviati E, Salvagno GL ir kt. Epigenetinis pokytis: naujos įžvalgos, pereinančios iš audinių į plazmą – PCDH10 promotoriaus metilinimo pavyzdys sergant gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu. Br J Vėžys. 2013109:807–13.

Deng J, Liang H, Ying G, Dong Q, Zhang L, Yu J ir kt. Protokadherino-10 promotoriaus metilintų citozino-fosfato-guanino vietų klinikinė reikšmė skrandžio vėžio prognozei įvertinti. J Am Coll Surg. 2014219:904–13.

Ying J, Li H, Seng TJ, Langford C, Srivastava G, Tsao SW ir kt. Funkcinė epigenetika identifikuoja protokadheriną PCDH10 kaip galimą naviko slopintuvą nosiaryklės, stemplės ir daugybei kitų karcinomų, kurios dažnai metilinamos. Onkogenas. 200625: 1070–80.

Narayan G, Scotto L, Neelakantan V, Kottoor SH, Wong AH, Loke SL ir kt. Protokadherinas PCDH10, dalyvaujantis naviko progresavime, yra dažnas ir ankstyvas gimdos kaklelio vėžio promotoriaus hipermetilinimo tikslas. Genų chromosomų vėžys. 200948:983–92.

Harada H, Miyamoto K, Yamashita Y, Taniyama K, Mihara K, Nishimura M ir kt. Prognostinis protokadherino 10 metilinimo parašas gydant pašalintą I stadijos nesmulkialąstelinį plaučių vėžį. Vėžio med. 2015 m.

Cheung HH, Lee TL, Davis AJ, Taft DH, Rennert OM, Chan WY. Genomo masto DNR metilinimo profiliavimas atskleidžia naujus epigenetiškai reguliuojamus genus ir nekoduojančias RNR žmogaus sėklidžių vėžiu. Br J Vėžys. 2010102: 419–27.

Ying J, Gao Z, Li H, Srivastava G, Murray PG, Goh HK ir kt. Dažnas epigenetinis protokadherino 10 nutildymas metilinant esant daugeliui hematologinių piktybinių navikų. Brolis J Hematolis. 2007136:829–32.

Haruki S, Imoto I, Kozaki K, Matsui T, Kawachi H, Komatsu S ir kt. Dažnas protokadherino 17, kandidato naviko slopintuvo stemplės plokščiųjų ląstelių karcinomai, nutildymas. Kancerogenezė. 201031:1027–36.

Hu X, Sui X, Li L, Huang X, Rong R, Su X ir kt. Protokadherinas 17 veikia kaip naviko slopintuvas, sukeliantis naviko ląstelių apoptozę ir autofagiją, ir dažnai metilinamas sergant skrandžio ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu. J Pathol. 2013229:62–73.

Imoto I, Izumi H, Yokoi S, Hosoda H, Shibata T, Hosoda F ir kt. Dažnas kandidato naviko slopintuvo PCDH20 nutildymas epigenetiniu mechanizmu sergant nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu. Cancer Res. 200666:4617–26.

Gendrel AV, Tang YA, Suzuki M, Godwin J, Nesterova TB, Greally JM ir kt. Epigenetinės smchd1 funkcijos slopina genų grupes neaktyvioje X chromosomoje ir autosomose. Mol Cell Biol. 201333:3150–65.

Chen K, Hu J, Moore DL, Liu R, Kessans SA, Breslin K ir kt. Smchd1 tarpininkaujamo epigenetinio reguliavimo genomo jungimosi ir mechaninės analizės. Proc Natl Acad Sci U S A 2015 m.

Leong HS, Chen K, Hu Y, Lee S, Corbin J, Pakusch M ir kt. Epigenetinis reguliatorius Smchd1 veikia kaip naviko slopintuvas. Cancer Res. 201373: 1591–9.

Bamford S, Dawson E, Forbes S, Clements J, Pettett R, Dogan A ir kt. COSMIC (vėžinių somatinių mutacijų katalogas) duomenų bazė ir svetainė. Br J Vėžys. 200491: 355–8.

Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, Gross BE, Sumer SO, Aksoy BA ir kt. cBio vėžio genomikos portalas: atvira platforma, skirta tyrinėti daugiamačius vėžio genomikos duomenis. Vėžio atradimas. 20122:401–4.

Marambaud P, Wen PH, Dutt A, Shioi J, Takashima A, Siman R ir kt. PS1 FAD mutacijos slopina CBP surišantį transkripcijos represorių, susidarantį skaidant N-kadheriną PS1 / epsilonu. Ląstelė. 2003114:635–45.

Maretzky T, Reiss K, Ludwig A, Buchholz J, Scholz F, Proksch E ir kt. ADAM10 tarpininkauja E-kadherino išsiskyrimui ir reguliuoja epitelio ląstelių ir ląstelių adheziją, migraciją ir beta katenino perkėlimą. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005102:9182–7.

Marambaud P, Robakis NK. Genetiniai ir molekuliniai Alzheimerio ligos aspektai atskleidžia naujus transkripcijos reguliavimo mechanizmus. Genų smegenų elgesys. 20054:134–46.

Bonn S, Seeburg PH, Schwarz MK. Kombinatorinė alfa ir gama protokadherinų ekspresija keičia nuo presenilino priklausomą jų apdorojimą. Mol Cell Biol. 200727:4121–32.

Asad M, Wong MK, Tan TZ, Choolani M, Low J, Mori S ir kt. FZD7 skatina kiaušidžių vėžio kamieninio A potipio agresyvumą in vitro, reguliuodamas nekanoninį Wnt / PCP kelią. Ląstelių mirtis Dis. 20145: e1346.

Wang C, Tao B, Li S, Li B, Wang X, Hu G ir kt. PCDH9 vaidmens apibūdinimas reguliuojant gliomos ląstelių apoptozę ir invaziją. J Mol Neurosci. 201452:250–60.

Zhu P, Lv J, Yang Z, Guo L, Zhang L, Li M ir kt. Protokadherinas 9 slopina epitelio-mezenchiminį perėjimą ir ląstelių migraciją, aktyvuodamas GSK-3 beta kepenų ląstelių karcinomą. Biochem Biophys Res Commun. 2014452:567–74.

Xu Y, Yang Z, Yuan H, Li Z, Li Y, Liu Q ir kt. PCDH10 slopina daugybinės mielomos ląstelių dauginimąsi neigiamai reguliuodamas Wnt / beta-katenino / BCL-9 signalizacijos kelią. Oncol Rep. 201534:747–54.

Jao TM, Tsai MH, Lio HY, Weng WT, Chen CC, Tzeng ST ir kt. Protokadherinas 10 slopina navikogenezę ir metastazes sergant gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu, o jo genetinis praradimas numato nepalankią prognozę. Int J Vėžys. 2014135:2593–603.

Zhao Y, Yang Y, Trovik J, Sun K, Zhou L, Jiang P ir kt. Nauja endometrioidinio endometriumo vėžio reguliavimo ašis. Cancer Res. 201474:5103–17.

Chen T, Long B, Ren G, Xiang T, Li L, Wang Z ir kt. Protokadherinas20 veikia kaip naviko slopinimo genas: epigenetinė inaktyvacija sergant nosiaryklės karcinoma. J Cell Biochem. 2015 m.

Wu, JC, Wang FZ, Tsai ML, Lo CY, Badmaev V, Ho CT ir kt. Se-alilselenocisteinas sukelia autofagiją, moduliuodamas AMPK/mTOR signalizacijos kelią ir epigenetinį PCDH17 reguliavimą žmogaus kolorektalinės adenokarcinomos ląstelėse. Mol Nutr Food Res 2015.

Dang Z, Shangguan J, Zhang C, Hu P, Ren Y, Lv Z ir kt. Protokadherino-17 (PCDH-17) praradimas skatina metastazes ir invaziją per hiperaktyvaciją EGFR/MEK/ERK signalizacijos keliu sergant kepenų ląstelių karcinoma. Tumor Biol 2015.

Chen MW, Vacherot F, De La Taille A, Gil-Diez-De-Medina S, Shen R, Friedman RA ir kt. Protokadherino-PC ekspresijos atsiradimas prostatos vėžio ląstelėms įgyjant atsparumą apoptozei. Onkogenas. 200221: 7861–71.

Terry S, Maille P, Baaddi H, Kheuang L, Soyeux P, Nicolaiew N ir kt. Kryžminis moduliavimas tarp androgenų receptorių ašies ir protokadherino-PC tarpininkaujant neuroendokrininei transdiferenciacijai ir terapiniam prostatos vėžio atsparumui. Neoplazija. 201315:761–72.

Terry S, Queires L, Gil-Diez-de-Medina S, Chen MW, de la Taille A, Allory Y ir kt. Protokadherinas-PC skatina nuo androgenų nepriklausomą prostatos vėžio ląstelių augimą. Prostata. 200666:1100–13.

Yang X, Chen MW, Terry S, Vacherot F, Chopin DK, Bemis DL ir kt. Žmogui ir vyrams būdingas protokadherinas, kuris veikia per wnt signalizacijos kelią, kad sukeltų neuroendokrininę prostatos vėžio ląstelių transdiferenciaciją. Cancer Res. 200565:5263–71.

Bos PD, Zhang XH, Nadal C, Shu W, Gomis RR, Nguyen DX ir kt. Genai, tarpininkaujantys krūties vėžio metastazei į smegenis. Gamta. 2009459:1005–9.

Li AM, Tian AX, Zhang RX, Ge J, Sun X, Cao XC. Protokaderinas-7 sukelia krūties vėžio metastazes kauluose. Biochem Biophys Res Commun. 2013436:486–90.

Du W, Liu X, Fan G, Zhao X, Sun Y, Wang T ir kt. Nuo ląstelės membranos iki branduolio: atsirandantis E-kadherino vaidmuo genų transkripcijos reguliavime. J Cell Mol Med. 201418:1712–9.

Han MH, Lin C, Meng S, Wang X. Proteomikos analizė atskleidžia sutampančių sugrupuotų protokadherinų funkcijas. Mol ląstelių proteomika. 20109:71–83.

Wilker EW, van Vugt MA, Artim SA, Huang PH, Petersen CP, Reinhardt HC ir kt. 14-3-3sigma kontroliuoja mitozinį vertimą, kad palengvintų citokinezę. Gamta. 2007446: 329–32.

Urano T, Saito T, Tsukui T, Fujita M, Hosoi T, Muramatsu M ir kt. Efp skirtas 14-3-3 sigma proteolizei ir skatina krūties naviko augimą. Gamta. 2002417:871–5.

Kohmura N, Senzaki K, Hamada S, Kai N, Yasuda R, Watanabe M ir kt. Įvairovė, kurią atskleidė nauja kadherinų šeima, išreikšta neuronuose sinapsiniame komplekse. Neuronas. 199820: 1137–51.

Zhang B, Wang J, Wang X, Zhu J, Liu Q, Shi Z ir kt. Žmogaus gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio proteogenominis apibūdinimas. Gamta. 2014513: 382–7.

Vanhalst K, Kools P, Staes K, van Roy F, Redies C. Delta-Protocadherins: genų šeima, išreikšta skirtingai pelių smegenyse. Cell Mol Life Sci. 200562:1247–59.

Heggem MA, Bradley RS. Xenopus NF-protokadherino citoplazminis domenas sąveikauja su TAF1 / rinkiniu. Dev Cell. 20034:419–29.

Yasuda S, Tanaka H, ​​Sugiura H, Okamura K, Sakaguchi T, Tran U ir kt. Veiklos sukeltas protokadherinas arkadlinas reguliuoja dendritinį stuburo skaičių, sukeldamas N-kadherino endocitozę per TAO2beta ir p38 MAP kinazes. Neuronas. 200756:456–71.

Nakao S, Platek A, Hirano S, Takeichi M. Nuo kontakto priklausomas ląstelių migracijos skatinimas naudojant OL-protokadherino-Nap1 sąveiką. J Cell Biol. 2008182:395–410.

Grove EA. Neuronų pavertimas nervų sistema. Plėtra. 2008135:2203–6.

Homayouni R, Rice DS, Curran T. Disabled-1 sąveikauja su nauju vystymosi reguliuojamu protokadherinu. Biochem Biophys Res Commun. 2001289:539–47.

Borrell V, Pujadas L, Simo S, Dura D, Sole M, Cooper JA ir kt. Reelin ir mDab1 reguliuoja hipokampo jungčių vystymąsi. Molinių ląstelių neurozė. 200736: 158–73.

Kahr I, Vandepoele K, van Roy F. Delta-protokadherinai sveikatai ir ligoms. Prog Mol Biol Transl Sci. 2013116:169–92.

Kietzmann A, Wang Y, Weber D, Steinbeisser H. Xenopus paraksialinis protokadherinas slopina Wnt/beta-catenin signalizaciją per kazeino kinazę 2beta. EMBO Rep. 201213:129–34.

Kai M, Ueno N, Kinoshita N. Nuo fosforilinimo priklausoma paraksinio protokadherino (PAPC) ubikvitinacija kontroliuoja gastruliacijos ląstelių judėjimą. PLoS One. 201510:e0115111.

Schalm SS, Ballif BA, Buchanan SM, Phillips GR, Maniatis T. Protokadherino baltymų fosforilinimas receptorių tirozinkinaze Ret. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010107:13894–9.

Santoro M, Carlomagno F, Romano A, Bottaro DP, Dathan NA, Grieco M ir kt. RET, kaip dominuojančio transformuojančio geno, aktyvinimas MEN2A ir MEN2B gemalo linijos mutacijomis. Mokslas. 1995267:381–3.

Fernandez-Sanchez ME, Barbier S, Whitehead J, Bealle G, Michel A, Latorre-Ossa H ir kt. Mechaninis navikogeninio beta-katenino kelio indukcija auglio augimo slėgiu. Gamta. 2015523:92–5.

Faura TG, Vandepoele K, Brouwer U, Koning H, Elderman RM, Hackett TL ir kt. Protokadherinas-1 prisijungia prie SMAD3 ir slopina TGFbeta1 sukeltą geno transkripciją. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2015:ajplung.00346.2014.

Wu C, Niu L, Yan Z, Wang C, Liu N, Dai Y ir kt. Pcdh11x neigiamai reguliuoja dendritinį išsišakojimą. J Mol Neurosci. 201556:822–8.

Takeichi M. Klasikinių kadherinų morfogenetiniai vaidmenys. Curr Opin Cell Biol. 19957: 619–27.

Chen X, Gumbiner BM. Paraksialinis protokadherinas tarpininkauja ląstelių rūšiavimui ir audinių morfogenezei, reguliuodamas C-kadherino adhezijos aktyvumą. J Cell Biol. 2006174:301–13.

Kazmierczak P, Sakaguchi H, Tokita J, Wilson-Kubalek EM, Milligan RA, Muller U ir kt. Kadherinas 23 ir protokaderinas 15 sąveikaudami sudaro jutimo plaukų ląstelėse galines siūles. Gamta. 2007449:87–91.

Chen X, Koh E, Yoder M, Gumbiner BM. Protokadherino-kadherino-FLRT3 kompleksas kontroliuoja ląstelių adheziją ir morfogenezę. PLoS One. 20094: e8411.

Kraft B, Berger CD, Wallkamm V, Steinbeisser H, Wedlich D. Wnt-11 ir Fz7 sumažina ląstelių adheziją konvergenciniame išplėtime sekvestruodami PAPC ir C-kadheriną. J Cell Biol. 2012198:695–709.

Jung B, Kohler A, Schambony A, Wedlich D. PAPC ir Wnt5a/Ror2 kelias kontroliuoja ausies placode invaginaciją Xenopus. BMC Dev Biol. 201111:36.

Himmelreich N, Kaufmann, LT, Steinbeisser H, Korner C, Thiel C. Fosphomannomutase 2 trūkumas paveikia Xenopus laevis morfogenezė ir nekanoninis Wnt5a / Ror2 signalizavimas. J Inherit Metab Dis. 2015 m.

Kozu Y, Gon Y, Maruoka S, Kazumichi K, Sekiyama A, Kishi H ir kt. Protokadherinas-1 yra į gliukokortikoidus reaguojantis kritinis kvėpavimo takų epitelio barjero funkcijos reguliatorius. BMC Pulm Med. 2015 m. 15:80.

Chen J, Lu Y, Meng S, Han MH, Lin C, Wang X. Alfa- ir gama-protokaderinai neigiamai reguliuoja PYK2. J Biol Chem. 2009284:2880–90.

Suo L, Lu H, Ying G, Capecchi MR, Wu Q. Protokadherino klasteriai ir ląstelių adhezijos kinazė reguliuoja dendrito sudėtingumą per Rho GTPazę. J Mol Cell Biol. 20124:362–76.

Zhang X, Chattopadhyay A, Ji QS, Owen JD, Ruest PJ, Carpenter G ir kt. Židinio adhezijos kinazė skatina fosfolipazės C-gamma1 aktyvumą. Proc Natl Acad Sci U S A. 199996:9021–6.

Tvorogov D, Wang XJ, Zent R, Carpenter G. Nuo integrino priklausomas PLC-gama1 fosforilinimas tarpininkauja nuo fibronektino priklausomam sukibimui. J Cell Sci. 2005118:601–10.

Heemskerk FM, Chen HC, Huang FL. Baltymų kinazė C fosforilina Ser152, Ser156 ir Ser163, bet ne MARCKS Ser160 žiurkės smegenyse. Biochem Biophys Res Commun. 1993190:236–41.

Li H, Chen G, Zhou B, Duan S. Aktino gijų surinkimas miristoilinto alanino turtingo C kinazės substrato-fosfatidilinozitolio-4,5-difosfato signalizacija yra labai svarbi dendrito išsišakojimui. Mol Biol Cell. 200819:4804–13.

Keeler AB, Schreiner D, Weiner JA, baltymų kinazė C. Gama-protokadherino C-galo lipidų surišimo domeno fosforilinimas reguliuoja židinio adhezijos kinazės slopinimą ir dendrito arborizaciją. J Biol Chem. 2015290:20674–86.

Biswas S, Emond MR, Duy PQ, Hao lT, Beattie CE, Jontes JD. Protokadherinas-18b sąveikauja su Nap1, kad kontroliuotų motorinių aksonų augimą ir arborizaciją zebrafijoje. Mol Biol Cell. 201425:633–42.

Takenawa T, Suetsugu S. WASP-WAVE baltymų tinklas: jungiantis membraną su citoskeletu. Nat Rev Mol Cell Biol. 20078:37–48.

Kurisu S, Takenawa T. WASP ir WAVE šeimos baltymai: draugai ar priešai invazijos metu. Cancer Sci. 2010101:2093–104.

Hayashi S, Inoue Y, Kiyonari H, Abe T, Misaki K, Moriguchi H ir kt. Protokadherinas-17 tarpininkauja kolektyviniam aksonų išplėtimui, įdarbindamas aktino reguliatorių kompleksus į interaksoninius kontaktus. Dev Cell. 201430: 673–87.

Hoshina N, Tanimura A, Yamasaki M, Inoue T, Fukabori R, Kuroda T ir kt. Protokadherinas 17 reguliuoja presinapsinį surinkimą topografinėse kortikobazinių ganglijų grandinėse. Neuronas. 201378:839–54.

Brigidi GS, Bamji SX. Kadherino-katenino adhezijos kompleksai sinapsėje. Curr Opin Neurobiol. 201121:208–14.

Biswas S, Emond MR, Jontes JD. Protokadherinas-19 ir N-kadherinas sąveikauja, kad kontroliuotų ląstelių judėjimą priekinės neuruliacijos metu. J Cell Biol. 2010191:1029–41.

Morrow EM, Yoo SY, Flavell SW, Kim TK, Lin Y, Hill RS ir kt. Autizmo lokusų ir genų identifikavimas atsekant naujausius bendrus protėvius. Mokslas. 2008321:218–23.

Tsai NP, Wilkerson JR, Guo W, Maksimova MA, DeMartino GN, Cowan CW ir kt. Keli su autizmu susiję genai tarpininkauja sinapsių pašalinimui per proteasominį sinapsinio karkaso PSD-95 skaidymą. Ląstelė. 2012151:1581–94.

Bassermann F, Eichner R, Pagano M. Ubikvitino proteasomų sistema – įtaka ląstelių ciklo kontrolei ir tiksliniam vėžio gydymui. Biochim Biophys Acta. 20141843: 150–62.

Schaefer A, Nethe M, Hordijk PL. Ubikvitinas yra susijęs su citoskeleto dinamika, ląstelių adhezija ir migracija. Biochem J. 2012442:13–25.

Haas IG, Frank M, Veron N, Kemler R. Presenilino priklausomas apdorojimas ir gama-protokadherinų branduolinė funkcija. J Biol Chem. 2005280: 9313–9.

Trimarchi T, Bilal E, Ntziachristos P, Fabbri G, Dalla-Favera R, Tsirigos A ir kt. Viso genomo kartografavimas ir Notch reguliuojamų ilgų nekoduojančių RNR ūminės leukemijos atveju. Ląstelė. 2014158:593–606.

Keithas B, Simonas MC. Hipoksijos sukeliami veiksniai, kamieninės ląstelės ir vėžys. Ląstelė. 2007129:465–72.

Racioppi L, reiškia AR. Nuo kalcio / kalmodulino priklausoma baltymų kinazės kinazė 2: vaidmenys signalizuojant ir patofiziologijoje. J Biol Chem. 2012287:31658–65.

Colomer J, reiškia AR. Nuo Ca2 + / CaM priklausomos baltymų kinazės kaskados fiziologiniai vaidmenys sveikatai ir ligoms. Subcell Biochem. 200745:169–214.

Gardner HP, Ha SI, Reynolds C, Chodosh LA. CaM kinazė, Pnck, yra erdviškai ir laikinai reguliuojama pelių pieno liaukų vystymosi metu ir gali nustatyti epitelio ląstelių potipį, susijusį su krūties vėžiu. Cancer Res. 200060:5571–7.

Takai N, Ueda T, Nasu K, Yamashita S, Toyofuku M, Narahara H. Kalcio/kalmodulino priklausomybės kinazės I ir II taikymas kaip potenciali endometriumo karcinomų prevencija. Cancer Lett. 2009277:235–43.

Onouchi T, Kishino-Kaneko Y, Kameshita I, Ishida A, Sueyoshi N. Nuo Ca/kalmodulino priklausomos proteinkinazės fosfatazės (CaMKP/PPM1F) reguliavimas protokadherinu-gamaC5 (Pcdh-gammaC5). Arch Biochem Biophys 2015.


ELife virškinimas

Daugialąstė gyvybė priklauso nuo ląstelių gebėjimo sulipti. Pavyzdžiui, žmogaus kūnas susideda iš trilijonų ląstelių, sugrupuotų į audinius ir organus. Vien smegenyse yra apie 87 milijardai neuronų, suskirstytų į sudėtingus tinklus. Kad išliktų kartu, ląstelės savo paviršiuje naudoja baltymus, vadinamus ląstelių adhezijos molekulėmis (CAM). Yra keturios pagrindinės CAM šeimos, kurių kiekviena turi kelis narius, o vienos ląstelės CAM atpažįsta ir sąveikauja su kitoje CAM.

Bet kaip veikia šis procesas? Viena iš galimybių yra ta, kad skirtingi CAM deriniai leidžia skirtingoms ląstelėms sulipti. Bisogni ir kt. išbandė šią idėją tyrinėdamas CAM šeimą, vadinamą delta-protokadherinais. Šią šeimą sudaro devyni nariai, kurių kiekvienas turi savo geną. Kad ląstelės galėtų panaudoti geną baltymui gaminti, jos pirmiausia turi panaudoti geno DNR kaip šabloną RNR molekulei sukurti. Skaičiuojant skirtingų tipų RNR molekulių skaičių atskirose ląstelėse, Bisogni ir kt. parodė, kad kiekvienas pelės jutimo neuronai gamina iki septynių skirtingų delta-protokadherinų.

Tolesni eksperimentai atskleidė, kad ląstelės tiksliai suderina savo sąveiką, keisdamos delta-protokadherinų skaičių, tipą ir derinį savo paviršiuje. Be to, delta-protokadherinai taip pat keičia sąveiką tarp susijusių genų šeimos narių, sugrupuotų protokadherinų. Tai dar labiau padidina jų gebėjimą reguliuoti ląstelių sąveiką.

Priešingai nei ankstesniuose tyrimuose, kuriuose daugiausia dėmesio buvo skiriama atskiroms molekulėms, Bisogni ir kt. parodė, kaip molekulių deriniai veikia kartu, kad paveiktų ląstelių sukibimą. Šio kombinacinio kodo iššifravimas yra labai svarbus norint suprasti, kaip ląstelių sąveika sugenda sergant ligomis.

CAM genų mutacijos dažnai sutrikdo smegenų vystymąsi. Pateikti atradimai gali padėti suprasti, kaip tokios mutacijos sutrikdo CAM kombinacinį kodą ir keičia ląstelių sąveiką su ląstelėmis.


Genų transkriptų dinamikos atsekimas po organizmo mirties

Gyvenime genetiniai ir epigenetiniai tinklai tiksliai koordinuoja genų ekspresiją, tačiau mirties atveju nežinoma, ar genų ekspresija mažėja palaipsniui, ar staiga sustoja, ar yra susiję specifiniai genai ir keliai. Mes tai ištyrėme nustatydami mRNR nuorašus, kurių santykinis gausumas po mirties akivaizdžiai padidėja, įvertindami jų funkcijas ir palygindami jų gausos profilius per pomirtinį laiką dviejose rūšyse, pelėse ir zebrafish. Mes nustatėme, kad 1063 genų mRNR nuorašo profiliai tapo žymiai gausesni po sveikų suaugusių gyvūnų mirties laiko eilutėje, apimančioje iki 96 valandų po mirties. Ordinacijos brėžiniai atskleidė neatsitiktinius profilių modelius pagal laiką. Nors dauguma šių transkripto lygių padidėjo per 0,5 val. po mirties, kai kurie padidėjo tik 24 ir 48 valandomis po mirties. Funkcinis gausiausių transkriptų apibūdinimas atskleidė šias kategorijas: stresas, imunitetas, uždegimas, apoptozė, transportavimas, vystymasis, epigenetinis reguliavimas ir vėžys. Duomenys rodo, kad organizmo mirtis įvyksta laipsniškai išjungiant, o tai pasireiškia akivaizdžiu tam tikrų transkriptų su įvairiais gausos maksimumais ir trukmės padidėjimu.

1. Įvadas

Sveikas suaugęs stuburinis gyvūnas yra sudėtinga biologinė sistema, galinti atlikti labai sudėtingas funkcijas, tokias kaip gebėjimas judėti, bendrauti ir jausti aplinką – visa tai tuo pačiu metu. Šias funkcijas griežtai reguliuoja genetiniai ir epigenetiniai tinklai per daug grįžtamojo ryšio linijų, kurios tiksliai koordinuoja tūkstančių genų raišką tinkamu laiku, tinkamoje vietoje ir reikiamu lygiu [1]. Kartu šie tinklai palaiko homeostazę ir taip palaiko biologinės sistemos „gyvybę“.

Nors daug žinoma apie genų ekspresijos grandines gyvenime, informacijos apie tai, kas nutinka šioms grandinėms po organizmo mirties, yra nedaug. Pavyzdžiui, nėra gerai žinoma, ar genų ekspresija mažėja palaipsniui, ar staiga sustoja mirties atveju, taip pat ar mirus padidėja specifinių genų transkriptų gausa.. Kalbant apie organizmo „mirtį“, kuri čia apibrėžiama kaip labai sudėtingų sistemos funkcijų nutraukimas stuburiniuose gyvūnuose, spėjame, kad vyksta laipsniškas pasaulinių reguliavimo tinklų atsijungimas ir nykimas, taip pat suaktyvinami reguliavimo genai, susiję su išgyvenimu ir streso kompensavimu. Norėdami tai patikrinti, ištyrėme pasaulinį pomirtinį mRNR gausą dviejuose modelio organizmuose: zebrafish, Danio Rerio, ir naminė pelė, Musculus musculus. Tyrimo tikslas buvo ištirti „laikrodžio atsukimą“, nustatant mRNR nuorašus, kurių gausa su pomirtiniu laiku, ir įvertinant jų funkcijas remiantis pirmine literatūra. Šiame tyrime tirtos biologinės sistemos skiriasi nuo tirtų kituose tyrimuose, pavyzdžiui, atskiros negyvos ir (arba) sužeistos gyvų organizmų ląstelės, ty apoptozė ir nekrozė (apžvelgta [2–5]). Priešingai nei ankstesniuose tyrimuose, mRNR nuorašų gausa iš viso D. rerio kūnas, smegenys ir kepenys M. musculus buvo vertinami per pomirtinį laiką. MRNR nuorašai buvo išmatuoti naudojant „genų matuoklio“ metodą, kuris tiksliai praneša apie transkriptų gausą, remiantis kiekvieno mikrogardelių zondo kalibravimo kreive [6–9].

2. Medžiaga ir metodai

2.1. Sukelta mirtis ir pomirtinis inkubavimas

2.1.1. Zebrafish

Keturiasdešimt keturių moterų Danio Rerio buvo perkelti iš kelių pratekančių akvariumų, laikomų 28 °C temperatūroje, į stiklinę stiklinę, kurioje yra 1 l akvariumo vandens. Keturi asmenys buvo nedelsiant išimti, greitai užšaldyti skystu azotu ir laikomi „Falcon“ mėgintuvėliuose –80 ° C temperatūroje (du zebrafai kiekviename mėgintuvėlyje). Šie mėginiai buvo paskirti kaip pirmasis gyvų kontrolių rinkinys. Antrasis gyvų valdiklių rinkinys buvo panardintas į atvirą cilindrą (aprašytas toliau). Buvo naudojami du gyvų kontrolinių mėginių rinkiniai, siekiant nustatyti, ar zebrafish grąžinimas į jų gimtąją aplinką turėjo kokių nors įtakos genų ekspresijai (vėliau neaptikome jokio reikšmingo poveikio).

Likusios zebražuvės staiga mirė panardintos į „žudymo“ kamerą. Kamerą sudarė 8 l polistirolo indas, pripildytas atšaldyto ledinio vandens. Kad būtų galima sinchronizuoti likusių zebrinių žuvų mirtį, jie buvo perkelti į atvirą cilindrą su tinkleliu uždengtu dugnu ir cilindras panardintas į žudymo kamerą. Po 20–30 sekundžių panardinimo iš kameros buvo paimtos keturios zebrinės žuvys, užšaldytos skystame azote ir laikomos –80 ° C temperatūroje (dvi zebrinės žuvys viename „Falcon“ mėgintuvėlyje). Šie mėginiai buvo priskirti antruoju gyvų kontrolių rinkiniu. Likę zebrafai buvo laikomi žudymo kameroje 5 minutes, o tada cilindras buvo perkeltas į srautinį akvariumą, laikomas 28 ° C temperatūroje, kad jie būtų grąžinti į gimtąją aplinką.

Zebrafish mėginių ėmimas po mirties buvo atliktas: 0, 15 min, 30 min, 1 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h ir 96 h. Kiekvienam mėginių ėmimo laikui iš cilindro buvo paimtos keturios pasibaigusio galiojimo zebražuvės, užšaldytos skystame azote ir laikomos –80 °C temperatūroje Falcon mėgintuvėliuose (du zebražuvės į vamzdelį). Vienas zebrafijos mėginys buvo prarastas, tačiau ekstrahavimo tūris buvo pritaikytas vienam asmeniui.

2.1.2. Pelė

Mūsų eksperimentams buvo naudojamas pelės padermė C57BL / 6JRj (Janvier SAS, Prancūzija). Pelės buvo 20 savaičių amžiaus, maždaug tokio paties svorio patinai. Pelės buvo labai inbred ir tikimasi, kad jų genetinis fonas bus vienodas. Prieš eutanaziją pelės buvo laikomos kambario temperatūroje ir duodamos ad libitum prieiga prie maisto ir vandens. Kiekviena pelė buvo nužudyta gimdos kaklelio dislokacijos būdu ir įdėta į atskirą plastikinį maišelį su skylėmis, kad būtų galima pakeisti orą/dujas. Supakuotos skerdenos buvo laikomos kambario temperatūroje dideliame atvirame polistirolo inde. Mirusių pelių mėginių ėmimas buvo pradėtas 0 val. (po skerdimo laikas nulis) ir tęsiamas 30 min., 1 val., 6 val., 12 val., 24 val. ir 48 val.Kiekvienu mėginio ėmimo metu buvo paimti trijų pelių mėginiai (išskyrus 48 valandas, kai buvo paimti dviejų pelių mėginiai), o iš kiekvienos pelės buvo išskirtos visos smegenys (plius stiebas) ir dvi kepenų dalys. Kepenų mėginiams buvo paimtos iškarpos iš priekinės ir dešinės kepenų skilčių. Smegenų ir kepenų mėginiai buvo užšaldyti skystame azotu ir atskirai laikomi Falcon mėgintuvėliuose -80 ° C temperatūroje.

2.2. RNR ekstrahavimas, ženklinimas, hibridizacija ir DNR mikroschemos

Zebrafish individų skaičius buvo 43, pelių - 20. Dviejų žuvų mėginiai buvo sujungti analizei, todėl kiekvienu laiko momentu buvo atlikti du pakartotiniai matavimai. Pelių kartotinių matavimų skaičius buvo trys kiekviename iš pirmųjų šešių laiko taškų ir du po 48 valandų. Taigi bendras ištirtų zebrafinių mėginių skaičius buvo 22, o pelių – 20. Zebrafish mėginiai buvo sumaišyti su 20 ml Trizol ir homogenizuoti naudojant TissueLyzer (Qiagen). Pelėms 100 mg smegenų arba kepenų mėginių buvo sumaišyti su 1 ml Trizol ir homogenizuoti. Vienas mililitras emulsijos iš kiekvieno mėginio buvo dedamas į naują 1, 5 ml centrifugos mėgintuvėlį RNR ekstrahavimui, o likusi dalis buvo užšaldyta -80 ° C temperatūroje.

RNR buvo ekstrahuota pridedant 200 µl chloroformo, sumaišius mėginį ir inkubuojant 25 °C temperatūroje 3 min. Po centrifugavimo (15 min 12 000g esant 4 °C), supernatantas (apie 350 µl) buvo perkeltas į naują 1,5 ml mėgintuvėlį, kuriame yra toks pat tūris 70 % etanolio. Vamzdelis buvo sūkurinis, centrifuguotas ir išgrynintas laikantis procedūrų, aprašytų „PureLink RNA Mini Kit“ („Life Technologies“, JAV).

Izoliuota RNR, 400 ng vienam mėginiui, buvo paženklinta, išgryninta ir hibridizuota pagal „One-Color Microarray“ pagrįstą genų ekspresijos analizę („Quick Amp Labelling“) su „Tecan HS Pro“ hibridizacijos rinkiniu („Agilent Technologies“). Zebrafish, pažymėta RNR buvo hibridizuota su Zebrafish (v2) Gene Expression Microarray (dizaino ID 019161). Pelės atveju pažymėta RNR buvo hibridizuota su SurePrint G3 Mouse GE 8 × 60K Microarray Design ID 028005 (Agilent Technologies). Mikroklijai buvo pakrauti 1, 65 µg pažymėtos cRNR kiekvienam pomirtiniam mėginiui.

2.3. „Microarray“ kalibravimas

Oligonukleotidų (60 nt) zondai ant zebrafish ir pelių mikrogardelių buvo kalibruoti naudojant atitinkamai visų zebrafinių ir visų pelių pomirtinių mėginių sujungtą pažymėtą cRNR. Zebrafish masyvo skiedimo serija buvo sukurta naudojant šias pažymėtos cRNR koncentracijas: 0,41, 0,83, 1,66, 1,66, 1,66, 3,29, 6,60 ir 8,26 µg. Pelių masyvų praskiedimo serija buvo sukurta naudojant šias pažymėtos cRNR koncentracijas: 0,17, 0,33, 0,66, 1,32, 2,64, 5,28, 7,92 ir 10,40 µg. Kalibravimas apėmė zondų signalo intensyvumo pagal skiedimo koeficientą nubrėžimą ir izotermos modelio (pvz., Freundlich ir (arba) Langmuir) nustatymą, kuris geriausiai atitinka ryšį tarp signalo intensyvumo ir genų gausos.

Apsvarstykite zebrafish genų nuorašus, nukreiptus į A_15_P110618 (kuris yra vienas iš geno transkripcijos profilių Hsp70.3 parodyta 1 paveikslea). Išorinis failas FishProbesParameters.txt rodo, kad Freundlich modelis geriausiai atitinka praskiedimo kreivę su R 2 = 0,99. Šio zondo lygtis yra tokia:

čia SI yra vidutinis praskiedimo signalo intensyvumas x. Nuorašo gausa G buvo apskaičiuotas apverčiant šią lygtį. Kiekvienam zondo signalo intensyvumui pomirtiniu laiku, SIt, genų gausa G= (SIt/exp(7.1081)) 1/0.67632 . Konkrečiai, apsvarstykite du biologinius 15 minučių pomirtinių zebrafish pakartojimus, zondo A_15_P110618 signalo intensyvumas yra 770,5 ir 576, o tai atitinkamai reiškia 0,50 ir 0,33 savavališkų vienetų (arb. vienetų). Tikslinė gausa buvo toliau konvertuota į log10 ir rodoma išoriniame faile Fish_log10_AllProfiles.txt.

1 paveikslas. Reprezentatyvių genų (arb. vienetų) transkripcijos profiliai, ordinacijos grafikai, pagrįsti transkripto gausa pagal pomirtinį laiką (h) su atitinkamais transkripto įnašais (biplotai) ir vidutinis transkripto gausumas pagal grupes. (a–c) transkripcijos profiliai (a) Hsp70.3 genas, (b) Tox2 genas ir (c) nekontuotas transkriptas „NULL“ (ty anotacijos nėra, zondo numeris nerodomas) genas kaip pomirtinio laiko funkcija. (d, e) Ordinacijos sklypai (d) zebrafish ir (e) pelės buvo pagrįstos visais genų transkripto profiliais, kurių gausa žymiai padidėjo. Genų nuorašai biplotuose buvo savavališkai priskirti abėcėlinėms grupėms, atsižvelgiant į jų pozicijas ordinacijoje. Rodomas kiekvienos grupės vidutinis nuorašų gausumas.

Daugiau informacijos apie kalibravimo protokolus, naudojamus skaičiuojant RNR nuorašo santykinį gausumą, pateikiama kitur [6, 7].

2.4. Statistinė analizė

Gausumo lygiai buvo log-transformuoti analizei, siekiant stabilizuoti dispersiją. Vienpusis Dunnett's T-statistika buvo taikoma padidėjimo bandymui vieną ar kelis kartus po mirties, palyginti su gyva kontrole (žuvis) arba 0 laiku (pelė). Įkrovos procedūra su 10 9 modeliavimu buvo naudojama Dunnett statistikos kritinei vertei nustatyti, kad būtų galima atsižvelgti į nukrypimus nuo parametrinių prielaidų ir atsižvelgti į bandymų įvairovę. Kiekvieno geno nuorašo profilis buvo sutelktas atimant vidutines vertes kiekviename pomirtiniame laiko taške, kad būtų sukurti „nuliniai“ profiliai. Nulinių profilių įkrovos pavyzdžiai buvo sukurti siekiant nustatyti Dunnett statistikos maksimumo (visų genų) 95 procentilį. Manoma, kad stenogramoje gausu žymiai daugiau, kai vienas ar daugiau taškų turėjo Dunnett T-reikšmės, didesnės nei 95 procentilis. Atitinkami genai buvo išsaugoti tolesnėms analizėms.

Buvo atlikta stačiakampė gausos transformacija į jų pagrindinius komponentus (PC), o rezultatai buvo pavaizduoti dvimatėje ordinacijos diagramoje. The m ×n buvo sukurta gausybės matrica (mėginių ėmimo laikas pagal genų transkriptų skaičių), kuri yra 10 × 548 zebrinėms žuvims ir 7 × 515 pelėms. m × m matrica D Euklido atstumai tarp visų mėginių ėmimo laiko porų. Pagrindinių komponentų analizė (PCA) buvo atlikta atstumų matricoje, D. Norint ištirti ir vizualizuoti skirtumus tarp mėginių ėmimo laiko, buvo sukurta pirmųjų dviejų pagrindinių komponentų (PC1 ir PC2) sklaidos diagrama. Norint nustatyti santykinį genų transkriptų indėlį, buvo apskaičiuota kiekvieno mėginių ėmimo laiko projekcija į (PC1 ir PC2) plokštumą ir tie genų transkriptai, turintys didelę koreliaciją (didesnę arba lygi 0,70) tarp gausos ir bet kurio komponento (PC1 arba PC2). buvo rodomi kaip biplotas.

2.5. Genų anotacija ir funkcinis kategorizavimas

„Microarray“ zondo sekos buvo atskirai anotuotos, atliekant BLASTN paiešką zebrafish ir pelių NCBI duomenų bazėse (2015 m. vasario mėn.). Genų anotacijos buvo išsaugotos, jei bitų balas buvo didesnis arba lygus 100, o anotacijos buvo tinkamos 5′–3′ orientacijos. Transkripcijos faktoriai, transkripcijos reguliatoriai ir ląstelių signalizacijos komponentai (pvz., Receptoriai, fermentai ir pasiuntiniai) buvo nustatyti kaip pasauliniai reguliavimo genai. Likusieji buvo laikomi atsako genais.

Funkcinės kategorijos buvo atliktos apklausiant anotuotus genų nuorašus pirminėje literatūroje ir naudojant „UniProt“ (www.uniprot.org). Genai, kurie funkciškai nepriskirti prie jų gimtojo organizmo (zebrafish arba pelės), buvo priskirti filogenetiškai susijusių organizmų (pvz., žmogaus) genams. Su vėžiu susiję genai buvo nustatyti naudojant anksčiau sukurtą duomenų bazę (žr. 1 papildomą failą: S1 lentelė [10]).

3. Rezultatai

Išskyrus visą mRNR, kalibruojant mikrogardelių zondus ir nustačius nuorašo gausą kiekvienu pomirtiniu mėginių ėmimo metu, buvo gauta smulkiagrūdė zebražuvės ir pelės transkripto duomenų serija. Nustatyta, kad apytiksliai 84,3 % (36 811 iš 43 663) zebrafinių zondų ir 67,1 % (37 368 iš 55 681) pelių zondų yra tinkamos dozės ir atsako kreivės kalibravimui (elektroninė papildoma medžiaga, failai S1–S7 http://dx. doi.org/10.5061/dryad.hv223).

2 paveiksle parodyta visų nuorašų gausumo suma, apskaičiuota pagal kalibruotus zondus, priklausomai nuo pomirtinio laiko. Apskritai, visų gausų suma laikui bėgant mažėjo, o tai reiškia, kad mažiau transkripto taikinių hibridizavosi su mikrogardelių zondais. Zebrafijoje mRNR staiga sumažėjo 12 val. po mirties (2 pav.a), o pelės smegenims (2 pavb), mRNR padidėjo per pirmąją valandą, o vėliau palaipsniui sumažėjo. Pelės kepenims mRNR palaipsniui mažėjo po mirties. Faktas, kad bendra mRNR parodyta 2 paveikslea, b atspindi elektroforezės modelius, parodytus elektroninėje papildomoje medžiagoje, S1 ir S2 paveikslai (neatsižvelgiant į 28S ir 18S rRNR juostas) rodo bendrą geno matuoklio metodo sutikimą su geliu pagrįstu metodu (t. y. „Agilent Bioanalyzer“). Taigi, mRNR gausa priklauso nuo organizmo (zebrafish, pelės), organo (smegenų, kepenų) ir pomirtinio laiko, kuris yra suderintas su ankstesniais tyrimais [11–16].

2 paveikslas. Bendras mRNR gausumas (savavališki vienetai, tarpiniai vienetai) pagal pomirtinį laiką, nustatytas naudojant visus kalibruotus „microarray“ zondus: (a) išgauti iš visos zebražuvės, (b) išgautas iš sveikų pelių smegenų ir kepenų audinių. Kiekvienas atskaitos taškas žymi dviejų zebražuvių ir vieno pelės individų mRNR.

Nuorašo gausą lemia jo sintezės greitis ir skilimo greitis [17]. Čia sutelkėme dėmesį į transkriptus, kurių gausa žymiai padidėjo, palyginti su gyvomis kontrolėmis, nes šie genai gali būti aktyviai transkribuojami po organizmo mirties, nepaisant bendro bendro mRNR sumažėjimo laikui bėgant. Nuorašas apibrėžiamas kaip reikšmingai padidėjęs gausumas, kai bent vienas laiko taškas buvo statistiškai didesnis nei kontrolinio (1 pav.a–c). Svarbu suprasti, kad visi profiliai, ty 22 duomenų taškai zebrafish ir 20 taškų pelės, buvo atlikti statistiniu testu, siekiant nustatyti reikšmingumą (žr. Medžiaga ir metodai). Mes nustatėme, kad 548 zebrafish profiliai ir 515 pelių profiliai turėjo žymiai padidintą transkripto gausą.

Remdamiesi GenBank genų anotacijomis, mes nustatėme, kad tarp transkriptų, kurių gausa žymiai padidėjo, zebrafish 291 buvo baltymus koduojantis genas (53 %) ir 257 neanotuotas mRNR (47 %), o pelės 324 buvo žinomas baltymas. -koduojantys genai (63%), 190 neanotuotų mRNR (37%) ir viena nežinomos sudėties Agilent kontrolinė seka. Taigi, zebrafijoje ir pelėje yra žinoma apie 58% visų genų, turinčių reikšmingą transkripto gausą, o likusieji (42%) yra tariamai nekontuota RNR.

Genų, iš kurių gaunami transkriptai, kurių gausa po mirties žymiai padidėjo, pavyzdžiai yra: šilumos šoko baltymas (Hsp70.3) genas, su timocitų atranka susijęs didelio mobilumo grupės 2 langelis (Tox2) genas ir nežinomas (NULL) genas (1 pava–c). Kol Hsp70.3 nuorašo gausa padidėjo po 1 valandos po mirties ir pasiekė maksimumą 12 val Tox2 nuorašas padidėjo po 12 valandų po mirties ir pasiekė maksimumą 24 val NULL nuorašas nuosekliai didėjo po mirties. Šie skaičiai pateikia tipinius nuorašų profilių pavyzdžius ir vaizduoja didelį mėginių pakartojimų atkuriamumą, taip pat išvesties kokybę, gautą taikant genų matuoklio metodą.

3.1. Neatsitiktiniai modeliai nuorašo profiliuose

Nuorašų profilių, kurių gausa žymiai padidėjo, ordinacijos diagramos atskleidė ryškius skirtumus su pomirtiniu laiku (1 pav.d, e), o tai rodo, kad genų transkriptų gausos padidėjimas abiejuose organizmuose buvo pastebimas (neatsitiktinis). Biplotai parodė, kad 203 zebrafish transkripto profiliai ir 226 pelių profiliai reikšmingai prisidėjo prie įšventinimo. Norėdami nustatyti modelius nuorašo profiliuose, priskyrėme juos grupėms pagal jų padėtį biplotuose. Šešios profilių grupės buvo priskirtos zebražuvėms (A–F), o penkios grupės (G–K) – pelėms. Vidutinio genų transkripto gausumo nustatymas pagal grupes atskleidė vidutinių profilių formų skirtumus, ypač didžiausio gausumo laiką ir dydį, o tai lėmė duomenų taškų išdėstymą ordinacijose.

Genai, koduojantys pasaulines reguliavimo funkcijas, buvo tiriami atskirai nuo kitų (t. y. atsako genų). Apibendrinti rezultatai rodo, kad apie 33 % ordinacijos sklypų genų buvo susiję su visuotiniu reguliavimu, 14 % šių koduojančių transkripcijos faktorių / transkripcijos reguliatorių ir 19 % koduoja ląstelių signalinius baltymus, tokius kaip fermentai, pasiuntiniai ir receptoriai (elektroninė papildoma medžiaga, lentelė S3). Atsakymo genai sudarė 67% visų.

Genai buvo priskirti 22 kategorijoms (elektroninė papildoma medžiaga, failas S8), kai kurie genai buvo suskirstyti į kelias kategorijas. Pavyzdžiui, eukariotų vertimo inicijavimo faktoriaus 3 subvienetas J-B (Eif3j2) genas buvo priskirtas baltymų sintezės ir vėžio kategorijoms [18].

Buvo tiriami šių funkcinių kategorijų genai: stresas, imunitetas, uždegimas, apoptozė, tirpių / jonų / baltymų pernešimas, embriono vystymasis, epigenetinis reguliavimas ir vėžys. Mes sutelkėme dėmesį į šias kategorijas, nes jos buvo bendros abiem organizmams, jose buvo keli genai ir jie gali pateikti galimus paaiškinimus dėl transkripto gausos padidėjimo po mirties (pvz., epigenetinis genų reguliavimas, embriono vystymasis, vėžys). Transkripcijos profiliai buvo nubraižyti pagal kategorijas, o kiekvienas profilis buvo suskirstytas pagal padidėjusio gausumo ir didžiausio gausumo laiką. Tai leido palyginti abiejų organizmų transkripto dinamiką kaip pomirtinio laiko funkciją. Kiekvienai kategorijai pateikėme geno pavadinimą ir funkciją bei palyginome transkripto dinamiką organizmuose ir tarp jų.

3.2. Streso reakcija

Tikimasi, kad organizmo mirties atveju žymiai padidės atsako į stresą genų transkriptų gausa, nes šie genai yra aktyvuojami gyvenime, kad susidorotų su perturbacijomis, atkurtų homeostazę [19] ir stabilizuotų citoskeletą [20]. Streso atsako genai buvo priskirti trims grupėms: šilumos šoko baltymas (Hsp), su hipoksija susijusias ir „kitas“ reakcijas, tokias kaip oksidacinis stresas.

3.2.1. Hsp

Zebrafijoje, Hsp Genų nuorašai, kurių gausa žymiai padidėjo, buvo: perkeltas promotoriaus regionas (Tpr), Hsp70.3 ir Hsp90 (3 pav.). The Tpr genas koduoja baltymą, kuris palengvina jo eksportą Hsp mRNR prasiskverbia per branduolio membraną [21] ir buvo susijusi su chromatino organizavimu, transkripcijos reguliavimu, mitoze [22] ir ląstelių senėjimo kontrole [23]. The Hsp70.3 ir Hsp90 genai koduoja baltymus, kurie kontroliuoja intracelulinio kalcio kiekį [24], padeda susilankstyti baltymus ir padeda skaidyti baltymus [25].

3 paveikslas. Padidėjusi atsako į stresą genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h) ir streso kategoriją: (a) zebrafish ir (b) pelė. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė.

Pelėje, Hsp Į genų nuorašus įtraukta: Tpr, Hsp- susijusi metiltransferazė (Mettl21) ir šilumos šoko baltymas 1 (1 psl) (3 pav.). The Mettl21 genas koduoja baltymą moduliuojantį Hsp funkcijos [26]. The 1 psl genas koduoja chaperonino baltymą, kuris padeda sulankstyti baltymus mitochondrijose [27].

Laikas ir trukmė Hsp nuorašų gausa skiriasi pagal organizmą. Apskritai, nuorašų gausos padidėjimas Hsp zebrafish genai atsirado daug vėliau nei pelėms (atitinkamai 4 val., palyginti su 0, 5 val. po mirties). Taip pat buvo skirtumų nuorašo gausos maksimumuose Hsp genų, nes zebrafijoje jie pasiekė maksimumą 9–24 val., o pelėms – 12–24 val. Ankstesni tyrimai ištyrė padidėjimą Hsp70.3 transkriptai su laiku gyvų serumo stimuliuojamose žmogaus ląstelių linijose [28]. Ir zebrafish, ir žmogaus ląstelių linijose (1 pava), Hsp70.3 geno transkriptas pasiekė didžiausią gausą maždaug po 12 valandų, o tai rodo, kad tos pačios reakcijos vyksta gyvenime ir mirtyje.

3.2.2. Hipoksija

Zebrafish, su hipoksija susijusių genų transkriptų, kurių žymiai padaugėjo, buvo: Anglies anhidrazė 4 (Ca4c), Branduolinis faktorius (NF) interleukinas-3 (Nfil3), hipoksijos sukeliamas faktorius 1-alfa (Hiflab) ir Arginazė-2 (Arg2) (3 pav.). Anglies anhidrazė 4 (Ca4c) genas koduoja fermentą, kuris anglies dioksidą paverčia bikarbonatu, reaguodamas į anoksines sąlygas [29]. The Nfil3 genas koduoja baltymą, kuris slopina hipoksijos sukeltą apoptozę [30] ir aktyvina imuninį atsaką [31]. The Hiflab genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris paruošia ląsteles deguonies sumažėjimui [32]. The Arg2 genas koduoja fermentą, kuris hipoksinėmis sąlygomis katalizuoja arginino virsmą karbamidu [33]. Pažymėtina, kad karbamido kaupimasis greičiausiai paskatino padidėjimą Slc14a2 genų nuorašai 24 val., kaip nurodyta Transporto skyriuje (toliau).

Pelės, su hipoksija susijusių genų transkriptų, kurių žymiai padaugėjo, apėmė: metiltransferazės hipoksijos indukuojamas domenas (Metimas1) ir sfingolipidų delta-desaturazė (Degs2) (3 pav.). The Metimas1 genas koduoja metiltransferazę, kuri tikriausiai dalyvauja genų reguliavime [34]. The Degs2 genas koduoja baltymą, kuris veikia kaip deguonies jutiklis ir reguliuoja keramidų metabolizmą [35]. Keramidai yra vaško lipidų molekulės ląstelių membranose, kurios reguliuoja ląstelių augimą, mirtį, senėjimą, adheziją, migraciją, uždegimą, angiogenezę ir intraląstelinę apyvartą [36].

Padidėjusi gausa Ca4c zebrafijos nuorašai tariamai rodo anglies dioksido susikaupimą zebrafijoje praėjus 0,1–1 valandai po mirties, tikriausiai dėl kraujotakos trūkumo. Padidėjusi gausa Nfil3 nuorašai zebrafish ir Metimas1 Pelės nuorašai rodo, kad abiejuose organizmuose hipoksinės sąlygos egzistuoja per 0,5 valandos po mirties. Kitų hipoksijos genų transkriptų gausa kinta po mirties, didėjant Hiflab, Arg2 ir Degs2 nuorašai atitinkamai 4 val., 12 val. ir 24 val.

3.2.3. Kitos streso reakcijos

Zebrafish genų transkriptai, kurių gausa žymiai padidėjo, buvo: šarminė keramidazė 3 (Acer3), peroksirodoksinas 2 (Prdx2), Iš karto anksti (Ier2), augimo sustojimas ir DNR pažeidimo sukeliamas baltymas (Gadd45a), cinko piršto CCH domenas, kuriame yra 12 (Zcchc12), Kortikotropiną atpalaiduojančio hormono receptorius 1 (Krhr1) ir cinko piršto AN1 tipo domenas 4 (Zfand4) (3 pav.). The Acer3 genas koduoja streso jutiklio baltymą, kuris tarpininkauja ląstelių augimo sustabdymui ir apoptozei [37]. The Prdx2 genas koduoja antioksidacinį fermentą, kuris kontroliuoja peroksido kiekį ląstelėse [38] ir skatina Tnfa baltymai, sukeliantys uždegimą [39]. The Ier2 genas koduoja transkripcijos faktorių, dalyvaujantį reaguojant į stresą [40]. The Gadd45a genas koduoja streso baltymo jutiklį, kuris sustabdo ląstelių ciklą [41], moduliuoja ląstelių mirtį ir išgyvenimą bei yra imuninių ląstelių signalizacijos tinklų dalis [42]. The Zcchc12 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį smegenų reakcijoje į stresą [43]. The Krhr1 ir Zfand4 genai koduoja streso baltymus [44,45].

Kol Acer3, Prdx2 ir Ier2 nuorašų skaičius padidėjo per 0,3 valandos po mirties, o tai rodo, kad pasikeitė fiziologinė būklė Gadd45a nuorašas padidėjo po 9 val., o kiti nuorašai (Zcchc12, Crhr1 ir Zfand4) padidėjo 24 val. po mirties.

Pelės genų transkriptai, kurių gausa žymiai padidėjo, buvo: su membrana susijęs RING-CH 4 (kovo 4 d), į homocisteiną reaguojantis endoplazminis tinklas, į ubikvitiną panašus domeno narys 2 (Herpud2), Prohibitin-2 (Phb2), Gadd45a ir dviejų oksoglutaratų ir nuo geležies priklausomų oksigenazės domenų, kuriuose yra 1 (Ogfod1) (3 pav.). The Kovo 4 d genas koduoja imunologiškai aktyvų atsako į stresą baltymą [46]. The Herpud2 genas koduoja baltymą, kuris jaučia išsiskleidusių baltymų kaupimąsi endoplazminiame tinkle [47]. The Phb2 genas koduoja ląstelės paviršiaus receptorių, kuris reaguoja į mitochondrijų stresą [48]. The Ogfod1 genas koduoja stresą jaučiantį baltymą [49].

Atkreipkite dėmesį, kad streso geno transkriptai pelėje padidėjo per 1 valandą po mirties ir išliko dideli 48 valandas.

3.2.4. Streso reakcijos santrauka

Abiejuose organizmuose organizmo mirtis padidino karščio šoko, hipoksijos ir „kitų streso“ genų transkriptų gausą, kurių laikas ir trukmė organizmuose ir tarp organizmų skyrėsi. Apsvarstykite, pavyzdžiui, Tpr ir Gadd45a genų, kurie buvo bendri abiem organizmams. Nors nuorašo gausa už Tpr genas reikšmingai padidėjo per 0,5 valandos po mirties abiejuose organizmuose, transkripto gausa Gadd45a zebrafish genas padidėjo 9 val., o pelėje - 0, 5 val. Be to, transkripcijos profilis Tpr genas buvo labiau kintantis zebrinėje žuvyje nei pelės, nes nuorašų padaugėjo po 0,3 val., 9 val. ir 24 val. po mirties, o tai rodo, kad jie gali būti reguliuojami per grįžtamojo ryšio kilpą. Priešingai, transkripcijos profilis Tpr pelės genas padidėjo po 0, 5 valandos ir pasiekė piką 12 ir 24 valandas po mirties.

Apskritai, reikšmingas streso genų transkripto gausos padidėjimas abiejuose organizmuose greičiausiai kompensuoja homeostazės praradimą.

3.3. Įgimtas ir adaptyvus imuninis atsakas

Organizmo mirties atveju buvo tikimasi, kad padidės imuninio atsako genų transkriptai, nes stuburiniai gyvūnai sukūrė būdus, kaip apsaugoti šeimininką nuo infekcijos gyvenime, net esant visiškai sterilioms sąlygoms [50]. Uždegimo genai buvo pašalinti iš šio skyriaus (nors jie yra įgimti imuniniai genai), nes mes juos ištyrėme atskirame skyriuje (toliau).

Zebrafish genų transkriptai, kurių gausa žymiai padidėjo, buvo: ankstyvas augimo atsakas-1 ir -2 (Egr1, Egr2), Interleukinas-1b (Il1b), l-aminorūgščių oksidazė (Laao), Interleukinas-17c (Il17c), membraną apimantis 4 domenų A pošeimos narys 17A.1 (Ms4a17.a1), Mucin-2 (Muc2), Imunoreaktyvus genas 1 (Irg1), Interleukinas-22 (Il22), Ubl karboksigalinė hidrolazė 18 (Usp18), Panašus į ATF 3 (Batf3), citochromo b-245 lengvoji grandinė (Cyba) ir su timocitų atranka susijusio didelio mobilumo grupės dėžės baltymų šeimos nario 2 (Tox2) (4 pav.). The Egr1 ir Egr2 genai koduoja baltymus, reguliuojančius B ir T ląstelių funkcijas esant adaptyviam imunitetui [51,52]. The Il1b genas koduoja interleukiną, kuris naikina bakterijų ląsteles, įtraukdamas kitas antimikrobines molekules [53]. The Laao genas koduoja oksidazę, susijusią su įgimtu imunitetu [54]. The Il17c ir Il22 genai koduoja interleukinus, kurie sinergiškai gamina antibakterinius peptidus [55]. The Ms4a17.a1 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį adaptaciniame imunitete [56]. The Muc2 genas koduoja baltymą, kuris apsaugo žarnyno epitelį nuo patogeninių bakterijų [57]. The Irg1 genas koduoja fermentą, gaminantį itakono rūgštį, kuri turi antimikrobinių savybių [58]. The 18 genas koduoja proteazę, kuri vaidina adaptyvų imunitetą [59]. The Batf3 genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris aktyvuoja genus, dalyvaujančius adaptaciniame imunitete [60]. The Cyba genas koduoja oksidazę, kuri naudojama mikroorganizmams naikinti [61]. The Tox2 genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris reguliuoja įgimtos imuninės sistemos natūralias žudikas (NK) ląsteles [62].

4 pav. Imuniteto genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h): (a) zebrafish ir (b) pelė. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė. Kai kurie nuorašai buvo pavaizduoti dviem skirtingais zondais (pvz. Il1b, Laao).

Imuniteto genų transkriptų padidėjimas zebrinėje žuvyje pasireiškė skirtingu laiku skirtingos trukmės metu. Nors adaptyviajame imunitete dalyvaujančių genų transkriptai padidėjo 0,1–0,3 val.Egr), 9 val.Ms4a17.a1) ir 24 val.Usp18, Batf3) po mirties, genų, susijusių su įgimtu imunitetu, transkriptai padidėjo 4 val.Il1b), 9 val (Laao, Il17c), 12 val (Muc2, Irg1) ir 24 val.Il22, Cyba, Tox2), nurodant daugialypį ir progresyvų požiūrį į sužalojimus ir mikrobų invazijos galimybę.

Pelės genų transkriptai, kurių gausa žymiai padidėjo, buvo: katalizinis polipeptido tipo 3G (Apobec3g), su CRISPR susijusi endonukleazė (Cas1), Perforin-1 (Prf1), Sunkusis imunoglobulino kintamasis 8–11 (Ighv8-11), C4b surišantis baltymas (C4b), Papildyti komponentą C7 (C7), T-ląstelių receptorių alfa ir delta grandinės (Tcra/Tcrd), didelio afiniteto imunoglobulino gama Fc receptorius I (Fcgr1a), Defensin (Defb30), chemokinas-4 (Ccr4), Interleukinas-5 (Il5), NK ląstelių receptorius 2B4 (CD244), diferenciacijos klasteris-22 (CD22), Limfocitų citozolinis baltymas 2 (Lcp2), Histocompatibility 2 O regiono beta lokusas (H2ob) ir interferono sukeltas transmembraninis baltymas 1 (Ifitm1) (4 pav.). The Apobec3g genas koduoja baltymą, kuris vaidina įgimtą antivirusinį imunitetą [63]. The Cas1 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį reguliuojant imuninės sistemos aktyvavimą [64–67]. The Prf1, C7 ir Defb30 genai koduoja baltymus, kurie naikina bakterijas, sudarydami poras tikslinių ląstelių plazmos membranoje [68–70]. The Ighv8-11 genas koduoja neaiškios funkcijos imunoglobuliną. The C4b genas koduoja baltymą, dalyvaujantį komplemento sistemoje [71]. The Tcra/Tcrd genai koduoja baltymus, kurie vaidina svarbų vaidmenį imuniniame atsake [72]. The Fcgr1a genas koduoja baltymą, dalyvaujantį tiek įgimtame, tiek adaptyviame imuniniame atsake [73]. The Ccr4 Genas koduoja citokiną, kuris pritraukia leukocitus į infekcijos vietas [74]. The Il5 genas koduoja interleukiną, dalyvaujantį tiek įgimtame, tiek adaptyviajame imunitete [75,76]. The CD244 ir CD22 genai koduoja baltymus, susijusius su įgimtu imunitetu [77]. The Lcp2 genas koduoja signalą perduodantį adapterio baltymą, dalyvaujantį T ląstelių vystyme ir aktyvavime [78]. The H2ob genas koduoja baltymą, dalyvaujantį adaptaciniame imunitete. The Ifitm1 genas koduoja baltymą, kuris turi antivirusinių savybių [79].

Daugumos imuninio atsako genų nuorašai padidėjo per 1 valandą po mirties.n = 14 iš 16 genų), o tai rodo greitesnį atsaką nei zebrafish.

3.3.1. Imuninio atsako santrauka

Imuninio atsako genų transkripto gausos padidėjimas abiejuose organizmuose apėmė įgimtus ir adaptacinius imuniteto komponentus. Įdomus reiškinys, pastebėtas pelėje (bet ne zebrafijoje), buvo tai, kad keturi genai (C7, Tcra / Tcrd, Fcgr1a ir Defb30) pasiekė transkripto gausos maksimumus dviem skirtingais pomirtiniais laikais (ty 1 val. ir 12 val.), o kiti pasiekė tik vieną. Genų transkripto gausos kintamumas rodo galimą reguliavimą grįžtamojo ryšio kilpomis.

3.4. Uždegimo reakcija

Buvo tikimasi, kad organizmo mirties atveju padidės uždegimo genų nuorašų gausa, nes uždegimas yra įgimtas imuniteto atsakas į sužalojimą. Zebrafijoje uždegimo genų nuorašai, kurie padidėjo, buvo: Egr1, Egr2, Il1b, naviko nekrozės faktoriaus receptorius (Tnfrsf19), Hemo oksigenazė 1 (Hmox1), naviko nekrozės faktorius (Tnf), G baltymų receptorius (Gpr31), Interleukinas-8 (Il8), naviko nekrozės faktorius alfa (Tnfa), NF kappa B (Nfkbiaa), MAP kinazę sąveikaujanti serino/treonino kinazė 2b (Mknk2b) ir kortikotropiną atpalaiduojančio faktoriaus receptorius 1 (Krhr1) (5 pav.). The Egr1 ir Egr2 genai koduoja transkripcijos faktorius, kurie yra atitinkamai prieš ir priešuždegiminiai [51,52,80]. The Il1b genas koduoja priešuždegiminį citokiną, kuris vaidina pagrindinį vaidmenį steriliame uždegime [81, 82]. The Tnfrsf19 genas koduoja receptorių, turintį priešuždegiminių funkcijų [83]. The Hmox1 genas koduoja fermentą, turintį priešuždegiminių funkcijų ir dalyvaujantį hemoraginiame katabolizme [84,85]. The Tnf ir Tnfa genai koduoja priešuždegiminius baltymus. The 31 gpr genas koduoja priešuždegiminį baltymą, kuris aktyvuoja NF-κB signalizacijos kelią [86]. The Il8 genas koduoja citokiną, turintį priešuždegiminių savybių [87]. The Nfkbiaa genas koduoja baltymą, kuris integruoja kelis uždegiminius signalizacijos kelius, įskaitant Tnf genai [88]. The Mknk2b genas koduoja baltymų kinazę, kuri nukreipia ląstelių atsaką ir yra priešuždegiminė [89]. The Krhr1 genas moduliuoja priešuždegiminius atsakus [90].

5 pav. Uždegimo genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h): (a) zebrafish ir (b) pelė. Uždegimas, pro-, + anti, −. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė. The Il1b ir Mknk2b genus reprezentavo du skirtingi zondai.

Padidėjęs priešuždegiminių medžiagų kiekis Egr1 po 0,1 val., po to padidėjo priešuždegiminis poveikis Egr2 nuorašas 0, 2 val., o tai rodo, kad vieno nuorašo padidėjimas paveikė kitą (5 pav.). Panašiai padidėja priešuždegiminių medžiagų gausa Il1b po 4 valandų po mirties nuorašo buvo stebimas: padidėjęs priešuždegiminių medžiagų gausa Tnfrsf19, Tnf, Gpr31 ir Il8 nuorašai ir priešuždegiminiai vaistai Hmox1 nuorašas po 9 val., padidėjo priešuždegiminių medžiagų gausa Tnfa, Nfkbiaa ir Mknk2b nuorašai po 12 val., ir padidėjęs priešuždegiminių vaistų gausa Krhr1 nuorašai 24 val. Pažymėtina, kad nors nė vienas priešuždegiminių genų transkriptas per 24 valandas nepadidėjo, priešuždegiminis Krhr1 genas išliko didelis 48 val. Taip pat reikėtų pažymėti, kad Il1b, Il8 ir Tnfa Buvo pranešta, kad genų nuorašai padidėja dėl trauminių smūgių sužalojimų pomirtiniuose žmogaus smegenų audiniuose [91].

Pelėms uždegimo genų transkriptai, kurių gausa padidėjo, buvo: mitogeno aktyvuota proteinkinazė (Žemėlapis3k2), TNF receptoriai (Tnfrsf9, Tnfrs14), B ląstelių limfomos 6 baltymas (Bcl6), 4 tipo C-C chemokino receptoriai (Ccr4), prokineticinas-2 (Prok2) ir trombocitus aktyvinančio faktoriaus receptorius (Pafr) (5 pav.). The Žemėlapis3k2 genas koduoja kinazę, kuri aktyvuoja priešuždegiminius NF-κB genus [89]. The Tnfrsf9 ir Tnfrs14 genai koduoja receptorių baltymus, kurie turi priešuždegiminių funkcijų [83]. The Bcl6 genas koduoja transkripcijos faktorių, turintį priešuždegiminių funkcijų [92]. The Ccr4 genas koduoja citokinų receptoriaus baltymą, susijusį su uždegimu [74]. The Prok2 genas koduoja į citokiną panašią molekulę, o Pafr genas, koduoja lipidų tarpininką, turi priešuždegiminių funkcijų [93, 94].

Daugumos su uždegimu susijusių genų transkriptų padaugėjo per 1 valandą po mirties ir toliau buvo gausu 12–48 val. Priešuždegiminis Bcl6 genų transkriptų gausa padidėjo dviem skirtingais laikais, 0, 5–6 val. ir 24 val., o tai rodo, kad jų gausa gali būti reguliuojama grįžtamojo ryšio kilpa. Taip pat reikėtų pažymėti, kad priešuždegiminis Map3k2 ir Tnfrs14 genų nuorašai nebuvo gausūs atitinkamai po 24 ir 12 valandų, o tai taip pat rodo reguliavimą numanoma grįžtamojo ryšio kilpa. Bcl6 nuorašo produktas.

3.4.1. Reakcijos į uždegimą santrauka

Abiejuose organizmuose kai kurie transkriptai, kurių padaugėjo, turi priešuždegiminių, kiti-priešuždegiminių funkcijų. Gali būti, kad nuorašų gausos padidėjimą reguliuoja grįžtamojo ryšio kilpos, apimančios pradinę uždegiminę reakciją, po kurios seka priešuždegiminė reakcija, siekiant ją slopinti [95]. Šių uždegiminių genų genų transkripto gausos kitimas rodo, kad pagrindinis reguliavimo tinklas vis dar veikia organizmo mirtį.

3.5. Apoptozė ir susiję genai

Kadangi apoptoziniai procesai naikina pažeistas ląsteles viso organizmo labui, mes tikėjomės, kad organizmo mirties atveju žymiai padidės apoptozės genų transkriptų gausa.

Zebrafish apoptozės geno nuorašai, kurių gausa padidėjo, buvo: Jun (Jdp2, birželio mėn), šarminė keramidazė 3 (Acer3), Fos (Fosb, Fosab, Fosl1), IAP surišantis mitochondrijų baltymas A (Diabloa), Peroxiredoxin-2 (Prdx2), kalio įtampa valdomas kanalo elementas 1 (Kcnb1), su kaspazės apoptoze susijusi cisteino peptidazė 3b (Casp3b), DNR pažeidimo sukeliamas nuorašas 3 (Ddit3), BCL2 (B ląstelių limfomos 2) sąveikaujantis žudikas (Bik) ir Ras asociacijos domeno šeima 6 (Rassf6) (6 pav.). The Jdp2 genas koduoja baltymą, kuris slopina transkripcijos faktoriaus aktyvatoriaus baltymo 1 aktyvumą.AP-1) [96]. The Acer3 genas koduoja fermentą, kuris palaiko ląstelės membranos vientisumą/funkciją ir skatina apoptozę [97]. The Fos genai koduoja baltymus, kurie dimerizuojasi su birželio mėn baltymai yra dalis AP-1 kuris skatina apoptozę [98,99]. The Diabloa genas koduoja baltymą, kuris neutralizuoja apoptozės (IAP) surišančio baltymo inhibitorius [99] ir aktyvina kaspazes [100]. The Prdx2 genas koduoja antioksidacinius fermentus, kurie kontroliuoja citokinų sukeltą peroksido kiekį ir slopina apoptozę [101]. nors Kcnb1 genas koduoja baltymą, naudojamą jonų kanalams gaminti, šių baltymų kaupimasis membranoje skatina apoptozę ląstelės signalizacijos keliu [102]. The Casp3b koduoja baltymą, kuris atlieka svarbų vaidmenį apoptozės vykdymo fazėje [103]. The Ddit3 genas koduoja transkripcijos faktorių, skatinantį apoptozę. The Bik genas koduoja baltymą, skatinantį apoptozę [104]. The Rassf6 genas koduoja baltymą, skatinantį apoptozę [105].

6 pav. Apoptozės genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h): (a) zebrafish ir (b) pelė. Apoptozė, pro-, + anti, −. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė. The Fosb geną reprezentavo du skirtingi zondai.

Zebrafish, abiejų anti-apoptozės nuorašai Jdp2 ir pro-apopotozę Acer3 genų gausa padidėjo per 0,1 valandos po mirties (6 pav.). Po šio padidėjimo po 0,3–0,5 val. Padidėjo penki proapoptozės geno nuorašai ir vienas anti-apoptozės geno nuorašas. Transkripcijos dinamika tarp genų skyrėsi. Tiksliau, i) padidėjęs Fosb geno transkriptas sustojo po 1 valandos, (ii) nuorašai Diabloa ir Fosab genai pasiekdavo gausumo maksimumą po 0,5–4 val., o vėliau jų gausa sumažėjo po 9 val. Diabloa ir po 24 val Fosab genai, (iii) birželio mėn genų nuorašai pasiekė du maksimumus (vieną po 0,5, o kitą po 4–12 val.), tada jo gausa sumažėjo po 24 val., ir (iv) geno transkriptas Prdx2 genas parodė nuolatinį gausos padidėjimą, kol pasiekė maksimumą 24 valandas, o tada gausa sumažėjo. Likę genai buvo proapoptozė, o jų nuorašų padaugėjo po 1–24 val. Nuorašai iš Ddit3 ir Rassf6 genai labai skyrėsi nuo kitų nuorašų, nes jų gausa padidėjo vienu mėginių ėmimo metu (atitinkamai 12 val. ir 24 val.), o vėliau sumažėjo. Matyt, nė vienas iš apoptozės genų transkriptų nepadidėjo po 24 valandų, priešingai nei kitų kategorijų genai (pvz.kai kurių streso ir imuniteto genų nuorašai padidėjo iki 96 valandų po mirties).

Pelės apoptozės genų nuorašai, kurių padaugėjo, apėmė: BCL2 panašų baltymą 11 (Bcl2L11), kazeino kinazė IIa (Csnk2a1), interleukino 15 receptorių subvienetas a (Il15ra), Miocitų stipriklio faktorius 2 (Mef2a), tik F dėžutės baltymas 10 (Fbxo10), Sp110 branduolinio kūno baltymas (Sp110), TGFB sukeltas faktorius homeobox 1 (Tgif1), Intersektinas 1 (Itsm1), B tipo efrino receptorius 3 (Efb3) ir p21 baltymu aktyvuota kinazė 4 (Pak4) (6 pav.). The Bcl2L11 genas koduoja baltymą, skatinantį apoptozę [106]. The Csnk2a1 genas koduoja fermentą, kuris fosforilina substratus ir skatina apoptozę [107]. The Il15ra genas koduoja anti-apoptotinį baltymą [108]. The Mef2a genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris užkerta kelią apoptozei [109]. The Fbxo10 genas koduoja baltymą, skatinantį apoptozę [110]. The Sp110 genas koduoja reguliatorių baltymą, skatinantį apoptozę [111]. The Tgif1 genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris blokuoja transformuojančio augimo faktoriaus beta signalus (TGFβ) kelią, todėl yra proapoptozė [112]. The Itsn1 genas koduoja adapterio baltymą, kuris yra antiapoptozinis [113]. The Ephb3 genas koduoja baltymą, kuris suriša ligandus ant gretimų ląstelių, kad galėtų perduoti ląstelėms signalus ir slopina apoptozę [108]. The Pak4 genas koduoja baltymą, kuris atitolina apoptozės pradžią [114].

Tačiau pelėms pro- ir anti-apoptozės genų nuorašai padidėjo per 0,5 valandos po mirties, išskyrus Bcl2L11, dauguma pasiekė transkripto gausos maksimumą 12–48 val. po mirties (6 pav.). The Bcl2L11 nuorašai pasiekė gausumo maksimumą po 1 ir 6 valandų po mirties.

3.5.1. Apoptozės atsako santrauka

Abiejuose organizmuose tiek pro-, tiek anti-apoptozės genų nuorašai padidėjo organizmo mirties atveju. Tačiau padidėjimo laikas, didžiausias nuorašo gausumas ir padidėjusio gausumo trukmė priklauso nuo organizmo. Rezultatai rodo, kad zebrafų genai ir jų reguliavimas labai skiriasi nuo pelės, o pelių genų nuorašai padidėjo iki 48 val. po mirties, o zebrafinių genų gausumas padidėjo iki 24 val. Nepaisant to, atrodo, kad pro ir anti-apoptozės genai tarpusavyje reguliuoja vienas kitą.

3.6. Transporto genų atsakas

Transporto procesai palaiko jonų/tirpių medžiagų/baltymų homeostazę ir dalyvauja angliavandenių, baltymų, signalinių molekulių ir nukleorūgščių antplūdyje/ištekėjime per membranas. Transporto genų nuorašai turėtų padidėti organizmo mirties atveju, reaguojant į disbiozę.

Zebrafish, su transportavimu susijusių genų transkriptų, kurių padaugėjo, buvo: tirpių nešiklių šeima 26 anijonų mainų narys 4 (Slc26a4), Kalio kanalo įtampos ribų pogrupis H (Kcnh2), Transmembraninis emp24 domeną turintis baltymas 10 (Tmed10), daug leucino turintis kartotinis 59 (Lrrc59), nukleoproteino TPR (Tpr), Importin subvienetas beta-1 (Kpnb1), Transportin 1 (Tnpo1), Syntaxin 10 (Stx10) ir karbamido transporteris 2 (Slc14a2) (7 pav.). Pažymėtina, kad keturi Tmed10 7 paveiksle parodytų nuorašų kiekvienas atspindi profilį, nukreiptą į nepriklausomą zondą. Šio geno transkripcijos profiliai buvo identiški, o tai rodo didelį genų matuoklio metodo atkuriamumą. The Slc26a4 genas koduoja prendriną, kuris per ląstelių membranas perneša neigiamo krūvio jonus (ty Cl-, bikarbonatą) [115]. The Kcnh2 genas koduoja baltymą, naudojamą kalio kanalams gaminti ir dalyvauja signalizacijoje [116]. The Tmed10 genas koduoja membraninį baltymą, dalyvaujantį vezikulinių baltymų apyvartoje [117]. The Lrrc59, Tpr, Tnpo1 ir Kpnb1 genai koduoja baltymus, susijusius su prekyba per branduolines poras [118–121]. The Stx10 genas koduoja baltymą, kuris palengvina pūslelių susiliejimą ir tarpląstelinį baltymų judėjimą į kitus ląstelių komponentus [122]. The Slc14a2 genas koduoja baltymą, kuris išneša karbamidą iš ląstelės [123].

7 pav. Transporto genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h): (a) zebrafish ir (b) pelė. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė. The Tmed10 geną reprezentavo keturi skirtingi zondai.

Nuorašai iš Slc26a4, Kcnh2, Lrrc59 ir Tpr genų gausa iš pradžių padidėjo per 0, 3 valandos po mirties ir išliko didelis 12–24 valandas. Nuorašai iš Tnpo1 geno gausa padidėjo du kartus, po 4 ir 12 valandų, o tai rodo galimą reguliavimą grįžtamojo ryšio kilpa. Likusių genų nuorašai padidėjo 24 val. Padidėjusi gausa Slc14a2 geno nuorašas rodo, kad zebrafijos ląstelėse 24–96 val. po mirties gali kauptis karbamidas, o tai gali būti dėl karbamido susikaupimo hipoksinėmis sąlygomis. Arg2 genas (žr Hsp atsako į stresą skyrių).

Pelės organizme su transportavimu susijusių genų transkriptai, kurių gausa, buvo: kalcį surišantis mitochondrijų nešiklis (Aralar2), su natriu sujungtas neutralių aminorūgščių transporteris 4 (Slc38a4), SFT2 domeną turintis 1 (Sft2d1), Uap56 sąveikaujantis veiksnys (Fyttd1), Tirpiųjų medžiagų nešiklio šeima 5 (natrio/gliukozės bendras transporteris) 10 narys (Slc5a10), mitochondrijų importo receptorių subvienetas (Tomas 5), perkelta promotoriaus sritis (Tpr), ATP surišimo kasetės transporteris 12 (Abca12), Daugeliui vaistų atsparus baltymas 5 (Abc5), LIM ir SH3 domenų turintis baltymas (Lasp1), 16 chromosoma atidaro 62 skaitymo rėmelį (C16orf62), Golgi transport 1 homologas A (Golt1a), ATP surišančios kasetės transporteris 17 (Abca17), Nukleotidų mainų faktorius (Sil1), vidinės mitochondrijų membranos translokazė 8A1 (Timm8a1), ankstyvasis endosominis antigenas 1 (Eea1) ir kalio įtampa valdomų kanalų V pošeimio narys2 (Kcnv2) (7 pav.). The Aralar2 genas koduoja baltymą, kuris katalizuoja nuo kalcio priklausomą citoplazminio glutamato keitimąsi mitochondrijų aspartatu per mitochondrijų membraną ir gali veikti karbamido cikle [124]. The Slc38a4 genas koduoja simportą, kuris tarpininkauja neutralių aminorūgščių ir natrio jonų transportavimui [125]. The Sft2d1 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį pernešant pūsleles iš Golgi komplekso endocitinio skyriaus [126]. The Fyttd1 genas yra atsakingas už mRNR eksportą iš branduolio į citoplazmą [127]. The Slc5a10 genas koduoja baltymą, kuris katalizuoja angliavandenių transportavimą per ląstelių membranas [128]. The Tomas 5 genas koduoja baltymą, kuris vaidina svarbų vaidmenį importuojant į baltymus, skirtus mitochondrijų poskyriams [129]. The Abca12, Abca17 ir Abc5 genai koduoja baltymus, kurie perneša molekules per membranas [130–132]. The Lasp1 genas koduoja baltymą, reguliuojantį jonų transportavimą [133]. The C16orf62 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį baltymų transportavime iš Golgi aparato į citoplazmą [134]. The Golt1a genas koduoja pūslelių transportavimo baltymą [126]. The Sil1 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį baltymų perkėlime į endoplazminį tinklą [135]. The Timm8a1 genas koduoja baltymą, kuris padeda importuoti kitus baltymus per vidines mitochondrijų membranas [136]. The Eea1 genas koduoja baltymą, kuris veikia kaip pririšimo molekulė vezikuliniam transportavimui iš plazmos membranos į ankstyvąsias endosomas [137]. The Kcnv2 genas koduoja membraninį baltymą, dalyvaujantį generuojant veikimo potencialą [138].

Per 0,5 val. po mirties genų, dalyvaujančių: (i) jonų ir karbamido reguliavime, transkriptai (Aralaras), (ii) aminorūgštis (Slc38a4), angliavandeniai (Slc5a10) ir baltymai (Sft2d1, Tom5) transportavimas, (iii) mRNR branduolinis eksportas (Fyttd1, Tprir iv) molekulinis nutekėjimas (Abca12, Abc5) padidėjo gausa pelėje. Šių genų transkripcijos profiliai skiriasi nuo transkripto gausos maksimumų ir trukmės. Nors nuorašai iš Aralar, Sft2d1, Slc38a4, Fyttd1 ir Slc5a10 gausumo maksimumus pasiekė po 1 val., tie iš Tom5, Tpr, Abca12 ir Abc5 maksimalus pasiekė 12–24 val. po mirties. Padidėjusio gausumo trukmė taip pat skyrėsi šiems nuorašams, nes dauguma jų išliko dideli 48 valandas po mirties. Sft2d1, Fyttd1 ir Slc5a10 nuorašų buvo didelis gausumas nuo 0,5 iki 12+ val. Trumpesnė padidėjusio gausos trukmė rodo greitą genų represiją. Nuorašų gausa Lasp1, C16orf62, Golt1a ir Abca17 padidėjo 1 valandą po mirties ir išliko pakilęs 48 valandas. Nuorašai Sil1, Timm8a1 ir Eea1 gausa padidėjo 6 val., o tie iš Kcnv2 padidėjo 24 val. po mirties ir išliko pakilęs 48 valandas.

3.6.1. Transporto genų suvestinė

Padidėjęs transportavimo genų nuorašų gausa rodo, kad zebrafish ir pelės bando atkurti homeostazę. Nors pusės šių genų nuorašų gausa per 0,5 valandos po mirties, daugelis jų padidėjo skirtingu laiku ir įvairiai trukmei. Nors dauguma zebrafish transportavimo genų nuorašų nebuvo gausūs po 24 valandų, dauguma transporto genų transkriptų pelėje išliko gausūs 24–48 valandas po mirties.

3.7. Vystymosi kontrolės genai

Netikėtas šio tyrimo atradimas buvo padidėjęs vystymosi kontrolės genų transkriptų gausa organizmo mirties atveju. Vystymosi kontrolės genai dažniausiai dalyvauja reguliuojant vystymosi procesus nuo ankstyvųjų embrionų iki suaugusiųjų zebrafijoje ir pelėje, todėl nesitikėjome, kad jų nuorašai gausės organizmo mirties metu.

Zebrafijoje su vystymusi susijusių genų transkriptai, kurių gausa, buvo: LIM domeno turintis baltymas 2 (Limd2), Su netvarkinga susijusi morfogenezės 1 aktyvatorius (Daam1b), Meltrin alfa (Adomas12), Perinimo fermentas 1a (Jis1a), Midnolinas (Vidur), Greitas greitas atsakas 2 (Ier2), Claudin b (Cldnb), G-baltymų signalizacijos reguliatorius, panašus į 4 (Rgs4), Prolino turtingas transmembraninis baltymas 4 (Prrt4), Inhibinas (Inhbaa), Wnt slopinantis 1 faktoriaus pirmtakas (Wif1), opioidų augimo faktoriaus receptorius (Ogfr), Braškių įpjovos homologas 2 (Sbno2) ir „Developing brain homeobox 2“ (Dbx2) (8 pav.). The Limd2 genas koduoja surišantį baltymą, kuris vaidina vaidmenį zebrafinio embriogenezėje [139]. The Daam1b genas reguliuoja endocitozę notochordo vystymosi metu [140]. The Adomas 12 genas koduoja metaloproteazę-dezintegriną, dalyvaujantį miogenezėje [141]. The Jis1a genas koduoja baltymą, dalyvaujantį kiaušinio apvalkalo virškinime [142]. The Vidur genas koduoja smegenyse išreikštą nukleolinį baltymą, kuris yra susijęs su neurogenezės reguliavimu [143, 144]. The Ier2 genas koduoja baltymą, susijusį su kairiosios ir dešinės asimetrijos modeliavimu zebrafijos embrione [145]. The Cldnb zebrafish lervos genas koduoja sandarų jungties baltymą [146]. The Rgs4 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį smegenų vystymesi [147]. The Prrt4 genas koduoja baltymą, kuris daugiausia ekspresuojamas smegenyse ir nugaros smegenyse embriono ir pogimdyminio vystymosi stadijose. The Inhbaa genas koduoja baltymą, kuris vaidina svarbų vaidmenį oocitų brendime [148]. The Wif1 genas koduoja WNT slopinantį veiksnį, kontroliuojantį embriono vystymąsi [149]. The Ogfr genas vaidina svarbų vaidmenį embriono vystymuisi [150]. The Sbno2 genas vaidina svarbų vaidmenį zebrafinio embriogenezėje [151]. The Dbx2 genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris vaidina vaidmenį nugaros smegenų vystymuisi [152].

8 pav. Vystymosi genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h): (a) zebrafish ir (b) pelė. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė. The Cldnb geną reprezentavo du skirtingi zondai.

Nors gausa Limd2, Daam1, Adam12 ir He1a zebrafish transkriptai padidėjo per 0,1 val. po mirties, kitų šios kategorijos genų transkriptai padidėjo nuo 0,3 iki 24 val.

Pelėje su vystymusi susijusių genų transkriptų, kurių gausa padidėjo, buvo: MDS1 ir EVI1 kompleksinio lokuso baltymo EVI1 (Mecom), MAM domeno turintis glikozilfosfatidilinozitolio inkaras 2 (Mdga2), FYVE, RhoGEF ir PH domenų turintys 5 (Fgd5), RNR surišančio motyvo baltymas 19 (19 rubliai), Vištienos ovalbumino prieš srovę promotorius (Perversmas), Vienišas homologas 2 (Sim2), Tirpusis nešiklis 38 šeima, 4 narys (Slc38a4), B ląstelių limfomos 6 baltymas (Bcl6), Sema domeno transmembraninis domenas (TM) citoplazminis domenas (semaforinas) 6D (Sema6d), RNR surišimo motyvo baltymas 45 (45 Rbm), Transkripcijos faktorius E2F4 (E2f4), Ilgos grandinės riebalų rūgščių-CoA ligazė 4 (Lacs4), Su kalikreinu 1 susijusi peptidazė b3 (Klk1b3), Semos domenas, imunoglobulino domenas, TM ir trumpasis citoplazminis domenas (Sema4c), TGFB sukeltas faktorius homeobox 1 (Tgif1), Į interferoną reguliuojantis faktorius 2 surišantis baltymus (Irf2bpl), Efrino B tipo receptorius 3 (Ephb3), Sėklidėms specifinis Y koduotas į 3 panašus baltymas (Tspyl3), Baltymų ripply 3 (Ripply3), Su Src kinaze susijęs fosfoproteinas 2 (Skap2), DNR polimerazės zeta katalizinis subvienetas (Rev3l), MKL/į miokardiną panašus 2 (Mkl2) ir baltymo fosfatazės 2 reguliavimo subvienetas A (Ppp2r1a) (8 pav.). The Mecom genas vaidina svarbų vaidmenį embriogenezėje ir vystymesi [153]. The Mdga2 genas koduoja imunoglobinus, dalyvaujančius nervų vystymesi [154]. The Fgd5 genas reikalingas embriono vystymuisi, nes jis sąveikauja su kraujodaros kamieninėmis ląstelėmis [155]. The 19 Rbm genas yra būtinas vystymuisi iki implantacijos [156]. The Perversmas genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris reguliuoja akies [157] ir kitų audinių vystymąsi [158]. The Sim2 genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris reguliuoja ląstelių likimą vidurinės linijos vystymosi metu [159]. The Slc38a4 genas koduoja baltymų sintezės reguliatorių kepenų vystymosi metu ir atlieka lemiamą vaidmenį vaisiaus augimui ir vystymuisi [160,161]. The Bcl6 genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris kontroliuoja neurogenezę [162]. The Sema6d genas koduoja baltymą, dalyvaujantį tinklainės vystyme [163]. The 45 Rbm genas koduoja baltymą, kuris pirmiausia jungiasi su poli(C) RNR ir yra ekspresuojamas smegenų vystymosi metu [164]. The E2f4 genas dalyvauja ląstelių brendime audiniuose [165]. The Lacs4 genas vaidina svarbų vaidmenį formuojant embrionus [166]. The Klk1b3 genas koduoja baltymą, kuris vaidina svarbų vaidmenį besivystantiems embrionams [167]. The Sema4c genas koduoja baltymą, kuris atlieka įvairias funkcijas neuronų vystymesi ir širdies morfogenezei [168,169]. The Tgif1 genas koduoja transkripcijos faktorių, kuris vaidina svarbų vaidmenį trofoblastų diferenciacijoje [170]. The Irf2bpl genas koduoja transkripcijos reguliatorių, kuris vaidina vaidmenį moterų neuroendokrininėje reprodukcijoje [171]. The Ephb3 genas koduoja kinazę, kuri vaidina vaidmenį nervų vystymuisi [172]. The Tspyl3 genas vaidina svarbų vaidmenį vystantis sėklidėms [173]. The Ripply3 genas koduoja transkripcijos faktorių, dalyvaujantį ektodermos vystyme [174]. The Skap2 genas koduoja baltymą, dalyvaujantį aktino pertvarkyme plėtojant lęšius [175]. The Rev3l genas koduoja polimerazę, kuri gali pakartoti praeities tam tikrų tipų DNR pažeidimus ir yra būtina embriono vystymuisi [176]. The Mkl2 genas koduoja transkripcijos koaktyvatorių, kuris dalyvauja formuojant raumeninį audinį embriono vystymosi metu [177]. The Ppp2r1a genas vaidina embriono epidermio vystymąsi [178].

Nuorašai iš Mecom, Mdga2, Fgd5, Rbm19, Coup, Sim2, Slc38a4, Bcl6, Sema6d, Rbm45, E2f4 ir Lacs4 pelės genų gausa žymiai padidėjo per 0, 5 valandos po mirties, tačiau kiti nuorašai padidėjo nuo 1 valandos iki 48 valandų, o gausos maksimumą pasiekė po 12 valandų ar daugiau.

3.7.1. Vystymosi kontrolės genų santrauka

Organizmo mirties atveju laipsniškai didėja kai kurių vystymosi kontrolės genų transkriptų gausa, o tai rodo, kad jie nebėra nutildyti. Galima šio padidėjusio gausumo priežastis yra ta, kad pomirtinės fiziologinės sąlygos yra panašios į ankstesnių vystymosi stadijų sąlygas.

3.8. Vėžio genai

Yra daugybė duomenų bazių, skirtų vėžiui ir su vėžiu susijusiems genams. Atlikę kryžmines nuorodas į šiame tyrime rastus genus, atradome reikšmingą sutapimą. Šioje paieškoje rasti genai pateikti žemiau.

Zebrafijoje šių vėžio genų nuorašai žymiai padidėjo: Jdp2, ksantino dehidrogenazė (Xdh), Egr1, Adomas12, miozinas-IIIa (Myo3a), Fosb, Jun, Alfa 6b integrinas (Itga6), Ier2, Tpr, Dvigubo specifiškumo baltymo fosfatazė 2 (Dusp2), dezintegrino ir metalopeptidazės domenas 28 (Adomas 28), Tnpo1, Ral guanino nukleotidų disociacijos stimuliatorius, panašusRgl1), su karcinoembrioniniu antigenu susijusi ląstelių adhezijos molekulė 5 (Ceacam1), Fosl1, Il1b, Hif1a, Serino/treonino-baltymų fosfatazės 2A reguliavimo (Ppp2r5d), DNR replikacijos licencijavimo faktorius (Mcm5), Gadd45, Miozinas-9 (Myh9), Casp3, Tnf, Il8, Ciklinis AMP priklausomas transkripcijos faktorius (Atf3), maža GTPazė (RhoA), Mknk2, Efrino A tipo receptoriaus 7 pirmtakas (Epha7), su ETS susijęs transkripcijos faktorius (Elfas3), Nfkbia, Kpnb1, Wif1, RAS guanilą atpalaiduojantis baltymas 1 (Rasgrp), Ras asociacijos domeno turintis baltymas 6 (Rassf6), Cyba, DNR pažeidimo indukuojamas nuorašas 3 (Ddit3), serino / treonino baltymų kinazė (Sbk1) ir tirozino-proteinkinazės transmembraninis receptorius (Ror1) (9 pav.).

9 pav. Vėžio genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h): (a) zebrafish ir (b) pelė. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė. Paryškintas geno pavadinimas reiškia, kad jis buvo rastas daugiau nei vienoje vėžio duomenų bazėje. The Rgl1 geną reprezentavo du skirtingi zondai.

Pelėse šių vėžio genų transkriptų gausa žymiai padidėjo: Retinoblastomos tipo baltymas 1 (Rbl1), pailgėjimo faktorius RNR polimerazė II (Ell), Į Bcl-2 panašus baltymas 11 (Bcl2l11), Į Salą panašus baltymas 1 (Sall1), Map3k2, Bcl6, Tnfrsf9, CK2 tikslinis baltymas 2 (Csnk2a1), transkripcijos faktorius E2f4 (E2f4), cinko piršto DHHC tipo, kuriame yra 14 (Zdhhc14), Tpr, RAS p21 baltymo aktyvatorius 1 (Rasa1), Gadd45, Draudimas (Phb2), serino/treonino-baltymų fosfatazės PP1-gama katalizatorius (Ppp1cc), Lasp1, G baltymų sujungta receptorių kinazė 4 (Grk4), LIM domeno transkripcijos faktorius (Lmo4), baltymų fosfatazė 1E (Ppm1e), Baltymų daigų homologas 1 (Spry1), keli PDZ domeno baltymai (Mpdz), Kisspeptino receptorius (Bučinys 1), receptoriaus tipo tirozino baltymo fosfatazės delta pirmtakas (Ptprd), mažas efektorinis baltymas, panašus į 2 (CD42), AT turtingas interaktyvus domenas turintis baltymas 1A (Arid1a), Limfocitų citozolinis baltymas 2 (Lcp2), DNR polimerazės zeta katalizinis subvienetas (Rev3l), Tnfrsf14, Integrino beta-6 pirmtakas (Itgb6), trigubo funkcinio domeno baltymas (Trio), VI klasės ATPazės 11C tipas (Atp11c) ir serino/treonino-baltymo fosfatazės 2A reguliavimo (Ppp2r1a) (9 pav.).

3.8.1. Vėžio genų santrauka

Šioje kategorijoje analizuojami genai buvo klasifikuojami kaip „vėžio genai“ vėžio genų duomenų bazėje [10] (9 pav.). Laikas, trukmė ir didžiausias nuorašo gausa skyrėsi organizmuose ir tarp jų. Atkreipkite dėmesį, kad kai kurie genų nuorašai turėjo du gausos maksimumus. Zebrafijoje šis reiškinys įvyko Adam12, Jun, Tpr, Dusp2, Tnpo1 ir Hif1a genuose ir pelėje, Bcl6, Tnfrs9, Lasp1, Cdc42 ir Lcp2 genų, ir atitinka nuostatą, kad nuorašo gausa reguliuojama grįžtamojo ryšio kilpomis.

3.9. Epigenetiniai reguliavimo genai

Epigenetinis genų ekspresijos reguliavimas apima DNR metilinimą ir chromatino histono modifikacijas į aktyvią ir nutildytą būseną [179]. Šios modifikacijos pakeičia chromatino kondensaciją ir daro įtaką DNR prieinamumui transkripcijos mechanizmui. Nors epigenetinis reguliavimas vaidina svarbų vaidmenį vystymuisi, modifikacijos gali atsirasti stochastiškai su amžiumi arba reaguojant į aplinkos dirgiklius [180]. Taigi mes tikėjomės, kad epigenetiniai reguliavimo genai bus susiję su organizmo mirtimi.

Zebrafijoje šių epigenetinių genų transkriptai žymiai padidėjo: Jun dimerizacijos baltymas 2 (Jdp2), chromatino helikazės baltymas 3 (Chd3), glutamato turintis WD kartotinis baltymas 1 (Grwd1), Histonas H1 (Histh1l), 1 histonų klasteris, panašus į H4 (Ist1h46l3) ir „Chromobox“ homologą 7a (Cbx7a) (10 pav.). The Jdp2 Manoma, kad genas slopina histonų acetilinimą ir slopina histonų ekspresiją c-birželio mėn genas [181]. The Chd3 genas koduoja histono deacetilazės komplekso komponentą, kuris dalyvauja chromatino remodeliavime [182]. The Grwd1 Manoma, kad genas yra histoną surišantis baltymas, reguliuojantis chromatino dinamiką replikacijos pradžioje [183]. The Histh1l genas koduoja histono baltymą, kuris suriša nukleozomą DNR įėjimo ir išėjimo vietose ir Hist1h46l3 genas koduoja histono baltymą, kuris yra nukleosomos šerdies dalis [184]. The Cbx7a genas koduoja epigenetinį reguliatorių baltymą, kuris jungiasi su nekoduojančia RNR ir histonais bei slopina naviko slopintojo geno ekspresiją [185].

10 pav. Epigenetinių genų transkriptų gausa pagal pomirtinį laiką (h): (a) zebrafish ir (b) pelė. Žalia, tarpinė vertė raudona, didžiausia vertė. Paryškintas geno pavadinimas reiškia, kad jis buvo rastas daugiau nei vienoje vėžio duomenų bazėje. The Jdp2 geną reprezentavo du skirtingi zondai.

Abiejų nuorašai Jdp2 ir Chd3 genų gausa padidėjo per 0, 3 val. po mirties, o gausos maksimumą pasiekė 0, 5 val. Atkreipkite dėmesį, kad du skirtingi zondai buvo nukreipti į Jdp2 nuorašas. Nuorašas Grwd1 geno gausa padidėjo 1 valandą ir 24 valandas po mirties. Histono genų nuorašas padidėjo praėjus 4 valandoms po mirties, o gausos maksimumą pasiekė 24 val. Nuorašas iš Cbx7a geno gausa padidėjo 12 val., Gausumo maksimumą pasiekė 24 val. Šių genų nuorašų gausa sumažėjo po 24 val.

Pelės organizme šių epigenetinių genų transkriptai žymiai padidėjo: Tubulino tirozino ligazės tipo šeimos narys 10 (Ttll10), Histonų klasteris 1 H3f (Ist1h3f), Histonų klasteris 1 H4c (Hist1h4c), YEATS domenas, kuriame yra 2 (Yeats2), Histono acetiltransferazė (Kat7) ir tikėtinas JmjC domeną turintis histono demetilinimo baltymas 2C (Jmjd1c) (10 pav.). The Ttll10 genas koduoja poliglicilazę, dalyvaujančią modifikuojant nukleozomų surinkimo baltymą 1, kuris veikia transkripcijos aktyvumą, histono pakeitimą ir chromatino remodeliavimą [186]. The Hist1h3f ir Hist1h4c genai koduoja histono baltymus, kurie yra nukleozomų šerdis [187]. The Yeats2 genas koduoja baltymą, kuris atpažįsta histono acetilinimą, kad galėtų reguliuoti genų ekspresiją chromatine [188]. The Kat7 genas koduoja acetiltransferazę, kuri yra histoną surišančio replikacijos pradžios komplekso komponentas, kuris acetilina chromatiną ir todėl reguliuoja DNR replikaciją bei genų ekspresiją [189]. The Jmjd1c genas koduoja fermentą, kuris specifiškai demetilina H3 histono Lys-9 ir yra susijęs su nutildytų genų reaktyvacija [190].

Nuorašai iš Ttll10, Yeats2 ir histono baltymų genų gausa padidėjo 0,5 valandos po mirties ir pasiekė maksimumą skirtingu laiku, Ttll10 nuorašas pasiekia maksimumą per 1–6 val., histono nuorašai pasiekia maksimumą po 6 ir 12 valandų po mirties, ir Yeats2 nuorašas pasiekia maksimumą 12–24 val. po mirties (10 pav.). Nuorašai iš Kat7 ir Jmjd1c genų gausa padidėjo 24 val., Gausumo maksimumą pasiekė 48 val. po mirties. Atkreipkite dėmesį, kad histono genų nuorašai nebebuvo gausūs po 24 valandų po mirties.

3.9.1. Epigenetinių reguliavimo genų santrauka

Padidėjęs genų, koduojančių histono baltymus, histoną ir chromatiną modifikuojančius baltymus ir baltymų, dalyvaujančių reguliuojant DNR replikaciją iš pradžių, nuorašų gausa buvo būdinga zebrafėms ir pelėms. Šie radiniai rodo, kad epigenetiniai reguliavimo genai vis dar modifikuoja chromatino struktūrą organizmo mirtyje ir taip keičia transkripcijos faktorių prieinamumą promotoriaus arba stipriklio regionams.

3.10. Genų nuorašų, kurių gausa po mirties, procentas

Genų nuorašų procentas buvo apibrėžtas kaip genų nuorašų, kurių gausa yra didesnė nei bendro transkriptų, kurių gausa yra didelė, skaičiaus kontrolė tam tikru pomirtiniu laiku. Palyginus visų genų kategorijų genų transkriptų procentą pagal pomirtinį laiką, paaiškėjo zebrafish ir pelės panašumai. Tiksliau, daugumos genų transkriptų padaugėjo nuo 0,5 iki 24 valandų po mirties, o po 24 valandų nuorašo gausa smarkiai sumažėjo (11 pav., „Visi genai“). Reikėtų pažymėti, kad abiejų organizmų streso, transporto ir vystymosi kategorijose buvo nustatytas tas pats modelis. Tačiau zebrafish imuniteto, uždegimo, apoptozės ir vėžio kategorijos skyrėsi nuo pelės. Tiksliau, imuniteto, uždegimo ir vėžio kategorijų genų transkriptai zebrafijoje padidėjo daug vėliau (1–4 val.) nei pelėse, o padidėjusio gausumo trukmė buvo daug trumpesnė. Pavyzdžiui, nors 90 % imuniteto ir uždegimo kategorijų genų nuorašų per 1 valandą po mirties padidėjo pelėse, mažiau nei 30 % tų pačių kategorijų transkriptų buvo gausu zebrafijoje (11 pav.). lėtesnis pradinis atsakas. Pažymėtina, kad nors imuniteto genų nuorašų skaičius pasiekė gausos maksimumą 24 val. po mirties abiejuose organizmuose, uždegimo genų, pasiekusių gausumo maksimumą, skaičius pelėms atsirado 1–4 val., o zebrafijoje – 24 val. Šių rezultatų reikšmė yra ta, kad uždegimo atsakas pelėje įvyksta greitai ir tvirtai, o zebrafijoje tai užtrunka ilgiau, o tai gali būti siejama su filogenetiniais skirtumais. Apoptozės genų nuorašų gausa tarp zebrafish ir pelės reikšmingai skyrėsi. Pelės apoptozės genų transkriptų procentas pasiekė 100% 1 valandą po mirties ir išliko išlaikytas 48 valandas po mirties, o transkripto genų, kurių gausa buvo padidinta, dalis zebrafish niekada nepasiekė 70%, o gausumas staiga sumažėjo po 12 val. .

11 pav. Nuorašų su padidėjusiu gausumu procentas pagal pomirtinį laiką ir kategorijas. Rodomas visų genų skaičius pagal organizmą ir kategorijas. „Visi genai“ reiškia genų transkriptus, kurie reikšmingai prisidėjo prie ordinacijos planų. Pelė raudona, o zebražuvė juoda.

3.11. Padidėjęs reguliavimas ar diferencinis mRNR stabilumas?

Kadangi visais laiko momentais buvo naudojami vienodi RNR kiekiai (žr. toliau), nors irimas tęsėsi, teoriškai įmanoma, kad akivaizdus transkriptų pogrupio gausos padidėjimas iš tikrųjų atsirado dėl didesnio šių transkriptų stabilumo, palyginti su žeminančių nuorašų fonas. Taigi kyla klausimas, ar didesnis transkripto gausumas atsiranda dėl padidėjusio reguliavimo po organizmo mirties, ar dėl sudėtingų skilimo profilių, dėl kurių santykinis praturtėjimas. Norint nustatyti, ar reikšmingas padidėjimas atsirado dėl tokio sodrinimo, buvo apskaičiuotas numatomas hipotetinės stabilios neskaidančios cRNR profilis zebrafijos, pelių kepenims ir pelių smegenims. Teoriškai stabilaus neskaidančio cRNR nuorašo gausa, nustatyta genų matuoklio metodu, turėtų teigiamai koreliuoti su bendro cRNR kiekiu, pristatytu į DNR mikrogardelę. Žemiau pateikiamas loginis pagrindas ir metodas, naudojamas identifikuoti stabilias neskaidančias cRNR nuorašo telkinyje.

Kaip nurodyta skyriuje Medžiaga ir metodai, iš gyvūno paimto mėginio kiekis buvo maždaug toks pat, o homogenizacijos tūris buvo toks pat. Elektroninėje papildomoje medžiagoje S1 ir S2 lentelėse parodytas visos iš audinio išskirtos RNR kiekis (x, ng µl –1). Kadangi ženklinant buvo paimtas fiksuotas RNR kiekis, homogenizuoto mėginio tūris buvo proporcingas 1/xy., t. y. efektyvus audinių kiekis, paimtas į „microarray“ analizę, buvo proporcingas 1/x.

Tarkime, kad buvo stabilių RNR pogrupis, o visos kitos RNR molekulės degradavo. Vadinasi, stabilaus geno transkripto kiekis būtų tiesiogiai proporcingas į eksperimentą paimto audinio kiekiui, 1/x. Norint pateikti numatomą koncentracijos ir laiko profilį numanomai stabiliai cRNR, galima palyginti (log2 skalėje) 1/x visų laiko taškų vertės. Kad ji būtų susijusi su tiesioginiu valdikliu, valdiklio log2 reikšmė bus atimama iš kiekvieno laiko taško. Gautas profilis bus laukiamas stabilios neskaidančios cRNR profilis (kartų pokytis).

Atsižvelgdami į pirmiau išdėstytas aplinkybes, nustatėme, kad numatomas stabilios zebrafish cRNR profilis padidės aštuonis kartus po 96 valandų po mirties (12 pav.). Priešingai, praėjus 48 valandoms po mirties, mes nustatėme, kad laukiamas stabilios cRNR profilis pelių kepenyse sumažėtų maždaug keturis kartus, o stabilios cRNR kiekis pelių smegenyse sumažėtų maždaug du kartus, nes į smegenis buvo paimta mažiau audinių. mikrogardelių analizė (nes padidėjo bendra RNR išeiga). Svarbu pažymėti, kad šie tikėtini stabilūs pelės mRNR profiliai (apatiniai du 12 paveikslo skydeliai) nebūtų pasirinkti taikant statistinę transkripcijos profilių, kurių gausa žymiai padidėjo, palyginti su gyvomis kontrolėmis, identifikavimo procedūrą.

12 pav. Numatomas tariamai stabilios cRNR pokytis po mirties. Sulenkimo pokytis buvo nustatytas atimant apverstos koncentracijos log2 iš µl ng −1 gyvų kontrolinių grupių ekstrahuotos cRNR iš apverstos ekstrahuotos cRNR koncentracijos kiekvieną mėginių ėmimo laiką.

Zebrafish potencialiai praturtinti nuorašai (dėl jų stabilumo) buvo nustatyti koreliuojant jų gausą su numatomu stabilios cRNR pakitimu. Teoriškai potencialiai praturtinti nuorašai turėtų būti teigiamai koreliuoti su numatomu tariamai stabilaus nuorašo pokyčiu. Arba nuorašai, kurie nėra praturtinti dėl stabilumo poveikio, turėtų būti neigiamai koreliuoti arba visai nesusieti su numatomu kartojimo pokyčiu. 548 genų nuorašų koreliacijos (t. y. tų, kurių gausa gerokai padidėjo pomirtiniu laiku) svyravo nuo labai neigiamo iki labai teigiamo (13 pav.). Atkreipkite dėmesį, kad didesnio dažnio genų nuorašai kairėje histogramos pusėje rodo, kad dauguma nuorašų buvo neigiamai koreliuojami su numatomu kartojimo pokyčiu, o mažesnis dažnis dešinėje histogramos pusėje rodo, kad nedidelė genų transkriptų dalis buvo tariamai praturtinta nei kiti transkriptai. . Standartinė statistinė lentelė, naudojant d.f. = n − 2 su kryptimi, atskleidė, kad didesnės nei 0,685 koreliacijos buvo statistiškai reikšmingos ties α = 0,01 (trys juostos dešinėje histogramos pusėje). Taigi buvo nustatyta, kad 45 iš 548 genų nuorašų reikšmingai koreliuoja su numatomu stabilios cRNR kartos pokyčiu.

13 pav. Tikėtino klosčių pokyčio ir santykinio genų transkripto gausos koreliacijų pasiskirstymas pagal pomirtinį laiką zebrafiniams žuvims. Mes svarstėme tik zondus, nukreiptus į genų nuorašus, kurie žymiai padidėjo po mirties, palyginti su gyvomis kontrolėmis (n = 548). Koreliacijos, viršijančios 0,685, buvo reikšmingos α = 0,01 ir nurodo galimybę praturtinti stabilią cRNR.

45 genų nuorašai, kurie tariamai buvo praturtinti, parodyti 1 lentelėje. 14 paveiksle parodyti trijų pasirinktų genų nuorašų transkripcijos profiliai, palyginti su numatomu lenkimo pokyčio profiliu, kaip parodyta trijose viršutinėse plokštėse. Neigiamai koreliuoto geno transkripto transkripcijos profilis buvo kontrolė. Nė vienas iš pelių mėginių genų transkriptų nebuvo praturtintas, nes cRNR kiekis audinių ekstrakte padidėjo arba išliko maždaug toks pat su pomirtiniu laiku.

14 paveikslas. Tikėtino raukšlių pasikeitimo palyginimas (pilkas), remiantis išgauta bendra cRNR, palyginti su gyva kontrole, palyginti su specifiniais genų transkripto profiliais (juoda) pagal pomirtinį laiką. (ac) Santykinis transkripto gausa, kuri labai koreliuoja su numatomu kartojimo pokyčiu ir todėl yra tariamai praturtinta ir (arba) stabili. (d) Nuorašo profilis, kuris neigiamai koreliuoja su numatomu lenkimo pokyčiu, todėl nėra nei praturtintas, nei stabilus.

1 lentelė. Teigiamai koreliuojantys zebrafish zondai ir numatomas lenkimo pokytis α = 0,01. −, nekontuotas genas. Pusjuodžiu šriftu pažymėti zondų profiliai parodyti 14 paveiksle.


Žiūrėti video įrašą: Extracellular Matrix And Interstitial Fluid - What Is The Extracellular Matrix (Sausis 2023).