Informacija

Baltymų pasiskirstymas

Baltymų pasiskirstymas


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Šiame vadovėlyje teigiama

Baltymai, kuriuos nustato vienas genas, gali suskaidyti ir sudaryti skirtingus baltymus, turinčius įvairių fiziologinių veiksmų.

Pirma, kaip dalijasi baltymai? Antra, jei tai tik suskaidymas, kaip vadinamas šis procesas? Trečia, kadangi mano vadovėlyje nepaaiškinta, ar kas nors galėtų paaiškinti pavyzdžiu, kaip skirtingos pradinio baltymo dalys (atsižvelgiant į tai, kad baltymas dalijasi fragmentacijos būdu) atlieka skirtingus fiziologinius veiksmus?


Tai nėra labai naudinga ištrauka, sutinku. Kai kuriuos baltymus skaido kiti baltymai (baltymas, kuris pjausto kitą baltymą, vadinamas proteaze). Kiti baltymai skaidosi patys. Priešingu atveju baltymai yra gana stabilūs ir ne tik gudriai suskaidomi.

Pirmosios grupės (proteazės, veikiančios kitus baltymus) atveju krešėjimo kaskada gali būti gera vieta pradėti. Šiame kelyje esantys baltymai pirmtakai paverčiami aktyviais fermentais vykstant baltymų „skilimo“ grandininei reakcijai ir kitai baltymų modifikacijai. Šiame puslapyje pateikiami kiti įdomūs šio proceso atvejai, pvz., maisto virškinimas, kurio galbūt ieškote.

Kai kurios antrosios grupės yra savaime suskilusios, todėl tarpinė seka pašalinama, o galai vėl suklijuojami. (Tai analogiška kaip intronai sujungiami iš pasiuntinio RNR, o egzonai sujungiami.) Tokios įsiterpusios baltymų sekos vadinamos „inteinais“; pašalinus vieną inteiną, gali susidaryti vienas funkcinis baltymas, todėl tai nėra baltymų padalijimas. Tačiau kai kurie virusai koduoja savaime skaidomas sritis, kurios padalija motininį baltymą į dvi ar daugiau dalių. Garsus šio proceso pavyzdys, dabar plačiai naudojamas biotechnologijoje, yra 2A peptidas, kuris naudojamas „padalyti“ vieną transgeniniu būdu išreikštą baltymą į 2 (pavyzdžiui, jei norite vienu metu ekspresuoti baltymą ir žymeklį, pvz., GFP. , galite panaudoti 2A peptidą, kad juos susietumėte.)

Pirmoji grupė gali jus labiau sudominti dėl žinomo šių proteazių vaidmens žmogaus sveikatai. Be to, jūsų klausime taip pat gali būti kalbama apie atsitiktinį baltymų „suskaldymą“, kuris šiuo metu nėra žinomas kaip svarbus baltymų skaidymo žmogaus organizme veiksnys, net skrandyje. Fermentai, tokie kaip pepsinas, yra atsakingi už baltymų virškinimą.


Neturiu prieigos prie vadovėlio, bet pirma mintis – autorė kalba apie genų dubliavimąsi evoliucijos metu. Jei genas dubliuojasi, abi kopijos gali skirtis, sukurdamos du panašius, bet šiek tiek specializuotus baltymus, kurie atlieka skirtingas funkcijas. Wikipedia

Sutinku, kad sakinys nėra gerai parašytas, kad ir kokia būtų jo prasmė. Tam tikras kontekstas gali būti naudingas.


Baltymų skirstymas – Biologija

III DALIS. MOLEKULINĖ BIOLOGIJA, LĄSTELIŲ SKILDYMAS IR GENETIKA

8.4. Baltymų sintezė

DNR ir RNR yra svarbios baltymų gamybos procese. Ląstelėje DNR nukleotidai naudojami kaip genetinė abėcėlė, suskirstyta į tris rinkinius (pvz., ATC, GGA, TCA, CCC), kad sudarytų kodinius žodžius DNR kalba. Būtent šių kodinių žodžių seka DNR nusako, kurios aminorūgštys yra naudojamos ir kokia tvarka jos atsiranda baltyme. DNR molekulės yra labai ilgos ir koduoja daugelį baltymų per visą jų ilgį. Baltymai sintetinami dviem transkripcijos ir vertimo etapais.

Pirmas žingsnis: transkripcija – RNR gamyba

Transkripcija yra procesas, kai DNR naudojamas kaip šablonas (trafaretas) RNR sintezei. Fermentas RNR polimerazė „skaito“ DNR azotinių bazių seką ir vadovaujasi bazių poravimosi tarp DNR ir RNR taisyklių, kad sukurtų naują RNR molekulę (8.6a-c pav.). RNR polimerazė prisijungia prie DNR ir juda išilgai griovelių, ieškodama bazinių sekų, veikiančių kaip žymenys arba ženklai, rodantys, kad netoliese yra genas. Fermentas ieško promotoriaus sekos (8.6d pav.). Tai specifinė DNR nukleotidų seka, nurodanti baltymą koduojančios srities vietą ir identifikuojanti, kuri iš dviejų DNR grandinių turėtų būti naudojama. Koduojanti DNR grandinė yra ta pusė, kuri naudojama kaip šablonas RNR sintezei. DNR grandinė, kurios fermentai neskaito tiesiogiai, yra nekoduojanti grandinė. Be promotoriaus sekų RNR polimerazė geno neperrašys.

8.6 PAVEIKSLAS. DNR transkripcija į RNR

Šis paveikslas iliustruoja pagrindinius įvykius, vykstančius transkripcijos metu. a) Fermentas, RNR polimerazė, prisijungia prie DNR promotoriaus sekoje (žr. d) ir atskiria papildomas grandines. Tada fermentas juda išilgai DNR grandinės teisinga kryptimi, kad surastų baltymą koduojančią geno sritį (žr. d). b) Kai RNR polimerazė juda žemyn koduojančia grandine, nauji papildomi RNR nukleotidai yra suporuojami su viena iš eksponuotų DNR grandžių. Suporuoti RNR nukleotidai yra sujungti RNR polimeraze, kad susidarytų nauja RNR molekulė, kuri papildo DNR nukleotidų seką. Nutraukimo seka (žr. d) signalizuoja RNR polimerazei, kad baigtų mRNR transkripciją, kad RNR galėtų palikti branduolį, kad padėtų transliacijai. (c) Tada naujai suformuota (transkribuota) RNR atskiriama nuo DNR molekulės ir naudojama ląstelėje.

Transkripcija prasideda, kai fermentas atskiria dvi dvigrandės DNR grandines. Atskyrus dvi sruogas, atsiskleidžia jų azotinės bazės, todėl kodavimo grandinę galima „perskaityti“. Skaitymas atliekamas įvedant naujus RNR nukleotidus ir susiejant juos bazėmis su vandenilio ryšiais po vieną su atskleistais DNR nukleotidais. Suderinus, naujai gautas RNR nukleotidas sujungiamas vietoje, sudarydamas kovalentinį ryšį tarp vieno RNR nukleotido cukraus ir kito RNR nukleotido fosfato.

RNR polimerazė nustoja transkribuoti DNR, kai pasiekia pabaigos seką. Nutraukimo sekos yra DNR nukleotidų sekos, rodančios, kada RNR polimerazė turi baigti gaminti RNR molekulę. Nuskaitoma tik viena iš dviejų DNR grandžių, kad kiekvienam genui būtų sukurta viena RNR grandinė.

Yra keletas RNR tipų: tačiau trys tipai, į kuriuos sutelksime dėmesį, yra pasiuntinio RNR (mRNR), pernešimo RNR (tRNR) ir ribosomų RNR (rRNR). Kiekvienas RNR tipas yra surinktas branduolyje iš tų pačių 4 nukleotidų derinių. Tačiau kiekvienas RNR tipas atlieka skirtingą funkciją baltymų sintezės procese, vykstančiame citoplazmoje. Messenger RNR (mRNR) turi būtinų baltymų gamybos planą. Pernešimo RNR (tRNR) ir ribosomų RNR (rRNR) naudojamos skirtingais būdais nuskaityti mRNR ir sujungti būtinas aminorūgštis, kad jos būtų surinktos į baltymą.

Antras žingsnis: vertimas – baltymų gamyba

Vertimas yra RNR informacijos panaudojimo procesas, nukreipiantis baltymų sintezę, prijungiant aminorūgštis viena prie kitos. MRNR skaitoma tiesiškai trijų nukleotidų, vadinamų kodonais, rinkiniais. Kodonas yra trijų nukleotidų rinkinys, koduojantis konkrečios aminorūgšties vietą. MRNR molekulės kontekste kodonas nustato, kuri aminorūgštis turi būti pridėta šalia baltymo transliacijos metu. 8.2 lentelėje parodytos kiekvieno kodono ir atitinkamos aminorūgšties mRNR nukleotidų deriniai. Pavyzdžiui, kodonas UUU atitinka tik aminorūgštį fenilalaniną (Phe). Yra 64 galimi kodonai ir tik 20 dažniausiai naudojamų aminorūgščių, todėl yra daug būdų koduoti daugybę aminorūgščių. Pavyzdžiui, kodonai UCU, UCC, UCA ir UCG koduoja seriną.

8.2 LENTELĖ. Amino rūgščių-mRNR žodynas ir 20 bendrų aminorūgščių ir jų santrumpos

Tai yra 20 įprastų aminorūgščių, naudojamų ląstelės baltymų sintezėje. Kiekvienas iš jų turi žinomą cheminę struktūrą ir yra koduojamas specifiniais mRNR kodonais.

Prisiminkite iš 4 skyriaus, kad ribosoma yra nemembraninė organelė, sintezuojanti baltymus. Ribosoma yra sudaryta iš baltymų ir RNR tipo, vadinamo ribosomų RNR (rRNR). Ribosomos ląstelėje paprastai egzistuoja kaip dvi dalys arba subvienetai. Yra didelis subvienetas ir mažas subvienetas. Vertimo metu du subvienetai sujungia ir laiko tarp jų mRNR. Kai mRNR yra tvirtai įterpta į ribosomą, nuskaitomi mRNR kodonai ir prasideda baltymų sintezė.

Ląstelėje yra daug ribosomų, skirtų baltymų sintezei. Bet kuri iš ribosomų gali nuskaityti bet kurią mRNR, kuri po transkripcijos gaunama iš ląstelės branduolio. Kai kurios ribosomos yra laisvos citoplazmoje, o kitos yra prijungtos prie ląstelės šiurkščio endoplazminio tinklo (ER). Baltymai, skirti būti ląstelės membranos dalimi arba supakuoti, kad išsiskirtų iš ląstelės, sintetinami ribosomose, pritvirtintose prie endoplazminio tinklo. Baltymai, kurie turi atlikti savo funkciją citoplazmoje, sintetinami ant ribosomų, kurios nėra prisijungusios prie endoplazminio tinklo. Vertimo procesą galima suskirstyti į tris pagrindinius etapus: (1) inicijavimas, (2) pailgėjimas ir (3) užbaigimas.

Baltymų sintezė prasideda mažam ribosominiam subvienetui prisijungus prie specifinės signalinės kodonų sekos mRNR. Mažas ribosominis subvienetas juda išilgai mRNR ir sustoja ties pirmuoju AUG kodonu pagal RNR ilgį. Šis AUG kodonas yra vieta, kur prasideda vertimas. Jei AUG nerastas, vertimas nevyksta. Pirmajame AUG kodone pirmoji aminorūgštis (metioninas arba MET) yra ant mRNR.

Aminorūgštys patenka į mRNR-ribosomų kompleksą pernešant RNR. Pernešimo RNR (tRNR) yra atsakinga už teisingos aminorūgšties suderinimą su kodonais, esančiais mRNR nukleotidų sekoje (8.7a pav.). Ląstelės tRNR gali suderinti aminorūgštis su mRNR kodonais dėl bazių poravimosi. TRNR dalis, kuri sąveikauja su mRNR, vadinama antikodonu. TRNR antikodonas yra trumpa nukleotidų seka, susidedanti iš porų su mRNR molekulės nukleotidais. Kitame tRNR gale yra aminorūgštis. Tinkamą tRNR ir aminorūgščių atitiktį atlieka ląstelėje esantis fermentas.

Pradinis kodonas, AUG, yra pirmasis kodonas, nuskaitomas mRNR, kad susidarytų bet koks baltymas. Kadangi tRNR, kuri jungiasi prie AUG kodono, turi aminorūgštį metioniną, pirmoji kiekvieno baltymo aminorūgštis yra metioninas (8.7 pav.). Jei šis pirmasis metioninas nėra reikalingas tinkamai baltymo funkcijai, vėliau jis gali būti pašalintas iš baltymo. Po to, kai metionino-tRNR molekulė yra išdėstyta virš starto kodono, didelis ribosomos subvienetas prisijungia prie mažo subvieneto, kad surištų mRNR. Kai du subvienetai yra kartu, o mRNR viduryje, ribosoma yra visiškai suformuota. Likusio baltymo susidarymo procesas yra paruoštas pradėti (8.7 pav.).

a) mRNR molekulė yra ribosomoje taip, kad du kodonai būtų transkripcijos padėtyje. Pirmasis iš šių dviejų kodonų (AUG) yra iniciacijos kodonas ir yra atsakingas už vandenilio ryšį su tRNR, turinčia aminorūgštį metioniną (MET). Pradinė tRNR susilygina su pradžios kodonu. b) Didysis ribosomos subvienetas prisijungia prie mažojo subvieneto. Dabar ribosoma yra surinkta ir gali išversti mRNR.

Pradėjus baltymų sintezę, ribosoma koordinuoja pasikartojančių įvykių seriją. Kiekvieną kartą, kai ribosoma veikia per šią įvykių seriją, į augantį baltymą pridedama nauja aminorūgštis. Tokiu būdu ribosoma yra tarsi surinkimo linija, kuri organizuoja sudėtingo surinkimo proceso etapus. Kiekvienai naujai aminorūgščiai į ribosomą patenka nauja tRNR su konkrečia aminorūgštimi. Ribosoma prideda naują aminorūgštį prie augančio baltymo (8.8 pav.).

(a) Dvi tRNR sulygina aminorūgštis izoleuciną (ILE) ir glutaminą (GLN), kad jas būtų galima chemiškai prijungti viena prie kitos, sudarydamos peptidinį ryšį. (b) Susidarius ryšiui, pirmoji tRNR atsiskiria nuo savo padėties mRNR. c) ribosoma juda žemyn vienu kodonu mRNR. Kita tRNR dabar susilygina taip, kad kitą aminorūgštį (ILE) būtų galima pridėti prie augančio baltymo. (d) Procesas tęsiamas naudojant naują tRNR, naują aminorūgštį ir formuojant naują peptidinį ryšį.

Ribosoma ir toliau pridės vieną aminorūgštį po kitos į augantį baltymą, nebent susidurs su sustabdymo signalu (8.9 pav.). Sustojimo signalas mRNR taip pat yra kodonas. Stabdymo kodonas gali būti UAA, UAG arba UGA. Kai pailgėjimo metu atsiranda bet kuris iš šių trijų kodonų, į ribosomą patenka cheminis išsiskyrimo faktorius. Atpalaidavimo faktorius priverčia ribosomą atsiskirti nuo baltymo. Kai baltymas išsiskiria, ribosomų subvienetai atsiskiria ir išskiria mRNR. MRNR gali būti naudojama dar vienai baltymo kopijai gaminti arba ląstelė gali ją suskaidyti, kad būtų išvengta daugiau baltymo susidarymo. Dvi ribosomos dalys taip pat gali būti naudojamos pakartotinai.

(a) Atpalaidavimo faktorius persikels į pabaigos kodono vietą – čia, UAG. (b) Ribosoma atpalaiduoja užbaigtą aminorūgščių grandinę. Ribosoma išyra, o mRNR gali būti panaudota kitos ribosomos, kad sintezuotų kitą baltymą.

Beveik universalus genetinis kodas

Baltymų gamybos iš DNR kodas yra vienodas beveik visoms ląstelėms. Bakterijos, archajos, dumbliai, pirmuonys, augalai, grybeliai ir gyvūnai genetinei informacijai saugoti naudoja DNR. Jie visi perrašo DNR informaciją į RNR. Visi jie verčia RNR, kad sintezuotų baltymus, naudodami ribosomą. Išskyrus labai mažas išimtis, jie visi naudoja tuos pačius tris nukleotidų kodonus, kad koduotų tą pačią aminorūgštį. Eukariotinėse ląstelėse transkripcija visada vyksta branduolyje, o transliacija visada vyksta citoplazmoje (8.10 pav.).

8.10 PAVEIKSLAS. Eukariotų baltymų sintezės santrauka

Genetinė informacija DNR transkripcijos metu branduolyje perrašoma kaip RNR branduolyje. iRNR, tRNR ir rRNR juda iš branduolio į citoplazmą (citozolį), kur genetinę informaciją skaito ribosomos vertimo metu.

Baltymų sintezės panašumas visose ląstelėse tvirtai įrodo bendrą visų gyvybės formų kilmę. Tai taip pat sukuria labai įdomių galimybių biotechnologijoms. Dabar bakterijose galima sintetinti žmogaus baltymus, tokius kaip insulinas, nes bakterijos ir žmonės baltymams gaminti naudoja tą patį kodą. Insulino gamyba tokiu būdu gali padėti sukurti pigų ir gausų vaistų šaltinį daugeliui diabetu sergančiųjų.

Tačiau ne visa genetinė informacija teka iš DNR į RNR į baltymus. Kai kurie virusai naudoja RNR, kad saugotų savo genetinę informaciją. Šie virusai vadinami retrovirusais. Retroviruso pavyzdys yra žmogaus imunodeficito virusas, ŽIV. Retrovirusai naudoja savo RNR DNR gamybai. Tada ši DNR naudojama daugiau RNR transkribuoti. Tada ši RNR naudojama baltymams gaminti (Outlooks 8.1).

Gyvenimas atvirkščiai – retrovirusai

Įgytą imunodeficito sindromą (AIDS) sukelia retrovirusas, vadinamas žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV). ŽIV yra sferinis virusas, kurio genetinė medžiaga yra RNR, apsupta baltymo apvalkalo. Be to, virusas yra apsuptas fosfolipidų sluoksnio, paimto iš ląstelės plazmos membranos, kai virusas išeina iš ląstelės šeimininkės. Kai žmonės užsikrečia ŽIV, išorinė viruso fosfolipidinė membrana susilieja su ląstelės-šeimininkės plazmine membrana ir išskiria virusą su RNR į ląstelę. Be savo RNR genetinės medžiagos, ŽIV turi keletą fermentų, iš kurių vienas yra atvirkštinė transkriptazė. Kai ŽIV patenka į tinkamą ląstelę šeimininkę, virusas pirmiausia naudoja atvirkštinę transkriptazę, kad gautų savo RNR DNR kopiją. (Tai yra atvirkštinis normalus procesas ląstelėse, kai fermentas transkriptazė naudoja DNR RNR gamybai.) Kadangi tai yra atvirkščiai (retro-) tam, kas paprastai vyksta ląstelėje, RNR virusai vadinami retrovirusais. Atvirkštinės transkriptazės pagaminta DNR sujungiama į šeimininko ląstelės DNR. Tik tada ŽIV tampa aktyviu, ligas sukeliančiu parazitu. Kai viruso RNR DNR kopija įterpiama į ląstelės šeimininkės DNR, virusinė RNR naudojama viruso RNR ir jos baltymų apvalkalo kopijoms.

Supratimas, kuo ŽIV skiriasi nuo DNR pagrįstų organizmų, turi dvi svarbias pasekmes. Pirma, atvirkštinės transkriptazės buvimas žmogaus organizme gali būti laikomas retrovirusinės infekcijos požymiu, nes atvirkštinės transkriptazės negamina žmogaus ląstelės. Tačiau, kadangi ŽIV yra tik vienas iš kelių retrovirusų tipų, fermento buvimas individe nebūtinai rodo ŽIV infekciją. Tai tik rodo retrovirusinės infekcijos tipą. Antra, antivirusiniai vaistai nuo ŽIV išnaudoja pažeidžiamus retroviruso gyvavimo ciklo taškus. Pavyzdžiui, trukdžiai atvirkštinei transkriptazei blokuoja viruso gebėjimą gaminti DNR ir sumažina jo galimybes integruotis į šeimininko DNR. Tai suteikia užsikrėtusio žmogaus organizmui galimybę sunaikinti virusus ir sumažina galimybę, kad žmogui pasireikš ligos simptomai. Išvalius virusus, sumažėja tikimybė, kad asmuo perduos virusą kitiems.

Šis elektroninis mikrografas rodo, kad ŽIV virusai palieka ląstelę. Šios viruso dalelės dabar gali užkrėsti kitą ląstelę ir tęsti viruso replikacijos ciklą, nebent vaistai tai užkirstų kelią.

8. Kuo RNR molekulės gamyba skiriasi nuo DNR replikacijos?

9. Jei DNR nukleotidų seka yra TACAAAGCA, kokia yra mRNR nukleotidų seka, kuri su ja susiporuotų?

10. Kokios aminorūgštys atsirastų baltyme, chemiškai užkoduotame 9 klausimo nukleotidų sekos?

11. Kuo tRNR, rRNR ir mRNR skiriasi savo funkcija?

12. Kuo skiriasi promotoriaus seka, užbaigimo seka ir atpalaidavimo faktorius?

13. Išvardykite įvykių seką, kuri įvyksta, kai DNR žinutė paverčiama baltymu.

Jei esate bet kokios mūsų svetainėje esančios medžiagos autorių teisių savininkas ir ketinate ją pašalinti, susisiekite su mūsų svetainės administratoriumi, kad patvirtintumėte.


Turinys

Metafazės pradžiai būdingas mikrotubulių susijungimas su chromosomų kinetochorais, taip pat chromosomų išsirikiavimas ląstelės viduryje. Kiekviena chromatidė turi savo kinetochorą, o visi mikrotubulai, susieti su seserinių chromatidžių kinetochorais, spinduliuoja iš priešingų ląstelės polių. Šie mikrotubulai daro traukiančią jėgą chromosomoms į priešingus ląstelių galus, o sanglauda tarp seserinių chromatidų priešinasi šiai jėgai.

Pereinant iš metafazės į anafazę, ši sanglauda tarp seserinių chromatidžių ištirpsta, o atskirtos chromatidės verpstės mikrovamzdeliais ištraukiamos į priešingas ląstelės puses. Chromatides toliau skiria fizinis pačių veleno polių judėjimas. Ankstyvas chromatidų disociacija gali sukelti chromosomų susiskaidymą ir aneuploidiją dukterinėse ląstelėse. Taigi metafazės kontrolinio taško užduotis yra užkirsti kelią šiam perėjimui į anafazę, kol chromosomos nėra tinkamai pritvirtintos, prieš atsiskiriant seserinėms chromatidėms.

Norint išsaugoti ląstelės tapatumą ir tinkamą funkcionavimą, po kiekvieno ląstelės dalijimosi būtina palaikyti atitinkamą chromosomų skaičių. Klaida generuojant dukterines ląsteles su mažesniu ar didesniu chromosomų skaičiumi, nei tikėtasi (ši situacija vadinama aneuploidija), geriausiu atveju gali sukelti ląstelių mirtį arba gali sukelti katastrofiškų fenotipinių rezultatų. [3] [4] Pavyzdžiai:

  • Vėžio ląstelėse aneuploidija yra dažnas reiškinys, rodantis, kad šiose ląstelėse yra chromosomų segregacijos mechanizmų, taip pat mechanizmo, užtikrinančio tinkamą atskyrimo, defektą.
  • Žmonėms Dauno sindromas pasireiškia vaikams, turintiems savo ląstelėse vieną papildomą 21 chromosomos kopiją, dėl vieno iš pirmtakų mejozės metu atsiradusio chromosomų atskyrimo defekto. Dėl šio defekto susidarys gameta (spermatozoidas arba oocitas) su papildoma 21 chromosoma.Po apvaisinimo ši gameta sukurs embrioną su trimis 21 chromosomos kopijomis.

Zirkle (1970 m.) buvo vienas iš pirmųjų tyrinėtojų, pastebėjusių, kad kai tik viena chromosoma sulėtėja patekti į metafazės plokštelę, anafazės pradžia nukeliama iki kelių minučių po jos atvykimo. [5] Šis stebėjimas kartu su panašiais leido manyti, kad pereinant iš metafazės į anafazę egzistuoja kontrolės mechanizmas. Naudojant tokius vaistus kaip nokodazolas ir kolchicinas, mitozinis velenas išyra ir ląstelių ciklas blokuojamas pereinant iš metafazės į anafazę. Naudojant šiuos vaistus (žr. Riederio ir Palazzo apžvalgą 1992 m. [6] ), buvo pavadintas tariamas kontrolės mechanizmas. Suklio surinkimo patikros taškas (SAC). Šis reguliavimo mechanizmas buvo intensyviai tiriamas nuo tada. [7]

Taikant įvairių tipų genetinius tyrimus buvo nustatyta, kad SAC gali suaktyvinti įvairūs defektai: verpstės depolimerizacija, [8] [9] dicentrinių chromosomų buvimas (su dviem centromerais), [10] centromerai, išsiskiriantys nenormalus būdas, [11] veleno polių korpusų defektai S. cerevisiae, [12] kinetochorų baltymų defektai, [13] centromerinės DNR mutacijos [14] arba mitozės metu aktyvių molekulinių variklių defektai. [8] Šių pastebėjimų santrauką galima rasti 1999 m. Hardwicko ir bendradarbių straipsnyje. [15]

Remdamasis savo stebėjimais, Zirkle [5] pirmasis pasiūlė, kad „tam tikra (...) medžiaga, reikalinga ląstelei pereiti į anafazę, atsiranda praėjus kelioms minutėms po C (paskutinės chromosomos patekimo į metafazės plokštelę momento). , arba po drastiško citoplazminės būklės pasikeitimo, tiesiog C arba iš karto po C ", o tai rodo, kad ši funkcija yra kinetochorose, neprisirišusi prie mitozinio veleno. McIntosh išplėtė šį pasiūlymą, teigdamas, kad vienas fermentas, jautrus įtampai, esantis centromeruose, gamina anafazės pradžios inhibitorių, kai dvi seserinės kinetochoros nėra bipolinės įtampos. [16] Iš tiesų, turimi duomenys rodo, kad signalas „laukti, kol įeis į anafazę“ dažniausiai sukuriamas ant neprisijungusių kinetochorų arba arti jų. [17] Tačiau pagrindinis įvykis, susijęs su kinetochoro prijungimu prie veleno, kuris gali inaktyvuoti slopinamąjį signalą ir atleisti metafazės sustabdymą, gali būti mikrotubulių įsigijimas kinetochore (kaip pasiūlė Riederis ir bendradarbiai 1995 m. [17]), arba įtampa, stabilizuojanti mikrotubulių tvirtinimą prie kinetochorų (kaip rodo Nicklaso laboratorijoje atlikti eksperimentai [18]). Vėlesni tyrimai su ląstelėmis, turinčiomis dvi nepriklausomas mitozines verpstes vienintelėje citoplazmoje, parodė, kad perėjimo iš metafazės į anafazę inhibitorius sukuria neprisijungę kinetochorai ir jis nėra laisvai difuzinis citoplazmoje. [19] Tačiau tame pačiame tyrime buvo įrodyta, kad kai vienoje ląstelės dalyje pradedamas perėjimas iš metafazės į anafazę, ši informacija išplečiama visoje citoplazmoje ir gali įveikti signalą „laukti, kol įeisite į anafazę“. susietas su antruoju velenu, kuriame yra nepritvirtintų kinetochorų.

Ląstelių dalijimasis: medžiagos dubliavimas ir paskirstymas dukterinėms ląstelėms Redaguoti

Kai ląstelės yra pasirengusios dalytis, nes ląstelės yra pakankamai didelės arba gauna atitinkamą dirgiklį [20], jos suaktyvina mechanizmą, skirtą patekti į ląstelės ciklą, ir S (sintezės) fazės metu dubliuoja daugumą organelių, įskaitant jų centrosomą. . Todėl, kai baigsis ląstelių dalijimosi procesas, kiekviena dukterinė ląstelė gaus visą organelių rinkinį. Tuo pačiu metu S fazės metu visos ląstelės turi labai tiksliai dubliuoti savo DNR – procesas vadinamas DNR replikacija. Pasibaigus DNR replikacijai, eukariotuose DNR molekulė sutankinama ir kondensuojama, kad susidarytų mitozinės chromosomos, kurių kiekvieną sudaro dvi seserinės chromatidės, kurios laikosi kartu sukuriant sanglaudą tarp jų kiekviena chromatidė yra pilna DNR molekulė, prijungta. per mikrovamzdelius į vieną iš dviejų besidalijančios ląstelės centrosomų, esančių priešinguose ląstelės poliuose. Struktūra, kurią sudaro centrosomos ir mikrotubuliai, dėl būdingos formos pavadinta mitozine verpstė, laikanti chromosomas tarp dviejų centrosomų. Abi seserys chromatidės lieka kartu iki anafazės, šiuo metu jos atsiskiria viena nuo kitos ir keliauja link centrosomos, prie kurios yra prisirišusios. Tokiu būdu, kai dalijimosi proceso pabaigoje atsiskiria dvi dukterinės ląstelės, kiekviena gaus visą chromatidų rinkinį. Įvardytas mechanizmas, atsakingas už teisingą seserinių chromatidžių pasiskirstymą ląstelių dalijimosi metu chromosomų atskyrimas.

Siekiant užtikrinti, kad chromosomų atskyrimas vyktų teisingai, ląstelės sukūrė tikslų ir sudėtingą mechanizmą. Visų pirma, ląstelės turi koordinuoti centrosomų dubliavimąsi su DNR replikacija, o šio koordinavimo sutrikimas sukels monopolinius arba daugiapolius mitozinius verpstus, kurie paprastai sukels nenormalią chromosomų segregaciją [21], nes tokiu atveju chromosomų pasiskirstymas neįvyks. subalansuotai.

Mitozė: chromosomų pritvirtinimas prie veleno ir chromosomų segregacija Redaguoti

S fazės metu centrosoma pradeda dubliuotis. Tik mitozės pradžioje abu centrioliai pasiekia maksimalų ilgį, įdarbina papildomos medžiagos ir padidėja jų gebėjimas formuoti mikrovamzdelius. Progresuojant mitozei, abi centrosomos atsiskiria ir sukuria mitozinį veleną. [22] Tokiu būdu mitozinis velenas turi du polius, išeinančius mikrovamzdelius. Mikrotubuliai (MT) yra ilgi proteininiai siūlai, turintys asimetrines galūnes: vienas galas vadinamas „minuso“ (-) galu, palyginti stabilus ir artimas centrosomai, o galas vadinamas „plius“ (+) galas, kintantis augimo ir atitraukimas, tyrinėjant ląstelės centrą, ieškant chromosomų. Kiekviena chromatidė turi specialią sritį, pavadintą centromeru, kurios viršuje yra surinkta baltyminė struktūra, vadinama kinetochore, kuri gali stabilizuoti mikrotubulą ir galą. Todėl, jei atsitiktinai ląstelės centrą tyrinėjantis mikrovamzdelis susidurs su kinetochora, gali atsitikti taip, kad kinetochoras jį užfiksuos ir chromosoma prisitvirtins prie veleno per vienos iš savo seserinių chromatidžių kinetochorą. Chromosoma vaidina aktyvų vaidmenį pritvirtinant kinetochorus prie veleno. Prie chromatino yra prijungtas Ran guanino nukleotidų mainų faktorius (GEF), kuris stimuliuoja citozolinį Ran šalia chromosomos, kad vietoj BVP prisijungtų GTP. Aktyvuota GTP surišta Ran forma iš citozolyje esančių baltymų kompleksų atpalaiduoja mikrotubulius stabilizuojančius baltymus, tokius kaip TPX2, o tai skatina mikrotubulių aplink chromosomas branduolių susidarymą ir polimerizaciją. [23] Šie kinetochore gauti mikrotubulai kartu su kinezino motoriniais baltymais, esančiais išoriniame kinetochore, palengvina sąveiką su veleno polių išvestų mikrotubulų šoniniu paviršiumi. Tačiau šie šoniniai tvirtinimai yra nestabilūs ir turi būti pakeisti į galutinį tvirtinimą. Konvertavimas iš šoninių į galinius tvirtinimo elementus leidžia mikrovamzdelių pliuso galų augimui ir susitraukimui paversti jėgas, kurios stumia ir traukia chromosomas, kad būtų pasiekta tinkama abipusė orientacija. Kadangi atsitinka, kad seserinės chromatidės yra sujungtos kartu ir abi kinetochorai yra abiejose chromatidėse, kai vienas kinetochoras prisijungia prie vienos centrosomos, seserinis kinetochoras yra veikiamas centrosomos, esančios priešingame poliuje, dėl šios priežasties. daugeliu atvejų antrasis kinetochoras per savo mikrovamzdelius susiejamas su centrosoma priešingame poliuje [24], todėl chromosomos tampa „dvi orientuotos“, pagrindinė konfigūracija (taip pat vadinama amfitelinis), siekiant užtikrinti, kad chromosomų atskyrimas įvyks teisingai, kai ląstelė dalinsis. [25] [26] Kartais vienas iš dviejų seserinių kinetochorų vienu metu gali prisijungti prie abiejų polių generuojamų MT, konfigūracija pavadinta merotelinis, kurio neaptinka veleno kontrolinis taškas, bet kuris gali generuoti atsiliekančias chromosomas anafazės metu ir, atitinkamai, aneuploidiją. Merotelinė orientacija (būdinga tuo, kad tarp seserinių kinetochorų nėra įtampos) yra dažna mitozės pradžioje, tačiau baltymas Aurora B (kinazė, konservuota nuo mielių iki stuburinių) aptinka ir pašalina tokio tipo tvirtinimą. [27] (Pastaba: Aurora B dažnai per daug išreiškiama įvairių tipų navikuose ir šiuo metu yra priešvėžinių vaistų kūrimo tikslas. [28] )

Sesuo chromatidinė sanglauda mitozės metu Redaguoti

Cohesin: SMC baltymai Redaguoti

Kaip jau buvo pažymėta anksčiau, seserinės chromatidės lieka susijusios nuo S fazės (kai DNR replikuojama, kad būtų sukurtos dvi identiškos kopijos, dvi chromatidės) iki anafazės. Šiuo metu dvi seserinės chromatidės atsiskiria ir dalijančioje ląstelėje keliauja į priešingus polius. Genetiniai ir biocheminiai mielių ir kiaušinių ekstraktų tyrimai Xenopus laevis nustatė, kad poliproteinų kompleksas yra esminis seserinių chromatidų sanglaudos dalyvis (žr. Hirano apžvalgą 2000 m. [29]). Šis kompleksas yra žinomas kaip kohesino kompleksas ir in Saccharomyces cerevisiae susideda iš mažiausiai keturių subvienetų: Smc1p, Smc3p, Scc1p (arba Mcd1p) ir Scc3p. Tiek Smc1p, tiek Smc3p priklauso baltymų šeimai Chromosomų struktūrinė priežiūra (SMC), kurios sudaro labai konservuotų chromosominių ATPazių grupę ir sudaro heterodimerą (Smc1p / Smc3p). Scc1p yra homologas S.cerevisiae Rad21, pirmą kartą identifikuotas kaip baltymas, dalyvaujantis DNR atstatyme S. pombe. Šie keturi baltymai yra būtini mielėse, o bet kurio iš jų mutacija sukels priešlaikinį seserų chromatidų atsiskyrimą. Mielėse kohesinas jungiasi prie pageidaujamų vietų išilgai chromosomų rankų ir yra labai gausus netoli centromerų, kaip buvo parodyta tyrime, kuriame panaudotas chromatino imuninis nusodinimas. [30]

Heterochromatino vaidmuo Redaguoti

Klasikiniai citologiniai stebėjimai leido manyti, kad seserinės chromatidės yra stipriau prisirišusios prie heterochromatinių regionų [31], ir tai leido manyti, kad ypatinga heterochromatino struktūra ar sudėtis gali paskatinti kohesino įdarbinimą. [32] Tiesą sakant, buvo įrodyta, kad Swi6 (HP-1 homologas in S. pombe) prisijungia prie metilinto histono H3 Lys 9 ir skatina kohezino prisijungimą prie centromerinių pasikartojimų S. pombe. [33] [34] Naujausi tyrimai rodo, kad RNRi mechanizmas reguliuoja heterochromatino susidarymą, o tai savo ruožtu įtraukia kohesiną į šį regioną. S. pombe [35] ir stuburinių ląstelių. [36] Tačiau turi būti ir kitų mechanizmų, išskyrus heterochromatiną, kad būtų užtikrinta padidinta centromerų sanglauda, ​​nes S. cerevisiae šalia centromerų trūksta heterochromatino, tačiau funkcinio centromero buvimas skatina kohesino asociacijos padidėjimą gretimoje srityje, apimančią 20–50 kb. [37]

Šia kryptimi, Orc2 (vienas baltymas, įtrauktas į kilmės atpažinimo kompleksą, ORC, susijęs su DNR replikacijos inicijavimu S fazės metu) taip pat yra ant kinetochorų žmogaus ląstelių mitozės metu [38], atsižvelgiant į šią lokalizaciją, kai kurie stebėjimai rodo, kad Orc2 mielėse yra susijęs su seserų chromatidų sanglauda, ​​o jo pašalinimas sukelia SAC aktyvavimą. [39] Taip pat pastebėta, kad kiti ORC komplekso komponentai (pvz., orc5 in S. pombe) yra susiję su sanglauda. [40] Tačiau atrodo, kad molekulinis kelias, apimantis ORC baltymus, yra priedas prie kohesinų kelio ir dažniausiai nežinomas.

Sanglaudos funkcija ir jos tirpimas Redaguoti

Centromerinė sanglauda priešinasi jėgoms, kurias suklio mikrovamzdeliai daro link polių, kurios sukuria įtampą tarp seserinių kinetochorų. Savo ruožtu ši įtampa stabilizuoja prisitvirtinimo mikrovamzdelius-kinetochorą per mechanizmą, kuriame dalyvauja baltymas Aurora B (šios problemos apžvalga: Hauf ir Watanabe 2004 [41]).

Iš tiesų, sumažėjus kochezino kiekiui ląstelėse, atsiranda priešlaikinis seserų chromatidžių atskyrimas, taip pat chromosomų kongreso defektai metafazės plokštelėje ir baltymų perkėlimas chromosominis keleivių kompleksas, kuriame yra baltymas Aurora B. [42] [43] Siūloma kohesino komplekso struktūra rodo, kad šis kompleksas tiesiogiai jungia abi seserines chromatides. [44] Šioje siūlomoje struktūroje kohesino SMC komponentai atlieka struktūrinį vaidmenį, todėl SMC heterodimeras gali veikti kaip DNR surišantis baltymas, kurio konformaciją reguliuoja ATP. [45] Tačiau Scc1p ir Scc3p atliktų reguliavimo vaidmenį. [29]

Į S. cerevisiae, Pds1p (taip pat žinomas kaip securin) reguliuoja seserinių chromatidų sanglaudą, nes jungiasi ir slopina proteazę Esp1p (separinas arba atskiras). Kai prasideda anafazė, atsiranda anafazę skatinantis kompleksas (APC/C. arba ciklosomas) skaido sekuriną. APC/C yra žiedinė E3 ubikvitino ligazė, kuri įdarbina E2 ubikvitiną konjuguojantį fermentą, pakrautą su ubikvitinu. Securin atpažįstamas tik tuo atveju, jei aktyvatoriaus subvienetas Cdc20 yra prijungtas prie APC/C šerdies. Kai securinas, Cdc20 ir E2 yra prijungti prie APC/C, E2 ubikvitina securiną ir selektyviai jį skaido. Securino skaidymas atpalaiduoja proteazę Esp1p/separase, kuri skaido kohesino žiedus, jungiančius dvi seserines chromatides, todėl skatina seserinių chromatidžių atskyrimą. [46] Taip pat buvo įrodyta, kad Polo/Cdc5 kinazė fosforilina serino likučius šalia Scc1 pjovimo vietos, ir šis fosforilinimas palengvintų pjovimo veiklą. [47]

Nors ši mašina išsaugota evoliucijos būdu, [48] [49] stuburiniuose gyvūnuose dauguma kohesino molekulių išsiskiria profazėje, nepriklausomai nuo APC/C buvimo, proceso metu, priklausančiame nuo Polo tipo 1 (PLK1) ir Auroros B. [50] Tačiau buvo įrodyta, kad nedidelis Scc1 kiekis lieka susietas su centromeriais žmogaus ląstelėse iki metafazės, o panašus kiekis sumažinamas anafazėje, kai jis išnyksta iš centromerų. [51] Kita vertus, kai kurie eksperimentai rodo, kad seserinių chromatidžių sanglauda rankose palaipsniui prarandama po to, kai atsiskiria seseriniai centromerai, o seserinės chromatidės juda link priešingų ląstelės polių. [52] [53]

Remiantis kai kuriais stebėjimais, dalis chromosomų rankose esančių kohesinų ir centromerinių kohesinų yra apsaugoti baltymo. Šugošinas (Sgo1), vengiant jų išleidimo per fazę. [54] [55] Kad galėtų veikti kaip centromerinės sanglaudos apsauga, Sgo1 turi būti inaktyvuotas anafazės pradžioje, taip pat Pds1p. Tiesą sakant, tiek Pds1p, tiek Sgo1 yra APC/C substratai stuburiniuose gyvūnuose. [56]

Suklio surinkimo kontrolinis taškas (SAC) yra aktyvus signalas, kurį sukuria netinkamai pritvirtinti kinetochorai, kuris yra išsaugotas visuose eukariotuose. SAC sustabdo ląstelių ciklą neigiamai reguliuodamas CDC20, taip užkertant kelią anafazę skatinančio komplekso (APC) poliubikvitilinimo aktyvumui. Baltymai, atsakingi už SAC signalą, sudaro mitozinio kontrolinio taško kompleksą (MCC), kurį sudaro SAC baltymai, MAD2 / MAD3 (mitozinio sustojimo trūkumas), BUB3 (benzimidazolo neslopinamas pumpurų atsiradimas) ir CDC20. [57] Kiti SAC dalyvaujantys baltymai yra MAD1, BUB1, MPS1 ir Aurora B. Aukštesniems eukariotams papildomi SAC reguliatoriai yra ROD-ZW10 komplekso sudedamosios dalys, p31 kometa, MAPK, CDK1-ciklinas-B, NEK2 ir PLK1. [58]

Kontrolinio taško aktyvinimas Redaguoti

SAC stebi sąveiką tarp netinkamai sujungtų kinetochorų ir veleno mikrotubulių ir palaikoma tol, kol kinetochorai tinkamai pritvirtinami prie veleno. Prometafazės metu CDC20 ir SAC baltymai koncentruojasi kinetochorose prieš pritvirtindami prie veleno mazgo. Šie baltymai palaiko SAC aktyvuotą tol, kol jie pašalinami ir bus tinkamai pritvirtintas kinetochoras-mikrotubulas. Net vienas nepritvirtintas kinetochoras gali išlaikyti veleno kontrolinį tašką. [57] Pritvirtinus mikrovamzdelių plius galus ir susidarius kinetochorų mikrotubulams, MAD1 ir MAD2 išeikvojami iš kinetochoro mazgo. Kitas kontrolinio taško aktyvavimo reguliatorius yra kinetochoro įtampa. Kai seseriniai kinetochorai yra tinkamai pritvirtinti prie priešingų veleno polių, jėgos mitoziniame velene sukuria įtampą kinetochorose. Dvi orientuotos seserinės kinetochoros stabilizuoja kinetochoro ir mikrovamzdelio mazgą, o silpna įtampa turi destabilizuojantį poveikį. Reaguodama į neteisingus kinetochoro tvirtinimus, tokius kaip sintetinis tvirtinimas, kai abu kinetokorai prisitvirtina prie vieno veleno poliaus, susidaranti silpna įtampa destabilizuoja neteisingą tvirtinimą ir leidžia kinetochorei tinkamai pritvirtinti prie veleno korpuso. Šio proceso metu kinetochorai, kurie yra pritvirtinti prie mitozinio veleno, bet nėra įtempti, suaktyvina veleno kontrolinį tašką. Chromosomų keleivių komplekso Aurora-B/Ipl1 kinazė veikia kaip įtampos jutiklis netinkamuose kinetochorų prieduose. Jis aptinka ir destabilizuoja neteisingus tvirtinimus, valdydamas mikrovamzdelius atskiriantį KINI kineziną MCAK, DASH kompleksą ir Ndc80/Hec1 kompleksą [59] mikrotubulo ir kinetochoro sąsajoje. [58] Aurora-B/Ipl1 kinazė taip pat labai svarbi koreguojant merotelinius prisirišimus, kai vienas kinetochoras vienu metu prijungiamas prie abiejų veleno polių. „Merotelic“ priedai sukuria pakankamą įtampą ir nėra aptinkami SAC, ir be pataisymo gali sukelti netinkamą chromosomų atskyrimą dėl lėto chromatidų migracijos greičio. Nors SAC aktyvavimui nepriklausomai reikalingas mikrotubulių tvirtinimas, neaišku, ar įtampa yra nepriklausomas SAC reguliatorius, nors akivaizdu, kad esant įtampai atsiranda skirtingas reguliavimo elgesys.

Suaktyvintas veleno kontrolinis taškas blokuoja anafazės patekimą, slopindamas anafazę skatinantį kompleksą reguliuodamas mitozinio kontrolinio taško komplekso aktyvumą. APC slopinimo mechanizmas mitozinio kontrolinio taško kompleksu yra menkai suprantamas, nors manoma, kad MCC jungiasi prie APC kaip pseudosubstratas, naudodamas KEN dėžutės motyvą BUBR1. Tuo pačiu metu, kai aktyvuojamas mitozinio kontrolinio taško kompleksas, centromero baltymas CENP-E aktyvuoja BUBR1, kuris taip pat blokuoja anafazę. [58]

Mitozinio kontrolinio taško komplekso susidarymas Redaguoti

Mitozinio kontrolinio taško kompleksą sudaro BUB3 kartu su MAD2 ir MAD3, prijungtais prie Cdc20. MAD2 ir MAD3 turi skirtingas surišimo vietas CDC20 ir veikia sinergiškai, kad slopintų APC/C. MAD3 kompleksą sudaro BUB3, kuris jungiasi prie Mad3 ir BUB1B per trumpą linijinį motyvą, žinomą kaip GLEBS motyvas. Tiksli priedų, kurie turi įvykti norint suformuoti MKC, tvarka lieka nežinoma. Gali būti, kad Mad2-Cdc20 sudaro kompleksą tuo pačiu metu, kai BUBR1-BUB3-Cdc20 sudaro kitą kompleksą, todėl šie du subkompleksai yra sujungti, kad sudarytų mitozinio kontrolinio taško kompleksą. [57] Žmogaus ląstelėse BUBR1 prisijungimui prie CDC20 reikalingas išankstinis MAD2 prisijungimas prie CDC20, todėl gali būti, kad MAD2-CDC20 subkompleksas veikia kaip MCC formavimosi iniciatorius. BUBR1 išeikvojimas lemia tik nedidelį Mad2-Cdc20 lygio sumažėjimą, o Mad2 reikalingas BubR1-Bub3 prijungimui prie Cdc20. Nepaisant to, BUBR1 vis tiek reikalingas kontrolinio taško aktyvinimui. [58]

MCC formavimosi mechanizmas yra neaiškus ir yra konkuruojančių teorijų dėl nuo kinetochoro priklausomo ir nuo kinetochoro nepriklausomo formavimosi. Remiantis nuo kinetochoro nepriklausoma teorija, MCC galima aptikti S. cerevisiae ląstelės, kuriose buvo mutuoti pagrindiniai kinetocore surinkimo baltymai, ir ląstelės, kuriose SAC buvo deaktyvuotas, o tai rodo, kad MCC gali būti surinktas mitozės metu be kinetochoro lokalizacijos.Viename modelyje nepritvirtinti prometafazės kinetochorai gali „jautrinti“ APC į MCC slopinimą, įdarbindami APC į kinetochorus per veikiantį SAC. Be to, įvairių SAC baltymų išeikvojimas atskleidė, kad MAD2 ir BUBR1 išeikvojimas turi įtakos mitozės laikui nepriklausomai nuo kinetochorų, o kitų SAC baltymų išeikvojimas sukelia disfunkcinį SAC, nekeičiant mitozės trukmės. Taigi gali būti, kad SAC veikia per dviejų pakopų laikmatį, kuriame MAD2 ir BUBR1 kontroliuoja mitozės trukmę pirmajame etape, kuri gali būti pratęsta antrajame etape, jei yra neprisijungusių kinetochorų ir kitų SAC baltymų. [58] Tačiau yra įrodymų, kurie prieštarauja nuo kinetochoro nepriklausomam agregatui. MKC dar turi būti rastas tarpfazės metu, o MKC nesusidaro iš jo sudedamųjų dalių X. laevis mejozės II ekstraktai, nepridedant branduolių spermos ir nokodazolo, kad būtų išvengta verpstės surinkimo.

Pagrindinis MCC formavimo modelis yra „MAD2 šablono modelis“, kuris priklauso nuo MAD2 kinetochoros dinamikos, kad būtų sukurtas MCC. MAD1 lokalizuojasi nepritvirtintuose kinetochoruose ir stipriai prisijungia prie MAD2. MAD2 ir BubR1 lokalizacija kinetochore taip pat gali priklausyti nuo Aurora B kinazės. [60] Ląstelės, kuriose nėra Aurora B, nesustabdo metafazės, net kai chromosomos nėra prijungtos prie mikrotubulių. [61] Neprisijungę kinetochorai pirmiausia prisijungia prie MAD1-C-MAD2-p31 kometos komplekso ir išlaisvina p31 kometą per nežinomus mechanizmus. Gautas MAD-C-MAD2 kompleksas įdarbina atvirą Mad2 konformerį (O-Mad2) į kinetochorus. Šis O-Mad2 pakeičia savo konformaciją į uždarą Mad2 (C-Mad2) ir sujungia Mad1. Šis Mad1 / C-Mad2 kompleksas yra atsakingas už daugiau O-Mad2 įtraukimą į kinetochorus, kurie pakeičia jo konformaciją į C-Mad2 ir suriša Cdc20 automatinio stiprinimo reakcijos metu. Kadangi MAD1 ir CDC20 turi panašų MAD2 surišimo motyvą, tuščia O-MAD2 konformacija pasikeičia į C-MAD2, o prisijungia prie CDC20. Šią teigiamą grįžtamojo ryšio kilpą neigiamai reguliuoja p31 kometa, kuri konkurencingai jungiasi prie C-MAD2, prijungto prie MAD1 arba CDC20, ir sumažina tolesnį O-MAD2 prisijungimą prie C-MAD2. Taip pat gali būti kitų kontrolės mechanizmų, atsižvelgiant į tai, kad p31 kometos nėra žemesniuose eukariotuose. Taigi „šablono modelio“ nomenklatūra gaunama iš proceso, kai MAD1-C-MAD2 veikia kaip C-MAD2-CDC20 kopijų formavimo šablonas. Šis Cdc20 sekvestravimas yra būtinas norint išlaikyti veleno kontrolinį tašką. [57]

Kontrolinio taško išjungimas Redaguoti

Egzistuoja keli mechanizmai, leidžiantys išjungti SAC po teisingos seserinių chromatidžių dvikryptės orientacijos. Pritvirtinus mikrovamzdelius-kinetochorą, pašalinimo mechanizmas per dyneino-dyneino variklio kompleksą transportuoja veleno kontrolinio taško baltymus nuo kinetochorų. [58] Tada nuimti baltymai, įskaitant MAD1, MAD2, MPS1 ir CENP-F, perskirstomi į veleno polius. Pašalinimo procesas labai priklauso nuo nepažeistos mikrotubulių struktūros, taip pat nuo dyneino judrumo išilgai mikrotubulių. P31 kometa ne tik veikia kaip C-MAD2 teigiamo grįžtamojo ryšio kilpos reguliatorius, ji taip pat gali veikti kaip SAC deaktyvatorius. Neprisijungę kinetochorai laikinai inaktyvuoja p31 kometą, tačiau prisirišimas vėl suaktyvina baltymą ir slopina MAD2 aktyvaciją, galbūt dėl ​​slopinamojo fosforilinimo. Kitas galimas SAC inaktyvavimo mechanizmas atsiranda dėl nuo energijos priklausomo MAD2-CDC20 komplekso disociacijos per nedegraduojančią CDC20 ubikvitiliaciją. Ir atvirkščiai, norint palaikyti SAC, reikalingas de-ubikvilituojantis fermentas protezinas. Taigi, nepritvirtinti kinetochorai palaiko kontrolinį tašką, nuolat atkurdami MAD2-CDC20 subkompleksą iš jo komponentų. SAC taip pat gali būti deaktyvuotas dėl APC aktyvacijos sukeltos proteolizės. Kadangi anafazės metu prarandant seserų ir chromatidų sanglaudą, SAC neaktyvuojamas, ciklino B proteolizė ir CDK1-ciklin-B kinazės inaktyvacija taip pat slopina SAC aktyvumą. MPS1 skilimas anafazės metu apsaugo nuo SAC pakartotinio aktyvavimo pašalinus seserų ir chromatidų sanglaudą. Po kontrolinio taško deaktyvavimo ir normalios ląstelės ciklo anafazės metu anafazę skatinantis kompleksas aktyvuojamas mažėjant MCC aktyvumui. Kai taip atsitinka, fermentų kompleksas poliubikvitina anafazės inhibitorių securiną. Ubikvitinacija ir sekurino sunaikinimas metafazės pabaigoje išskiria aktyvią proteazę, vadinamą separaze. Separazė suskaido sanglaudos molekules, kurios kartu laiko seserines chromatides, kad suaktyvintų anafazę. [23]

Naujas SAC išjungimo modelis S. cerevisiae: mechaninis jungiklis Redaguoti

Buvo pasiūlytas naujas mechanizmas, paaiškinantis, kaip mikrotubulų pritvirtinimas prie kinetochoro gali sutrikdyti konkrečius SAC signalizacijos veiksmus. Neprijungtame kinetochore pirmasis MCC formavimo žingsnis yra Spc105 fosforilinimas kinaze Mps1. Tada fosforilintas Spc105 gali įdarbinti paskesnius signalinius baltymus Bub1 ir 3 Mad 1,2, 3 ir Cdc20. Asociacija su Mad1 neprisijungus kinetochorose sukelia Mad2 konformacinį pasikeitimą, kuris paverčia jį iš atviros formos (O-Mad2) į uždarą formą (C-Mad2.) C-Mad2, susietas su Mad1, dimerizuojasi su antruoju O-Mad2 ir katalizuoja jo uždarymą aplink Cdc20. Šis C-Mad2 ir Cdc20 kompleksas, MCC, palieka Mad1 ir C-Mad2 kinetochore, kad sudarytų kitą MCC. Kiekvienas MKC atskiria dvi Cdc20 molekules, kad būtų išvengta jų sąveikos su APC/C, taip išlaikant SAC. [23] Spc105 Mps1 fosforilinimas yra būtinas ir pakankamas, kad būtų inicijuotas SAC signalizacijos kelias, tačiau šis žingsnis gali įvykti tik nesant mikrotubulų prijungimo prie kinetochoro. Įrodyta, kad endogeninis Mps1 yra susijęs su Ndc80 kalponino homologijos (CH) domenu, esančiu išoriniame kinetochoro regione, kuris yra nutolęs nuo chromosomos. Nors Mps1 yra prijungtas prie išorinio kinetochoro, jis vis tiek gali lokalizuotis vidiniame kinetochore ir fosforilinti Spc105 dėl lanksčių Ndc80 vyrių sričių. Tačiau mechaninio jungiklio modelis siūlo, kad mikrotubulo pritvirtinimas prie kinetochoro išjungia SAC dviem mechanizmais. Pritvirtinto mikrotubulo buvimas padidina atstumą tarp Ndc80 CH domeno ir Spc105. Be to, Dam1 / DASH, didelis kompleksas, susidedantis iš 160 baltymų, kurie sudaro žiedą aplink prijungtą mikrotubulą, veikia kaip barjeras tarp dviejų baltymų. Atskyrimas apsaugo nuo Mps1 ir Spc105 sąveikos ir taip slopina SAC signalizacijos kelią. [62]

Svarbu pažymėti, kad šis modelis netaikomas aukštesnės eilės organizmų, įskaitant gyvūnus, SAC reguliavimui. Pagrindinis mechaninio jungiklio mechanizmo aspektas yra tai, kad į S. cerevisiae kinetochoro struktūra leidžia pritvirtinti tik vieną mikrovamzdelį. Kita vertus, gyvūnų kinetochorai yra daug sudėtingesni tinklai, kuriuose yra daugybės mikrotubulių surišimo vietų. [63] Mikrotubulų pritvirtinimas visose kinetochoro surišimo vietose nėra būtinas norint išjungti SAC ir pereiti į anafazę. Todėl gyvūnų kinetochore egzistuoja kartu su mikrotubuliais ir nepritvirtintos būsenos, kai SAC yra slopinamas. Šiame modelyje nėra barjero, kuris neleistų Mps1, susijusiam su prijungtu kinetochoru, fosforilinti Spc105 gretimame neprisijungusiame kinetochore. Be to, mielių Dam1 / DASH komplekso nėra gyvūnų ląstelėse.

Kai suklio kontrolinis taškas veikia netinkamai, tai gali sukelti netinkamą chromosomų agregaciją, aneuploidiją ir net naviko atsiradimą. [58] Transformacija įvyksta ir paspartėja, kai genomo vientisumo palaikymas nutrūksta, ypač bendrame ištisų chromosomų arba didelių jų dalių lygyje. Tiesą sakant, aneuploidija yra labiausiai paplitusi žmogaus solidinių navikų savybė, todėl veleno surinkimo kontrolinis taškas gali būti laikomas galimu priešnavikinės terapijos taikiniu. [64] Tai yra labai neįvertintas faktas, nes manoma, kad genetinio nestabilumo ir naviko atsiradimo priežastis pirmiausia yra specifinių genų, žinomų kaip onkogenai arba naviko slopintuvai, mutacijos. Paprastai įvairūs ląstelių ciklo kontroliniai taškai rūpinasi genomo vientisumu per labai konservuotus perteklinius mechanizmus, kurie yra svarbūs palaikant ląstelių homeostazę ir užkertant kelią navikogenezei. Keli veleno surinkimo kontrolinių taškų baltymai veikia ir kaip teigiami, ir kaip neigiami reguliatoriai, užtikrinantys tinkamą chromosomų segregaciją kiekviename ląstelių cikle, užkertant kelią chromosomų nestabilumui (CIN), dar vadinamam genomo nestabilumu.

Genominis vientisumas dabar vertinamas keliais lygiais, kai kai kurie navikai pasireiškia nestabilumu, pasireiškiančiu kaip baziniai pakeitimai, įterpimai ir ištrynimai, o dauguma rodo visų chromosomų padidėjimą ar praradimą. [65]

Dėl to, kad mitozinių reguliuojančių baltymų pokyčiai gali sukelti aneuploidiją ir tai yra dažnas reiškinys sergant vėžiu [66], iš pradžių buvo manoma, kad šie genai gali būti mutuoti vėžiniuose audiniuose. [67]

Mutuoti genai sergant vėžiu Redaguoti

Kai kurių vėžio formų genai, kuriais grindžiami transformacijos defektai, yra gerai apibūdinami. Sergant hematologiniais vėžiniais susirgimais, tokiais kaip daugybinė mieloma, citogenetiniai anomalijos yra labai dažni dėl būdingo DNR pertraukų, reikalingų imunoglobulino genų pertvarkymui, pobūdžio. Tačiau baltymų, tokių kaip MAD2, kurie daugiausia veikia SAC, defektai taip pat būdingi daugybinei mielomai. [68] Dauguma solidinių navikų taip pat daugiausia yra aneuploidiniai. Kolorektalinio vėžio atveju BUB1 ir BUBR1 bei STK15 amplifikacija yra pagrindiniai reguliatoriai, kurie yra susiję su genomo nestabilumu, sukeliančiu vėžį. [69] Sergant krūties vėžiu, genetinė forma, kuriai būdingas BRCA-1 genas, pasižymi didesniu genomo nestabilumo lygiu nei sporadinės formos. Eksperimentai parodė, kad BRCA-1 nulinės pelės sumažino pagrindinio veleno kontrolinio taško baltymo MAD2 ekspresiją. [70] Dėl kitų vėžio atvejų reikia daugiau darbo, siekiant nustatyti aneuploidijos priežastis.

Kiti genai, tradiciškai nesusiję su vėžio SAC Redaguoti

Akivaizdu, kad šių baltymų (pvz., Mad2 ar BubR1) fiziologinio lygio svyravimai yra susiję su aneuploidija ir naviko atsiradimu, ir tai buvo įrodyta naudojant gyvūnų modelius. [71] [72] Tačiau naujausi tyrimai rodo, kad tai, kas atrodo, yra sudėtingesnis scenarijus: aneuploidija paskatintų didelį naviko atsiradimo dažnį tik tada, kai pasikeičia specifinių mitozinių kontrolinių taškų komponentų lygis (sumažėjimas arba per didelė ekspresija) audiniuose. taip pat sukelia kitus defektus, galinčius paskatinti juos augliams. [73] Tai yra defektai, tokie kaip DNR pažeidimo padidėjimas, chromosomų pertvarkymai ir (arba) sumažėjęs ląstelių mirties dažnis. Yra žinoma, kad kai kurių mitozinių kontrolinių punktų komponentai yra susiję su funkcijomis už mitozės ribų: branduolio importas (Mad1), transkripcijos slopinimas (Bub3) ir ląstelių mirtis, atsakas į DNR pažeidimą, senėjimas ir BubR1 megakariopoezė. Visa tai patvirtina išvadą, kad auglio atsiradimo padidėjimas yra susijęs su kitais nei tik aneuploidijos defektais. [73]

Su vėžiu susijusios mutacijos, turinčios įtakos žinomiems kontrolinių taškų genams, tokiems kaip BUB1 ar BUBR1, iš tikrųjų yra retos. Tačiau keli baltymai, susiję su vėžiu, susikerta su veleno surinkimo tinklais. Pagrindiniai naviko slopintuvai, tokie kaip p53, taip pat atlieka vaidmenį veleno kontroliniame taške. P53, dažniausiai mutavusio geno, sergančio žmogaus vėžiu, nebuvimas daro didelį poveikį ląstelių ciklo kontrolinių taškų reguliatoriams ir anksčiau buvo įrodyta, kad jis veikė G1 kontrolinį tašką, tačiau dabar atrodo, kad jis svarbus ir reguliuojant veleno kontrolinį tašką. [74] Kitas svarbus vėžio aspektas yra ląstelių mirties arba apoptozės slopinimas. Survivinas, apoptozės inhibitorių (IAP) šeimos narys, yra lokalizuotas telkiniuose prie mitozinio veleno mikrotubulų šalia centrosomų ir metafazių chromosomų kinetochorose. Survivinas ne tik slopina apoptozę, skatindamas naviko vystymąsi, bet ir yra susijęs (per eksperimentines išmušamas peles) kaip svarbus chromosomų atskyrimo reguliatorius ir vėlyvosios stadijos mitozė, panaši į jo vaidmenį primityvesniuose organizmuose. [75]

Kiti veleno surinkimo kontrolinio taško aspektai, tokie kaip kinetochoro pritvirtinimas, mikrotubulų funkcija ir seserinės chromatidės sanglauda, ​​taip pat gali būti sugedę ir sukelti aneuploidiją. Pastebėta, kad vėžio ląstelės dalijasi keliomis kryptimis, išvengdamos veleno surinkimo kontrolinio taško, todėl susidaro daugiapoliės mitozės. [76] Daugiapolis metafazės-anafazės perėjimas vyksta per neužbaigtą separazės ciklą, dėl kurio atsiranda dažnų nesusipratimų, kurie sustiprina vėžio ląstelių aneuploidiją.

SAC vėžio terapijos Redaguoti

Pažanga šioje srityje paskatino kai kurių gydymo būdų, skirtų suklio surinkimo defektams, kūrimą. Senesni gydymo būdai, tokie kaip vinkos alkaloidai ir taksanai, yra nukreipti į mikrotubules, kurios lydi mitozinių verpstės formavimąsi, sutrikdant mikrotubulų dinamiką, kuri sustabdo ląstelę ir galiausiai sukelia jos mirtį. [77] Taksolis ir docetakselis vis dar naudojami krūties vėžiui, kiaušidžių vėžiui ir kitų tipų epitelio vėžiui gydyti. Tačiau šie gydymo būdai dažnai pasižymi dideliu šalutiniu poveikiu ir atsparumu vaistams.

Taip pat siekiama kitų reguliatorių tinklo tikslų, turinčių įtakos SAC, didelis susidomėjimas perėjo link aurora kinazės baltymų. [78] Pastiprintas kinazės genas Aurora A veikia kaip onkogenas, viršijantis SAC, sukeliantis nenormalų anafazės pradžią ir vėlesnę aneuploidiją, taip pat atsparumą TAXOL. [79] Įdomu tai, kad mažos molekulės Aurora A inhibitorius parodė priešnavikinį poveikį in vivo modelyje, o tai rodo, kad tai gali būti geras tolesnio klinikinio vystymosi tikslas. [80] Aurora B inhibitoriai, kurie taip pat yra klinikinėje formoje, sukelia nenormalų kinetochorą prie mikrovamzdelių prisijungimo ir taip pat panaikina mitozinį kontrolinį tašką. [78] Survivin taip pat yra patrauklus molekulinis taikinys klinikiniam terapiniam vystymuisi, nes jis veikia kaip pagrindinis mazgas daugelyje būdų, vienas iš kurių yra veleno formavimas ir kontrolinių taškų kontrolė. [81] Dar kiti metodai apėmė mitozinių motorinių baltymų, tokių kaip KSP, slopinimą. Šie inhibitoriai, kurie neseniai buvo pradėti klinikiniuose tyrimuose, sukelia mitozinį sustojimą ir, įtraukdami veleno surinkimo kontrolinį tašką, ir sukelia apoptozę. [82] [3]


Baltymų skirstymas – Biologija

Ląstelių dalijimasis yra griežtai reguliuojamas daugialąsčiuose organizmuose, kad būtų išvengta nekontroliuojamo ląstelių dauginimosi. Dauguma eukariotų ląstelių dalijasi tik esant mitogenams. Mitogenai skatina ląsteles patekti į pradžią G1, o tai yra taškas, kuriame ląstelės yra įsipareigojusios dalytis. Biochemiškai „Start“ yra pažymėtas G1/S ciklin-CDK ir S ciklin-CDK, kurie inicijuoja DNR replikaciją, aktyvavimu. G1 ciklinai (ciklinas D) reguliuoja patekimą į Startą, įjungdami G1/S ir S ciklinų ekspresiją ir pašalindami bei slopinančius baltymus iš G1/S ciklino-CDK kompleksų. DNR pažeidimas taip pat slopina ląstelių ciklą, slopindamas G1/S-CDK kompleksų aktyvaciją.

Santrauka

  • Įsipareigojimas dalytis ląstelėmis įvyksta pradžioje, kai suaktyvinamas G1/S ciklin-CDK.
  • G1/S ciklinų ekspresiją reguliuoja E2F baltymai kartu su pRB baltymais.
  • Mitogenai skatino ląstelių dalijimąsi padidindami G1 ciklinų kiekį.
  • G1 ciklinas-CDK sukelia aktyvų G1/S ciklin-CDK, padidindamas G1/S ciklino transkripciją ir pašalindamas G1/S ciklino-CDK inhibitorių.
  • DNR pažeidimas sukelia P53 aktyvavimą, kuris padidina baltymų, slopinančių G1/S cikliną-CDK, kiekį.

Įvadas

Pradžia reiškia G1 tašką, po kurio ląstelės pasiskirsto. Todėl ląstelės intensyviai reguliuoja progresavimą po pradžios. Vienaląsteliuose organizmuose, tokiuose kaip mielės, patekimas į Start paprastai yra susijęs su maistinių medžiagų prieinamumu. Gyvūnams, kur maistinių medžiagų paprastai yra daug, Start reguliuoja ekstraląsteliniai signalai, vadinami mitogenais, ir DNR pažeidimo nebuvimas. Pradžia žymima G1/S ciklin-CDK aktyvavimu. G1/S ciklinų ekspresija padidinama prieš pradedant ir pašalinami baltymai, slopinantys G1/S ciklin-CDK aktyvaciją.

G1/S ciklinų transkripcijos reguliavimas

E2F baltymų šeima reguliuoja G1/S ciklinų ekspresiją. Šeimoje yra baltymų, kurie aktyvina G1/S ciklinų transkripciją (E2F1, E2F2, E2F3), ir baltymų, kurie slopina G1/S ciklinų transkripciją (E2F4, E2F5). Ar G1/S ciklino aktyvatoriai ar inhibitoriai yra aktyvūs, priklauso nuo pRB baltymų šeimos. pRB baltymai prisijungia prie E2F baltymų ir kontroliuoja jų aktyvumą. pRB jungiasi ir slopina transkripcijos aktyvatorių (E2F1, E2F2, E2F3) aktyvumą, o kiti pRB šeimos nariai, P107 ir p130, veikia kaip korepresoriai su E2F4 ir E2F5. Todėl, kai ekspresuojami pRB baltymai, pavyzdžiui, G0, G1 / S ciklinų transkripcija yra slopinama. Svarbu tai, kad ląstelės, kurioms trūksta pRB baltymų aktyvumo, dažnai nesugeba išeiti iš ląstelių ciklo ir nekontroliuojamai daugintis. Daugelyje žmogaus vėžio atvejų yra mutacijų pRB genuose.

Kaip mitogenai skatina ląstelių ciklą

Nesant mitogenų, dauguma ląstelių egzistuoja G0 dėl pRB baltymų, trukdančių G1/S ciklinų ekspresijai. Mitogenai sukelia pRB baltymų fosforilinimą, kuris atskiria juos nuo E2F baltymų. Kai E2F4 ir E2F5 nėra susieti su p107 ir p130, jie yra daug mažiau veiksmingi transkripcijos inaktyvatoriai. Kai E2F1-3 nėra prijungtas prie pRB, jie tampa įgudusiais G1/S ciklino transkripcijos aktyvatoriais. pRB baltymai yra fosforilinami ciklinD-CDK4 ir ciklinD-CDK6 kompleksais. Ciklinas D yra G1 ciklinas ir jo ekspresija padidėja esant mitogenams.

Mitogenai ir G1 ciklinų ekspresija

Mitogenai veikia klasikiniu tirozino kinazės keliu. Mitogenų receptoriai tampa aktyvūs, kai prisijungia prie mitogenų, ir vienas kitą fosforilina citoplazmos domenuose. Fosforilinti domenai yra atpažįstami pagal guanino nukleotidų mainų faktorių, kuris padidina Ras-GTP kiekį. Ras-GTP aktyvuoja MAP kinazės kelią su galutiniais kinazę fosforilinančiais transkripcijos faktoriais, kurie įjungia ankstyvo atsako genų ekspresiją. Ankstyvojo atsako genai apima FOS ir MYC. Fos ir Myc baltymai sudaro atskirus kompleksus, kurie aktyvina G1 ciklinų (ciklino D) ekspresiją.

Cyclin D-CDK reguliavimas

Padidėjusios ciklino D ekspresijos nepakanka aktyviam ciklino D-CDK generavimui. Ink4 baltymai jungiasi prie ciklino D-CDK ir slopina jo aktyvumą. Ink4 ekspresija padidėja, kai yra transkripcijos baltymas Miz1. Miz1 lygis padidėja, kai ląstelės jungiasi su antimitogeniniais veiksniais, tokiais kaip TGFβ-1. Esant mitogenams, Myc inaktyvuoja Miz1, sumažindamas Ink4 baltymų ekspresiją. Kai Ink4 lygis mažėja, aktyvaus ciklino D-CDK kiekis didėja. Ink4 svarbą reguliuojant ląstelių ciklą pabrėžia išvados, kad daugelyje vėžio atvejų yra INK4 genų mutacijų, įskaitant 80% kasos vėžio atvejų.

Antrasis mechanizmas, reguliuojantis ciklino D-CDK aktyvumą, yra baltymų lokalizacija. Kadangi dauguma ciklino D-CDK taikinių yra branduolyje, ląstelės gali slopinti ciklino D-CDK poveikį, apribodamos jį citoplazmoje. Glikogeno sintazės kinazė fosforilina ciklino D-CDK ir neleidžia jam patekti į branduolį.Mitogenai, veikiantys tirozinkinazės keliu (skiriasi nuo aukščiau aprašyto MAP kinazės kelio), slopina glikogeno sintazės kinazės aktyvumą, leisdami ciklinui D-CDK patekti į branduolį ir fosforilinti savo tikslinius baltymus.

CDK slopinantys baltymai

Kaip minėta, ciklinas D-CDK padidina G1/S ciklin-CDK aktyvumą, padidindamas ciklino E transkripciją, tačiau ciklinas D-CDK taip pat aktyvina ciklino E-CDK kitu mechanizmu. Ciklinas E-CDK yra surištas baltymų, P27 ir P21, kurie slopina jų aktyvumą. Cyclin D-CDK konkuruoja su ciklinu E-CDK dėl P27 ir P21. Įdomu tai, kad nors P27 ir P21 slopina ciklino E-CDK aktyvumą, jie padidina ciklino D-CDK aktyvumą. Didėjant ciklino D-CDK koncentracijai, iš ciklino E-CDK pašalinama daugiau P27 ir P21, todėl padidėja ciklino E-CDK aktyvumas. Panašiai kaip INK4, daugelyje vėžio atvejų yra mutacijų genuose, koduojančiuose P27 ir P21. Galiausiai aktyvaus ciklino D-CDK kiekis pakyla iki tokio lygio, kurio pakanka pagaminti pakankamai aktyvaus ciklino E-CDK, kad ląstelės būtų suaktyvintos, kad įeitų į Start ir pradėtų ląstelių dalijimosi procesą.

DNR pažeidimų kontrolės punktas

Vienas iš svarbiausių kontrolinių taškų ląstelių cikle yra DNR pažeidimas, nes nefiksuotas pažeidimas gali sukelti mutacijas DNR replikacijos metu, o tai gali sukelti ląstelių elgesio pokyčius. P53 yra vienas iš pagrindinių ląstelių atsako į DNR pažeidimus. P53 aktyvuoja baltymai, kurie randa ir stebi DNR pažeidimus, o P53, kaip transkripcijos aktyvatorius, įjungia ląstelių ciklą slopinančių genų ekspresiją (pvz., P27, P21). Kai kuriais atvejais P53 sukelia ląstelių apoptozę.

Nesant DNR pažeidimo, baltymas Mdm2 palaiko žemą P53 lygį. Mdm2 katalizuoja P53 ubikvitinaciją, pažymėdamas ją skilimui. Mdm2 taip pat suriša ir slopina transkripcijos aktyvinimo domeną P53. DNR pažeidimas suaktyvina kinazių rinkinį, kuris fosforilina Mdm2, todėl jis atsiskiria nuo P53. Išlaisvintas iš Mdm2, P53 nebėra skirtas skaidymui ir jo koncentracija didėja. Be to, yra atskleistas jo transkripcijos aktyvinimo domenas.

Ląstelės taip pat reguliuoja P53 aktyvumą per baltymų lokalizaciją. Nesant DNR pažeidimo, P53 yra monomeras. Monomerine forma P53 atskleidžia branduolinio eksporto seką. Dėl to bet koks P53, patenkantis į branduolį, greitai eksportuojamas. Kadangi P53 veikia kaip transkripcijos aktyvatorius, jis yra impotentas citoplazmoje. DNR pažeidimas sukelia P53 konformacijos pokyčius, dėl kurių jis susijungia į tetramerą. Tetramerinėje formoje branduolio eksporto seka yra paslėpta, todėl į branduolį patenkantis P53 nėra eksportuojamas.

Be P53 aktyvavimo, DNR pažeidimas taip pat slopina ląstelių ciklą, inaktyvuodamas Cdc25. Cdc25 yra fosfatazė, kuri pašalina slopinančią fosfatų grupę ATP surišančioje CDK kišenėje. Manoma, kad Cdc25 aktyvinimas yra trigeris, kuris aktyvuoja cikliną-CDK, pradedant kitą ląstelių ciklo fazę. Kinazės, suaktyvintos DNR, pažeidžia fosforilinimą Cdc25, nukreiptą į Cdc25, kad būtų pasiekta ubikvitinacija ir skilimas.

Ląstelių augimo reguliavimas

Ląstelių augimo greitį daugiausia lemia baltymų sintezės greitis, nes baltymai sudaro didžiąją ląstelės dalį. Baltymų sintezės greitį kontroliuoja ribosomų arba ribosomų sintezės greitis ir vertimo pradžios greitis. TOR laikomas pagrindiniu ląstelių augimo greičio reguliatoriumi, nes padidina ribosomų gamybos greitį, padidindamas ribosomų baltymų ir RNR ekspresiją, ir padidina transliacijos inicijavimo greitį, sumažindamas inicijavimo slopinimą.

Augimo faktoriai (skirtingi nei mitogenai) skatina TOR veiklą. Į insuliną panašus augimo faktorius (IGF) yra vienas geriausiai suprantamų augimo faktorių ir aktyvuoja TOR tirozinkinazės keliu. IGF receptorius aktyvuoja fosfatidilinozitolio kinazę, kuri sukuria fosfatidilinozitolio 3-fosfato (PIP3) lopą vidiniame plazminės membranos lapelyje. PIP3 įdarbina ir aktyvina kinazes, kurios slopina Rheb GTPazę aktyvinantį baltymą (GAP). Didėjant Rheb-GTP lygiui, jis aktyvuoja TOR, todėl padidėja baltymų sintezė.

Ląstelių augimo ir dalijimosi koordinavimas

Daugelyje vienaląsčių organizmų ląstelių augimas ir ląstelių dalijimasis yra koordinuojami, kai ląstelės dalijasi pasiekusios tam tikrą dydį. Ryšys tarp ląstelių augimo ir dalijimosi žinduolių ląstelėse yra sudėtingesnis, nes atrodo, kad ląstelių augimas reguliuoja kai kurių ląstelių (fibroblastų) ląstelių dalijimąsi, tačiau atrodo, kad neturi įtakos kitoms ląstelėms (raumenims, neuronams). Maži fibroblastai G1 išlieka ilgiau nei dideli fibroblastai, o tai rodo, kad prieš dalijant jie turi pasiekti minimalų dydį. Priešingai, raumenų ląstelės gali išaugti iki labai didelių dydžių be ląstelių dalijimosi.

Atrodo, ar ląstelių augimas ir dalijimasis yra suderinti, priklauso nuo mitogeno ir augimo faktoriaus signalizacijos kelių. Kai kuriose ląstelėse mitogenai arba augimo faktoriai suaktyvina ir ląstelių augimą, ir ląstelių dalijimąsi, o tai rodo, kad tarp augimo faktoriaus ir mitogeno signalizacijos kelių yra skersinis pokalbis. Kitose ląstelėse augimo faktoriaus ir mitogeno signalizacijos keliai, atrodo, veikia nepriklausomai, nes augimo faktoriai neskatina ląstelių dalijimosi, o mitogenai - ląstelių augimo.


Ląstelių dalijimosi priežastys arba inicijavimas

Ląstelių dalijimasis yra naujų & lsquodaughter & rsquo ląstelių sukūrimas iš vienos & lsquoparent & rsquo ląstelės. Tam tikru jų gyvavimo ciklo momentu visos ląstelės pasiskirstys ir naujos ląstelės gali būti lygiai tokios pačios kaip pradinė ląstelė arba dalintis puse tos pačios medžiagos. Kai kurios ląstelės dalijasi tik vieną kartą savo gyvenimo cikle, o kitos - nuolat. Yra keletas priežasčių, dėl kurių kūno ląstelės dalijasi arba kopijuoja save: ląstelės nesibaigia ir ilgainiui nusidėvi, taisydamos pažeistus audinius, ir todėl, kad augant organizmui reikia naujų ląstelių. Nors tai paaiškina priežastį, kodėl reikalingas ląstelių dalijimasis, kaip tiksliai yra pradėtas dalijimasis arba kas tai?

Ląstelių dalijimasis vyksta ne tik atsitiktinai. Ląstelė skirstysis pagal savo aplinkos sąlygas ir dėl savo genetinio kodo. Ląstelės gauna ekstraląstelinius cheminius signalus iš kūno arba iš kitų ląstelių, dėl kurių jos pradės dalintis, beveik kaip grandininė reakcija. Prieš gaunant šiuos signalus, ląstelių ciklo etapas, kuriame vyksta dalijimasis, yra užblokuotas. Šie cheminiai signalai vadinami mitogenais ir yra daugiau nei vienas tipas.

Ląstelės pirmiausia yra dalijamos dėl augimo faktorių. Ląstelės membranos paviršius turi skirtingas šių specifinių reguliuojančių baltymų receptorių sritis. Kai receptoriaus sritis yra užpildyta baltymu (augimo faktoriai), jis sukelia signalą, kuris aktyvuoja baltymus ląstelėje ir pradeda ląstelių dalijimosi procesą. Yra apie penkiasdešimt skirtingų šio tipo baltymų, kurie paskatins daug skirtingų tipų ląstelių dalijimąsi organizme.

Kitos ląstelės taip pat gali išskirti cheminius junginius, dėl kurių netoliese esančios ląstelės pradės dalintis. To pavyzdys yra citokinai - molekulės, kurios gali būti gaminamos tam tikrose nervų ir imuninės sistemos ląstelėse. Jie yra tik vienas pavyzdys signalinių molekulių, kurias ląstelės naudoja tarpląsteliniam ryšiui, kategorijoje.

Tyrimų, atliktų su vištienos ląstelėmis, metu nustatyta, kad medžiaga trombinas skatina ląstelių dalijimąsi. Ši cheminė medžiaga dalyvauja įvairiuose organizmo procesuose ir gali pradėti ląstelių dalijimąsi, kai ji liečiasi su ląstelės membrana, panaši į du minėtus mitogenus.

Ląstelės dalijasi dėl skirtingų priežasčių, tačiau tiksli dalijimosi priežastis yra cheminių junginių ir baltymų bei molekulių buvimas tarpląsteliniame skystyje. Šios medžiagos liečiasi su ląstelės membrana ir skatina ląstelę pradėti dalytis. Juos gamina kita kūno dalis arba aplinkinės ląstelės. Galutinis rezultatas yra tas, kad atviros ląstelės pradės tą ląstelių ciklo dalį, kuri leidžia joms padalyti ir sukurti & lsquodaughter & rsquo ląsteles.


2 dalis: Dyneino judrumo mechanizmas

00: 00: 15.09 Sveiki.
00:00:16.17 Aš esu Ronas Vale'as iš UCSF.
00: 00: 18.24 Pirmoje mano „iBiology“ pokalbio dalyje
00:00:20.20 Pristačiau biologinį judrumą
00: 00: 23.14 ir aš sutelkiau dėmesį į mechanizmus
00:00:25.05 kinezino ir miozino,
00: 00: 26.13 ir šioje kalboje
00:00:27.25 Norėčiau padiskutuoti
00:00:29.08 mūsų naujausias tyrimas
00: 00: 30.26 apie dyneino judrumo mechanizmą.
00: 00: 33.29 Dabar, šiais metais, 2015 m.
00: 00: 37.18 yra pirmasis jubiliejus
00:00:39.12 nuo dyneino atradimo,
00: 00: 40.29, kurį sukūrė Ianas Gibbonsas,
00:00:43.12 ir Ianas aprašė
00: 00: 45.11 naujo tipo ATPazė
00: 00: 47.13 nuo blakstienų
00:00:49.07 kuris dalyvavo kuriant jo judrumą.
00:00:53.13 Dabar, nors dyneinas buvo atrastas
00: 00: 55.21 dvidešimt metų prieš kinesiną,
00:00:57.25 mes žinome daug daugiau apie kinezinų judrumą
00: 01: 00.22, nei mes kalbame apie tai, kaip veikia dyneinas.
00:01:03.16 Ir to priežastis yra ta
00:01:06.13 dynein yra neįtikėtinai sudėtinga mašina.
00: 01: 08.23 Visų pirma,
00: 01: 10.15 tai didžiulis baltymų kompleksas,
00: 01: 11.29 viena didžiausių kameroje.
00: 01: 14.11 Tai yra apie pusantro megaDaltono
00: 01: 16.22 dydžio.
00:01:17.28 Netgi genas, kuris koduoja
00: 01: 20.18 variklio polipeptidas
00: 01: 22.20 yra labai didelis.
00: 01: 24.25 Variklio polipeptidas
00:01:26.01 yra maždaug 500 kilodaltonų dydžio,
00:01:29.02 taigi tai vienas didžiausių polipeptidų
00: 01: 30.18 genome.
00: 01: 32.03 Net pati variklio sritis
00: 01: 34.12 yra masyvi, parodyta čia.
00:01:36.16 Jis yra maždaug aštuonis kartus didesnis
00: 01: 38.13 nei kinezino variklio sritis.
00:01:40.20 Taip tiesiog dėl šio variklio
00: 01: 42.08 buvo toks didelis ir sudėtingas,
00: 01: 44.14 tai apsunkino mokymąsi.
00: 01: 46.15 Sunku tai išreikšti
00:01:48.29 ir gauti grynų baltymų,
00:01:51.07 sunku juo manipuliuoti
00: 01: 53.10 naudojant rekombinantinių baltymų metodus,
00: 01: 56.01 ir taip pat ne trivialus, kad gautumėte struktūrą
00: 01: 59.05 pagal rentgeno kristalografiją.
00:02:01.01 Taigi visa tai sukėlė iššūkių.
00:02:04.18 Ir 2007 m
00:02:06.17 Aš iš tikrųjų pasakiau iBiologijos kalbą,
00: 02: 08.25, kurį rasite archyvuose,
00:02:11.02 ir tuo momentu
00: 02: 12.26 mes visų pirma mokėmės
00:02:15.02 vienos molekulės mielių dyneino judrumas,
00: 02: 18.25, bet žinojome labai mažai
00:02:20.25 apie dyneino struktūrą
00: 02: 22.18 bet kokiomis didelėmis detalėmis.
00: 02: 24.28 Na, daug kas pasikeitė
00: 02: 26.19 tais tarpiniais metais
00: 02: 29.06 ir šiandien norėčiau pasidalinti su jumis
00: 02: 31.21 neseniai padaryta pažanga
00: 02: 33.28 apie dyneino struktūrą,
00: 02: 36.19 ir dabar mes turime dyneino atomines struktūras
00: 02: 38.25 ir mes pradedame
00: 02: 40.15 šiek tiek supranti, kaip veikia šis variklis.
00: 02: 44.09 Taigi pirmiausia
00: 02: 45.14 leiskite man papasakoti jums apie įvairių rūšių dyneinus.
00:02:48.17 Pagrindinė dyneino klasė
00:02:50.12 yra aksoneminiai dyneinai.
00:02:52.07 Tai galios dyneinai
00:02:54.04 blakstienų judėjimas,
00: 02: 56.04 jie taip pat skatina judėjimą
00: 02: 58.21 spygliuočių skiautelių, pvz.
00:03:01.16 ir tai tik parodo, kokia architektūra
00:03:03.17 aksonemos atrodo.
00: 03: 05.27 Jį sudaro
00: 03: 09.14 devyni neįprasti mikrotubulų tipai
00:03:11.13 kurie vadinami išoriniais dvigubais mikrovamzdeliais,
00:03:15.04 ir jie turi tokią konkrečią struktūrą.
00:03:18.16 Ir ant šių išorinių dvigubų mikrotubulių
00:03:21.20 sėdi dyneino molekulė.
00:03:23.03 Tiesą sakant, yra dvi skirtingos dyneinų rūšys
00: 03: 25.03 - yra išorinė rankos dynein
00: 03: 26.08 ir vidinės rankos dyneinas -
00:03:28.07 ir jie sėdi nejudėdami
00: 03: 31.02 ant vieno iš išorinių dublių,
00: 03: 33.16 A vamzdelis,
00:03:35.23 ir tada jie pasiekia skersą
00: 03: 37.03 į kaimyninį B kanalėlį
00:03:39.15 ir jie sukelia santykinį slydimą
00: 03: 41.21 tarp šių gretimų mikrotubulių.
00:03:44.20 Dabar šis slankusis judesys
00: 03: 46.11 iš dviejų mikrotubulių
00:03:49.01 blakstienose
00: 03: 50.27 virsta šiuo sinusiniu
00: 03: 52.27 mušimo modelis
00:03:54.14 procesu, kuris vis dar yra
00: 03: 56.10 labai prastai suprantamas.
00: 03: 59.00 Dabar, be šių aksoneminių dyneinų,
00:04:01.12 yra citoplazminių dyneinų
00: 04: 02.27, kurie yra labiau krovinius gabenantys varikliai.
00:04:06.15 Taigi, vienas iš šių
00:04:07.28 yra citoplazminis dyneinas 2
00: 04: 09.11 ir ji atsakinga
00:04:10.21 tam tikros rūšies krovinių gabenimui
00:04:12.24 kuris iš tikrųjų atsiranda blakstienų ir žvynelių viduje,
00: 04: 16.15 ir jis yra atsakingas už transportavimą,
00:04:19.01 pirmiausia statybiniai blokai
00: 04: 21.00 aukštyn ir žemyn
00:04:23.10 už blakstienų ir žvynelių priežiūrą,
00: 04: 24.23 ir kai kurių rūšių signalinės molekulės
00: 04: 26.20 taip pat yra blakstienose,
00: 04: 29.05 ir jie parduodami
00:04:31.27 taip pat motoriniais baltymais.
00: 04: 34.09 Tai rodo, ką
00: 04: 36.13 atrodo kaip
00: 04: 38.29 kaip atrodo intraplagellar transportas,
00: 04: 40.13 fluorescenciniu žymėjimu
00:04:42.06 vienas iš šių krovinių padalinių.
00: 04: 43.29 Dabar kinezino variklis
00: 04: 46.15 gabena krovinį iki galo,
00: 04: 48.17 iki pliuso pabaigos,
00:04:50.00 bet dyneinai yra atėmus galutinį variklį,
00: 04: 51.19 ir taip dyneinas
00:04:55.08 gabena krovinius priešinga kryptimi,
00: 04: 56.24 nuo galiuko link ląstelės kūno.
00: 04: 59.02 Dabar taip pat yra citoplazminis dyneinas 1,
00:05:01.24 ir tai atsakinga
00: 05: 03.09 beveik visiems kroviniams vežti
00:05:05.00, kuris atsiranda ląstelių citoplazmoje
00:05:08.06 link minuso pabaigos.
00:05:10.01 Taigi kinezinai,
00:05:11.23 kaip prisimenate iš pirmosios paskaitos,
00: 05: 13.03 perkelkite dalykus į pliusą,
00:05:14.22 ir šis vienas citoplazminio dyneino tipas
00: 05: 16.08 vykdo
00: 05: 17.28 praktiškai visas transportas priešinga kryptimi,
00:05:20.18 link minuso pabaigos.
00: 05: 21.27 Taigi, gabenami daiktai
00: 05: 23.12 apima membranas,
00:05:24.29 mRNR,
00:05:26.14 transportuojami baltymų kompleksai,
00: 05: 28.02 kaip ir virusai.
00: 05: 29.16 Čia yra tik vienas pavyzdys,
00: 05: 32.08 kuri yra melanocitų ląstelė.
00: 05: 33.27 Tai yra odos ląstelė
00:05:35.21, kuriame yra pigmentų
00: 05: 37.25 kurios yra melanosomos,
00: 05: 39.27 ir kai kuriuose organizmuose
00:05:41.22 kaip varliagyviai ir žuvys
00: 05: 43.23 jie gali pakeisti paskirstymą
00:05:45.07 jų melanosomų,
00: 05: 47.14 kad jie būtų paskirstyti į išorę
00: 05: 50.11 odos spalva tamsi,
00:05:52.18 kai jie perkeliami į vidų
00: 05: 54.07 odos spalva tampa šviesesnė,
00: 05: 55.14 ir šis transportas
00: 05: 57.11 link centro
00: 05: 58.20 ką matai čia
00: 05: 59.27 yra varomas citoplazminio dyneino.
00: 06: 02.12 Dabar, pirmoje „iBiology“ diskusijoje,
00: 06: 04.29 Aš tau sakiau, kad miozinas ir kinezinas iš tikrųjų
00:06:08.17 yra santykinai panašūs vienas į kitą.
00: 06: 11.12 Jų struktūra panaši
00:06:12.27 ir jie aiškiai išsivystė,
00:06:14.11 kurį laiką evoliucijoje,
00: 06: 16.11 iš bendro protėvio.
00: 06: 18.28 Bet nors kinezinas ir dyneinas
00: 06: 22.02 abu veikia mikrotubuliuose,
00: 06: 24.05 jie visai nesusiję vienas su kitu.
00: 06: 26.03 Tiesą sakant, dyneinai
00: 06: 27.27 atsirado visiškai
00:06:29.29 skirtingos evoliucinės ATPazių linijos
00: 06: 32.18 ir jie priklauso ATPazių grupei
00:06:34.26 kurios vadinamos AAA ATPazėmis.
00:06:38.15 Ir iš tikrųjų dyneinas
00: 06: 40.11 yra gana neįprastas narys
00:06:41.27 šios AAA ATPazės šeimos.
00: 06: 44.01 Dauguma jų nėra tradiciniai varikliai
00: 06: 46.00
00: 06: 47.16 judėti takeliu.
00: 06: 49.05 Vietoj to jie naudoja ATP energiją
00:06:51.24 gaminti mechaninius darbus
00: 06: 54.03 ant molekulių, tokių kaip baltymai
00:06:56.00 iš esmės juos suskaidyti
00:06:57.27 ir juos išskleiskite.
00: 06: 59.13 Taigi, pavyzdys
00: 07: 01.16, kuris vyksta bakterinės ir eukariotinės proteolizės metu
00: 07: 06.05 yra tai, kad yra AAA ATPazės
00:07:09.07 kurie sėdi viršuje
00: 07: 11.07 proteolitinės kameros
00:07:12.15 ir jų darbas yra paimti gaunamą polipeptidą
00: 07: 15.19 ir iš esmės jį išnarplioti
00: 07: 17.10 ir įkiškite ją per šią skylę
00:07:19.24 į proteolitinę kamerą
00: 07: 21.28, kad polipeptidas būtų skaidomas.
00: 07: 25.20 Taigi leiskite man jums pasakyti
00:07:27.04 yra keletas dalykų
00: 07: 29.00 universalesnis
00: 07: 30.13 apie šias AAA ATPazes.
00: 07: 32.12 Visų pirma, dauguma AAA ATFazių
00:07:36.16 koduoja santykinai mažą baltymą
00: 07: 39.06, turintis du domenus,
00: 07: 40.13 didelis domenas ir mažas domenas.
00:07:43.11 Tai yra pagrindinis ATP surišimo vienetas,
00:07:46.12 bet šis vienintelis subvienetas
00:07:47.25 nėra funkcinis elementas
00: 07: 49.17 kaip veikia šie baltymai.
00:07:51.22 Jie patys susirenka,
00: 07: 53.23 oligomerizuojasi į heksamerą,
00: 07: 55.10 ir šis heksameras yra aktyvus agentas.
00:07:59.06 Ir iš tikrųjų
00: 08: 01.10 gretimi subvienetai padeda vieni kitiems
00:08:03.01 hidrolizuoti ATP,
00:08:05.02, o paskutiniame pavyzdyje – žiedinė struktūra
00: 08: 08.09 yra tai, kas iš tikrųjų išskleidžia polipeptidą
00:08:11.14 ir užpildo polipeptidą
00: 08: 13.19 į šią kamerą, kurią matote čia.
00: 08: 15.27 Dabar vėl dyneinas
00:08:17.11 yra neįprastas faktas
00: 08: 19.06
00: 08: 21.15 AAA ATPazių žiedas,
00:08:24.05 bet tai daro įdėjus
00: 08: 26.11 visi AAA domenai
00: 08: 28.01 viename labai, labai ilgai
00: 08: 29.29 polipeptidinė grandinė.
00: 08: 31.22 Ir tai tik parodo variklio srities struktūrą
00:08:35.06 dyneino
00:08:36.26 ir rodo pozicijas
00: 08: 38.18 iš šešių AAA domenų.
00: 08: 41.05 Ir kadangi jie yra viename polipeptide,
00:08:44.15 kiekvienas iš jų sukūrė skirtingas aminorūgščių sekas
00: 08: 46.26 laikui bėgant
00:08:48.10 ir sukūrė skirtingas funkcijas.
00: 08: 50.00 Taigi, pavyzdžiui, AAA1,
00: 08: 53.05 yra pagrindinė dyneino ATPazės vieta,
00:08:55.22 taigi tai yra tikrai atsakinga
00:08:57.20 vairavimo judrumui, kaip parodysiu vėliau.
00: 09: 00.08 AAA2 suriša ATP,
00: 09: 02.09, bet neatrodo.
00: 09: 05.14 suriškite jį cikliniu arba hidrolitiniu būdu.
00: 09: 08.18 AAA3 taip pat vaidina svarbų vaidmenį
00: 09: 10.22 prie kurio grįšiu vėliau
00:09:12.08 ir tai gali būti mechanizmas
00: 09: 13.26 reguliuojančio dyneino.
00:09:15.14 AAA4 taip pat hidrolizuoja [ATP],
00: 09: 18.03, bet atrodo, kad jis vaidina labai menką vaidmenį
00: 09: 20.23 esant dyneino judrumui
00:09:22.06 ir tas, kurio mes visiškai nesuprantame.
00: 09: 25.07 Taigi, dabar norėčiau pakalbėti šia tema
00:09:27.05 apie tai, kaip dyneinas gali judėti išilgai mikrovamzdelių,
00:09:30.17 ir sprendžiant šią problemą
00: 09: 32.22 reikia su tuo susitvarkyti
00:09:34.24 naudojant įvairius metodus
00: 09: 36.19 kurie papildo vienas kitą.
00: 09: 38.04 Taigi, vienas būdas yra matuoti
00:09:40.09 dyneino judrumą,
00:09:41.20 ypač vienos molekulės lygiu,
00:09:43.24 ir tai suteikia jums įvairiausios informacijos
00:09:45.25 apie dyneino dinamiką
00: 09: 47.10 ir kaip tai vyksta mikrotubulų takeliu.
00:09:50.13 Tačiau tai palyginti mažos skyros informacija,
00: 09: 53.26, kitaip tariant, jis tikrai nemato
00:09:55.28 baltymų struktūrą
00:09:57.12 ir ką jis daro.
00: 09: 58.22 Kita vertus,
00:10:00.12 galime atlikti rentgeno kristalografiją
00: 10: 01.28 arba atlikite elektroninę mikroskopiją
00:10:04.27 ir jie suteikia didesnės skyros informaciją,
00: 10: 07.14 net iki atominių detalių,
00: 10: 09.08, bet jie yra statiniai vaizdai,
00: 10: 11.00, taigi, žinote,
00: 10: 12.18 matome, kad baltymai užšąla laiku
00:10:14.11 ir nepateikia informacijos
00:10:16.02 dėl dinamikos.
00:10:17.13 Taigi, kaip nors sujungti
00: 10: 19.21 atsakymas į šią problemą,
00:10:20.28 reikia naudoti informaciją iš abiejų šių metodų
00: 10: 23.03 ir pabandykite sukurti modelį
00:10:25.03 kaip gali veikti dynein.
00:10:28.05 Taigi, pirmiausia papasakosiu apie
00: 10: 30.04 in vitro judrumo tyrimai.
00:10:32.02 Tai rodo judrumo tyrimą in vitro
00:10:33.29 mielių citoplazminiam dyneinui,
00:10:35.26 kur pažymėjome dyneiną
00: 10: 37.14 su fluoroforu,
00:10:38.29 ir matai
00:10:40.13 šios atskiros dyneino molekulės
00: 10: 41.29 gražiai juda
00: 10: 43.19 išilgai šių mikrotubulų takelių.
00:10:45.02 Tai proceso judėjimas,
00: 10: 46.29, tai reiškia, kad dyneinas gali žengti daugybę žingsnių
00:10:48.23 palei mikrotubulų takelį
00:10:50.00 nepaleisdamas.
00: 10: 53.03 Dabar mes taip pat galime
00: 10: 56.05 išmatuokite šį judrumą
00:10:57.14 didesniu tikslumu
00:10:59.09 jei naudosime skaičiavimo metodą.
00: 11: 02.01 Iš esmės kiekviena iš šių atskirų vietų,
00: 11: 05.15 fluorescencinės dyneino dėmės, kurias matote.
00: 11: 08.24, kai jie praeina pro mikroskopą,
00: 11: 10.25 šviesa skleidžiasi
00:11:13.28 į tai, kas žinoma kaip taško sklaidos funkcija,
00: 11: 16.12 todėl jie pasirodo.
00: 11: 18.12 šie pavieniai fluoroforai
00:11:20.22 skersmuo
00:11:22.05 apie 250 nanometrų.
00: 11: 24.08 Bet jei surinksite pakankamai fotonų,
00: 11: 26.21 galite apibūdinti tą fluorescenciją,
00:11:28.29 kurie išskleidžia fluorescencijos intensyvumo profilį,
00: 11: 33.22 ir jūs galite pritaikyti tą intensyvumo profilį
00: 11: 35.22 su Gauso kreive,
00:11:37.20 ir tos Gauso kreivės centras
00: 11: 39.14 apibrėžia vidurio tašką
00: 11: 41.08 toje fluorescencinės dėmės vietoje.
00: 11: 44.15 Dabar galite sekti iš eilės
00:11:46.29 dyneino, judančio mikrovamzdeliu, momentinės nuotraukos
00:11:49.18 ir kiekvienoje momentinėje nuotraukoje
00:11:51.10 galite pažymėti to centroido padėtį,
00:11:54.19 ir tai yra visi šie atskiri taškai
00: 11: 58.01 yra čia, duomenų taškai yra
00:11:59.16 ir tai skirta kinezino molekulei,
00: 12: 01.16, bet galite pamatyti, pavyzdžiui, čia
00:12:03.19 motorinis baltymas
00: 12: 05.05 trasoje beveik nejudėjo
00: 12: 07.07 ir tada jis šoktelėjo į priekį,
00:12:09.26 todėl žengė staigų žingsnį į priekį
00: 12: 12.25 palei mikrotubulų takelį,
00:12:14.21 ir toks mechanizmas
00: 12: 16.04 leidžia jums gauti
00: 12: 18.20 daug informacijos
00:12:20.10 dėl variklio žingsniavimo
00:12:22.06 ant mikrotubulo.
00: 12: 24.08 Ir turėčiau pasakyti, kad šis bendras metodas
00:12:25.24 pirmą kartą buvo sukurtas
00: 12: 27.28 pateikė Ahmetas Yildizas ir Paulius Selvinas.
00:12:31.22 Taigi, pirmiausia leiskite jums apibūdinti
00: 12: 33.28 kaip kinesinas žingsniuoja takeliu
00: 12: 36.18 palyginimui su dyneinu.
00: 12: 37.25 Taigi, kinesinas visada vaikšto
00: 12: 39.16 tokiu būdu,
00:12:41.25 kur priekinė variklio sritis.
00: 12: 44.24 šios dvi variklio sritys yra identiškos.
00:12:46.24 bet priekinė dalis patiria konformacinius pokyčius
00: 12: 49.18 ir tai sukelia poslinkį
00: 12: 52.10 partnerio galvos
00: 12: 54.02 iš galinės į priekinę.
00: 12: 58.00 Ir štai kaip kinesinas
00: 12: 59.21 pėsčiomis ilgus atstumus
00:13:01.12 tokiu labai reguliariu perdavimo būdu
00:13:06.16 kur jis išeina iš vieno tubulino subvieneto
00: 13: 08.18 į kitą.
00: 13: 09.26 Ir jūs netgi galite tai pamatyti
00:13:11.15 jei pažymėsime dvi galvas
00:13:14.22 su dviem skirtingais fluorescenciniais dažais.
00: 13: 17.10 Taigi, pažymėjome dvi galvas
00: 13: 19.06 raudona spalva ir mėlyna spalva
00:13:21.19 ir dabar mes planuojame
00:13:23.28 šių galvų padėtis
00: 13: 25.07 jiems einant,
00: 13: 26.28 ir čia galite pamatyti, pavyzdžiui,
00: 13: 28.26 šiame kadre čia,
00: 13: 30.24 raudona galva yra prieš mėlyną galvą,
00:13:33.00 kaip ši diagrama,
00:13:35.03 bet tada mėlyna galva
00: 13: 36.28 šuoliai pro raudoną galvą
00:13:38.29 ir dabar raudona galva
00:13:41.04 lekia pro mėlyną galvą,
00:13:42.29 ir tt ir tt
00:13:44.17 ir jūs galite pamatyti, kaip šios dvi galvos
00: 13: 46.07 keičiasi pozicija
00: 13: 47.29 reguliariai, pakaitomis.
00:13:50.21 Dabar dynein žingsniuoja
00: 13: 52.10 atrodo ne taip,
00: 13: 54.26, taigi panašus eksperimentas
00:13:57.16 pažymėti dvi dynein galvutes
00: 13: 59.09 su dviem skirtingomis dažų spalvomis
00:14:02.08 atliko Ahmetas Yildizas
00:14:04.11 ir Samas Reckas-Petersonas.
00:14:05.23 Ahmetas ir Samas buvo podoktoriai laboratorijoje,
00: 14: 08.03, bet darbas, kurį jums čia parodau
00: 14: 09.18 buvo atlikta jų nepriklausomose laboratorijose
00: 14: 14.11 Berklyje ir Harvarde.
00: 14: 16.17 Taigi, ką galite pamatyti čia
00:14:18.09 yra, jei pažvelgsime į padėtį
00: 14: 20.02 mėlynos galvos, čia,
00: 14: 22.10 1 žingsnyje,
00: 14: 24.11 tai žengtas didelis žingsnis į priekį,
00: 14: 27.17, bet 2 žingsnyje
00:14:29.27 vietoj to, kad partneris žengtų žingsnį,
00: 14: 32.04 ta pati galva dabar
00:14:34.04 žengė dar vieną žingsnį
00: 14: 35.19 palei mikrotubulą.
00: 14: 37.06 Tai yra 2 žingsnis.
00:14:39.08 Ir dabar, pagaliau,
00: 14: 40.20 galinė galva, 3 žingsniu,
00:14:42.23 pradeda pasivyti,
00: 14: 44.11, bet nepraeina mėlynos galvos.
00: 14: 45.26 Ir dabar 4 žingsnyje
00: 14: 47.16 mėlyna galva
00:14:49.02 vis tiek žengia dar vieną žingsnį į priekį.
00:14:51.05 Taigi, ką galite pamatyti iš to
00: 14: 52.26 yra tas dyneinas
00:14:54.23 rodo sliekų modelį,
00:14:57.04 kur dvi galvos
00: 14: 59.01 gali išlaikyti priekinę ir galinę padėtį
00: 15: 01.25 ir abu žengia į priekį kartu.
00: 15: 04.08 Ir antra
00: 15: 06.19 dvi galvos nebūtinai yra
00: 15: 08.06 keisdamiesi vaidmenimis nustatydami žingsnių laiką.
Pavyzdžiui: 00: 15: 11.25
00: 15: 13.06 mėlyna galva žengė du žingsnius iš eilės
00:15:15.01 prieš raudongalvei žengiant žingsnį.
00:15:17.14 Taigi, tai tik labai
00:15:19.14 skirtingos rūšies judrumas,
00:15:20.27 nereguliarus judrumas
00:15:22.21 to kinezine nėra.
00:15:24.22 Be to, dyneinas gali paimti
00: 15: 27.03 taip pat labai skirtingo dydžio žingsniai,
00:15:29.06 taigi, pavyzdžiui, čia,
00: 15: 30.16 čia labai didelis dyneino žingsnis
00:15:32.17 toliau,
00:15:35.16 bet šie žingsniai čia mažesni,
00:15:37.10 taigi dyneino žingsnio dydis
00:15:39.06 nėra toks reguliarus kaip kinezinas.
00: 15: 41.17 Be to, jei pažvelgsite į šį pėdsaką,
00:15:43.17 yra daug kartų, kai dynein
00: 15: 45.17 iš tikrųjų žengia žingsnį atgal
00:15:47.25 prieš žengiant žingsnį į priekį,
00:15:49.14 ir šiuos žingsnius atgal
00: 15: 51.08 yra gana dažni dyneinui
00: 15: 52.27 ir labai retai pastebimas kinezinui,
00: 15: 55.11, ypač jei kinezinas
00: 15: 57.14 nebando dirbti prieš apkrovą.
00:15:59.29 Taigi, leiskite man tik peržiūrėti
00:16:01.14 dalykų, kuriuos ką tik tau pasakiau.
00: 16: 02.21 Kinesinas turi labai įprastą žingsnio dydį,
00: 16: 05.10 tai atstumas
00:16:06.21 tarp subvienetų mikrotubulų takelyje,
00: 16: 09.03 dynein labiau kintamas.
00:16:10.24 Kinesinas turi tokį žingsniavimą ranka.
00:16:14.28 Dyneinas taip pat gali tai parodyti,
00: 16: 16.02, bet taip pat eksponuojama
00:16:17.18 šis sliekų modelis.
00:16:20.00 Dvi kinesino galvos paeiliui juda
00: 16: 21.23 tai nebūtinai taikoma dyneinui.
00: 16: 25.03 Ir nors žingsniai atgal kinezinui yra reti,
00: 16: 27.22, kaip jums parodžiau, jie yra gana dažni
00:16:29.14 dyneino molekulei.
00:16:31.13 Taigi, dabar norėčiau tęsti
00: 16: 33.11 ir aptarkite:
00:16:34.17 Kaip tai dyneinas
00: 16: 36.12 iš tikrųjų gali atlikti šiuos veiksmus mikrotubulų takeliu?
00: 16: 38.20 Koks yra šio judėjimo struktūrinis pagrindas?
00:16:42.02 Na, pirmasis didelis proveržis
00: 16: 44.22 šioje problemoje
00: 16: 46.13 atėjo iš pionierių
00: 16: 48.03 elektronų mikroskopijos tyrimai
00: 16: 49.23, autorius Stan Burgess,
00: 16: 51.25 ir tai rodo vaizdus
00: 16: 53.14 kad jie gavo dyneino
00:16:55.04 dviejose skirtingose ​​nukleotidų būsenose,
00: 16: 56.19 ir iš šių EM (elektronų mikrografų)
00:16:58.10 galite matyti, pavyzdžiui,
00:16:59.23 šių AAA ATPazės domenų žiedas,
00: 17: 02.10, bet taip pat galite pamatyti keletą priedų.
00:17:04.17 Vienas yra ilgas kotelis
00:17:06.29 kuris išeina iš dyneino
00:17:08.11 kuris veda pačiame gale
00: 17: 09.28 prie jo mikrotubulų surišimo domeno,
00:17:12.00 ir yra dar vienas priedas
00: 17: 13.17, kurią galite pamatyti ir čia.
00: 17: 14.21 Tai jie vadino
00:17:16.11 nuoroda.
00:17:17.20 Tai kažkas, kas sėdi tarsi skersai žiedo
00: 17: 21.04 ir tada išsitraukia iš žiedo.
00: 17: 23.15 Ir ką jie pastebėjo
00: 17: 24.25 šiose dviejose skirtingose ​​nukleotidų konformacijose
00: 17: 27.13 yra ta jungiklio padėtis
00:17:29.27 žiedo ir kotelio atžvilgiu
00: 17: 33.05 gali keistis.
00:17:34.22 Taigi, čia jis sėdi.
00:17:37.02 jis kyla iš ringo
00: 17: 39.01 toli nuo kotelio
00: 17: 40.23 ir čia jie susilieja arti vienas kito.
00:17:43.04 Ir jie manė, kad šis nuorodos judesys
00: 17: 46.09 gali veikti kaip svirtis
00: 17: 48.11 arba mechaninis elementas
00: 17: 50.13 panašus į miozino svirtį,
00: 17: 53.29 taigi, ką jie pasiūlė
00: 17: 55.18 yra tas jungiklio judesys
00: 17: 58.21 žiedo atžvilgiu
00: 18: 00.24 gali sugeneruoti
00: 18: 03.05 jėga mikrotubuliui
00: 18: 05.00, dėl ko jis slystų,
00: 18: 07.21 ir grįšiu prie to vėliau.
00:18:10.06 Taigi, žinoma
00:18:12.26 turėjome gauti didesnės skiriamosios gebos informaciją apie dyneiną
00: 18: 15.27 ir tai turėjo būti gauta iš rentgeno kristalografijos,
00:18:19.28 ir tai buvo nemenka kova
00:18:22.07 gauti kristalinę dyneino struktūrą
00: 18: 25.06 ir iš tikrųjų mūsų laboratorija
00:18:27.00 pavyko gauti pirmąją kristalų struktūrą
00: 18: 29.09 dyneino be nukleotidų būklės 2011 m.
00: 18: 33.27, bet netrukus po to
00:18:35.13 visa krūva kitų
00: 18: 37.15 dyneino nukleotidų konformacijos
Buvo pranešta 00: 18: 39.20.
00: 18: 41.20 Taigi, Kono ir kolegų grupė
00: 18: 44.00 iš Japonijos
00: 18: 46.19 pranešė apie labai gražią struktūrą
00: 18: 48.00 Dictostelium citoplazminio dyneino su ADP,
00:18:52.12 ir per pastaruosius metus ar dvejus
00: 18: 55.21 mūsų laboratorija gavo dyneino struktūrą
00: 18: 57.18 su ATP analogu, vadinamu AMPPNP,
00:19:03.00 ir Andrew Carterio laboratorija
00: 19: 04.11 pavyko gauti struktūrą
00: 19: 06.13 su ADP-vanadatu,
00: 19: 07.14, kuris gali būti imituojantis ADP-Pi būseną.
00: 19: 10.09 Ir ką mes norėtume padaryti
00: 19: 12.02 yra panašus į tai, ką matote
00: 19: 14.00 šiame žirgo atvaizde,
00:19:16.00 kur galėjote pamatyti įvairias momentines nuotraukas
00: 19: 17.25 arklio
00: 19: 19.06 priimtas kaip šuolis
00: 19: 21.29 ir iš šių skirtingų momentinių nuotraukų
00: 19: 23.14 galite pamatyti skirtingas formas
00: 19: 25.12 arklio
00:19:26.21 ir pradėti jungtis
00: 19: 27.29 kaip šis arklys
00: 19: 29.28 sugeba vykdyti judrumą,
00:19:33.08 ir tuo pačiu principu
00: 19: 34.21 mes bandome panaudoti šiuos dyneino momentinius vaizdus
00:19:36.19 suprasti
00: 19: 38.06 kaip ji keičia savo formą
00: 19: 39.20, kad galėčiau atlikti judesį.
00:19:41.19 Taigi, dabar norėčiau jums duoti
00:19:43.22 savotiška ekskursija apie tai, ko išmokome
00: 19: 46.12 apie kristalų struktūras,
00: 19: 47.27 ne tik iš mūsų laboratorijos, bet ir iš visų kristalų struktūrų
00: 19: 50.05, kurie pasirodė lauke.
00: 19: 52.23 Pirmiausia čia tik dyneino vaizdas
00: 19: 54.24, palyginti su kinezinu,
00:19:56.07 ir pamatysite, kiek didesnis yra dyneinas
00: 19: 58.19, palyginti su kinezinu
00: 20: 00.10 ir kiek sudėtingiau
00: 20: 02.11 tai yra motorinė sritis.
00: 20: 06.24 O štai skirtingų AAA domenų padėtis
00:20:10.25 kurį jums parodžiau anksčiau
00:20:12.15 šioje linijinėje diagramoje,
00: 20: 13.26, bet štai kaip jie susiplanuoja
00: 20: 15.19 dėl dyneino motorinio baltymo,
00:20:17.11 ir jie visi spalvomis koduojami vienodai
00: 20: 19.28, ką matote šioje linijinėje diagramoje, čia.
00:20:23.28 Taigi, aš sutelksiu dėmesį į
00:20:25.29 keli svarbūs komponentai.
00: 20: 27.16 taigi pirmasis yra AAA1.
00:20:29.24 Taigi, tai vėlgi
00: 20: 31.14 pagrindinė hidrolizės vieta.
00:20:32.17 Jei atliksite AAA1 mutaciją,
00: 20: 34.15 jūs visiškai išjungiate dyneino judrumą,
00: 20: 36.28 ir įdomu tai AAA1
00: 20: 39.08 iš tikrųjų yra tas regionas
00: 20: 41.08, kuris yra toliausiai nuo mikrotubulų.
00:20:44.08 Dabar kitas domenas, kurį aš.
00:20:46.17 AAA subvienetas, kurį paminėjau
00: 20: 48.05 svarbu AAA3,
00: 20: 50.00 ir tai yra jo padėtis čia.
00:20:52.22 Kaip sakiau anksčiau, jis taip pat hidrolizuoja ATP
00: 20: 55.00 ir vaidina svarbų vaidmenį
00: 20: 56.20 mechanizme,
00:20:58.06 ir vėliau šiame pokalbyje paaiškinsiu, kaip tai veikia,
00: 21: 02.19, bet jei užkirsite kelią ATP3 hidrolizei,
00:21:05.23 dynein nėra visiškai neaktyvus,
00: 21: 08.19, bet judėjimo greitis mažėja
00: 21: 11.06 žemyn su hidrolizės mutantu.
00:21:14.26 Taigi, štai dabar
00:21:16.23 atominės raiškos linkerio vaizdas
00: 21: 18.23, kurį anksčiau apibūdinau kaip mechaninį elementą,
00: 21: 21.16 ir čia tai parodyta
00: 21: 23.20 tęsiasi per žiedą.
00: 21: 26.14 Čia yra mikrotubulų surišimo domenas
00: 21: 28.29 tai nedidelis domenas
00: 21: 30.23 kuris sąveikauja su mikrotubuliu,
00:21:32.12 ir tarp žiedo ir mikrotubulų surišimo srities
00:21:35.15 guli šios dvi susuktos ritės.
00: 21: 38.12 Vienas vadinamas koteliu,
00:21:41.06 bet yra antra susukta ritė, vadinama atrama,
00: 21: 44.14, kuris iš tikrųjų tęsiasi iš žiedo
00: 21: 46.20 ir užmezga svarbią sąveiką su koteliu
00:21:49.24 kurį aprašysiu po sekundės.
00: 21: 53.11 Taigi, vienas įdomių dalykų
00: 21: 54.27, kurią norime sužinoti iš šios struktūros
00:21:57.15 kaip informacija,
00:21:59.10 arba konformacinius pokyčius,
00: 22: 01.06 yra dauginami
00: 22: 03.11 kontroliuoti įvairius dyneino funkcijos aspektus,
00: 22: 06.17 ir tai ypač žavus klausimas dyneinui
00: 22: 10.02, nes mes tai žinome, kai susieja ATP
00: 22: 13.01 pačioje šios molekulės viršuje
00: 22: 15.23 jis turi perduoti konformacinį pokytį
00: 22: 18.12 iki mikrotubulų surišimo domeno,
00:22:23.02 kuris iš tikrųjų sukelia šį mikrotubulų surišimo domeną
00:22:25.26 išsilaisvinti iš mikrotubulo
00: 22: 27.23, kad jis galėtų žengti pirmyn takeliu.
00: 22: 30.14 Taigi, kaip vyksta šis plitimas
00:22:32.25 yra žavus klausimas,
00: 22: 34.11 ypač šiuo ilgu atstumu
00:22:36.02 apie 25 nanometrų.
00: 22: 38.11 Mes taip pat žinome, kad ATP yra privalomas
00: 22: 41.10 taip pat turi būti perduota
00: 22: 43.12 kažkaip pakeisti konformaciją
00: 22: 45.25, kur yra šis nuorodos galas
00:22:47.29 bus pastatytas ant žiedo.
00: 22: 50.25 Taigi dabar norėčiau pasidalinti su jumis
00: 22: 53.23 kai kurios idėjos, kaip mes galvojame
00: 22: 55.07 šis ilgalaikis konformacinis pokytis veikia,
00:22:58.00 remiantis šia naujų rentgeno struktūrų kolekcija
00:23:00.23, kurie buvo gauti.
00:23:02.20 Taigi pirmiausia
00: 23: 04.20 leiskite man pasakyti jums vieną užuominą
00: 23: 06.22 iš mūsų pirmosios rentgeno kristalų struktūros
00: 23: 08.26 būsenoje be nukleotidų,
00: 23: 11.10 ir tai tik rodo AAA žiedą,
00: 23: 13.15 tiesiog sutelkiant dėmesį į dideles sritis.
00: 23: 17.09 Ir vienas dalykas, kurį čia pastebite
00:23:19.08 yra tai, kad šis žiedas nėra simetriškas,
00:23:21.01 tai labai asimetrinė struktūra
00: 23: 23.08 ir šiame žiede yra pora spragų
00:23:25.05 kur AAA domenai yra toliau vienas nuo kito.
00: 23: 29.24 Ir šis atotrūkis tarp AAA1 ir AAA2
00:23:32.26 buvo ypač įdomu
00: 23: 34.23 ir taip pat stebina,
00: 23: 36.10, nes tai yra regionas
00:23:38.03 kur jungiasi ATP
00:23:40.07 ir skatina judrumą,
00: 23: 42.04, bet mes žinome iš kitų AAA baltymų,
00:23:46.16 ATPazės,
00:23:48.17 kad ATP būtų hidrolizuotas,
00:23:51.06 šie du domenai, AAA1 ir AAA2,
00: 23: 53.26 turi suartėti
00: 23: 56.08, nes yra likučių
00: 23: 57.29, kurie prisideda prie hidrolizės
00:23:59.12 tiek iš AAA2, tiek iš AAA1.
00:24:01.19 Taigi mes spėliojome,
00:24:03.22 nors čia buvo tik viena nukleotidų būsena,
00: 24: 06.01, kad tai, kas gali nutikti dėl dyneino judrumo
00: 24: 08.15 yra nukleotidų neturinti būsena
00: 24: 10.09 yra didelis tarpas,
00: 24: 11.18, bet kai ATP suriša, ta spraga užsidaro,
00: 24: 14.12 ir tas uždarymas sklinda
00: 24: 16.25 konformacinis pokytis aplink žiedą
00: 24: 20.03, kuris perduodamas į mikrotubulų surišimo domeną
00: 24: 23.04 ir taip pat platinamas linkeriui
00: 24: 28.07, kad pakeistumėte linkerio konfigūraciją,
00: 24: 31.01, tačiau viskas buvo inicijuota susiejus ATP
00:24:35.09 ir šios spragos uždarymas.
00: 24: 37.29 Taigi, aš jums parodysiu šias bendras idėjas
00:24:39.26 atrodo tiesa,
00: 24: 42.09 ir tai, ką jūs čia matote
00:24:44.03 yra morfas,
00: 24: 45.23, todėl eisime lėtai
00: 24: 47.25 eina iš vienos kristalinės struktūros,
00:24:49.24 kuri yra ADP struktūra
00: 24: 52.26 iš Kon ir kt. Laboratorijos
00: 24: 55.23 į kitą kristalų struktūrą,
00:24:58.00, tai yra ADP-vanadatas,
00: 24: 59.24, tai labiau panašu į ATP būseną.
00: 25: 01.18 Taigi, tai yra konformacinis pokytis
00: 25: 03.05, tai tikriausiai atsitinka su ADP
00: 25: 06.06 iškeičiamas į ATP
00: 25: 08.07 AAA1.
00: 25: 10.04 Taigi, kai ATP prisijungia prie AAA1,
00:25:14.17 pamatysite konformacinį pokytį
00: 25: 17.07 ir šiame vaizdo įraše aš sutelksiu ypatingą dėmesį
00: 25: 19.10 ant šių ritinių,
00: 25: 21.07 ir kaip keičiasi konformacija
00: 25: 23.06 galima skleisti iš AAA1
00:25:25.09 iki pat mikrotubulo.
00: 25: 27.16 Taigi, štai filmas.
00: 25: 29.08 Galite pamatyti, kaip visas žiedas iškraipo formą,
00: 25: 32.22 ir jei pažiūrėtumėte, kas čia vyksta,
00:25:35.16 ši oranžinė suvyniota ritė, atrama,
00:25:37.12 atitraukiamas nuo kotelio,
00:25:40.21 kad sukurtų įtampą ant kotelio,
00: 25: 43.00 čia,
00:25:44.22 ir tai daro kažką įdomaus
00: 25: 46.12 dviem sraigtams, sudarantiems kotelį.
00:25:49.05 Tai sukelia slydimo judesį
00:25:53.03 kad dvi spiralės
00:25:55.08 gali judėti nedideliu atstumu vienas kito atžvilgiu,
00: 25: 59.08, bet tas slydimo judesys
00: 26: 01.12 skleidžiama iki pat susuktos ritės,
00:26:04.13 iki pat mikrotubulų surišimo srities,
00:26:06.24 ir sukelia subtilų pokytį
00: 26: 08.22 mikrotubulų surišimo domeno struktūroje
00: 26: 11.03, kuris keičia savo afinitetą mikrotubuliams.
00: 26: 13.08 Ir iš tikrųjų toks mechanizmas
00: 26: 15.19 buvo spėliojama prieš daugelį metų
00: 26: 17.11 pateikė Ianas. 2005 metais
00: 26: 19.23 Ianas Gibbonsas ir jo kolegos,
00: 26: 21.22 ir dabar atrodo, kad yra
00: 26: 23.28 tam yra gerų struktūrinių įrodymų
00:26:25.22 taip pat kitų rūšių įrodymus
00: 26: 28.00, kurį gavo kitos laboratorijos,
00:26:31.11 įskaitant Kon ir Sutoh.
00: 26: 34.13 Taigi, aš taip pat noriu
00:26:37.10 fokusuokite tą patį morfą
00:26:39.03 tarp šių dviejų nukleotidų būsenų,
00: 26: 40.17, bet su nuoroda.
00: 26: 42.07 Ir pamatysite, kad kai ATP susiejamas su AAA1,
00:26:46.14 pamatysite pokyčius AAA subvienetuose,
00: 26: 49.27 ir dabar sutelksime dėmesį į tai, kas vyksta šioje nuorodoje,
00: 26: 52.29 ir jūs matote, kad jis patiria šį didelį konformacinį pokytį,
00:26:55.29 efektyviai išeinant iš tiesios būsenos
00:26:58.15 prie šios sulenktos konformacijos.
00:27:00.23 Taigi, anksčiau šioje kalboje
00: 27: 02.08 Aš aprašiau vienos molekulės judrumo tyrimus
00: 27: 04.14, kurie teikia informaciją
00:27:06.08 apie tai, kaip veikia dyneino variklis
00: 27: 08.00 palei mikrotubulų takelį
00:27:09.12 ir tada aprašiau rentgeno kristalografiją
00:27:11.08 ir EM studijos
00: 27: 12.25, kurie teikia informaciją
00: 27: 14.18 dėl konformacinių pokyčių
00:27:16.09 kurie atsiranda dyneino motorinėje srityje,
00:27:18.03 o dabar ką norėčiau padaryti
00: 27: 19.22 yra sintezuoti abi informacijos dalis kartu
00: 27: 23.05 į modelį, kuriame aprašoma, kaip dyneinas
00: 27: 26.00 gali judėti palei mikrotubulą.
00: 27: 28.28 Ir pateikiamas šis modelis
00: 27: 30.20 gyvūno pavidalu
00: 27: 32.20 tai sukūrė Grahamas Johnsonas.
00: 27: 34.22 Daugelis šio animacinio modelio dalių
00:27:37.18 šiuo metu yra spekuliatyvūs
00:27:39.22 ir be jokios abejonės,
00:27:41.20 kai gauname daugiau informacijos apie dyneiną,
00: 27: 43.14 šis modelis bėgant metams keisis.
00:27:47.06 Bet kol kas tai naudinga
00:27:49.05 kaip būdas sintezuoti surinktus duomenis
00:27:52.26 daugelio skirtingų dyneino laboratorijų,
00: 27: 55.16 ir taip pat sukurti modelius
00: 27: 57.13 dėl dyneino judrumo
00: 27: 59.04, kurį bus galima išbandyti ateityje
00: 28: 00.27 eksperimentuodami.
00: 28: 03.03 Taigi pirmiausia leiskite man parodyti jums
00: 28: 04.10 ką pamatysite šiame filme.
00: 28: 06.08 Šį vaizdą matote čia
00: 28: 08.04 dyneino dimero
00: 28: 09.12 yra gautas iš rentgeno kristalografinių duomenų.
00:28:13.29 Tačiau mes nelabai žinome
00:28:15.23 apie tai, kaip du dyneino motoriniai domenai
00: 28: 17.21 yra sujungti vienas su kitu
00:28:19.25 arba kaip jie prisirišę
00:28:21.17 ant membraninio krovinio, pavyzdžiui.
00:28:23.28 Taigi ši dyneino molekulės dalis
00: 28: 26.17 yra stilistiškesnis ir paprastesnis
00: 28: 28.07, nes mes tiesiog neturime tos struktūrinės informacijos
00:28:30.19 dabar.
00:28:32.12 Dabar, kai pradedu žaisti šį filmą,
00:28:33.27 matote, kaip dyneinas juda pirmyn ir atgal.
00:28:36.18 Šis drebėjimas atsirado dėl to
00: 28: 39.13 Brauno judesys,
00: 28: 41.04 kuris yra varomas. termiškai varomas
00: 28: 43.16 vandens molekulių susidūrimai su dyneinu,
00: 28: 46.03 iš tikrųjų šis Brauno judesys
00: 28: 47.22 tikriausiai yra daug energingesnis
00:28:49.23 nei parodyta šioje animacijoje.
00:28:51.27 Čia yra skirtingos dyneino dalys.
00: 28: 53.19 Štai ATPazės žiedas,
00:28:55.14 žiedą jungiantis kotelis
00: 28: 57.10 į mikrotubulų surišimo domeną.
00: 28: 59.01 Čia, tamsiai mėlyna spalva,
00: 29: 01.00 tai yra stipri dyneino surišimo būsena.
00:29:03.05 Pamatysite, kad tai pereis
00: 29: 05.07 iki šviesiai mėlynos spalvos
00: 29: 07.23, kai jis pereina
00: 29: 09.18 iki silpnos surišimo konformacijos.
00:29:12.02 Pamatysite konformacinius pokyčius
00: 29: 13.29, kuris vyksta susiejime
00:29:15.16 kurį jau aprašiau
00: 29: 17.04 ir tas perėjimas bus parodytas
00: 29: 18.24 nuo spalvos pasikeitimo
00: 29: 21.10 iš šios geltonos būsenos į raudoną.
00: 29: 26.22 Ir kai mikrotubulų surišimo sritis
00: 29: 28.18 yra atskirtas
00:29:30.00 taip pat pamatysite, kaip ji virpa,
00:29:31.22 atsitiktinai juda pirmyn ir atgal
00: 29: 33.10 išilgai mikrotubulų.
00:29:34.26 Tai vėlgi dėl Browno judesio
00: 29: 38.07 ir tai tikriausiai padeda šiam mikrotubulų surišimo domenui
00: 29: 41.06 atlikite naujų surišimo vietų paiešką
00: 29: 43.21 palei mikrotubulų gardelę.
00:29:46.09 Taigi dabar pradėkime šį filmą
00:29:48.19 ir stebėkite, kaip dyneinas žingsniuoja
00: 29: 50.21 palei mikrotubulą.
00:29:52.05 Ir aš jums parodysiu pirmąjį žingsnį
00: 29: 53.20 ir tada mes tai išsamiau išanalizuosime
00:29:55.23 antrajame žingsnyje.
00: 29: 57.15 Taigi, šita pirmaujanti galva
00:29:59.14 žengia žingsnį į priekį,
00: 30: 01.06 aplinkui švilpia
00:30:02.18 ir dabar jis vėl prisitvirtina prie mikrotubulų surišimo vietos.
00: 30: 05.24 Dabar pamatysite, kaip galinė galva žengia žingsnį.
00: 30: 08.05 Tai žengė žingsnį į priekį
00: 30: 09.20 ir jūs galite pamatyti šią nuorodą
00: 30: 11.11 pasikeičia konformacija
00:30:13.06 iš šios geltonos būsenos į šią raudoną būseną,
00: 30: 16.22 ir šis konformacinis pokytis
00:30:19.22 yra lydimas, manome,
00:30:22.23 galimai, sukant žiedą,
00: 30: 26.11 ir šis žiedo sukimasis
00: 30: 28.19 gali pakeisti koto kampą,
00: 30: 31.12 nurodydamas jį ir mikrotubulų surišimo domeną
00: 30: 35.00 į priekį mikrotubulų takeliu,
00:30:37.12, kuris leidžia šį mikrotubulų surišimo domeną
00:30:39.26 vėl prijungti prie tubulino subvieneto
00:30:42.27 toliau link minusinio mikrotubulo galo.
00: 30: 45.25 Taigi tai pamatysite šiame kitame žingsnyje.
00: 30: 48.07 Tai bus perdaroma,
00: 30: 50.05 ten,
00:30:52.12 ir vieną kartą vėl susijungia
00:30:54.19 kurį lydi, manome,
00: 30: 56.23 ATP hidrolizė
00:30:58.13 ir fosfato išsiskyrimas iš AAA1,
00: 31: 01.21 ir tas fosfato išsiskyrimas
00: 31: 03.24 sukelia šį konformacinį pokytį,
00: 31: 05.19 vėl, linkeris
00: 31: 07.17 iš šios sulenktos raudonos būsenos
00: 31: 10.08 į šią tiesesnę geltoną būseną,
00: 31: 12.06 ir šis konformacinis pokytis,
00:31:13.29 mes taip pat manome,
00:31:15.08 gali sukelti krovinio vilkiką
00:31:17.22, kuris stumia krovinį pirmyn takeliu.
00: 31: 20.12 Taigi, pažiūrėkime
00: 31: 23.02 vėl šie konformaciniai pokyčiai,
00:31:25.17 šioje kitoje sekoje,
00:31:27.03 ir taip pat pamatysite skirtingus dyneino tipus
00: 31: 29.14 įžengdamas į kitą filmo dalį.
00: 31: 32.23 Taigi čia pirmaujanti galva žengia į priekį,
00: 31: 35.18 vėl žengia didelį žingsnį į priekį.
00: 31: 37.27 Tai vėl
00:31:39.13 bet dabar tai iš tikrųjų žengia žingsnį atgal
00:31:42.12 palei mikrotubulų takelį.
00:31:43.25 Štai galinė galva,
00: 31: 45.23 iš tikrųjų, Brauno judesiu,
00: 31: 47.13 aplink kitą galvą
00: 31: 49.04 šiuo judesiu per ranką.
00: 31: 51.06 Dabar dar vienas žingsnis į priekį
00: 31: 53.17 palei mikrotubulų takelį,
00: 31: 55.04 ir dabar jos partnerio galva
00: 31: 57.08 vėl pasikeičia konformacija
00:32:00.15 ir žengia žingsnį į priekį
00: 32: 02.20 palei trasą.
00: 32: 04.08 Ir mes taip galvojame
00: 32: 06.29 tipo procesas
00: 32: 08.07 dyneino molekulė sugeba
00: 32: 10.23, kad palaipsniui judėtumėte takeliu,
00: 32: 12.19 ir dabar pažiūrėkime dar kartą
00:32:16.04 šiame vaizdo įraše
00: 32: 17.28 ir dar kartą pažiūrėkite visus šiuos veiksmus.
00:33:24.19 Dabar leiskite man baigti
00:33:26.13 į šį kitą AAA domeną,
00: 33: 29.13 AAA3,
00: 33: 30.29 ir leiskite man pasakyti, kaip mes manome, kad tai veikia.
00: 33: 32.20 Kaip sakiau,
00: 33: 34.04 tai taip pat vaidina svarbų vaidmenį judrumui,
00:33:37.10 ir ypač mes žinome
00: 33: 38.23, jei blokuojame ATP hidrolizę,
00: 33: 40.17 variklis nustoja veikti.
00:33:43.06 Ir buvo paslaptis, kodėl tai buvo tiesa,
00: 33: 46.07, nes mes tai žinome
00:33:49.13 hidrolizė AAA1
00: 33: 51.15 pakanka
00:33:53.09 atlikti visus konformacinius pokyčius
00: 33: 54.27
00: 33: 56.13 ir kad dyneinas žengtų žingsnį į priekį,
00:33:58.18 taigi priežastis, kodėl AAA3
00: 34: 01.23 atrodė svarbus
00:34:03.08 nebuvo taip aišku.
00:34:04.20 Bet atsakymas į tai
00: 34: 06.11 atėjo iš struktūrinių tyrimų
00:34:09.04 iš mūsų laboratorijos,
00:34:11.00 Gira Bhabha ir Hui-Chun Cheng,
00: 34: 12.29 ten, kur jie žiūrėjo
00: 34: 15.21 dyneino konformacija ir konformaciniai pokyčiai,
00: 34: 19.09 ne tiek, kai yra skirtingų nukleotidų
00:34:22.17 AAA1,
00: 34: 24.07, bet dviem skirtingomis nukleotidinėmis būsenomis
00: 34: 26.08 AAA3.
00:34:27.23 Taigi, ypač
00:34:29.18 lyginant, kai ADP yra susietas AAA3
00: 34: 32.04, kai ATP yra susietas su AAA3.
00:34:35.22 Ir aš tau parodysiu,
00:34:37.21 kai AAA3 yra šiose skirtingose ​​nukleotidų būsenose,
00:34:40.25 kas atsitiks su konformaciniais pokyčiais
00:34:44.14 tai įvyksta, kai ATP prisijungia prie AAA1.
00:34:46.29 Taigi, pirmasis yra ką tik matytas filmas.
00: 34: 49.28 Tai yra konformacinis pokytis
00:34:52.27 kurį tau parodžiau
00: 34: 54.29, kur vyksta jungiklis
00: 34: 56.20 šis didelis konformacijos pokytis
00: 34: 58.08 ir visas žiedas keičia savo struktūrą.
00: 35: 00.24 Bet jei dabar
00: 35: 03.22 pakrauti AAA1 su ATP,
00: 35: 05.29, bet dabar ATP yra ir AAA3,
00:35:09.24 tai, ką pamatysite, yra visiškai kitoks vaizdas.
00:35:13.21 Šios žiedo pusės konformacija
00:35:16.13 pakeitimai,
00: 35: 17.26 ten galite pastebėti dramatiškus konformacinius pokyčius,
00:35:19.20 bet konformacinis pokytis
00:35:21.22 sustoja apie AAA4
00: 35: 23.29 ir neplatinamas
00: 35: 25.20 aplink likusią žiedo dalį,
00:35:27.08 ir niekada nesukelia konformacinių pokyčių
00: 35: 29.04 nuorodoje
00:35:31.00 arba stiebo domene.
00: 35: 32.24 Taigi AAA3
00:35:35.01 iš tikrųjų blokuoja konformacinius pokyčius
00: 35: 37.25 ir neleisti jam plisti
00:35:40.02 visame ringe.
00:35:41.13 Taigi, kaip man patinka apie tai galvoti
00: 35: 43.11 yra tas AAA3
00: 35: 45.20 atrodo kaip vartai
00: 35: 47.15, kuris kontroliuoja sklidimą
00: 35: 49.08 dėl konformacinių pokyčių
00: 35: 51.11 visame dyneino žiede.
00:35:53.03 AAA1 yra paleidiklis,
00: 35: 55.03, taigi šiame domino vaizde čia
00: 35: 57.26 tai iš pradžių prasideda grandininė reakcija
00: 36: 01.08, kuris persikelia iš vieno AAA domeno
00: 36: 03.11 į kitą,
00: 36: 04.25 ir galiausiai gali judėti iki galo
00:36:06.26 per žiedą iki AAA6
00:36:09.00 ir sukelti šį didžiulį konformacinį pokytį.
00: 36: 12.18 Bet jei AAA3
00: 36: 14.22 šioje svetainėje turi ATP,
00: 36: 17.12 tai iš tikrųjų veikia
00: 36: 19.23 užblokuoti plitimą.
00:36:21.18 Beveik taip, lyg turėčiau
00: 36: 23.29 pirštą, laikantį šį domino
00: 36: 26.15 ir neleisti plisti
00: 36: 28.19 nuo ėjimo toliau.
00: 36: 30.24 Taigi konformacinių pokyčių blokavimas,
00: 36: 33.17 arba leidimas tai leisti,
00: 36: 35.29 atrodo pagrindinė veikla
AAA3 00: 36: 38.25.
00: 36: 41.09 Taigi, tai atnaujina
00:36:43.04 to, ką sužinojome apie dyneiną
00: 36: 45.04 per pastaruosius kelerius metus,
00:36:46.28 bet turiu pasakyti, kad mes vis dar
00: 36: 48.19 labai pradžioje
00:36:50.04 ir yra be galo daug nežinomų klausimų.
00: 36: 52.20 Taigi, aš iliustravau kai kurias atomines struktūras
00:36:55.25 ir vykstantys konformaciniai pokyčiai,
00:36:58.22 bet mes tikrai nežinome
00: 37: 01.10 kaip tie struktūriniai pokyčiai susiję
00: 37: 03.12 iki dyneino užlipimo ant mikrotubulų.
00:37:06.22 Kas būtų ypač puiku
00:37:08.08 užuot gavęs tik statinius dyneino vaizdus,
00: 37: 11.10 mes galime stebėti ir matuoti
00: 37: 14.09 dyneino struktūriniai pokyčiai
00: 37: 16.01, kol vyksta judrumas.
00:37:17.25 Ir yra būdų tai padaryti,
00:37:19.28 pavyzdžiui, metodai, tokie kaip vienos molekulės FRET,
00: 37: 22.21 kurie veikia kaip zondai
00: 37: 24.17 išmatuoti tam tikrus konformacinius pokyčius
00: 37: 26.13, kurie atsiranda baltymuose,
00: 37: 28.02 ir galbūt tokios technikos
00: 37: 29.29 galima taikyti dyneinui
00:37:31.17 kad iš tikrųjų matytume
00: 37: 33.08 dyneino žingsniavimas
00:37:35.03 ir tuo pačiu metu matuoti
00:37:36.27 konformaciniai pokyčiai.
00:37:38.06 Aš taip pat pateikiau jums struktūrinę informaciją
00: 37: 40.10 apie AAA3 vaidmenį,
00: 37: 43.00 rodo, kad gali blokuoti
00: 37: 44.26 konformacinis dyneino pokytis
00: 37: 47.12 ir taip užkirsti kelią jo judrumui.
00:37:50.06 Bet mes nelabai suprantame
00: 37: 52.00 kaip ir kodėl
00: 37: 54.10 AAA3 tai daro.
00:37:56.21 Kaip veikia ląstelė
00: 37: 58.20 naudokite šį valdymo mechanizmą
00: 38: 00.03 reguliuoti dyneino judrumą?
00: 38: 01.21 Kaip tai iš tikrųjų kontroliuoja
00: 38: 03.22 ar AAA3
00:38:05.13 turi ATP arba ADP aktyvioje vietoje?
00: 38: 08.17 Taigi, mes neįsivaizduojame
00:38:10.20 šiuo klausimu šiuo metu,
00:38:13.28 ir tai akivaizdu
00:38:16.04 bus svarbu suprasti
00:38:17.23 koks yra tikrasis AAA3 tikslas
00:38:20.22 dyneino ląstelių biologijoje.
00: 38: 24.00 Taigi,
00: 38: 25.16 Norėčiau padėkoti daugeliui žmonių
00:38:26.27 kurie prisidėjo prie šio darbo.
00: 38: 28.10 Visų pirma,
00: 38: 29.20 žmonių, kurie anksčiau buvo laboratorijoje,
00: 38: 32.25 fantastiška asmenų grupė
00: 38: 35.19 tai padėjo pradėti dyneino projektą
00:38:37.18 laboratorijoje
00: 38: 39.05 -Semas, Ahmetas, Andrew ir Arne -
00: 38: 43.16 dabar visi nuėjo į savo laboratorijas
00: 38: 45.11 ir yra labai sėkmingi,
00: 38: 47.17 ir aš aptariau daug jų darbų
00:38:49.17 iš savo nepriklausomų laboratorijų šiame pokalbyje.
00: 38: 51.09 Ir Carol Cho buvo magistrantė
00:38:54.06 kuris dabar išvyko į Korėją.
00: 38: 55.28 Ir naujesnis darbas
00:38:58.02 yra Giros Bhabha darbas
00: 39: 00.24 ir Hui-Chun Cheng.
00: 39: 02.28 Gira vis dar yra laboratorijoje
00: 39: 04.11 ir Hui-Chun persikėlė
00:39:06.12 į savo laboratoriją Taivane.
00: 39: 07.29 Ir tuo norėčiau padėkoti už dėmesį,
00: 39: 11.18 ir trečioje mano „iBiology“ kalboje
00: 39: 13.20 Aš aptarsiu reglamentą
00: 39: 16.03 žinduolių citoplazminio dyneino.


Biologija 171

Šio skyriaus pabaigoje galėsite atlikti šiuos veiksmus:

  • Suprasti, kaip ląstelių ciklą kontroliuoja mechanizmai, kurie yra ląstelės vidiniai ir išoriniai
  • Paaiškinkite, kaip G pabaigoje atsiranda trys vidiniai „kontrolės taškai“.1, prie G2/M perėjimas ir metafazės metu
  • Apibūdinkite molekules, kurios kontroliuoja ląstelių ciklą per teigiamą ir neigiamą reguliavimą

Ląstelių ciklo trukmė labai skiriasi, net ir vieno organizmo ląstelėse. Žmonėms ląstelių apykaitos dažnis svyruoja nuo kelių valandų ankstyvame embriono vystymosi etape iki vidutiniškai nuo dviejų iki penkių dienų epitelio ląstelėse ir iki viso žmogaus gyvenimo, praleisto G0 specializuotų ląstelių, tokių kaip žievės neuronai ar širdies raumenų ląstelės.

Taip pat skiriasi laikas, kurį ląstelė praleidžia kiekvienoje ląstelės ciklo fazėje. Kai kultūroje (už kūno esant optimalioms augimo sąlygoms) auginamos greitai besidalijančios žinduolių ląstelės, ląstelių ciklo trukmė yra apie 24 val. Sparčiai besidalijančiose žmogaus ląstelėse, kurių ląstelių ciklas trunka 24 valandas, G1 fazė trunka maždaug devynias valandas, S fazė - 10 valandų, G2 fazė trunka apie keturias su puse valandos, o M fazė-maždaug pusvalandį. Palyginimui, apvaisintų vaisių musių kiaušiniuose (ir ankstyvuose embrionuose) ląstelių ciklas baigiamas maždaug per aštuonias minutes. Taip yra todėl, kad apvaisinto kiaušinio branduolys daug kartų dalijasi mitozės būdu, bet neperžengia citokinezės, kol nesusidaro daugiabranduolė „zigota“, kurioje daug branduolių yra palei ląstelių membranos periferiją, taip sutrumpėja ląstelių dalijimosi laikas. ciklas. Tiek „stuburinių“, tiek „stuburinių“ ląstelių ciklo įvykių laikas yra kontroliuojamas mechanizmais, kurie yra ląstelės viduje ir išorėje.

Ląstelių ciklo reguliavimas išoriniais įvykiais

Ląstelių dalijimosi inicijavimą ir slopinimą sukelia išoriniai ląstelės įvykiai, kai ji ruošiasi pradėti replikacijos procesą. Įvykis gali būti toks paprastas kaip netoliese esančių ląstelių mirtis arba toks pat platus kaip augimą skatinančių hormonų, tokių kaip žmogaus augimo hormonas (HGH arba hGH), išsiskyrimas. HGH trūkumas gali slopinti ląstelių dalijimąsi, o tai sukelia nykštuką, o per didelis HGH gali sukelti gigantizmą. Ląstelių susigrūdimas taip pat gali slopinti ląstelių dalijimąsi. Priešingai, veiksnys, galintis inicijuoti ląstelių dalijimąsi, yra ląstelės dydis: kai ląstelė auga, ji tampa fiziologiškai neveiksminga dėl mažėjančio paviršiaus ir tūrio santykio. Šios problemos sprendimas yra padalinti.

Nepriklausomai nuo pranešimo šaltinio, ląstelė gauna signalą, o ląstelėje vykstantys įvykiai leidžia jam pereiti į tarpfazę. Pereinant į priekį nuo šio inicijavimo taško, turi būti įvykdyti visi parametrai, kurių reikia kiekvienoje ląstelių ciklo fazėje, arba ciklas negali progresuoti.

Reguliavimas vidaus kontrolės punktuose

Labai svarbu, kad pagamintos dukterinės ląstelės būtų tikslios pirminės ląstelės dublikatai. Dėl chromosomų dubliavimosi ar pasiskirstymo klaidų atsiranda mutacijų, kurios gali būti perduodamos kiekvienai naujai ląstelei, pagamintai iš nenormalios ląstelės. Siekiant užkirsti kelią pažeistos ląstelės tolesniam dalijimuisi, yra vidinės kontrolės mechanizmai, kurie veikia trijuose pagrindiniuose ląstelių ciklo kontroliniuose taškuose: Kontrolinis taškas yra vienas iš kelių eukariotinių ląstelių ciklo taškų, kai ląstelė progresuoja į kitą etapą. ciklą galima sustabdyti, kol sąlygos bus palankios. Šie kontroliniai taškai yra netoli G pabaigos1, prie G2/M perėjimas, ir metafazės metu ((pav.)).


G1 Patikrinimo taškas

G1 kontrolinis taškas nustato, ar visos sąlygos yra palankios ląstelių dalijimuisi. G1 Kontrolinis taškas, dar vadinamas ribojimo tašku (mielėse), yra taškas, kuriame ląstelė negrįžtamai įsitraukia į ląstelių dalijimosi procesą. Išorinė įtaka, tokia kaip augimo faktoriai, vaidina svarbų vaidmenį pernešant ląstelę pro G1 kontrolinis punktas. Be tinkamų atsargų ir ląstelių dydžio, G1 kontrolinis punktas. Ląstelė, kuri neatitinka visų reikalavimų, nebus leidžiama pereiti į S fazę. Ląstelė gali sustabdyti ciklą ir bandyti išspręsti probleminę būklę, arba ląstelė gali pereiti į G0 ir laukti tolesnių signalų, kai sąlygos pagerės.

G2 Patikrinimo taškas

G2 kontrolės taškai patenka į mitozinę fazę, jei nesilaikoma tam tikrų sąlygų. Kaip ir prie G1 įvertinamas kontrolinis taškas, ląstelių dydis ir baltymų atsargos. Tačiau svarbiausias G. vaidmuo2 tikrinimo taškas yra užtikrinti, kad visos chromosomos būtų pakartotos ir ar nepažeista replikuota DNR. Jei kontrolinio taško mechanizmai nustato DNR problemas, ląstelių ciklas sustabdomas ir ląstelė bando užbaigti DNR replikaciją arba ištaisyti pažeistą DNR.

M kontrolės punktas

M kontrolinis taškas atsiranda netoli kariokinezės metafazės stadijos pabaigos. M kontrolinis taškas taip pat žinomas kaip veleno kontrolinis taškas, nes jis nustato, ar visos seserinės chromatidės yra tinkamai pritvirtintos prie veleno mikrotubulių. Kadangi seserinių chromatidžių atskyrimas anafazės metu yra negrįžtamas žingsnis, ciklas nebus tęsiamas tol, kol kiekvienos poros chromatidžių poros kinetokorai nebus tvirtai pritvirtinti prie mažiausiai dviejų verpstės pluoštų, kylančių iš priešingų ląstelės polių.

Stebėkite, kas vyksta G1, G.2, ir M kontrolinius taškus, apsilankę šioje svetainėje, norėdami pamatyti ląstelių ciklo animaciją.

Ląstelių ciklo reguliatoriaus molekulės

Be vidiniu būdu kontroliuojamų kontrolinių taškų, yra dvi tarpląstelinių molekulių grupės, reguliuojančios ląstelių ciklą. Šios reguliuojančios molekulės arba skatina ląstelės pažangą į kitą fazę (teigiamas reguliavimas), arba sustabdo ciklą (neigiamas reguliavimas). Reguliuojančios molekulės gali veikti atskirai arba turėti įtakos kitų reguliuojančių baltymų veiklai ar gamybai. Todėl vieno reguliatoriaus gedimas gali beveik neturėti įtakos ląstelių ciklui, ypač jei tą patį įvykį valdo daugiau nei vienas mechanizmas. Tačiau nepakankamo arba neveikiančio reguliatoriaus poveikis gali būti platus ir gali būti mirtinas ląstelei, jei paveikiami keli procesai.

Teigiamas ląstelių ciklo reguliavimas

Dvi baltymų grupės, vadinamos ciklinais ir nuo ciklino priklausomomis kinazėmis (Cdks), vadinamos teigiamais reguliatoriais. Jie yra atsakingi už ląstelės eigą per įvairius kontrolinius taškus. Keturių ciklino baltymų lygiai per visą ląstelės ciklą svyruoja pagal nuspėjamąjį modelį ((pav.)). Ciklino baltymų koncentracijos padidėjimą sukelia tiek išoriniai, tiek vidiniai signalai. Po to, kai ląstelė pereina į kitą ląstelių ciklo etapą, ankstesniame etape buvę ciklinai yra suskaidomi citoplazminių fermentų, kaip parodyta žemiau esančiame paveikslėlyje.


Ciklinai reguliuoja ląstelių ciklą tik tada, kai yra glaudžiai susiję su Cdks. Kad būtų visiškai aktyvus, Cdk/ciklino kompleksas taip pat turi būti fosforilintas tam tikrose vietose, kad suaktyvintų kompleksą. Kaip ir visos kinazės, Cdks yra fermentai (kinazės), kurie savo ruožtu fosforilina kitus baltymus. Fosforilinimas aktyvina baltymą, pakeisdamas jo formą. Cdks fosforilinti baltymai dalyvauja ląstelės perkėlime į kitą fazę. ((Pav.)). Cdk baltymų kiekis yra gana stabilus per visą ląstelių ciklą, tačiau ciklino koncentracijos svyruoja ir lemia, kada susidaro Cdk/ciklino kompleksai. Skirtingi ciklinai ir Cdks jungiasi tam tikruose ląstelių ciklo taškuose ir taip reguliuoja skirtingus kontrolinius taškus.


Kadangi cikliniai ciklino lygio svyravimai daugiausia priklauso nuo ląstelių ciklo laikas o ne konkrečiais įvykiais, ląstelių ciklo reguliavimas paprastai vyksta arba vien tik Cdk molekulėmis, arba Cdk/ciklino kompleksais. Be konkrečios visiškai aktyvuotų ciklino / Cdk kompleksų koncentracijos, ląstelių ciklas negali tęstis per kontrolinius taškus.

Nors ciklinai yra pagrindinės reguliuojančios molekulės, lemiančios ląstelių ciklo impulsą į priekį, yra keletas kitų mechanizmų, kurie tiksliai sureguliuoja ciklo eigą ir turi neigiamą, o ne teigiamą poveikį. Šie mechanizmai iš esmės blokuoja ląstelių ciklo progresavimą, kol išsprendžiamos probleminės sąlygos. Molekulės, neleidžiančios visiškai suaktyvinti Cdks, vadinamos Cdk inhibitoriais. Daugelis šių inhibitorių molekulių tiesiogiai ar netiesiogiai stebi tam tikrą ląstelių ciklo įvykį. Blokas, kurį ant Cdks uždeda inhibitoriaus molekulės, nebus pašalintas, kol nebus baigtas konkretus inhibitoriaus stebėjimo įvykis.

Neigiamas ląstelių ciklo reguliavimas

Antroji ląstelių ciklo reguliavimo molekulių grupė yra neigiami reguliatoriai, kurios sustabdo ląstelių ciklą. Atminkite, kad esant teigiamam reguliavimui, aktyvios molekulės sukelia ciklo progresavimą.

Geriausiai suprantamos neigiamos reguliavimo molekulės yra retinoblastomos baltymas (Rb), p53 ir p21. Retinoblastomos baltymai yra grupė naviką slopinantys baltymai dažnas daugelyje ląstelių. Turėtume atkreipti dėmesį į tai, kad 53 ir 21 žymėjimai nurodo funkcines baltymų (p) molekulines mases kilodaltonuose (daltonas lygus a atominės masės vienetas, kuris yra lygus vienam protonui arba vienam neutronui arba 1 g/mol). Didžioji dalis to, kas žinoma apie ląstelių ciklo reguliavimą, gaunama iš tyrimų, atliktų su ląstelėmis, kurios turi prarado reguliavimo kontrolę. Nustatyta, kad visi trys šie reguliuojantys baltymai yra pažeisti arba neveikia ląstelėse, kurios pradėjo nekontroliuojamai daugintis (t. y. tapo vėžinėmis). Kiekvienu atveju pagrindinė nekontroliuojamo ląstelių ciklo progreso priežastis buvo netinkama reguliavimo baltymo kopija.

Rb, p53 ir p21 pirmiausia veikia G1 kontrolinis punktas. p53 yra daugiafunkcinis baltymas, kuris daro didelę įtaką ląstelės įsipareigojimui dalintis, nes jis veikia, kai ląstelėse, kuriose vyksta paruošiamieji procesai, yra pažeista DNR1. Jei aptinkama pažeista DNR, p53 sustabdo ląstelių ciklą ir tada įdarbina specifinius fermentus, kad atkurtų DNR. Jei DNR negalima pataisyti, p53 gali sukelti apoptozę arba ląstelių savižudybę, kad būtų išvengta pažeistų chromosomų dubliavimo. Didėjant p53 lygiui, pradedama gaminti p21. p21 sustabdo p53 diktuojamą ciklą, prisijungdamas prie Cdk / ciklino kompleksų ir slopindamas jų aktyvumą. Kadangi ląstelė patiria didesnį stresą, kaupiasi didesnis p53 ir p21 lygis, todėl mažesnė tikimybė, kad ląstelė pateks į S fazę.

Rb, kuris iš esmės stebi ląstelių dydį, daro reguliavimo įtaką kitiems teigiamiems reguliatorių baltymams. Viduje konors aktyvus, defosforilintos būsenos, Rb jungiasi su baltymais, vadinamais transkripcijos veiksniai, dažniausiai E2F ((Pav.)). Transkripcijos veiksniai „įjungia“ specifinius genus, leidžiančius gaminti to geno koduojamus baltymus. Kai Rb yra prijungtas prie E2F, gaminami baltymai, reikalingi G1/S perėjimas yra užblokuotas. Didėjant ląstelės dydžiui, Rb lėtai fosforilinamas, kol tampa neaktyvus. Rb išskiria E2F, kuris dabar gali įjungti geną, gaminantį pereinamąjį baltymą, ir šis konkretus blokas pašalinamas. Kad ląstelė praeitų pro kiekvieną kontrolinį tašką, visi teigiami reguliatoriai turi būti „įjungti“, o visi neigiami reguliatoriai turi būti „išjungti“.


Rb ir kiti baltymai, kurie neigiamai reguliuoja ląstelių ciklą, kartais vadinami naviko slopintuvais. Kodėl, jūsų manymu, pavadinimas naviko slopintuvas gali tikti šiems baltymams?

Skilties santrauka

Kiekvieną ląstelių ciklo etapą stebi vidiniai valdikliai, vadinami kontroliniais taškais. Ląstelių cikle yra trys pagrindiniai kontroliniai taškai: vienas netoli G pabaigos1, sekundę prie G2/M perėjimas, o trečiasis - metafazės metu. Teigiamos reguliatoriaus molekulės leidžia ląstelių ciklui pereiti į kitą ląstelių dalijimosi etapą. Neigiamos reguliatoriaus molekulės stebi ląstelių sąlygas ir gali sustabdyti ciklą, kol bus įvykdyti konkretūs reikalavimai.

Meno jungtys

(Paveikslas) Rb ir kiti baltymai, neigiamai reguliuojantys ląstelių ciklą, kartais vadinami naviko slopintuvais. Kodėl, jūsų manymu, pavadinimas naviko slopintuvas gali tikti šiems baltymams?

(Paveikslas) Rb ir kiti neigiami reguliavimo baltymai kontroliuoja ląstelių dalijimąsi, todėl neleidžia susidaryti navikams. Mutacijos, trukdančios šiems baltymams atlikti savo funkciją, gali sukelti vėžį.

Nemokamas atsakymas

Aprašykite bendrąsias sąlygas, kurių turi būti laikomasi kiekviename iš trijų pagrindinių ląstelių ciklo kontrolinių taškų.

G1 kontrolinis taškas stebi tinkamą ląstelių augimą, genominės DNR būseną, pakankamas energijos atsargas ir medžiagas S fazei. Prie G.2 patikrinimo taške, DNR tikrinama siekiant įsitikinti, kad visos chromosomos buvo dubliuotos ir ar naujai susintetintoje DNR nėra klaidų. Be to, įvertinamas ląstelių dydis ir energijos atsargos. M kontrolinis taškas patvirtina teisingą mitozinio veleno pluošto pritvirtinimą prie kinetochorų.

Palyginkite ir palyginkite teigiamų ląstelių ciklo reguliatorių ir neigiamų reguliatorių vaidmenis.

Teigiami ląstelių reguliatoriai, tokie kaip ciklinas ir Cdk, atlieka užduotis, kurios perkelia ląstelių ciklą į kitą etapą. Neigiami reguliatoriai, tokie kaip Rb, p53 ir p21, blokuoja ląstelių ciklo progresavimą, kol neįvyksta tam tikri įvykiai.

Kokių veiksmų reikia imtis, kad „Cdk“ taptų visiškai aktyvus?

Cdk turi prisijungti prie ciklino ir turi būti tinkamoje padėtyje fosforilintas, kad taptų visiškai aktyvus.

Rb yra neigiamas reguliatorius, kuris blokuoja ląstelių ciklą G1 kontrolinis taškas, kol langelis pasieks reikiamą dydį. Kokį molekulinį mechanizmą naudoja Rb, kad sustabdytų ląstelių ciklą?

Rb yra aktyvus, kai yra defosforilintas. Esant tokiai būsenai, Rb jungiasi prie E2F, kuris yra transkripcijos faktorius, reikalingas transkripcijai ir galutiniam G molekulių, reikalingų G1/S perėjimas. E2F negali perrašyti tam tikrų genų, kai yra susietas su Rb. Kai ląstelė didėja, Rb fosforilinamas, inaktyvuojamas ir išskiria E2F. Tada E2F gali skatinti savo kontroliuojamų genų transkripciją ir bus gaminami pereinamieji baltymai.

Žodynėlis


Medžiagos ir metodai

Augalinės medžiagos, augimo sąlygos ir T-DNR įterpimo augalų identifikavimas

Arabidopsis thaliana augalai buvo auginami augimo kamerose esant 16 valandų šviesai (~ 70-80 μmol/m 2 s 2 balta šviesa), esant 20 ° C temperatūrai ir 70% drėgmei.T-DNR įterpimo mutantai drp3A-2 (SALK_147485), drp3B-2 (SALK_112233), ir drp5B-2 (SAIL_71D_11) buvo apibūdinti anksčiau (Zhang ir Hu 2009, 2010). drp5B-1 (lankas5), lankas6 ir ftsZ2 dvigubą mutantą pateikė Kathy Osteryoung (MSU). drp5B-1 yra L.er fone, o visi kiti T-DNR įterpimo mutantai yra Col-0 fone. T-DNR buvimas ir mutantų homozigotiškumas buvo patikrintas PGR, naudojant genominę DNR kaip šabloną. LBb1.3 (5′-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3′) kartu su genų specifiniais pradmenimis buvo naudojami SALK mutantams genotipuoti. SALK_147485-LP (5′- AACCACAGGTTTACCTCCTGG-3′) ir SALK_147485-RP (5′- ACGCCTCCTTCTTCTTCTCTACG-3′) buvo naudojami drp3A-2 ir SALK_112233-LP (5′-TAAAATGGCCTTCAGGAAAGG-3′) ir SALK_112233-RP (5′-TGAGGAGAGAAATAGCACCTTTG-3′) buvo naudojami drp3B-2. Į genotipą drp5B-2, buvo naudojami šie pradmenys: SAIL_71D_11-LP (5′- TGTGTTGGATGCCCTTAAGAC-3′), SAIL_71D_11-RP (5′-TGTCACCTGATGAAGGAAAGG-3′) ir SAIL_LB3 (5′GAATCAATCATACTACATACTACATACTAC-3′).

Augalų transformacija

Gėlių panardinimo metodas buvo naudojamas mitochondrijų žymeniui įvesti ScCOX4-YFP į Ler ir drp5B-1. Tas pats metodas taip pat buvo naudojamas įvedant 35Spro:YFP-DRP5B į 0 koloną, kurioje jau buvo ScCOX4-CFP. Norėdami pasirinkti 35Spro: YFP-DRP5B, T1 sėklos buvo auginamos dirvožemyje ir purškiamos 0,1 % (v/v) Basta (Finale Farnam Companies) ir 0,025 % (v/v) Silwet L-77 praėjus 7 ir 9 dienoms po sudygimo. Transgeniniai augalai buvo toliau patvirtinti dėl geltonojo fluorescencinio baltymo (YFP) sulietų baltymų ekspresijos naudojant epifluorescencinę mikroskopiją.

Genų klonavimas

Viso ilgio kodavimo sritys DRP3A, DRP3B, ir DRP5B buvo amplifikuoti iš cDNR, sukurtos iš bendros mRNR Arabidopsis Col-0 daigai naudojant šiuos pradmenis: DRP3A-attB1 (5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatgactattgaagaagtttccg-3 '), DRP3A-attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttagaatccgtatccattttggtg-3'), DRP3B-attB1 (5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatgtccgtcgacgatctccc-3 '), DRP3B- attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttacatatgaagccgtccgttc-3 '), DRP5B-attB1 (5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcggaagtatcagc-3') ir DRP5B-attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgtcaatgctgcaccgaagg-3 '). Amplifikuotas produktas buvo klonuotas naudojant Gateway® sistemą (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). Konstruojant buvo naudojamas „pEarleyGate101“ (CD3-683) (Earley ir kt., 2006). 35Spro:YFP-DRP5B, ir pGilda-GW ir pB42AD-GW buvo naudojami norint sukurti jauko ir pray sulietus baltymus mielių dviejų hibridų tyrimams naudojant Matchmaker sistemą (Clontech, JAV).

Mikroskopinė analizė ir mitochondrijų kiekybinis nustatymas

Konfokaliniai vaizdai buvo padaryti naudojant konfokalinį lazerinį skenavimo mikroskopą (Zeiss LSM 510 META), naudojant 63x panardinimo į aliejų objektyvą. Šviežiai iškirptas Arabidopsis lapų diskai buvo sumontuoti su vandeniu vaizdavimui. YFP ir chlorofilo fluorescencija buvo sužadinti 514 nm argono lazerio linija, o signalai buvo surinkti naudojant atitinkamai BP530-600 nm ir BP630-700 nm. CFP signalai buvo sužadinti naudojant 458 nm argono lazerio liniją ir aptikti BP465-510 nm. Bendros lokalizacijos analizei CFP, YFP ir chlorofilo fluorescencija buvo sužadinti ir aptikta vienu metu naudojant tuos pačius aukščiau aprašytus nustatymus.

Mitochondrijų skaičius buvo kiekybiškai įvertintas naudojant ImageJ programinę įrangą (ImageJ 1997), kaip aprašyta anksčiau (Desai ir Hu 2008 Aung ir Hu 2011). P vertės buvo apskaičiuotos naudojant Studento dviuodeges t- bandymas prieš laukinį tipą.

Mielių dviejų hibridų tyrimai

Dviejų hibridų sistema „Matchmaker“ („Clontech“, JAV) buvo naudojama homo- ir heteromerinėms DRP5B ir DRP3 sąveikoms išbandyti. Frozen-EZ Yeast Transformation Kit (Zymo, Irvine, CA, JAV) buvo naudojamas kartu transformuoti jauko ir maldos plazmidės DNR į mielių padermę EGY48. Norimi transformantai buvo atrinkti naudojant standartinę sintetinę iškritimo terpę (SD/Glc-Ura-Trp-His). Fizinė sąveika tarp išbandytų baltymų buvo ištirta SD/Gal-Ura-Trp-His-Leu agaro plokštelėse, kuriose yra X-Gal.

SDS-PAGE analizė

50 mg šviežio dviejų metų amžiaus Arabidopsis kiekvieno genotipo daigai buvo sumalti plastikiniu grūstuvu, naudojant skystą azotą, pridedant 500 μL SDS turinčio ekstrahavimo buferio, kuriame yra 60 mM Tris-HCL pH 8,8, 2 % SDS, 2,5 % glicerolio, 0,13 mM EDTA pH 8,0, ir 1X Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche, JAV). Mėginiai buvo maišomi 30 sekundžių ir kaitinami 70 ° C temperatūroje 10 minučių, po to centrifuguojami 13 000 g du kartus (5 min. per kiekvieną kartą) kambario temperatūroje. Tada supernatantai (bendrai baltymai) buvo perkelti į naujus mėgintuvėlius. 5 μL visų baltymų buvo sumaišyti su tokiu pat tūriu 2x NuPAGE LDS mėginio buferio (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV), atskirti 4–12 % NuPage geliu (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) ir blotuojami. prie polivinilideno difluorido (PVDF) membranos.

Mėlynos spalvos poliakrilamido gelio elektroforezė (BN-PAGE)

50 mg šviežio dviejų metų amžiaus Arabidopsis kiekvieno genotipo sodinukai buvo homogenizuoti grūstuvu ir skystu azotu. Visi natūralūs baltymai buvo išskirti naudojant NativePAGE™ Sample Prep Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). Į homogenizuotus mėginius buvo pridėta 100 μl 1x pakrovimo buferio, kuriame yra 2% ploviklio (DDM), po to mišiniai inkubuojami ant ledo 30 min. Inkubuoti mėginiai buvo centrifuguojami 17 000 g du kartus (15 min. per kiekvieną kartą) 4 ° C temperatūroje, o supernatantai buvo perkelti į naujus mėgintuvėlius. 2 μL 5% G-250 mėginio priedo buvo įpilta į 20 μL mėginio tirpalo, kuris po to buvo atskirtas 4%–12% NativePAGE™ naudojant 1x NativePAGE™ veikimo buferį ir katodo buferio priedą. Prieš perkeldamas į PVDF membraną, gelis 10 minučių buvo inkubuojamas su 2x NuPAGE ™ perkėlimo buferiu.

Antikūnų generavimas ir imunoblotų analizė

Antikūnus prieš DRP3A (α-DRP3A: 489-RKRMDEVIGDFLREGLEP-506) ir DRP3B (α-DRP3B: 535-HPVARPDTVEPER-548) sukūrė ir sintezavo „Open Biosystems, Inc.“. Antikūnams išvalyti serumas buvo atskiestas iki 1: 400 į blokavimo buferį ir inkubuojama su PVDF membrana, kurioje buvo iš viso pernešamų baltymų drp3A-2 arba drp3B-2 4 °C temperatūroje per naktį. Apdoroti antikūnai buvo naudojami imunoblotinėje analizėje.

PVDF membrana iš SDS-PAGE arba BN-PAGE buvo užblokuota 3 % BSA 1x TBST (50 mM Tris bazės, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 8,0) per naktį 4 °C temperatūroje, prieš zondavimą su blokuojančiame buferyje paruoštų antikūnų. Apdoroti antikūnai buvo hibridizuoti su PVDF membrana, kurioje yra perkeltų dominančių baltymų, 1 valandą kambario temperatūroje. Tada hibridizuota membrana buvo tris kartus skalaujama (10 min./kiekvieną kartą) 1x TBST, o po to buvo tiriama antriniu antikūnu (1:20 000 ožkos anti-triušio IgG) ir HRP konjugatu (Millipore, JAV) 1x TBST. Signalai buvo aptikti naudojant 4 kartus praskiestą SuperSignal® West Dura Extended Duration substratą (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, JAV). Membrana buvo veikiama plėvele, kad būtų galima vizualizuoti signalus.


Rezultatai

Chloroplastų skyriaus cianobakterinės kilmės genų pasiskirstymas ir išvestas endosimbiotinių genų perdavimo laikas

Norėdami ištirti ir palyginti ryšį tarp eukariotinių ląstelių ciklo ir chloroplastų dalijimosi laiko eukariotiniuose dumbliuose, kuriuose yra pirminių chloroplastų, šiame tyrime naudojome raudonuosius dumblius C. merolae, žalieji dumbliai C. reinhardtii, ir Chlorella vulgaris, glaukofito dumbliai Cyanophora paradoxa ir streptofitų dumbliai Mesostgma viride. C. merolae ir C. reinhardtii buvo pasirinkti, nes yra visi branduolio ir chloroplasto genomo sekos duomenys ir nustatyti ląstelių ciklo sinchronizavimo šviesos ir tamsos ciklo metodais (Surzycki 1971 Suzuki et al. 1994). Abiejuose organizmuose visi žinomi chloroplastų dalijimosi baltymai yra užkoduoti branduoliniame genome (1B pav.). Kitos dumblių rūšys buvo pasirinktos, nes chloroplastų genomai buvo visiškai sekvenuoti, o cianobakterijų kilmės MinD, FtsI, FtsW ir SepF vis dar yra užkoduoti chloroplasto genome (1B pav.) (anksčiau buvo pranešta, kad MinE yra užkoduotas chloroplaste genomas C. vulgaris, bet žr. toliau), nors šiuo metu nėra visų branduolinio genomo sekos duomenų. Įrodyta, kad MinD reguliuoja chloroplasto FtsZ žiedo padėtį, kaip ir jo cianobakterijų atitikmuo (Yang ir kt., 2008 Maple ir Moller, 2010 Yoshida ir kt., 2010 Miyagishima ir kt., 2011). Nors FtsI, FtsW ir SepF funkcijos eukariotiniuose dumbliuose nenustatytos, šie baltymai lokalizuojasi bakterijų dalijimosi vietoje ir įrodyta, kad jie dalyvauja cianobakterijų ląstelių dalijime (Marbouty ir kt., 2009a, 2009b).

Scheminis chloroplastų dalijimosi komplekso vaizdas ir cianobakterinės kilmės chloroplastų dalijimosi baltymų pasiskirstymas. (A) Padalijimų komplekso komponentų lokalizacija (modifikuota pagal Miyagishima et al. 2011). Rodomi tik žinomi dalijimosi vietoje lokalizuoti komponentai ir baltymai, lemiantys dalijimosi vietą (Yang et al. 2008 Maple and Moller 2010 Yoshida et al. 2010 Miyagishima et al. 2011). Kai kurios linijos turi dviejų tipų FtsZ, kurios yra susijusios su chloroplastų dalijimu. Viridiplantae jie vadinami FtsZ1 ir FtsZ2. Padalijimo baltymai, būdingi tik sausumos augalams, tokiems kaip PDV1, PDV2, MCD1 ir PARC6, nerodomi. Nors diagramoje neįtrauktas, ARC3 taip pat dalyvauja nustatant FtsZ žiedo padėtį ir yra užkoduotas sausumos augalų ir tam tikrų žaliųjų dumblių linijų branduoliniuose genomuose. Kadangi ARC3 nerastas Cianidioschizonas merolae ir Chlamidomonas reinhardtii, kuriame yra visos branduolio genomo sekos, šiame tyrime negalėjome ištirti išraiškos. Buvo įrodyta, kad MinC, FtsW, FtsI ir SepF dalyvauja melsvabakterių dalijime (Marbouty ir kt. 2009a, 2009b), tačiau šių baltymų funkcija ir lokalizacija chloroplastuose nenustatyta. (B) Melsvabakterinės kilmės chloroplastų dalijimosi genų pasiskirstymas ir išvestas endosimbitozinio genų perdavimo laikas (atnaujinta iš Miyagishima ir kt., 2011). Medžio topologija pagrįsta Becker ir Marin (2009) ir Archibald (2009). Šakų ilgiai neatspindi filogenetinių atstumų. „Blast“ ieškojo baltymų pagal viso genomo duomenų bazę C. merolae, Ostreokokas lucimarinus, C. reinhardtii, Physcomitrella patens, ir Arabidopsis thaliana. Kitais atvejais buvo atliekamos paieškos chloroplastų genomo duomenų bazėse ir EST duomenų bazėse Cyanophora paradoksas, Guillardia teta, Nefroselmis olivacea, Chlorella vulgaris, ir Mesostigma viride. Kadangi nėra visos genominės informacijos apie pastaruosius penkis organizmus, yra tušti stulpeliai. Žvaigždutės nurodo genus, kurie buvo nustatyti šiame tyrime. FtsZ stulpelyje „nm“ rodo, kad FtsZ yra užkoduotas nukleomorfe, relikviniame branduolyje, kuris kilo iš raudonųjų dumblių antrinio endosimbionto. „D“, „E“, „Z“, „6“ ir „C“ nurodo išvestinį endosimbiotinio geno perdavimo laiką. minD, minE, ftsZ, lankas6 (ftn2 cianobakterijose) ir minC, atitinkamai. C. paradoxa, Cyanophora paradoxa UTEX555 C. merolae, Cyanidioschyzon merolae 10D G. teta, Guillardia teta N. olivacea, Nephroselmis olivacea NIES-484 O. lucimarinus, Ostreococcus lucimarinus CCE9901 C. vulgaris, Chlorella vulgaris C-27 C. reinhardtii, Chlamydomonas reinhardtii M. virde, Mesostigma viride NIES-296 P. patensas, Physcomitrella patens A. thaliana, Arabidopsis thaliana. Aminorūgščių sekų GenBank prisijungimo numeriai yra apibendrinti 1 papildomoje lentelėje (papildoma medžiaga internete).

Scheminis chloroplastų dalijimosi komplekso vaizdas ir cianobakterinės kilmės chloroplastų dalijimosi baltymų pasiskirstymas. (A) Padalijimų komplekso komponentų lokalizacija (modifikuota pagal Miyagishima et al. 2011). Rodomi tik žinomi dalijimosi vietoje lokalizuoti komponentai ir baltymai, lemiantys dalijimosi vietą (Yang et al. 2008 Maple and Moller 2010 Yoshida et al. 2010 Miyagishima et al. 2011). Kai kurios linijos turi dviejų tipų FtsZ, kurios yra susijusios su chloroplastų dalijimu. Viridiplantae jie vadinami FtsZ1 ir FtsZ2. Padalijimo baltymai, būdingi tik sausumos augalams, tokiems kaip PDV1, PDV2, MCD1 ir PARC6, nerodomi. Nors ir neįtrauktas į diagramą, ARC3 taip pat dalyvauja nustatant FtsZ žiedą ir yra užkoduotas sausumos augalų branduoliniuose genomuose ir tam tikrose žaliųjų dumblių linijose. Kadangi ARC3 nerastas Cianidioschizonas merolae ir Chlamidomonas reinhardtii, kuriose yra visos branduolinės genomo sekos, mes negalėjome ištirti šio tyrimo išraiškos. Įrodyta, kad MinC, FtsW, FtsI ir SepF dalyvauja cianobakterijų dalijimuisi (Marbouty ir kt., 2009a, 2009b), tačiau šių baltymų funkcija ir lokalizacija chloroplastuose nebuvo nustatyta. (B) Melsvabakterinės kilmės chloroplastų dalijimosi genų pasiskirstymas ir išvestas endosimbitozinio genų perdavimo laikas (atnaujinta iš Miyagishima ir kt., 2011). Medžio topologija pagrįsta Becker ir Marin (2009) ir Archibald (2009). Šakų ilgiai neatspindi filogenetinių atstumų. „Blast“ ieškojo baltymų pagal viso genomo duomenų bazę C. merolae, Ostreokokas lucimarinus, C. reinhardtii, Physcomitrella patens, ir Arabidopsis thaliana. Kitais atvejais buvo atliekamos paieškos chloroplastų genomo duomenų bazėse ir EST duomenų bazėse Cyanophora paradoksas, Guillardia teta, Nefroselmis olivacea, Chlorella vulgaris, ir Mesostigma viride. Kadangi nėra visos genominės informacijos apie pastaruosius penkis organizmus, yra tušti stulpeliai. Žvaigždutės nurodo genus, kurie buvo nustatyti šiame tyrime. FtsZ stulpelyje „nm“ reiškia, kad FtsZ yra užkoduotas nukleomorfe - relikviniame branduolyje, kuris atsirado iš antrinio raudonųjų dumblių endosimbionto. „D“, „E“, „Z“, „6“ ir „C“ nurodo išvestinį endosimbiotinio geno perdavimo laiką. minD, minE, ftsZ, lankas6 (ftn2 cianobakterijose) ir minC, atitinkamai. C. paradoxa, Cyanophora paradoxa UTEX555 C. merolae, Cyanidioschyzon merolae 10D G. teta, Guillardia teta N. olivacea, Nephroselmis olivacea NIES-484 O. lucimarinus, Ostreococcus lucimarinus CCE9901 C. vulgaris, Chlorella vulgaris C-27 C. reinhardtii, Chlamydomonas reinhardtii M. virde, Mesostigma viride NIES-296 P. patens, Physcomitrella patens A. thaliana, Arabidopsis thaliana. Aminorūgščių sekų GenBank prisijungimo numeriai yra apibendrinti 1 papildomoje lentelėje (papildoma medžiaga internete).

Vienas iš šio tyrimo tikslų – ištirti ryšį tarp chloroplastų dalijimosi genų ekspresijos reguliavimo ir endosimbiotinio geno perkėlimo iš chloroplasto į branduolinį genomą. Taigi, prieš apibūdindami kiekvieną organizmą atskirai, palyginome žinomų cianobakterinės kilmės chloroplastų dalijimosi genų repertuarą ir genų vietą (t. y. branduolio ar chloroplasto genomą), kad nustatytų endosimbiotinių genų perdavimo laiką (1B pav.). Tarp chloroplastų dalijimosi genų, FTSZ, ARC6, ir MINC (MinC dalyvauja nustatant FtsZ žiedo padėtį bakterijose, tačiau jo funkcija eukariotų dumbliuose nenustatyta) buvo rasta tik branduoliniame genome, o tai rodo, kad šie genai buvo perkelti į branduolinį genomą prieš atsirandant išlikusiems dumbliams. linijos (1B pav.). Priešingai, ftsI, ftsW, ir rugsėjo F buvo aptikti tik chloroplasto genome, o tai rodo, kad šie genai buvo prarasti, o ne perkelti į šeimininko branduolio genomą. Paskirstymo modeliai ftsI ir ftsW rodo, kad šie genai buvo prarasti kelis kartus nepriklausomai skirtingose ​​linijose (1B pav.).

Paskirstymo modeliai PROTAS (minD) ir MANO (minE) genai rodo, kad šie genai buvo perkelti į branduolinį genomą kelis kartus nepriklausomai skirtingomis linijomis, kaip aprašyta toliau. Naudojant Blast paieškas EST duomenų bazėje C. paradoxa (Reyes-Prieto ir kt. 2006), radome užkoduotą branduolį MANO (įskaitant visą ilgį orf GenBank prisijungimo numeris EC659992) ir PROTAS (kuriame yra 210 bp orf EH035858) cDNR sekos. Jų ekspresija buvo patvirtinta RT-PCR, ir mes toliau klonavome ilgiau PROTAS cDNR (756 bp orf). Nors anksčiau buvo pranešta, kad MinE kartu su MinD yra užkoduotas chloroplasto genome C. vulgaris (Wakasugi ir kt., 1997) (C-27, ta pati padermė, kuri buvo naudojama šiame tyrime), nukleotidų seka ir išvestoji aminorūgščių seka (NP_045873) neparodė reikšmingo panašumo į kitų organizmų genus ar baltymus, įskaitant minE genai ir MinE baltymai mūsų Blast paieškoje. Be to, radome MANO cDNR (CAB42593) anksčiau apibūdintuose branduoliniuose cDNR klonuose Auxenochlorella protothecoides (Hortensteiner ir kt. 2000), kuri yra glaudžiai susijusi su C. vulgaris. Todėl tikėjomės, kad MinE bus užkoduotas branduoliniame genome C. vulgaris ir, tiesą sakant, branduolinis MANO cDNR buvo rasta RT-PCR. Nenustatyta, kad MinE ir MinD būtų užkoduoti C. merolae genomo, o tai rodo, kad šie genai buvo prarasti protėviuose. Tačiau abu baltymai yra užkoduoti kriptomonado chloroplastų genome Guillardia teta, kuriame yra raudonųjų dumblių antrinės endosimbiotinės kilmės chloroplastų, o tai rodo, kad MinD ir MinE iš pradžių buvo užkoduoti raudonųjų dumblių protėvio chloroplastų genome. Atsižvelgiant į šiuos paskirstymo modelius PROTAS (minD) ir MANO (minE) genai, endosimbiotinis genų perdavimas minD tikriausiai pasitaikė bent keturis nepriklausomus atvejus glaukofitų, chlorophyceae (žaliųjų dumblių grupė), Mamiellophyceae (žaliųjų dumblių grupė) ir sausumos augalų protėviuose (1B pav.). Endosimbiotinis genų perdavimas minE tikriausiai atsirado nepriklausomai bent du kartus glaukofitų ir Viridiplantae (žaliųjų dumblių ir streptofitų) protėviuose (1B pav.).Kadangi endosimbiotinių genų perdavimo laikas yra išvestas remiantis švelniais sumetimais, tikėtina, kad kiekvienam genui gali būti daugiau nepriklausomo perdavimo atvejų.

Ląstelių ciklo reguliuojama chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija raudonuosiuose dumbliuose C. merolae

Vienaląsčiai raudonieji dumbliai C. merolae vienoje ląstelėje yra vienas chloroplastas, kuris dalijasi vieną kartą prieš citokinezę (2 pav.). Ankstesni tyrimai naudojant C. merolae sinchronizuotas pagal šviesos / tamsos ciklą, parodė, kad chloroplastų dalijimosi genų nuorašai ir baltymai kaupiasi būtent prasidėjus tamsiajam periodui, kai prasideda chloroplastų dalijimasis (Takahara ir kt., 2000 Fujiwara ir kt., 2009 Yoshida ir kt., 2010). Dėl šviesos / tamsos ciklo naudojimo vis dar buvo neaišku, ar chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresiją reguliuoja ląstelių ciklas, o ne šviesos ar cirkadiniai ritmai. Be to, chloroplastų dalijimosi laikas buvo priskirtas G2 ir M fazėms (Fujiwara ir kt., 2009 Yoshida ir kt., 2010), iš esmės remiantis ląstelių morfologijos stebėjimais, tačiau tikslus chloroplastų dalijimosi genų ekspresijos ir chloroplastų dalijimosi laikas į ląstelių ciklą nebuvo pranešta.

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija raudonųjų dumblių ląstelių ciklo metu Cianidioschizonas merolae. C. merolae Šiame tyrime buvo naudojamas 10D. (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje C. merolae. Ląstelės buvo įtrauktos į 12 valandų šviesos ir 12 valandų tamsos ciklą. Rodomos antrojo ciklo ląstelės. Norint sulaikyti ląsteles S arba M fazėje, nurodytu laiko momentu į kultūrą buvo pridėta kamptotecino (DNR topoizomerazės-I inhibitorius) arba MG-132 (proteasomų inhibitorius). (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, parodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų padalijimo genai yra dėžutėse. 18S rRNR (CMQ305R) buvo naudojama kaip kiekybinė kontrolė. PCNA (CMS101C) ir CDC20 (CMA138C) buvo naudojami atitinkamai kaip S ir M fazės žymenys. (C) Imunoblotiniai tyrimai, rodantys chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. (D) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija, o raudona yra chlorofilo autofluorescencija. Mastelio juosta = 5 μm (A), 2 μm (D).

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija raudonųjų dumblių ląstelių ciklo metu Cianidioschizonas merolae. C. merolae Šiame tyrime buvo naudojamas 10D. (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje C. merolae. Ląstelės buvo įtrauktos į 12 valandų šviesos ir 12 valandų tamsos ciklą. Rodomos antrojo ciklo ląstelės. Norint sulaikyti ląsteles S arba M fazėje, nurodytu laiko momentu į kultūrą buvo pridėta kamptotecino (DNR topoizomerazės-I inhibitorius) arba MG-132 (proteasomų inhibitorius). (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, rodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų dalijimosi genai yra dėžutėse. 18S rRNR (CMQ305R) buvo naudojama kaip kiekybinė kontrolė. PCNA (CMS101C) ir CDC20 (CMA138C) buvo naudojami atitinkamai kaip S ir M fazės žymenys. (C) Imunobloto analizė, rodanti chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. (D) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija, o raudona yra chlorofilo autofluorescencija. Mastelio juosta = 5 μm (A), 2 μm (D).

Norėdami ištirti, ar chloroplastų dalijimosi laiką tiesiogiai kontroliuoja ląstelių ciklas, ir, jei taip, nustatyti ląstelių ciklo etapą, kuriame chloroplastas dalijasi, sulaikėme ląsteles sinchroninėje kultūroje S arba M fazėje, naudodami inhibitorius. ląstelių ciklo progresavimo. Įrodyta, kad ląstelių ciklą reguliuoja cirkadiniai ritmai, tačiau cirkadinio laikrodžio mechanizmas svyruoja nepriklausomai nuo ląstelės ciklo progreso (Goto ir Johnson 1995 Mori ir Johnson 2001). Norint sustabdyti ląsteles S fazėje, į kultūrą buvo pridėta kamptotecino, specifinio DNR topoizomerazės I inhibitoriaus (Nishida ir kt., 2005). RT-PGR analizės parodė, kad lygis PCNA (S fazės žymeklio genas Pcna dalyvauja pagrindinės grandinės sintezėje DNR replikacijos metu, Morgan 2006) išlieka pastovus ir CDC20 (M fazės žymeklio genas Cdc20 veikia pereinant iš metafazės į anafazę, Morgan 2006) nėra transkribuojamas, o tai priešingai nei kultūroje be inhibitoriaus, kurioje PCNA nuorašas išnyksta po S fazės ir tada CDC20 kaupiasi nuorašas (2B pav.). Šie rezultatai rodo, kad kamptotecinas efektyviai sulaikė ląsteles S fazėje. Norėdami sustabdyti ląsteles M fazėje, į kultūrą buvo pridėtas proteasomų inhibitorius MG-132 (Nishida ir kt., 2005). RT -PGR analizė parodė, kad lygis CDC20 išlieka pastovus, priešingai nei kultūroje, kurioje nėra inhibitoriaus, kurioje CDC20 nuorašas išnyksta po M fazės (2B pav.). Šie rezultatai rodo, kad MG-132 ląstelės buvo efektyviai sulaikytos M fazėje.

Kai ląstelės buvo sulaikytos S fazėje, nors ląstelės nesidalijo, chloroplastai dalijasi toliau, gamindami nenormalias ląsteles, kurių vienoje ląstelėje yra keturi chloroplastai (2A pav.), kaip aprašyta anksčiau (Itoh ir kt., 1996 Nishida ir kt., 2005). ). RT-PGR analizės parodė, kad visų žinomų chloroplastų padalijimo genų transkriptų lygiai išliko pastovūs po to, kai transkriptai atsirado maždaug 12 valandą sinchroninėje kultūroje (2B pav.). Imunoblotinė analizė parodė, kad FtsZ2-1 ir Drp5B baltymų lygiai taip pat išliko pastovūs po pirmojo pasirodymo maždaug 12 val. sinchroninėje kultūroje (2C pav.). Priešingai, kai ląstelės buvo sulaikytos M fazėje, chloroplastų dalijimasis sustojo po vieno dalijimosi raundo S fazės metu (2A pav.). RT-PGR ir imunobloto analizės parodė, kad chloroplastų dalijimosi genų ir FtsZ2-1 bei Drp5B baltymų transkriptai išnyko po S fazės, kaip buvo pasėlyje be inhibitoriaus (2B ir C pav.). Dėl šių rezultatų C. merolae rodo, kad 1) chloroplastų dalijimasis vyksta tik S fazės metu, 2) taip yra todėl, kad chloroplastų dalijimosi kompleksas susidaro būtent S fazės metu (2D pav.), ir 3) šis reguliavimas bent iš dalies pagrįstas išraiška ir chloroplastų dalijimosi komplekso komponentų skilimas atitinkamai S fazės ir M fazės metu.

Ląstelių ciklas – reguliuojama chloroplastų skyriaus genų ir baltymų ekspresija žaliuosiuose dumbliuose C. reinhardtii

Siekdami ištirti bendrus eukariotinių dumblių chloroplastų dalijimosi reguliavimo bruožus ir skirtumus, ištyrėme ryšį tarp ląstelių ciklo ir chloroplastų dalijimosi genų bei baltymų ekspresijos žaliuosiuose dumbliuose. C. reinhardtii. C. reinhardtii ląstelėje yra vienas chloroplastas, ir šis chloroplastas dalijasi S/M fazės metu. G1 fazės metu ląstelės išauga daug kartų, o vėliau patenka į du ar keturis S/M fazių ratus, kad susidarytų 4–16 dukterinių ląstelių (3A pav.) (Surzycki 1971). Ankstesni tyrimai naudojant C. reinhardtii sinchronizuoti šviesos ir tamsos ciklu parodė, kad lygiai FTSZ1, FTSZ2, PROTAS, ir MANO nuorašai svyruoja ankstyvuoju tamsiuoju periodu (Adams et al. 2008 Hu et al. 2008). Kadangi šis svyravimas išliko arba nuolatinėje šviesoje, arba tamsoje (tamsos sąlygomis pasiekęs aukščiausią tašką subjektyviame-tamsiame periode, ląstelės vis dar dalijamos heterotrofinėje terpėje) po ankstesnio įtraukimo į šviesos ir tamsos ciklą, buvo pasiūlyta, kad koreliuoja su cirkadiniu ritmu (Hu et al. 2008). Tačiau ląstelių ciklas C. reinhardtii Jį taip pat reguliuoja cirkadinis ritmas (Goto ir Johnson 1995), todėl vis dar neaišku, ar chloroplastų dalijimosi genų ekspresiją reguliuoja cirkadinis ritmas, ar ląstelių ciklas.

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija žaliųjų dumblių ląstelių ciklo metu Chlamidomonas reinhardtii. C. reinhardtii Šiame tyrime buvo naudojamas 137c (Chlorophyceae). (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje C. reinhardtii. Ląstelės buvo įtrauktos į 12 valandų šviesos ir 12 valandų tamsos ciklą. Rodomos antrojo ciklo ląstelės. Norint sulaikyti ląsteles S fazėje, nurodytu laiko momentu į kultūrą buvo pridėtas deoksiadenozinas, kuris blokuoja DNR sintezę. (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, parodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų padalijimo genai yra dėžutėse. EF-1α (XM_001696516) buvo naudojamas kaip kiekybinė kontrolė. CYCA (XM_001693115) buvo naudojamas kaip S fazės žymeklis. (C) Imunoblotiniai tyrimai, rodantys chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. (D) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija, o raudona yra chlorofilo autofluorescencija. Mastelio juosta = 10 μm (A), 2 μm (D).

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija žaliųjų dumblių ląstelių ciklo metu Chlamidomonas reinhardtii. C. reinhardtii Šiame tyrime buvo naudojamas 137c (Chlorophyceae). (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje C. reinhardtii. Ląstelės buvo įtrauktos į 12 valandų šviesos ir 12 valandų tamsos ciklą. Rodomos antrojo ciklo ląstelės. Norint sulaikyti ląsteles S fazėje, nurodytu laiko momentu į kultūrą buvo pridėtas deoksiadenozinas, kuris blokuoja DNR sintezę. (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, parodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų dalijimosi genai yra dėžutėse. EF-1α (XM_001696516) buvo naudojamas kaip kiekybinė kontrolė. CYCA (XM_001693115) buvo naudojamas kaip S fazės žymeklis. (C) Imunoblotiniai tyrimai, rodantys chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. (D) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija, o raudona yra chlorofilo autofluorescencija. Mastelio juosta = 10 μm (A), 2 μm (D).

RT -PGR analizė, atlikta naudojant sinchroninę kultūrą, parodė, kad visų žinomų chloroplastų dalijimosi genų nuorašai buvo sukaupti specialiai S/M fazėse (be FTSZ1, taip pat buvo FTSZ2, PROTAS, ir MANO, ARC6, MINC, ir DRP5B) (3B pav.). Šis modelis taip pat buvo stebimas esant nuolatinei šviesai po šviesos ir tamsos ciklo įtraukimo. Kai ląstelės buvo sulaikytos S/M fazėje deoksiadenozinu, kuris, kaip įrodyta, slopina DNR sintezę C. reinhardtii (Harper ir John 1986), chloroplastų dalijimosi genų transkripto lygiai ir S/M fazės žymeklis C. reinhardtii, CYCA (Bisova ir kt., 2005) išliko pastovus po jo pasirodymo maždaug 12 val. (3B pav.). Šis rezultatas rodo, kad chloroplastų dalijimosi genų ekspresiją reguliuoja ląstelių ciklas. Be to, imunoblotinė analizė parodė, kad FtsZ1, MinD ir Drp5B baltymai specifiškai kaupiasi S/M fazių metu ir vėliau suyra (3C pav.). Baltymų lygis išliko pastovus, kai ląstelės buvo sulaikytos S fazės metu (3C pav.). Imunofluorescencinė mikroskopija parodė, kad FtsZ žiedas susidaro tik S/M fazių metu (3D pav.). Šie rezultatai rodo, kad chloroplastų dalijimosi mechanizmų komponentų ekspresija S/M fazės metu ir šių baltymų skilimas po chloroplastų dalijimosi riboja chloroplastų dalijimosi komplekso susidarymo laiką žaliuosiuose dumbliuose. C. reinhardtii panašiai kaip raudonuosiuose dumbliuose C. merolae. Priešingai nei C. merolae (2A pav.), chloroplastų dalijimasis sustojo susiaurėjus dalijimosi vietai C Reinhardtii kai kamera buvo suimta S/M fazėse (3A pav.), tačiau priežastis šiuo metu nėra aiški.

Ryšys tarp ląstelių ciklo ir chloroplastų skyriaus genų bei baltymų ekspresijos žaliuosiuose dumbliuose C. vulgaris, kuriame MinD baltymas yra užkoduotas chloroplasto genome

Abejuose C. merolae ir C. reinhardtii, visi chloroplastų dalijimosi genai yra užkoduoti branduoliniame genome. Priešingai, keli chloroplastų padalijimo genai cianobakterinės kilmės vis dar yra užkoduoti chloroplastų genome tam tikrose dumblių linijose (1B pav.). Siekdami ištirti ryšį tarp chloroplastų dalijimosi genų endosimbiotinių genų perkėlimo iš chloroplasto į branduolio genomą ir genų ekspresijos reguliavimą ląstelės šeimininko cikle, ištyrėme chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresiją žaliuosiuose dumbliuose. C. vulgaris, kuriame MinD baltymas yra užkoduotas chloroplastų genome, kaip aprašyta aukščiau. C. vulgaris ląstelėse yra vienas chloroplastas, o ląstelių ciklas gali būti sinchronizuojamas pagal šviesos ir tamsos ciklą (Tamiya ir kt., 1953). Panašus į C. reinhardtii, ląstelės auga G1 fazės metu ir tada patenka į du ar keturis S/M fazių raundus, kad susidarytų 4–16 dukterinių ląstelių (4A pav.) (Tamiya ir kt., 1953).

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija žaliųjų dumblių ląstelių ciklo metu Chlorella vulgaris. C. vulgaris Šiame tyrime buvo naudojamas C-27 (Trebouxiophyceae). (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje Chlamidomonas reinhardtii. Ląstelės buvo įtrauktos į 16 valandų šviesos ir 8 valandų tamsos ciklą. Rodomos trečiojo ciklo ląstelės. (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, parodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų padalijimo genai yra dėžutėse. EF-1α ir užkoduotas chloroplastais rpoA (NC_001865) buvo naudojami kaip kiekybinė kontrolė. „N“ ir „CP“ nurodo genus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduolio ir chloroplasto genome. (C) Imunoblotiniai tyrimai, rodantys chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. N ir CP nurodo baltymus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduoliniame ir chloroplasto genome. Atkreipkite dėmesį, kad ląstelės buvo kultivuojamos dar 4 valandas tamsoje (B) ir (C). Mastelio juosta = 5 μm.

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija žaliųjų dumblių ląstelių ciklo metu Chlorella vulgaris. C. vulgaris Šiame tyrime buvo naudojamas C-27 (Trebouxiophyceae). (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje Chlamidomonas reinhardtii. Ląstelės buvo įtrauktos į 16 valandų šviesos ir 8 valandų tamsų ciklą. Rodomos trečiojo ciklo ląstelės. (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, parodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų padalijimo genai yra dėžutėse. EF-1α ir užkoduotas chloroplastu rpoA (NC_001865) buvo naudojami kaip kiekybinė kontrolė. „N“ ir „CP“ nurodo genus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduolio ir chloroplasto genome. (C) Imunoblotiniai tyrimai, rodantys chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. N ir CP nurodo baltymus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduoliniame ir chloroplasto genome. Atkreipkite dėmesį, kad ląstelės buvo auginamos dar 4 valandas tamsoje (B) ir (C). Mastelio juosta = 5 μm.

RT-PGR analizės C. vulgaris sinchronizuotas šviesos ir tamsos ciklu parodė, kad branduolys yra užkoduotas FTSZ1, DRP5B, ir MANO nuorašai, sukaupti maždaug chloroplastų dalijimosi metu (4B pav.). Chloroplasto užkoduotas transkripto lygis minD taip pat svyruoja, pasiekia aukščiausią tašką apie šviesos / tamsos perėjimą, kuris atitinka chloroplastų dalijimosi laiką. Tačiau esant nuolatinei šviesai po šviesos ir tamsos ciklo, minD nuorašo lygis toliau didėjo, priešingai nei FTSZ1, DRP5B, ir MANO, kuris sumažėjo po chloroplastų dalijimosi (4B pav.). Šie rezultatai rodo, kad chloroplastu užkoduoto nuorašo lygis minD kinta pagal šviesos sąlygas, o ne ląstelių ciklą ir chloroplastų dalijimosi laiką. Imunobloto analizė parodė, kad branduolio koduojami FtsZ1, Drp5B ir MinE baltymai kaupėsi prieš (MinE) arba maždaug (FtsZ1 ir Drp5B) chloroplastų dalijimosi laiką, o chloroplasto koduojamo MinD lygis išliko pastovus per visą ląstelių ciklą. Šis chloroplasto koduojamo MinD baltymo modelis kontrastuoja su branduolio koduojamu MinD baltymu C. reinhardtii, o tai rodo, kad MinD ekspresijos reguliavimo sistema šeimininko ląstelės cikle buvo sukurta po endosimbiotinio geno perdavimo minD nuo chloroplasto iki branduolinio genomo, bent jau šioje žaliųjų dumblių linijoje. Imunofluorescencinės mikroskopijos būdu negalėjome stebėti chloroplastų dalijimosi komplekso susidarymo laiko dėl labai storų ląstelių sienelių. C. vulgaris. Tačiau Drp5B baltymas ekspresuojamas tik chloroplastų dalijimosi metu, o tai rodo, kad subrendęs dalijimosi kompleksas susidaro tik tam tikru ląstelių ciklo laikotarpiu. C. vulgaris.

Ryšys tarp ląstelių ciklo ir chloroplastų skyriaus genų ir baltymų ekspresijos glaukofitų dumblyje C. paradoxa

Norėdami nustatyti, ar chloroplastų dalijimąsi reguliuoja ląstelių šeimininko ciklas, taip pat glaukofituose, ištyrėme chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresiją glaukofituose C. paradoxa. Glaukofitai išlaikė peptidoglikano sluoksnį tarp dviejų chloroplasto apvalkalo membranų, skirtingai nei kitų linijų chloroplastai, ir manoma, kad jie atsišako anksčiausiai augalų evoliucijos metu (Reyes-Prieto ir Bhattacharya 2007). Chloroplastų (vadinamų cianelėmis) skaičius vienam C. paradoxa ląstelė skiriasi nuo vienos iki šešių, tačiau daugumoje mūsų kultūros ląstelių buvo du ar keturi chloroplastai vienoje ląstelėje, kaip buvo pranešta anksčiau (Pickett-Heaps 1972 Sato ir kt., 2007).Išbandėme keletą sąlygų, siekdami sinchronizuoti ląstelių ciklą su šviesos ir tamsos ciklu, tačiau sinchronizavimo nepasiekėme. Todėl mes sinchronizavome ląsteles, sulaikydami ląsteles S fazėje su afidikolinu ir iš naujo paleisdami ląstelių ciklą pašalindami afidikoliną nuolatinės šviesos sąlygomis. Ląstelės citokinezės metu daugiausia buvo stebimos praėjus maždaug 6 valandoms po afidikolino pašalinimo (5A pav.), o tai rodo, kad ląstelės į M fazę pateko sinchroniškai. S fazės žymens RT-PGR analizė, PCNAir M fazės žymeklį, CYCB (koduojantis ann M fazės cikliną), taip pat parodė, kad kultūra buvo sinchronizuota (5B pav.).

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija glaukofitų dumblių ląstelių ciklo metu C. paradoxa. Šiame tyrime buvo naudojamas C. paradoxa UTEX555. (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje Cyanophora paradoksas. Ląstelės buvo sulaikytos S fazėje su afidikolinu (DNR polimerazės inhibitoriumi) 24 valandas nuolatinėje šviesoje, o tada ląstelių ciklas buvo atnaujintas nuolatinėje šviesoje, kartu pašalinant afidikoliną. (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, parodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų padalijimo genai yra dėžutėse. EF-1α buvo naudojamas kaip kiekybinė kontrolė. Pcna ir CycB buvo naudojami kaip S ir M fazių žymekliai. „N“ ir „CP“ nurodo genus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduolio ir chloroplasto genome. (C) Imunoblotiniai tyrimai, rodantys chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. N ir CP nurodo baltymus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduoliniame ir chloroplasto genome. (D) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija, o raudona yra chlorofilo autofluorescencija. Mastelio juostos = 10 μm (A ir D).

Chloroplastų dalijimosi genų ir baltymų ekspresija glaukofito dumblio C. paradoxa ląstelių ciklo metu. Šiame tyrime buvo naudojamas C. paradoxa UTEX555. (A) Ląstelių ciklo progresavimas sinchroninėje kultūroje Cyanophora paradoksas. Ląstelės buvo sulaikytos S fazėje su afidikolinu (DNR polimerazės inhibitoriumi) 24 valandas nuolatinėje šviesoje, tada ląstelių ciklas buvo atnaujintas nuolatinėje šviesoje, kartu pašalinant afidikoliną. (B) Pusiau kiekybinės RT-PGR analizės, parodančios chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygių pokyčius sinchroninės kultūros metu. Chloroplastų padalijimo genai yra dėžutėse. EF-1α buvo naudojamas kaip kiekybinė kontrolė. Pcna ir CycB buvo naudojami kaip S ir M fazių žymekliai. „N“ ir „CP“ nurodo genus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduolio ir chloroplasto genome. (C) Imunoblotiniai tyrimai, rodantys chloroplastų dalijimosi baltymų lygio pokyčius sinchroninės kultūros metu. N ir CP nurodo baltymus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduoliniame ir chloroplasto genome. (D) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija, o raudona yra chlorofilo autofluorescencija. Mastelio juostos = 10 μm (A ir D).

RT-PCR parodė, kad per visą ląstelių ciklą branduolio nuorašo lygiai buvo užkoduoti PROTAS ir MANO pasikeitė, pasiekdamas aukščiausią tašką S fazės metu (5B pav.), o branduolio nuorašo lygiai užkoduoti FTSZ ir chloroplastų užkoduotas ftsW ir rugsėjo F išliko pastovus (5B pav.). Imunobloto analizė parodė, kad MinD ir MinE baltymų lygiai kinta, pasiekę didžiausią S fazės metu, tuo tarpu FtsZ lygis yra pastovus per visą ląstelių ciklą (5C pav.), Kaip ir atitinkamų transkriptų lygiai (5B pav.). Priešingai nei nuolatinė išraiška rugsėjo F transkripto (5B pav.), pasikeitė SepF baltymų lygis, pasiekęs didžiausią S fazės metu (5C pav.). Nors FtsZ lygis išliko pastovus per ląstelių ciklą, FtsZ žiedai daugiausia buvo stebimi ląstelėse S fazės metu (5D pav.). Šie rezultatai rodo, kad chloroplastų koduojamų dalijimosi genų transkripcijos nereguliuoja ląstelės-šeimininkės ciklas, kaip C. vulgaris minD. Rezultatai taip pat rodo, kad ląstelė-šeimininkė gali nustatyti chloroplastų dalijimosi laiką pagal ląstelių ciklu pagrįstą ne visų, bet tik kai kurių branduolio koduojamų chloroplastų dalijimosi genų / baltymų reguliavimą.

Ryšys tarp ląstelių ciklo ir chloroplastų skyriaus genų bei baltymų ekspresijos streptofitų dumbluose M. viride

Išnagrinėjome chloroplastų dalijimosi laiko reguliavimą trijose pagrindinėse eukariotinių dumblių grupėse, turinčiose pirminius chloroplastus (glaukofitus, taip pat raudonuosius ir žaliuosius dumblius). Galiausiai ištyrėme ryšį su streptofitų dumbliais M. viride, vienas iš anksčiausiai besiskiriančių streptofitų narių, apimančių tam tikras dumblių linijas ir sausumos augalus (Becker ir Marin 2009 Delwiche ir Timme 2011). M. viride Kiekvienoje ląstelėje yra vienas puodelio formos chloroplastas. Nes nepavyko sinchronizuoti M. viride Taikant įvairius šviesos ir tamsos ciklus arba gydydami vaistais, nesinchroniškai besidauginančias ląsteles nuolatinėje šviesoje, naudodami mikroskysčių prietaisą, suskirstėme į dvi frakcijas, kuriose yra atitinkamai mažesnės ir didesnės ląstelės (6A pav.). Frakcionuojant gautas pakankamas ląstelių skaičius RT-PCR analizei, bet ne imunoblotingas. RT-PCR patvirtino, kad ląstelės S fazėje (išreikšdamos PCNA) ir M fazė (išreiškianti CYCB) yra praturtinti didesnių ląstelių frakcija (6B pav.). Analizės parodė, kad branduolio nuorašai užkoduoti FTSZ ir DRP5B taip pat yra praturtinti didesnių ląstelių dalimi, o chloroplastų užkoduoti transkriptai minD, ftsI, ir ftsW yra tolygiai pasiskirstę mažesnėse ir didesnėse ląstelių frakcijose (6B pav.). Imunofluorescencinė mikroskopija atskleidė, kad FtsZ žiedas egzistuoja tik didesnėse ląstelėse (6C pav.). Šie rezultatai rodo, kad chloroplastų dalijimosi komplekso susidarymą ir branduolio koduojamų, bet ne chloroplastu koduojamų chloroplastų dalijimosi genų transkripciją reguliuoja ląstelės šeimininko ciklas. M. viride, kaip buvo pastebėta žaliųjų dumblių atveju C. vulgaris ir glaukofito dumbliai C. paradoxa.

Chloroplastų dalijimosi genų ekspresija ląstelių ciklo metu Mesostigma viride. M. viride Šiame tyrime buvo naudojamas NIES-296 (Streptophyta, Mesostigmatophyceae). (A) Mažesnės ląstelės ir didesnės besidalijančios ląstelės buvo atskirtos mikrofluidiniu prietaisu nuo log-fazės kultūros nuolatinėje šviesoje. (B) Pusiau kiekybinė RT-PGR analizė, lyginanti chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygius tarp mažesnių ląstelių (S) ir didesnių besidalijančių ląstelių (L). Chloroplastų dalijimosi genai yra dėžutėse. EF-1α (DQ394295) buvo naudojamas kaip kiekybinė kontrolė. PCNA (DN262911) ir CYCB (EC728922) buvo naudojami kaip S ir M fazių žymenys. „N“ ir „CP“ nurodo genus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduolio ir chloroplasto genome. (C) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija. Diferencialinio trukdžių kontrasto vaizdai ir fluorescenciniai vaizdai yra sujungti. Mastelio juosta = 20 μm (A) ir 10 μm (C).

Chloroplastų dalijimosi genų ekspresija ląstelių ciklo metu Mesostigma viride. M. viride Šiame tyrime buvo naudojamas NIES-296 (Streptophyta, Mesostigmatophyceae). (A) Mažesnės ląstelės ir didesnės besidalijančios ląstelės buvo atskirtos mikrofluidiniu prietaisu nuo log-fazės kultūros nuolatinėje šviesoje. (B) Pusiau kiekybinė RT-PGR analizė, lyginanti chloroplastų dalijimosi genų mRNR lygius tarp mažesnių ląstelių (S) ir didesnių besidalijančių ląstelių (L). Chloroplastų dalijimosi genai yra dėžutėse. EF-1α (DQ394295) buvo naudojamas kaip kiekybinė kontrolė. PCNA (DN262911) ir CYCB (EC728922) buvo naudojami kaip S ir M fazių žymekliai. „N“ ir „CP“ nurodo genus, kurie yra užkoduoti atitinkamai branduolio ir chloroplasto genome. (C) Imunofluorescencinė mikroskopija, rodanti FtsZ žiedo susidarymo laiką. FtsZ lokalizaciją rodo žalia fluorescencija. Diferencialinio trukdžių kontrasto vaizdai ir fluorescenciniai vaizdai yra sujungti. Mastelio juosta = 20 μm (A) ir 10 μm (C).


Ląstelių ciklas

Ląstelių ciklas reiškia visus pokyčius, susijusius su ląstelių augimu ir vystymusi. Tai pokyčių serija, per kurią ląstelė dubliuoja savo genomą (visą genetinės informacijos rinkinį), sintezuoja kitus ląstelės komponentus ir galiausiai dalijasi į dvi dukterines ląsteles. Ląstelių ciklą kontroliuoja baltymų ciklinai, Ciklino priklausomos kinazės (CDK). Intervalas tarp dviejų ląstelių ciklų vadinamas generavimo laiku.

Ląstelių ciklas susideda iš trijų pagrindinių etapų:

2) M-fazė arba mitozinė fazė

Ląstelė nuo 75% iki 95% laiko praleidžia tarpfazėje (interfazėje arba ramybės fazėje), o likusį laiką praleidžia M fazėje.

Tai etapas nuo vieno ląstelių dalijimosi pabaigos iki kito ląstelių dalijimosi pradžios. Nors atrodo, kad ląstelė šioje stadijoje ilsisi, tačiau iš tikrųjų metaboliškai labai aktyvi, nes ląstelė ruošiasi kitam ląstelių dalijimuisi atlikdama daugybę biosintetinių veiksmų. Jį sudaro trys subfazės.

i) G1 fazė (1 tarpas arba pirmoji augimo fazė)

  • Ilgiausia tarpfazė.
  • Vyksta ląstelių augimas ir bendra medžiagų apykaita
  • Padidėja ląstelių branduolys.
  • Ląstelių organelės dauginasi
  • Susidarė daug energijos turintys junginiai (angliavandeniai, lipidai ir baltymai) ir RNR.

ii) Sintetinė fazė arba S-fazė

  • Vyksta DNR replikacija ir histono baltymų sintezė.
  • Chromosomas su dviem chromatidėmis laiko kartu centromeras.

iii)G2 fazė (Gap-2 fazė arba antroji augimo fazė)

  • DNR replikacija sustoja.
  • Vyksta RNR ir baltymų sintezė.
  • Ląstelių organelės dauginasi.


Reikia pažymėti
Pasibaigus G1 fazėje ląstelė turi dvi galimybes arba tęsti ląstelės ciklą ir pereiti į S fazę, arba sustabdyti ląstelės ciklą ir įvesti G° fazė (kai ląstelių ciklas sustabdomas dėl mitogenų ir daug energijos turinčių junginių trūkumo). Lemiamas veiksnys yra mitogenų ir daug energijos turinčių junginių prieinamumas, o lemiamas taškas vadinamas tikrinimo tašku. Kitas patikrinimo taškas yra tarp G.2 fazė ir M fazė, kai tikrinama RNR ir baltymų, reikalingų verpstės formavimuisi ir ląstelių augimui, gausa.

M fazė ( mitozinė fazė )

aš) Kariokinezė: Kariokinezė yra branduolio padalijimas ir baigiasi 4 fazėmis: profazė, metafazė, anafazė ir telofazė.

II) Citokinezė: Citokinezė yra citoplazmos dalijimasis. Augalų ląstelėse citokinezė vyksta ląstelių plokštelės metodu, o gyvūnuose ji vyksta skilimo arba susiaurėjimo metodu.

Ląstelių ciklo trukmė 

Ląstelių ciklo trukmė priklauso nuo ląstelės tipo ir išorinių veiksnių, tokių kaip temperatūra, maistas ir deguonies tiekimas. Paprastai žmogaus ląstelės dalijasi kas 24 valandas (10 valandų G1 fazė, 9 valandos S fazėje, 4 valandos G2 fazė ir 1 val. M fazėje).