Informacija

Suaugusiam daugialąsčiui organizmui pristatyti naujus genus?

Suaugusiam daugialąsčiui organizmui pristatyti naujus genus?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ar įmanoma įvesti naują geną į kiekvienos suaugusio daugialąsčio organizmo ląstelės (ar bent jau daugumos ląstelių) genomą? Kaip tai būtų padaryta?

Dėkoju,

CDB


Trumpas atsakymas, teoriškai taip, iš tikrųjų, esant dabartinei technikos padėčiai, ne.

Manau, jūs kalbate apie aukštesnius organizmus (pvz., Peles ar žmones), jei turite omenyje mažus nesudėtingus daugialąsčius organizmus, atsakymas yra teigiamas, jei galite transfekuoti visas ląsteles toliau aprašyta sistema.

Perspektyviausia technika yra CRISPR/Cas9 sistemos naudojimas, kuris jau buvo naudojamas kuriant visų tipų modifikuotus organizmus, bet pradedant nuo embriono. Čia yra gera gamtos nuoroda http://www.nature.com/nbt/journal/v32/n4/full/nbt.2842.html.

Šiuo metu nėra būdų, kaip pernešti visą organizmą visa sistema. Naujausi bandymai, apie kuriuos girdėjau, yra nukreipti į konkrečias ląsteles naudojant kapsuliavimo metodus, kurie susilieja tik su konkrečių ląstelių membrana, todėl tikslingai pristato CRISPR / Cas9 sistemą. Taip buvo bandoma išmušti apibrėžtus genomo regionus tose specifinėse ląstelėse, o ne įvesti naują geną.

Artimiausiu metu tikiu, kad tai bus įmanoma. Nebūtinai kiekviena organizmo ląstelė, bet bent jau tam tikri ląstelių tipai.


6 sesija: nuo prokariotų iki daugialąsčių organizmų

Kai Žemėje atsirado prokariotinė gyvybė, kaip ji išsivystė į didesnius, sudėtingesnius eukariotų organizmus? Trys mokslininkai padeda mums suprasti, kaip tai galėjo atsitikti. Dr Julie Theriot spėlioja apie svarbų vaidmenį, kurį galėjo atlikti su citoskeletu susiję baltymai šiame perėjime (ir ji ragina jus įrodyti, kad jos spėlionės neteisingos!). Dr. Milleris paaiškina, kaip endosimbiontai, tokie kaip mitochondrijos ir chloroplastai, tapo eukariotų galios organelėmis. Ir daktaras Nicole King sprendžia įdomų klausimą, kaip pirmieji daugialąsčiai gyvūnai galėjo išsivystyti iš mūsų vienaląsčių protėvių.


Mejozė ir seksualinis dauginimasis

Gebėjimas daugintis natūra yra pagrindinė visų gyvų būtybių savybė. Natūra reiškia, kad bet kurio organizmo palikuonys labai panašūs į jo tėvus ar tėvus. Begemotai gimdo begemotų veršelius Monterėjaus pušys išaugina sėklas, iš kurių išnyra Monterėjaus pušies daigai, o suaugę flamingos deda kiaušinius, iš kurių išsirita flamingo jaunikliai. Natūra apskritai nereiškia visiškai toks pat. Nors daugelis vienaląsčių organizmų ir keli daugialąsčiai organizmai gali pasigaminti genetiškai identiškus savo klonus per mitozinę ląstelių dalijimąsi, daugelis vienaląsčių organizmų ir dauguma daugialąsčių organizmų reguliariai dauginasi naudodami kitą metodą.

1 pav. Kiekvienas iš mūsų, kaip ir kiti dideli daugialąsčiai organizmai, pradeda savo gyvenimą kaip apvaisintas kiaušinis. Po trilijonų ląstelių dalijimosi kiekvienas iš mūsų virsta sudėtingu, daugialąsčiu organizmu. (a kreditas: Franko Wouterso darbo modifikavimas, kreditas b: Keno Cole'o darbo modifikavimas, USGS kreditas c: Martino Pettitto darbo modifikavimas)

Lytinis dauginimasis yra tėvų vykdoma lytinių ląstelių gamyba ir dviejų lytinių ląstelių susiliejimas, kad susidarytų viena unikali ląstelė. Daugialąsčiuose organizmuose ši nauja ląstelė dalijasi mitozinėmis ląstelėmis, kad išsivystytų į suaugusį organizmą. Ląstelių dalijimosi tipas mejozė veda prie ląstelių, kurios yra lytinio dauginimosi ciklo dalis. Seksualinis dauginimasis, ypač mejozė ir apvaisinimas, palikuonims suteikia skirtumų, kurie gali lemti seksualinės reprodukcijos evoliucinę sėkmę. Didžioji dauguma eukariotinių organizmų gali arba turi naudoti tam tikrą mejozę ir apvaisinimą.

Lytinis dauginimasis buvo ankstyva evoliucinė naujovė po eukariotinių ląstelių atsiradimo. Faktas, kad dauguma eukariotų dauginasi lytiškai, yra jų evoliucinės sėkmės įrodymas. Daugeliui gyvūnų tai yra vienintelis dauginimosi būdas. Ir vis dėlto mokslininkai pripažįsta kai kuriuos tikrus seksualinės reprodukcijos trūkumus. Iš pažiūros gali pasirodyti, kad palikuonys, kurie yra genetiškai identiški tėvams, yra naudingesni. Jei pirminis organizmas sėkmingai užima buveinę, panašiai sėkmingi būtų palikuonys, turintys tuos pačius bruožus. Taip pat akivaizdi nauda organizmui, kuris gali susilaukti palikuonių nelytinis dauginimasis, pumpurai, suskaidymas ar aseksualus kiaušinių gamyba. Šie dauginimosi būdai nereikalauja kito priešingos lyties organizmo. Nereikia eikvoti energijos ieškant ar pritraukiant draugą. Tą energiją galima skirti daugiau palikuonių susilaukimui. Iš tiesų, kai kurie organizmai, vedantys vienišą gyvenimo būdą, išsaugojo galimybę daugintis aseksualiai. Be to, aseksualios populiacijos turi tik moteris, todėl kiekvienas individas yra pajėgus daugintis. Priešingai, seksualinės populiacijos patinai (pusė populiacijos) patys susilaukia palikuonių. Dėl šios priežasties aseksuali populiacija teoriškai gali augti dvigubai greičiau nei seksualinė populiacija. Tai reiškia, kad konkurencijoje aseksualūs gyventojai turėtų pranašumą. Visi šie aseksualios reprodukcijos pranašumai, kurie taip pat yra seksualinės reprodukcijos trūkumai, turėtų reikšti, kad rūšių, turinčių aseksualų dauginimąsi, skaičius turėtų būti dažnesnis.

Tačiau daugialąsčiai organizmai, priklausantys tik nuo aseksualios reprodukcijos, yra labai reti. Kodėl seksualinis dauginimasis yra toks dažnas? Tai yra vienas iš svarbių biologijos klausimų ir nuo XX a. Antrosios pusės iki šiol buvo daug tyrimų. Tikėtinas paaiškinimas yra tas, kad seksualinės reprodukcijos skirtumai tarp palikuonių yra labai svarbūs tų palikuonių išlikimui ir dauginimuisi. Vienintelis aseksualių organizmų kitimo šaltinis yra mutacija. Tai yra didžiausias seksualinių organizmų įvairovės šaltinis. Be to, tos skirtingos mutacijos nuolat keičiamos iš kartos į kartą, kai skirtingi tėvai sujungia savo unikalius genomus, o genai sumaišomi į skirtingus derinius. mejozė. Mejozė yra branduolio turinio padalijimas, kuris padalija chromosomas tarp lytinių ląstelių. Variacija įvedama mejozės metu, taip pat kai lytinės ląstelės susijungia apvaisinimo metu.


Nuo vienaląsčių iki daugialąsčių: ką gali žalieji dumbliai „Volvox“ papasakokite apie daugialąsčių ir ląstelių diferenciacijos evoliuciją?

Nepaisant 2 mm skersmens ir tik 2 ląstelių tipų, žali dumbliai „Volvox“ žavi biologus daugiau nei 300 metų ir yra pavyzdinis organizmas vystymosi, fiziologiniams ir evoliuciniams tyrimams. Šiandien paskelbta BMC biologija nauji tyrimai analizuoja visą transkriptą „Volvox Carteri“ pagal RNR seką. Čia pagrindinis tyrimo autorius Arminas Hallmannas paaiškina, kaip tai daro įtaką mūsų supratimui apie evoliuciją nuo vienaląsčių iki daugialąsčių organizmų.

Vienaląsčiuose organizmuose visas užduotis išgyventi ir daugintis turi atlikti viena ir ta pati ląstelė, nes tik viena ląstelė sudaro visą organizmą. Vienas didžiausių sudėtingų gyvybės formų evoliucijos pasiekimų buvo perėjimas nuo vienaląsčių organizmų prie daugialąsčių organizmų su skirtingais ląstelių tipais.

Kadangi žingsnis nuo vienaląsčio iki daugialąsčio gyvenimo buvo žengtas anksti ir dažnai, selektyvus daugialąsčio pranašumas atrodo gana didelis. Daugialąsčiuose organizmuose, tokiuose kaip žmonės, daug ląstelių sudaro bendradarbiaujančią ląstelių bendruomenę su specializuotais ląstelių tipais ir darbo pasidalijimu tarp įvairių ląstelių. Pagrindinis biologinių tyrimų klausimas yra išsiaiškinti, kaip vienaląsčiai organizmai evoliucijos metu gali virsti daugialąsčiais organizmais.

Žalieji dumbliai „Volvox“

Situacija atrodo kitokia dėl vulkaninių žaliųjų dumblių, tokių kaip „Volvox Carteri“, kuriame daugialąsteliškumas yra palyginti nauja naujovė.

Kas įdomu apie mažus, sferinius žaliuosius dumblius „Volvox Carteri“ šiame kontekste? Nors sudėtingas daugialąsteliškumas eukariotuose išsivystė kelis kartus, daugumoje linijų yra gana sudėtinga ištirti jo molekulinį foną, nes perėjimas įvyko per toli praeityje ir, be to, šios linijos sukūrė daugybę ląstelių tipų.

Tačiau padėtis skiriasi vulvocininių žaliųjų dumblių, tokių kaip „Volvox Carteri“, kuriame daugialąsteliškumas yra palyginti nauja naujovė. Kalbant apie ląstelių sudėtį, V. carteri yra maždaug toks paprastas, koks gali būti daugialąstelis organizmas, tačiau jis turi daug ypatybių, apibūdinančių daug sudėtingesnių aukštesnių organizmų gyvenimo ciklus ir vystymosi istorijas.

V. carteri turi tik dviejų tipų ląsteles: 2000–4000 mažų, galutinai diferencijuotų, dvisluoksnių somatinių ląstelių, esančių šalia sferoido paviršiaus, ir maždaug 16 didelių, potencialiai nemirtingų dauginimosi ląstelių, esančių somatinių ląstelių sluoksnio viduje. Daugiau nei 95% tokio sferoido tūrio sudaro sudėtinga, tačiau skaidri tarpląstelinė matrica.

Gamtoje, „Volvox“ gyvena gėlo vandens tvenkiniuose, balose ir grioviuose. Iki 2 mm skersmens dumblius galite atpažinti net plika akimi. Beje, pavadinimas „Volvox“ kilęs iš lotyniško žodžio volvere, ridenti ir -Jautis, kaip ir atrox, reiškia „nuožmus“. Taigi, trumpai tariant, tai yra „aršus volas“.

„Volvox“ ir jo artimiesiems

Prieš kiek daugiau nei 300 metų jį atrado Antoni van Leeuwenhoek, „Volvox“ ne tik sužavėjo biologus, bet ir jau seniai tapo pavyzdiniu organizmu vystymosi, fiziologiniams ir evoliuciniams tyrimams.

Dabartinę jos būklę patvirtino ir tai, kad „Volvox“ turi gana įdomių giminaičių volvocine giminėje. Kelios šios linijos gentys gali būti išdėstytos konceptualioje serijoje, atsižvelgiant į didėjantį vienaląsčio vystymosi sudėtingumą Chlamidomonas, kolonijiniams organizmams be darbo pasidalijimo, pvz Gonijus, Pandorina, Yamagishiella ir Eudorina, daugialąsčiams organizmams, turintiems dalinį ar visišką gemalų ir somų darbo pasidalijimą, pvz Pleodorina ir „Volvox“, atitinkamai.

Šioje serijoje palaipsniui didėja ląstelių skaičius, organizmo poliškumas, tarpląstelinės matricos tūris vienoje ląstelėje, suaugusių organizmų dydis ir tendencija gaminti sterilias, galutinai diferencijuotas somatines ląsteles. Daugialąsteliškumo raida taip pat laikoma susijusi su laipsnišku perėjimu nuo izogamijos prie anizogamijos/oogamijos (lytinis dauginimasis suliejant panašaus dydžio gametas, lyginant su skirtingo dydžio lytinėmis ląstelėmis).

Taigi, vulkaniniai žalieji dumbliai ir ypač V. carteri suteikia unikalią galimybę ištirti daugialąsčius ir ląstelių diferenciacijas molekuliniu lygiu ir atrasti universalias taisykles, apibūdinančias perėjimą prie diferencijuoto daugialąsčio.

Branduolinių genomų sekos nustatymas ir V. carteri ir du jo giminaičiai, Chlamidomonas ir Gonijus, atskleidė, kad evoliuciniam perėjimui nuo vienaląsčių prie sudėtingų daugialąsčių dumblių, atrodo, reikia stebėtinai mažo genomo naujovių kiekio.

Didelio masto molekulinės analizės „Volvox“

Genomas V. carteri buvo įrodyta apie keturiolika tūkstančių genų. Šių genų ekspresija diktuoja, kaip veikia jos ląstelės, ir, be daugelio kitų užduočių, reguliuoja ląstelių diferenciaciją bei gemalų ir somų atskyrimą. Genų ekspresiją galima eksperimentiškai nustatyti išmatuojant tam tikro geno transkriptų kiekį. Jei tai daroma ne tik vienam genui, bet ir visiems genams vienu metu, tai yra transkripto analizė.

Neseniai atliktame tyrime, paskelbtame „BMC Biology“, mano kolegos ir aš išanalizavome visą jo nuorašą V. carteri RNR sekos nustatymu (RNA-Seq). Tai leido mums išmatuoti, kokia stipri kiekvieno geno ekspresija, ar ji išjungta. Kadangi mes išskyrėme ląstelių tipus „Volvox“ prieš atlikdami analizę, mes taip pat galėjome palyginti visų dviejų tipų ląstelių, ty somatinių ir reprodukcinių ląstelių, išraiškas.

Mūsų rezultatai rodo stebėtinai platų transkripto padalijimą tarp ląstelių tipų: daugiau nei pusė visų genų rodo aiškų somatinių ir reprodukcinių ląstelių ekspresijos skirtumą. Šis didelis diferencinės išraiškos laipsnis rodo stiprią ląstelių tipų diferenciaciją, nepaisant to V. carteri palyginti neseniai išsiskyrė su savo vienaląsčiais giminaičiais. Ląstelių tipui specifinės genų ekspresijos analizė taip pat leido gauti naujos informacijos apie anksčiau tirtą ekspresijos modelį „Volvox“ genų (maždaug keturi šimtai genų).

Visumos analizė „Volvox“ atskirtų ląstelių tipų transkripcija yra svarbus žingsnis siekiant suprasti molekulinę ir#8220 įrankių dėžę ”, kuri yra evoliucijos iš vienaląsčių į daugialąsčius organizmus pagrindas. Ilgainiui paprastų organizmų molekulinių procesų tyrimas turėtų padėti mums geriau suprasti daug sudėtingesnių gyvybės formų vystymosi istoriją ir pagrindines funkcijas.


Diskusija

Iki šiol yra mažai sisteminės literatūros apie tarpląstelinio bendravimo tarp žmogaus ląstelių tipų laipsnį. Išsamiausi iš literatūros gautų ligandų ir receptorių rinkiniai yra DLRP 27 ir HPMR 29 , tačiau nė vienas iš jų neapima sudėtingo signalų tinklo tarp normalių ląstelių tipų. Mes sudarėme ir iš esmės išplėtėme 1 179 žinomų ligandų ir receptorių porų rinkinį iki 1894 pirminės literatūros palaikomos ir 528 tariamos (sąveikaujančios PM ir išskiriami baltymai) poros. Naudodami šias ligandų ir receptorių poras ir unikalų FANTOM5 šaltinį, kuris suteikia šių genų ekspresijos lygius pagrindiniuose žmogaus pirminiuose ląstelių tipuose, sukūrėme ir išanalizavome pirmąjį didelio masto ląstelių komunikacijos žemėlapį ir atskleidėme platų intra ir signalizacija tarp linijų.

Remiantis baltymų, klasifikuojamų į skirtingas tarpląstelines lokalizacijos klases, ekspresijos profiliais, mes nustatėme, kaip ir galima tikėtis, kad išskiriami ir PM baltymai turi labiausiai ląstelių tipui būdingus ekspresijos profilius. Naudodami skirtingus šių baltymų genų įvertinimus, pastebėjome, kad jaunesni baltymai taip pat dažniau yra PM arba išskiriami baltymai, o vyresni yra branduoliniai arba citoplazminiai. Apskritai tai rodo, kad metazoanams toliau vystant naujus ląstelių tipus, buvo reikalingi nauji ląstelių tipui būdingi PM baltymai, skirti specialiai pažymėti šiuos naujų ląstelių tipus, ir kad nauji išskiriami baltymai turėjo pranešti apie naujo ląstelių tipo būseną kitoms ląstelėms, tai yra pagrindinės funkcijos, reikalingos specifiniam ryšiui tarp ląstelių. Nagrinėdami evoliucinę sąveikaujančių ligandų ir receptorių porų išvaizdą Wagner 21 metodu, pastebime naujų receptorių ir ligandų pliūpsnį, atsirandantį po Opisthokonta Bilateria ir Euteleostomi, tačiau mes taip pat nuosekliai stebime bendrą šališkumą, naudodami įvairius genų įvertinimo metodus kad receptoriai atsirastų prieš jų giminingus ligandus. Atrodytų, kad tai tinka vienam iš Ben-Shlomo pasiūlytų ligandų ir receptorių porų formavimo modelių ir kt. 29, kur esami PM baltymai (išankstiniai receptoriai) priima ligandus, kurie moduliuoja jų veiklą.

Siekdami būti naudingi mokslinių tyrimų bendruomenei, sukūrėme žiniatinklio įrankį (http://fantom.gsc.riken.jp/5/suppl/Ramilowski_et_al_2015/vis), kuris leidžia vartotojams rasti: (i) labiausiai išreikštus receptorius ir ligandai bet kokiam dominančiam ląstelių tipui (ii) specifiškiausi signalizacijos keliai tarp bet kurių dviejų ląstelių tipų ir (iii) visos ląstelės, kuriose naudojamas apibrėžtas ligandų ir receptorių porų rinkinys (1 papildoma pastaba). Žinomoms poroms mes teikiame nuorodas į pirminę literatūrą per „PubMed“, bet taip pat leidžiame vartotojui ištirti mūsų tyrimo metu nustatytas naujas poras. Įtariame, kad daugelis šių spėjamų porų yra tikros, remiantis žinoma paralogų sąveika (pavyzdžiui, žinoma, kad ENG yra surištas su INHBA, bet mes taip pat prognozuojame, kad paralogas INHBE jungiasi panašiai, kaip žinoma, kad CCR9 jungiasi su CCL25, bet mes tai prognozuojame. taip pat susieja CCL13) 41,42. Be to, kai kurių iš šių tariamų porų genai yra kartu susiję su liga, pavyzdžiui, APOE yra prognozuojamas kaip CHRNA4 ligandas, o keliuose dokumentuose buvo parodyta genetinė šių genų sąveika, daranti įtaką su amžiumi susijusiam pažinimo nuosmukiui 43 ir baltajai medžiagai. 44 tomas, panašiai prognozuojamas BDNF kaip naujas DRD4 ligandas ir buvo nustatyta genetinė šių dviejų genų sąveika, susijusi su nervine bulimija 45 .

Atrodo, kad jungčių tarp ląstelių tinklas yra neįtikėtinai sudėtingas su daugybe maršrutų tarp tų pačių dviejų ląstelių skirtingais ekspresijos ir specifiškumo lygiais. Skirtingai nuo transkripcijos reguliavimo tinklo, kuris paprastai yra supaprastintas iki genų rinkinio kaip mazgai ir transkripcijos faktoriaus surišimas kaip reguliavimo briaunos, ląstelių ir ląstelių tinklą sudaro ląstelės kaip mazgai, o tarp bet kurių dviejų ląstelių gali būti perduodami šimtai galimų pranešimų tarp jų. Be to, nėra lengva modeliuoti mazgo (ląstelės) fiziologinę reakciją be išsamių biocheminių duomenų. Čia, sutelkdami dėmesį tik į pagrindines signalizavimo poras (ląstelių pora, išreiškusi aukščiausią ligando lygį ir aukščiausią receptorių lygį kiekvienai sąveikaujančiai porai) ir toliau abstrahuojant tinklą, grupuojant ląsteles į linijas (5 pav.), didelis šališkumas bendraujant linijos viduje. Visų pirma kraujo atžvilgiu daugiau nei pusė ligandų buvo nukreipti į kitas kraujo ląsteles. GO praturtinimo genų porų, naudojamų bendraujant linijose arba tarp jų, analizė parodė, kad genai, dalyvaujantys kraujodaros sistemos linijų signalizavime, buvo praturtinti imuninio atsako ir uždegimo genų atžvilgiu, o genai, dalyvaujantys endotelio linijos signalizavime, dalyvavo angiogenezėje. Mezenchiminių ir epitelio linijų signalizavimas į hematopoetines ląsteles buvo praturtintas atitinkamai chemotaksės ir gynybos atsako terminais.

Išsamiau išnagrinėję atskirus kraštus, radome pavyzdžių, susijusių su linijai būdingais paralogais, naudojamais bendraujant su ligandų receptorių šeimomis, kurios dažnai laikomos apribotomis kita linija. Pavyzdžiui, chemokinai ir jų receptoriai paprastai laikomi hematopoetiniais, tačiau randame chemokinų, kurie yra labiausiai išreikšti mezenchiminėse, epitelio ir endotelio linijose ir, atrodo, naudojami ryšiui su kraujodaros linijomis. Signalizuodami nuo mezenchiminių iki kraujodaros ląstelių, randame CCL11 ir CXCL12 chemokinus.CCL11 yra labai ekspresuojamas lygiųjų raumenų ląstelėse, ypač ne kraujagyslių audiniuose (storosios žarnos, stemplės, prostatos ir gimdos), ir gali prisijungti prie CCR3 receptoriaus, išreikšto mieloidinėse ląstelėse. Šis ryšys turi funkcinių įrodymų, nes CCL11 ekspresija gimdos lygiųjų raumenų ląstelėse buvo susijusi su putliųjų ląstelių pritraukimu per CCR3 į gimdos ląstelių lejomiosarkomą 46 ir eozinofilinę infiltraciją į kitus audinius sergant liga 47 . Panašiai mes nustatome, kad CXCL12 (kuris jungiasi su CD4, CXCR3 ir CXCR4 kraujodaros ląstelėse) yra labai išreikštas sinoviocituose. Nustatyta, kad Reumatoidinio artrito sinoviocituose CXCL12 yra sureguliuotas ir turi įtakos T-ląstelių kaupimuisi sergant šia liga 48 . Mes taip pat stebime epitelio ir kraujodaros signalizaciją per CCL15 prisijungimą prie CCR1/3 ir per CCL16 prisijungimą prie CCR1/2/5/8 ir HRH4, ir endotelio prie hematopoetinės signalizacijos per CCL14 prisijungimą prie CCR1/3/5. CCL16 atveju šis ligandas yra labiausiai išreikštas hepatocituose 49 , yra makrofagų suaktyvinimo efektorius per CCR1 (nuoroda 50) ir įtraukia eozinofilus per nekanoninį receptorių HRH4 (nuoroda 51).

Kadangi stebimų kelių tarp dominančių langelių gausa yra per didelė, kad čia būtų galima pateikti papildomų išsamių pavyzdžių, mes nukreipiame vartotoją į žiniatinklio įrankį, kad galėtų toliau tyrinėti. Tačiau sistemingas ligandų ir receptorių ekspresijos tyrimas 144 pirminiuose ląstelių tipuose gali suteikti įžvalgų, leidžiančių atlikti keletą bendrų pastebėjimų. Dauguma ląstelių išreiškia maždaug 140 receptorių ir 140 ligandų reikšmingu lygiu, ty maždaug 30% visų ligandų ir receptorių, išskyrus hematopoetines ląsteles, kurios vidutiniškai išreiškia tik 18–22% visų ligandų ir receptorių. Tai rodo, kad jie naudoja mažiau kelių savo būsenai perduoti savo kaimynams, tačiau atsižvelgiant į didelį kraujodaros ląstelių, veikiančių kaip pagrindiniai imtuvai ar siųstuvai, skaičių, kaip parodyta 5 pav., tai taip pat gali atspindėti didesnį ląstelių, į kurias jie nukreipia, rinkinį. Kitas pastebėjimas buvo tas, kad vidutiniškai 70% ligandų, ekspresuojamų bet kokio tipo ląstelėse, gali susieti su giminingu to paties tipo ląstelės receptoriumi, ir atvirkščiai, 60% ląstelės ekspresuojamų receptorių gali susieti su to paties tipo ląstelių ekspresuojamais ligandais. Tai gali reikšti, kad daugelis autokrininių signalizacijos takų yra naudojami ląstelių būklei sustiprinti arba kad jukstakrininis signalas to paties tipo ląstelėms yra naudojamas perduoti būseną kaimynams. Nagrinėdami ląstelių tipus, išreiškiančius kiekvieną ligandą ir receptorių, nustatome, kad 72% porų turi bent vieną partnerį (ligandą ar receptorių) su ribota išraiška, o tai dar labiau rodo ligando-receptoriaus ląstelių tipo ekspresijos specifiškumo svarbą selektyviai informacijai pernešimas daugialąsčiuose organizmuose.

Pripažįstame, kad analizuodami padarėme keletą supaprastinimų ir prielaidų. Mes naudojame CAGE mRNR lygiui matuoti, tačiau fiziologiškai reikšminga endogeninių ligandų ir receptorių sąveika reikalauja, kad jie būtų išreikšti kaip baltymai, teisingai modifikuoti po transliacijos ir tada lokalizuoti PM arba tarpląstelinėje erdvėje. Be PM ir sekreto proteomikos duomenų apie žmogaus pirmines ląsteles 19,52, transkriptomikos duomenys yra geriausia mūsų alternatyva ir ginama, atsižvelgiant į gerą koreliacijos laipsnį tarp mRNR ir baltymų lygių 52. Tačiau turime pastebėti, kad visų ląstelių proteomikos analizė nėra tokia subrendusi kaip transkripto analizė. Nors 82% CAGE aptiktų ligandų ir receptorių B ląstelėse taip pat turėjo baltymų lygio palaikymą, mūsų literatūros apžvalgoje nustatyta, kad daugelis baltymų buvo aptikti tik Kim B ląstelių proteome. ir kt. 19 (ir neaptinkami FANTOM5 B ląstelių transkripte) greičiausiai nėra gaminami B ląstelių ir greičiausiai yra klaidingi analizės teiginiai arba nepriklausomi ląstelių 36 indėliai į proteomą.

Be to, mes neatsižvelgiame į tiesioginį ląstelių ir ląstelių kontaktą, kuris yra ypač svarbus signalizuojant gretas. Manome, kad surišimas sukelia tam tikrus tikslinės ląstelės būsenos pokyčius, tačiau norint teisingai įvertinti fiziologinius atsakus, ligandų afinitetą, receptorių internalizavimą, perdirbimą, intraląstelinius signalizacijos kelius ir tai, ar receptoriui reikia dimerizuotis, ar sąveikauti su papildomais baltymais. Mes nežinome išsamių duomenų, apimančių šiuos aspektus apie pirminius ląstelių tipus, ir todėl sutikome su paprastais reikalavimais, kad receptorius ir ligandas yra išreikšti ir žinomi kaip surišami. Taip pat pripažįstame, kad laikui bėgant prie išteklių turime pridėti naujų ląstelių tipų, nes atsiranda nauji CAGE ir RNA-seq duomenų rinkiniai. Tai būtina, nes 147 nagrinėjamuose pirminiuose ląstelių tipuose 177 ligandai ir 112 receptoriai nebuvo išreikšti pastebimu lygiu. Visų pirma, GO analizės atskleidė, kad trūkstami baltymai dažnai buvo susiję su neuropeptidų signalizavimu, viruso atsaku (ypač alfa interferonais) arba buvo hormonai, ekspresuojami labai ribotose ląstelių populiacijose (pavyzdžiui, insulinas iš beta ląstelių, gastrinas iš G ląstelių ir gonadotropiną atpalaiduojantys baltymai). 1 hormonas iš GnRH neuronų) (8 papildomi duomenys).

Nepaisant šių įspėjimų, atgauname žinomus ir atrandame naujus fiziologiškai svarbius ląstelių tarpusavio ryšius, įskaitant CSF1 – CSF1R tinklą (4 pav.). CSF1 yra pagrindinis makrofagų augimo faktorius, o CSF1R yra išreikštas daugumoje mieloidinių linijų ląstelių 53. Kaip pranešta anksčiau, mes stebime monocitų išvestų makrofagų autokrininį signalizacijos potencialą 54, bet taip pat ir nesubrendusių monocitų kilmės dendritinių ląstelių ir bazofilų. Įdomiausia, kad mes pastebėjome, kad putliosios ląstelės gamina didžiausią CSF1 kiekį ir stimuliuojant jį padidina. Mūsų žiniomis, tai naujas santykis, kurį atskleidė mūsų analizė.

Apibendrinant, pristatome pirmąjį didelio masto signalizacijos tarp ląstelių žemėlapį, pateikdami tinklą, kuriame ląstelės yra mazgai, o receptorių ir ligandų poros sudaro kraštus. Ši informacija yra labai svarbi organizmo lygmens sistemų biologijai (molekulinei fiziologijai), kad būtų galima geriau suprasti ląstelių dalyvius ir signalizacijos poras, naudojamas sudėtinguose ląstelių tinkluose, naudojamuose ligoms, vystymuisi, imuniniam atsakui ir normaliai homeostazei. Galiausiai, neatidėliotinu ir praktiniu lygmeniu tai leis mums rasti naujų faktorių, padedančių pagerinti įvairių tipų ląstelių kultūrą, kaip neseniai parodėme naudojant BMP putliosioms ląstelėms 55 ir CCL2 embrioninėms kamieninėms ląstelėms 56 . Ateityje tikimės aprėpti daugiau pirminių ląstelių tipų, įtraukdami atskirų ląstelių ekspresijos duomenų rinkinius 57, įskaitant tuos, kurie fiksuoja erdvinius ryšius 58 ir leidžia mums ištirti jukstakrino signalus tarp gretimų ląstelių.


Kodavimo sekos ir anatomijos raida

Nariuotakojų ir tetrapodų kūno planai pasikeitė naudojant gana stabilų jų priedą Hox genų kiekviename prieglobstyje [24,39]. Stabilumas Hox genų skaičius ir išsaugojimas Hox ortologų sekos ir funkcijos, susidarė pirminis įspūdis, kad Hox baltymų funkcijos reikšmingai nesiskyrė. Tačiau dabar suprantama, kad keli nariuotakojai Hox baltymai pasikeitė taip, kaip yra susiję su formos ar vystymosi mechanizmų pokyčiais, įskaitant Hox3, Fushi tarazu, Ultrabithorax (Ubx) ir Antennapedia [40] baltymus. „Hox3“ ir „Fushi tarazu“ atveju Hox tipo funkcija buvo prarasta tam tikrose linijose, o įgyta naujų funkcijų. Tam tikrų vabzdžių Fushi tarazu baltymas prarado Hox funkcijose dalyvaujančius sekos motyvus ir įgijo naujos veiklos, susijusios su segmentavimu, motyvą [41, 42]. Panašiai, Hox3 baltymas prarado Hox funkciją vabzdžiams ir įgijo naują dorsoventralinės ašies modeliavimo funkciją. Vėliau ji buvo dubliuojama, sukuriant du skirtingus genus, susijusius su ankstyvu dviejų kūno ašių modeliavimu vienoje musių klade [43–45].

Ubx baltymo funkciniai motyvai vystėsi, o baltymas išlaikė Hox funkciją. Lyginamieji ir funkciniai tyrimai parodė, kad Ubx baltymo karboksi galas buvo išplėstas vėžiagyvių linijoje ir tarnauja kaip aktyvumą moduliuojantis domenas [46]. Vabzdžių giminėje ši sritis buvo pakeista trumpu glutamino/alanino turtingu motyvu, kuris buvo gerai išsaugotas per daugiau nei 300 milijonų vabzdžių evoliucijos metų [47].

Šie nariuotakojų Hox baltymai rodo, kad kai kurie labiausiai konservuoti baltymai tam tikromis aplinkybėmis gali vystytis naujai ir kitokiai veiklai. Šiuose pavyzdžiuose pasirinkimas dėl kodavimo pakeitimų galėjo būti sušvelnintas dėl funkcinio pertekliaus Hox paralogai. Tačiau šie įvykiai per ilgą šių giminių istorijos laikotarpį yra reti, palyginti su dideliu kūno formų įvairove. Taip pat reikia pabrėžti, kad abu ftz ir Hox3 (ir jo dariniai zen ir bcd) įsigijo visiškai naujus reguliavimo elementus, kurie valdė jų raišką naujose srityse ir modeliuose. Be to, Ubx reguliavimas buvo labai įvairus tarp nariuotakojų [24], įskaitant vabzdžius [48–50]. Taigi, net ir retais atvejais, kai reguliuojamuose baltymuose vyksta aiški koduojančių sekų evoliucija, reguliavimo sekos evoliucija yra esminis funkcinės evoliucijos ir tolesnio genų funkcijos įvairinimo komponentas.

Ar yra labiau paplitusių ir greitesnių morfologinės įvairovės raidos priemonių koduojant mutacijas? Tikrai. Vienas ryškus pavyzdys yra melanokortino-1 receptorius (MC1R), kuris moduliuoja melanino sintezės kiekį ir tipą melanocituose. Mutacijos MC1R genas yra susijęs su masto, kailio ar plunksnos spalvos kitimu ir įvairių rūšių skirtumais [51]. Alternatyvių fenotipų ekologinė reikšmė rodo, kad MC1R genas išsivystė pagal natūralią ir seksualinę atranką. Aiškus atvejis MC1R evoliucija kelia klausimą, kodėl kodavimo sekos evoliucija yra tokia paplitusi įvairinant stuburinių pigmentaciją, o genų reguliavimo evoliucija vaidina pagrindinį vaidmenį gėlių ir vaisinių muselių pigmentacijoje?

Gali būti, kad tam tikros MC1R savybės leido jam atlikti šį pagrindinį vaidmenį. MC1R yra penkių susijusių receptorių šeimos narys ir yra vienintelis narys, dalyvaujantis pigmento sintezės reguliavime [52]. Taigi, šios receptorių šeimos struktūrinis ir reguliavimo įvairinimas (tai yra MC1R raiškos evoliucija melanocituose) sukūrė baltymą, kuris turi daug didesnę evoliucijos laisvę nei daugiau pleiotropinių receptorių. Reikėtų pažymėti, kad MC1R koduojančios mutacijos sukelia viso kūno poveikį pigmentacijai ir nesukuria ir nekeičia dėmių, juostelių ar kitų raštų. Stuburinių gyvūnų erdvinių pigmentacijos modelių raida vis dar gali būti susijusi su pigmentacijos baltymų ekspresijos reguliavimo raida arba receptorių aktyvumo reguliatoriais [53], naudojant mechanizmus, panašius į tuos, kurie yra vabzdžių spalvų modelių raidos pagrindas.

Platus dalyvavimas MC1R tada matomos stuburinių gyvūnų įvairovės kodavimas gali būti gana ypatingas atvejis, kurį įgalina MC1R atsidavimas pigmentacijai ir minimali jo pleiotropija. Tikimasi, kad kiti, labiau pleiotropiniai baltymai bus apriboti jų sekos kitimu, taigi ir jų indėliu į morfologinius pokyčius. Tačiau neseniai buvo įrodyta, kad šunų veislių morfologiniai svyravimai yra susiję su pasikartojančių aminorūgščių sekų ilgio skirtumais įvairių vystymuisi svarbių transkripcijos faktorių koduojančiuose regionuose [54]. Šiuos pakartojimus koduoja mikrosatelitų sekos, kurios labai sparčiai plečiasi arba susitraukia, o spontaniškos ar sukeltos šių vietų mutacijos veikia matomus bruožus. Nepaprastas kartotinių ilgių kitimas ir jų galimas poveikis morfologijai kelia galimybę, kad šie pakartojimai yra natūralių populiacijų skirtumų šaltinis. Tačiau šis skirtumas gali turėti žalingų, pleiotropinių padarinių, kurie, nors ir valdomi prijaukinant, apribotų jo indėlį į evoliuciją esant natūraliai atrankai.


Išplėstinė informacija

2007 m. Nobelio fiziologijos ar medicinos premija skiriama daktarams Mario R. Capecchi, Martinui J. Evansui ir Oliveriui Smithiesui už principų, nustatančių specifines genų modifikacijas pelėms, naudojant embrionines kamienines ląsteles, atradimus. Jų darbas leido modifikuoti specifinius žinduolių gemalo linijos genus ir užauginti palikuonis, nešiojančius ir išreiškiančius modifikuotą geną. Capecchi, Evans ir Smithies sukurtų eksperimentinių genetinių metodų rinkinys, paprastai vadinamas išmušimo technologija, leido mokslininkams nustatyti konkrečių genų vaidmenį vystymuisi, fiziologijai ir patologijai. Tai sukėlė revoliuciją gyvybės moksle ir vaidina pagrindinį vaidmenį kuriant medicinos terapiją.

Atradimai

Martinas Evansas nustatė ir išskyrė ankstyvojo embriono embrioninę kamieninę ląstelę, ląstelę, iš kurios gaunamos visos suaugusio organizmo ląstelės. Jis įvedė jį į ląstelių kultūrą, modifikavo genetiškai ir vėl įvedė į globėjus, kad susilauktų genetiškai modifikuotų palikuonių. Mario Capecchi ir Oliveris Smithiesas, nepriklausomai vienas nuo kito, atrado, kaip homologinė rekombinacija tarp DNR molekulių segmentų gali būti naudojama žinduolių genomo genams nukreipti, ir sukūrė genetiškai modifikuotų pelių generavimo metodus. Tokie gyvūnai tapo nepakeičiami atliekant medicininius tyrimus. Be to, žinios apie kamieninių ląstelių biologiją ir genų technologijas, gautos atliekant tyrimus, po kurių buvo sukurta „pelės išmušimas“, pakeitė mūsų supratimą apie normalų vystymąsi ir ligos procesus bei nustatė naujus gydymo būdus. 1 pav. parodyta bendroji genų taikymo pelėms strategija.

Tyrimai, kurie paskatino nukreipti genus

Embrioninės kamieninės ląstelės

Kamieninė ląstelė yra ląstelė, galinti plačiai daugintis, sukurianti daugiau kamieninių ląstelių (savaime atsinaujinti), taip pat labiau diferencijuotos ląstelės. Somatinės kamieninės ląstelės yra būtinos suaugusio organizmo audiniams atnaujinti. Pavyzdžiui, kaulų čiulpų kraujodaros kamieninės ląstelės diferencijuojasi į kraujo ląsteles, t. Y. Eritrocitus, megakariocitus/trombocitus ir įvairių tipų leukocitus. Nors kiekviena suaugusio organizmo somatinė kamieninė ląstelė yra įsipareigojusi tam tikrai diferenciacijos linijai, ankstyvame embrione yra kamieninių ląstelių, kurios yra totipotentinės, t. Todėl mintis, kad blastocistos embrioninės kamieninės ląstelės gali būti panaudotos gyvam žinduolių organizmui sukurti, daugelį metų žavėjo mokslininkus.

Koncepcija, kad diferencijuotos ląstelės ir audiniai yra kilę iš nediferencijuotų kamieninių ląstelių (“Stammzellen ”), buvo pasiūlyta jau prieš šimtą metų [1]. Tačiau tikslios jų savybės išliko sunkiai suprantamos daugelį dešimtmečių. Sėklidžių teratomų tyrimai parodė, kad šiuose navikuose yra totipotentinių ląstelių. 5 -ajame dešimtmetyje Leroy Stevens iš Džeksono laboratorijos nustatė, kad 129Sv kamieno pelėms yra daug tokių navikų. Jis parodė, kad jų ląstelės gali išsivystyti į embrioninius kūnus, ty embrioninių ląstelių agregatus. Transplantuojant tokie agregatai gali sukelti solidžius navikus su daugybe skirtingų ląstelių tipų [2, 3]. Po kelerių metų Kleinsmith ir Pierce parodė, kad tokie navikai buvo gauti iš nediferencijuotų embriono karcinomos ląstelių [4].

Ląstelių kultūros metodų kūrimas leido tyrėjams sukurti embrioninių karcinomos ląstelių (EC ląstelių) kultūras iš pelių sėklidžių teratokarcinomų. Keletas mokslininkų, įskaitant Martiną Evansą iš Kembridžo universiteto, pranešė apie tokias kultūras aštuntojo dešimtmečio pradžioje [5–7].

Evansas iš Stevens gavo 129Sv peles, sukūrė pelių koloniją ir kultūroje apibūdino iš teratomos gautas ląsteles [8, 9]. Šios embrioninės karcinomos (EC) ląstelės gali būti auginamos ant apšvitintų fibroblastų maitinimo sluoksnių. Kai pastarieji buvo atšaukti, plačiai in vitro įvyko diferenciacija. Jis vyko per primityvią embriono endodermą, kuri susikaupė į embrioninius kūnus. Prisirišus prie kieto paviršiaus atsirado visų tipų ląstelės, įskaitant odą, nervą, širdies raumenį ir tt .

Evansas įžvelgė galimybes panaudoti šias EB ląsteles ne tik ląstelių kultūros tyrimams, bet ir kuriant chimerines peles. Siekdamas įgyvendinti šią viziją, jis bendradarbiavo su Richardu Gardneriu Oksforde, kuris suleido EK ląsteles į blastocistas ir persodino jas į globojamas peles. Palikuonys buvo chimeriniai, beveik visuose audiniuose prisidėjo EB ląstelės [10]. Panašias išvadas maždaug tuo pačiu metu padarė kelios kitos grupės [11] [12]. Tačiau chimerinėms pelėms, turinčioms iš EC gautas ląsteles, atsirado daug navikų ir jie negalėjo prisidėti prie gemalų linijos dėl kariotipinių anomalijų.

Evansui tapo akivaizdu, kad norint gauti lytinių ląstelių perdavimą, gautą iš kultivuotų embrioninių kamieninių ląstelių, reikia naudoti alternatyvią strategiją. Naudodamas monokloninius antikūnus, jis apibūdino EC ląstelių paviršiaus makromolekules ir normalias jų kolegas, taip nustatydamas ankstyvos diferenciacijos molekulinius žymenis [13]. Rezultatai rodo, kad galima rasti normalias ląsteles, turinčias panašų fenotipą kaip ir EC ląstelės, ir panaudoti jas eksperimentams. 1980 m. Evansas kartu su embriologu Mattu Kaufmanu sujungė ląstelių kultūrą ir manipuliavimą embrionais. Kaip vėliau aprašė Evansas [14], jis ketino ląstelių auginimui naudoti haploidinius embrionus, tačiau kai kuriuos diploidinius paruošė kaip kontrolę. Evansas rašo [14]:

“Kai aš auginau šias blastocistas kaip eksplantacijas audinių kultūroje, naudodamas terpę, kuri buvo sušvelninta siekiant optimalaus pelių ir žmogaus EC ląstelių klonavimo efektyvumo, iš karto pastebėjau į EK panašių ląstelių išaugimą. Šios ląstelės buvo aiškiai atpažįstamos kaip geidžiamos pluripotencinės ląstelės, ir jos išlaikė kiekvieną testą: in vivo susidarė teratomos ir in vitro diferencijuotos. Jie turėjo ląstelių paviršiaus antigenus, kurių tikėjomės. Jie buvo labai teigiami dėl šarminės fosfatazės, buvo kariotipiškai normalūs ir, svarbiausia, sudarė nuostabias chimeras. ”

Šios ląstelės buvo embrioninės kamieninės ląstelės (ES ląstelės), kurios tapo labai svarbios siekiant sėkmingai nukreipti genus. 1981 m. Liepos mėn. Evansas ir Kaufmanas paskelbė savo ataskaitą apie ES ląsteles pagrindiniame dokumente „Nature“ [15]. Gailas Martinas, buvęs Evanso bendradarbis, pranešė apie panašias išvadas po pusės metų [16]. Savo straipsnyje „Nature“ Evansas ir Kaufmanas atkreipė dėmesį į galimybę naudoti ES ląsteles genų modifikavimui. Jie rašė [15]:

“Jų [t.y.ES ląstelės] kaip patrauklus pasiūlymas buvo panaudotas kaip priemonė pernešti mutantinių alelių pelių genomą, pasirinktus ląstelių kultūroje arba įterptus į ląsteles transformuojant su specifiniais DNR fragmentais. Daugelyje šių tyrimų pluripotencinių ląstelių, tiesiogiai izoliuotų nuo tiriamų embrionų, naudojimas turėtų turėti didelių pranašumų. ”

„Evans ’“ komanda sukūrė blastocistų injekcijos metodus, kad patikrintų, ar ES ląstelės iš tikrųjų gali prisidėti prie funkcinių lytinių ląstelių kūrimo ir tokiu būdu gali būti naudojamos sukurti chimerinę pelę. Jie pranešė apie sėkmingą lytinių ląstelių perdavimą 1984 m., Kitame svarbiame „Nature“ dokumente [17].

Kitas žingsnis buvo nustatyti, ar ES ląstelės gali būti naudojamos genetinei medžiagai įvesti į gemalo liniją. Evansas ir jo bendradarbiai užkrėtė ES ląsteles rekombinantiniu retrovirusu, prieš suleisdami jas į blastocistas [18]. Retrovirusinė DNR buvo nustatyta įkūrėjų ir perduota F1 palikuonims, parodant svetimos DNR įvedimą į pelių gemalų liniją [19]. 1986 m. spalį Evans ir kt. apie savo atradimus pranešė „Nature“ ir padarė tokią išvadą “ kultivuotos embrioninės ląstelės yra veiksminga priemonė transgeniniams gyvūnams gaminti [19]. Tų metų gruodį kita laboratorija pranešė apie neomicino atsparumo geno, kurį jie įvedė į ES ląsteles retrovirusine infekcija, perdavimą gemalo linijose [20].

Dabar Evansas žengė svarbų žingsnį - į pelės genomą įvedė specifinio endogeninio geno mutantinę formą. Jis ir jo bendradarbiai perkėlė mutantinį hipoksantino fosforiboziltransferazės (HPRT) geną, turintį Lesch-Nyhan sindromo, su X susieto monogeninio purino metabolizmo defekto, defektą [21]. Kelios mutavusio HPRT geno kopijos buvo įvestos į ES ląstelių genomą retrovirusine infekcija kultūroje. Mutuotos ES ląstelės buvo suleistos į blastocistas ir prisidėjo prie chimerų. Mutacijos buvo perduotos gemalo linijai ir identifikuotos patinams kaip HPRT aktyvumo praradimas. Straipsnyje, publikuotame žurnale „Nature“, kartu su „Evans ’“ laboratorija, Hooperis ir kiti Edinburge pranešė apie kito mutavusio HPRT geno, kuris yra savaiminė ištrynimo mutacija ES ląstelėse, perdavimą gemalo linija [22]. Pirmą kartą žmogaus ligų modeliai buvo sukurti genetiškai manipuliuojant ES ląstelėmis.

Savo darbe [21] Evansas ir jo bendradarbiai pabrėžia, kad jų sėkmė “ atveria galimybę gauti štamų, turinčių specifiškai sukeltų kitų genų pakitimų ” ir pasiūlykite tai “ galiausiai taip pat gali būti įmanoma sukelti specifinius endogeninių genų pokyčius, atliekant homologinę rekombinaciją su in vitro modifikuotomis klonuotomis kopijomis., cituodamas Capecchi ir Smithies darbus [23, 24]. Iš tiesų, šių dviejų technologijų derinys sukėlė revoliuciją eksperimentinėje medicinoje, kaip dabar žinome beveik po 20 metų.

Genų taikymas ir transgenezė žinduoliams

Transgeninės pelės

Pelė daugelį dešimtmečių buvo mėgstamiausias genetinių tyrimų gyvūnas ir buvo akivaizdus pasirinkimas pirmiesiems bandymams įvesti į žinduolių genomą naujus genus. Darbe keliose laboratorijose buvo nustatytos sąlygos manipuliuoti apvaisintais pelių kiaušinėliais ir blastocistomis kultūroje. Naudojant šiuos kultivavimo metodus, SV40 viruso DNR buvo įvesta į blastocistas, kurios vėliau buvo implantuotos pseudonėščioms globėjams. Palikuoniuose buvo galima aptikti SV40 DNR, tačiau nebuvo įmanoma tiksliai įrodyti, ar DNR buvo integruota į šeimininko genomą, ar liko kaip epizomos [25]. Po kelerių metų, užkrėtus embrionus Moloney leukemijos virusu, buvo sukurta pirmoji transgeninė pelė [26]. Virusinės RNR DNR kopija buvo transgeninių pelių genome ir buvo perduota palikuonims Mendelio būdu, todėl viruso DNR buvo įvesta į pelių gemalo liniją. Vėlesnis vystymasis leido pelėms ir kitiems žinduoliams įvesti ir per daug išreikšti transgenus [27]. Tačiau svetimos DNR integracija į genomą vyksta atsitiktinai, o kopijų skaičius skiriasi. Nors tokia transgeno technologija yra svarbi gyvybės mokslo priemonė, ji neturi tikslumo įterpto geno atžvilgiu ir negali būti naudojama manipuliuoti endogeniniais genais iš anksto. Šios būdingos problemos, susijusios su transgeninės pernelyg didelės ekspresijos technika, riboja jos naudingumą.

Homologinė rekombinacija

Homologinių genų rekombinacijos principas buvo žinomas pusę amžiaus ir 1958 m. buvo pripažintas Nobelio premija Joshua Lederbergui už bakterijų tyrimus. Aštuntajame dešimtmetyje paaiškėjo, kad eukariotai naudoja panašią įrangą, kad tarpininkautų keitimuisi genetine informacija tarp homologinių chromosomų mejozės metu. Ankstyvieji mielių tyrimai buvo atlikti eksperimentais, rodančiais retrovirusinių DNR sekų rekombinaciją žinduolių genome ir įvestą oligomerinę retrovirusinę DNR. Novatoriškas Richardo Axelio darbas (2004 m. Nobelio premija už kvapo receptorių atradimą) parodė, kad išaugintas žinduolių ląsteles, turinčias timidinkinazės defektus, galima išgelbėti įvedus herpeso viruso timidino kinazę (tk) genas [28]. Mario Capecchi nusprendė patobulinti šį metodą ir naudojo smulkią stiklinę pipetę, kad DNR sušvirkštų tiesiai į branduolį [29]. Tai labai pagerino genų perdavimo efektyvumą, o Capecchi metodą greitai perėmė kiti tyrėjai, norėdami įvesti naujus genus į apvaisintus pelių embrionus ir gaminti transgenines peles [30]. Tačiau perkeltas genas vis tiek atsitiktinai buvo įvestas į šeimininko genomą.

„Capecchi“ dabar padarė esminį pastebėjimą: kai tk buvo suleistas genas, kopijos buvo integruotos tik viename ar dviejuose šeimininko genomo lokusuose, o kelios kopijos sudarė konkatemerus nuo galvos iki uodegos. Jis samprotavo, kad tokius konkatemerus galima generuoti tik dviem mechanizmais: arba replikacijos, arba homologinės rekombinacijos būdu. Buvo atlikta kruopščių eksperimentų serija, kuri vienareikšmiškai parodė, kad sujungėjai nuo galvos iki uodegos buvo sukurti naudojant homologinę rekombinaciją [31]. Tai savo ruožtu pateikė įrodymų, kad žinduolių somatinės ląstelės turi efektyvią fermentinę mašiną homologinei rekombinacijai tarpininkauti. Jei šią mašiną būtų galima panaudoti homologinei rekombinacijai tarp naujai įvestos DNR molekulės ir tos pačios DNR sekos recipiento ląstelės genome, bet kuris ląstelės genas galėtų būti mutavęs.

„Capecchi“ dabar pateikė JAV nacionaliniams sveikatos institutams dotacijos pasiūlymą, kad patikrintų žinduolių ląstelių genų taikymo pagrįstumą. Jis buvo atmestas, nes recenzentai manė, kad labai mažai tikėtina, kad įvesta DNR suras atitinkamą seką šeimininko genome (cituojama Capecchi vėlesnėje apžvalgoje [32])! Maždaug tuo pačiu metu Martinas Evansas ir kt Anglijoje panašią strategiją pasiūlė dotacijos paraiškoje JK Medicinos tyrimų tarybai, kuri taip pat buvo atmesta, nes buvo per daug ambicinga!

„Capecchi“ nusprendė tęsti homologinio rekombinacijos darbą, nepaisant to, kad NIH jį atmetė. Jis sukūrė ląstelių recipientų linijas, turinčias defektinį neomicino atsparumo geną (neo r), ir sugebėjo jį ištaisyti įvesdamas funkcinį neo r geną [23]. Korekcija įvyko gana dažnai (vienoje ląstelėje iš 1000 suleistų ląstelių), todėl tikėtina, kad homologinė rekombinacija gali būti naudojama manipuliuoti žinduolių genomo genais.

Lygiagrečiai su Capecchi darbu, Oliveris Smithiesas sukūrė koncepciją, kad homologinė rekombinacija gali būti naudojama mutavusiems genams atstatyti. Dar septintajame dešimtmetyje jis jau nustatė, kad alelinis haptoglobino variantas atsirado per rekombinacinius įvykius [33]. Vėliau jis klonavo žmogaus vaisiaus globino genus ir padarė išvadą, kad G γ ir A γ atsirado per procesą, apimantį homologinę rekombinaciją [34]. Jis sukūrė laipsnišką atrankos procedūrą, kaip atkurti tikslines ląsteles, turinčias modifikuotus genus. Strategija buvo sėkminga, o 1985 m. rugsėjo 19 d. žurnalo „Nature“ numeryje jis pranešė apie sėkmingą plazmidės integraciją homologinės rekombinacijos būdu į žmogaus eritroleukemijos ląstelių chromosomų β-globino geną [24].

Iki 1985 m. Capecchi parodė, kad homologinė rekombinacija žinduolių ląstelėse vyksta labai dažnai, o Smithies naudojo homologinę rekombinaciją, kad įterptų plazmidės DNR seką į žmogaus ląstelės chromosomų geną. Tačiau visas šis darbas buvo atliktas ląstelių kultūroje. Ar homologinė rekombinacija galėtų būti naudojama genams nukreipti į gemalo liniją ir gauti genetiškai modifikuotų gyvūnų padermes? Tiek Capecchi, tiek Smithies girdėjo apie Martin Evans’ ES ląsteles ir nusprendė jas išbandyti. Padedami Evanso, jie abu sukūrė ES ląstelių kultūrą, skirtą naudoti homologiniuose rekombinacijos eksperimentuose.

Smithies pirmą kartą panaudojo homologinę rekombinaciją, kad ištaisytų mutantinį HPRT geną kultivuotose ES ląstelėse [35]. Šiuo tikslu buvo naudojama ES ląstelių linija, turinti delecijos mutaciją, ši ląstelių linija anksčiau buvo naudojama pelėms mutantėms gaminti. HPRT genas buvo pataisytas naudojant plazmidę, turinčią trūkstamą promotorių, o pirmieji 2 egzonai ir Smithies parodė, kad apdorotos ląstelės išgyveno ir augo HAT atrankos terpėje, kuriai reikalingas HPRT fermento aktyvumas. Smithies ir jo bendraautoriai padarė išvadą “Šis pasirinkto geno modifikavimas pluripotentinėse ES ląstelėse parodo, kad šiuo būdu galima manipuliuoti žinduolių genomais iš anksto nustatytais būdais” [35].

Capecchi komanda taip pat pasirinko HPRT geną savo ankstyviesiems tyrimams. Buvo prieinami standartiniai metodai selektyviai augančioms ląstelėms su funkciniais HPRT fermentais ir jau keletą metų buvo naudojami atrenkant mutantus, hibridomos ląsteles gaminant monokloninius antikūnus ir kt. Thomas ir Capecchi [36] į HPRT egzoną įvedė atsparumo neomicinui geną. genas ES ląstelėse ir parodė, kad transfekuotų ląstelių klonai prarado HPRT, bet įgijo neo R aktyvumą. Savo Cell dokumente jie padarė išvadą “Tikimasi, kad šis ES ląstelių panaudojimo kaip recipiento ląstelių linijos ir vietos specifinės mutagenezės derinys, pasiektas taikant genus, suteiks galimybę sukurti bet kokio pageidaujamo genotipo peles.” [36] Jie tęsė apibūdindami eksperimentinę strategiją:

“Šio scenarijaus pranašumas yra tas, kad pirmosios kartos chimera paprastai bus heterozigotinė tikslinės mutacijos atžvilgiu ir kad vėliau veisimas gali būti naudojamas homozigotiniam gyvūnui sukurti. Taigi tik vienas iš dviejų lokusų turi būti inaktyvuotas, o recesyviniai mirtini atvejai gali būti išlaikyti kaip heterozigotai. Jei ši technologija bus sėkminga, ji bus naudojama ateityje, norint išnagrinėti pelės vystymosi kelią ir sukurti pelių modelius žmonių ligoms. ” [36]

Ši vizija tapo realybe ir dabar yra eksperimentinės medicinos kertinis akmuo.

Buvo svarbu pereiti nuo „modelio geno“ HPRT prie bendros strategijos, kuri leistų nukreipti genus, kurių funkcijos negalima pasirinkti ląstelių kultūroje. Thomas ir Capecchi [36] nurodė, kad homologinės rekombinacijos ir atsitiktinės integracijos dažnis buvo 1/1000, o tai turėtų būti pakankamai didelis, kad būtų galima nukreipti ir į nepasirenkamus genus. Šis pastebėjimas paskatino kurti metodus, reikalingus tokiems metodams. Kitais metais „Nature“ buvo pristatyta Capecchi teigiamos-neigiamos atrankos strategija, skirta ES ląstelėms, turinčioms tikslinį bet kurio transfekuoto geno sutrikimą, praturtinti [37] (2 pav.). Atsparumo neomicinui elementas (neo R ) įvedamas į pakaitinio vektoriaus egzoną, kurio gale taip pat yra timidino kinazės (HSV-tk) elementas. Homologinė tikslinio geno rekombinacija sukels neo R ekspresiją, tačiau tk elementas bus prarastas, nes jis buvo už rekombinuojančių DNR sekų ribų. Priešingai, atsitiktinis pakaitinio vektoriaus integravimas į geną įves tk ir neo R. Ši strategija buvo sėkmingai panaudota sutrikdyti int-2 genas, kuris yra fibroblastų augimo faktoriaus (FGF) šeimos narys [37].

Visi komponentai dabar buvo skirti genų nukreiptoms pelių padermėms gaminti: ES ląstelių kultūros vystymasis, įrodymas, kad genų modifikacija tokiose ląstelėse gali būti perduodama į gemalo liniją ir užregistruota palikuonims, pastebėjimas, kad homologinė rekombinacija vyksta su dideliu dažnis žinduolių genome, genų perdavimo metodų taikymas ES ląstelėms ir transfekuotų ląstelių praturtinimo strategijų išradimas. Kelios laboratorijos prisijungė prie lenktynių ir 1989 m. Gimė kelios skirtingos pelės, išmuštos [38-41]. 3 paveiksle pavaizduoti molekuliniai įrodymai, kaip Smithies ir bendradarbiai ištaiso mutantinį HPRT geną gemalo linijoje [39].

Tolesnis genų taikymo technologijos tobulinimas

Nustačius genų taikymo technologiją, keli svarbūs pakeitimai ir patobulinimai keliose laboratorijose gerokai išplėtė jos naudojimą. Išradingai išplėtotas genų taikymas, į esamus genus įvedus fermento Cre rekombinazės atpažinimo vietas, vadinamąsias lox P vietas. Kai pelės, turinčios tokius “floxed” genus, poruojamos su transgeninėmis pelėmis, ekspresuojančiomis Cre rekombinazę, palikuonių tikslinis genas modifikuojamas veikiant Cre [42-44]. Kita vietai būdinga rekombinazė Flp taip pat dažnai naudojama sąlyginiam pelių genų taikymui sukurti [45]. Cre arba Flp geno aktyvumą galima kontroliuoti pastatant jį po tinkamu promotoriumi, kad būtų pasiektas specifinis audinio taikymas [46]. Cre ekspresija ir dėl to taikymas į flokuotą geną gali būti apribotas, pvz. T ląstelės (lck promotorius), širdies raumenys (širdies miozino promotorius), neuronai (enolazės promotorius) arba epitelis (citokeratino promotorius).

2 pav. Teigiamas neigiamas atranka naudojama praturtinti ES ląsteles, kuriose yra tikslinis geno sutrikimas. Taikant abu genus (A) ir atsitiktinė integracija (B), viršutinė eilutė rodo nukreipimo vektorių, vidurinė - chromosomų geną, o apatinė - modifikuotą geną. Genuose, nukreiptuose į homologinę rekombinaciją, yra neo R elementas, bet ne HSV-tk, nes pastarasis yra už taikinio vektoriaus sekų, homologinių chromosomų geno sekoms. Priešingai, atsitiktinė vektoriaus integracija sukelia HSV-tk ir neo R įvedimą. Atrankos metodai teigiamai pasirenka neo R teigiamus klonus ir pašalina tuos neo R + klonus, kurie turi HSV-tk.

Cre ekspresiją taip pat galima kontroliuoti laikinai, įvedant į promotorių elementą, kuriam reikalingas ligandas, pvz., Vaistas indukcijai [47]. Tetraciklinas, I tipo interferonas ir tamoksifenas (kuris jungiasi prie estrogenų receptorių surišančio elemento) buvo panaudoti vaistų sukeliamiems promotoriams gauti. Tokiu būdu norimą geną galima nukreipti skiriant vaistą. Įvedus tamoksifeno vietą į tam tikram audiniui skirtą promotorių, pelę gydant vaistu, tam tikrame audinyje galima selektyviai nukreipti geną.

Cre-lox technologija taip pat gali būti naudojama esamą geną pakeisti kitu [48]. Toks “knock-in ” buvo naudojamas pvz. pakeisti pelių imunoglobulino arba MHC genus žmogaus genais, siekiant “humanizuoti” pelę, atsižvelgiant į imuninę funkciją. Jis taip pat buvo naudojamas aleliui pakeisti kitu, pavyzdžiui, pastarasis yra alelis, įtariamas sukeliantis ligą.

Genų taikymo reikšmė fiziologijai ir medicinai

Taikymas į genus pakeitė mokslinę mediciną, leisdamas eksperimentiškai išbandyti hipotezes apie konkrečių genų funkciją. Prieš taikant genus, mūsų supratimas apie genų vaidmenį aukštesniuose organizmuose buvo išvestas iš pacientų ir eksperimentinių gyvūnų spontaniškų mutacijų stebėjimų, ryšių ir asociacijos tyrimų, genų produktų skyrimo gyvūnams ir tam tikru mastu iš ląstelių kultūros eksperimentų. Tačiau ląstelių kultūra nepadeda suprasti funkcijas ir ligas, susijusias su daugialąsčiais integraciniais atsakais. Įžvalgos apie organų sistemas, tokias kaip nervų sistema, širdies ir kraujagyslių sistema bei imuninė sistema, geriausiu atveju buvo fragmentiškos, kaip ir žinios apie žinduolių vystymąsi. Kaip sakė širdies ir kraujagyslių fiziologas Heimo Ehmke, “ląstelės neturi kraujospūdžio” [49]. Galimybė stebėti geno kandidato sunaikinimo poveikį nepažeistam organizmui pakeitė šias tyrimų sritis. Pavyzdžiui, širdies ir kraujagyslių fiziologai perėjo nuo žiurkių prie pelių kaip modelių, sumažindami savo instrumentus ir metodus, kad galėtų ištirti genetinį hemodinamikos reguliavimą. Gimė nauja genetinės fiziologijos era.

Žmogaus ir pelės genomuose yra apie 22 400 genų. Keli tūkstančiai jų jau buvo ištirti taikant genus. Visi šie tyrimai suteikė daug informacijos apie genų funkciją vystymosi ir ligų metu. Jie padėjo sujungti mechanistinę molekulinę biologiją su integruotais gyvybės mokslais, tokiais kaip embriologija, fiziologija ir imunologija, ir paskatino naujus fiziologijos mokslų pasiekimus. Kalbant apie mediciną, žmonių ligų modeliavimas pagal genų taikymą pelėms buvo ypač informatyvus.

Šiame etape gali būti naudinga apibendrinti Claude'o Bernardo pirmą kartą pasiūlytus mokslinio metodo medicinoje kriterijus [50]: medicinos mokslininkai naudoja stebėjimus, hipotezes ir išvedžiojimus, kad pasiūlytų gamtos reiškinių paaiškinimus, teorijas. Šių teorijų prognozės tikrinamos eksperimentu. Bet kurią teoriją, kuri yra pakankamai įtikinama prognozuoti, galima atkurti tokiu būdu. Todėl mokslinis metodas iš esmės yra atsargi priemonė sukurti pagrįstą, įrodymais pagrįstą mūsų gamtos pasaulio supratimą. Eksperimentai šiame procese yra labai svarbūs.

Prieš taikant genus, genetinei medicinai trūko eksperimentinio tyrimo priemonių. Jei padarysime analogiją su Roberto Kocho požiūriu į infekcines ligas [51], genetinė medicina galėtų taikyti pirmąjį iš Kocho postulatų (ty stebėti ryšį tarp mikrobo, arba šiuo atveju, geno ar alelio ir ligos) ir atsiradus genų klonavimui, antrasis (izoliuokite mikrobą/geną nuo sergančio individo ir nustatykite jį kultūroje), tačiau reikia taikyti Kocho trečiąjį postulatą (sukelti ligą pernešant mikrobą/geną į šeimininko organizmą). nukreipimas į genus. Mutuojant geną, kad būtų sunaikinta jo funkcija (išmušimas) arba pakeitus jį į su liga susijusį alelį (knock-in), liga sukeliama, jei hipotezė yra teisinga.Šiuo metu yra kuriami alternatyvūs genetine epidemiologija pagrįsti metodai, tačiau šiuo metu turimi metodai nėra tokie tikslūs, kaip hipotezėmis pagrįsti eksperimentai.. Šio nukrypimo į mokslinę teoriją gali pakakti, kad būtų galima pasakyti, kad tik nutaikius kandidatus į genus tapo įmanoma formaliai nustatyti priežastinį ryšį tarp geno ir ligos. Dabar pažvelkime į keletą konkrečių genų taikymo poveikio medicinoje pavyzdžių.

3 pav. Molekuliniai genetiniai įrodymai dėl pataisyto HPRT geno perdavimo gemalo linijose. Iš nuorodos [39]. „Southern blot“ rodo genominę DNR, hibridizuotą su zondu, būdingu sekos taikymo vektoriuje. ES ląstelės buvo iš agouti pelių, blastocistos iš juodųjų pelių, o HPRT genas yra X chromosomoje. Navikas buvo kilęs iš chimerinės pelės, kuri nešė tikslinį geną, kaip ir tikslinė ES ląstelių linija. F1 palikuonims agouti pelių patelės, gautos iš tikslinių ES ląstelių, turėjo tikslinį HPRT geną, o jo nebuvo nei juodosiose pelėse, gautose iš recipientų blastocistų, nei agouti pelių patinuose. Apatinėje dalyje parodyta taikymo strategija su ištrynimo mutacija HPRT genu (a), taikymo konstrukcija (b), HPRT genas, pataisytas taikant geną (c), ir zondas (19*), naudojamas hibridizacijai (d) ). Perspausdinta, gavus leidimą, iš Nacionalinės mokslų akademijos leidinių. Autorių teisės 1989 Nacionalinė mokslų akademija, JAV

Monogeninės ligos

Pirmoji sritis, į kurią eksperimentiniai genetikai atkreipė dėmesį gimus žinduolių genams, buvo monogeninės ligos. The Lesch-Nyhan sindromas, sugedęs nukleotidų metabolizmas, kurį sukėlė HPRT geno mutacija, iš tikrųjų buvo pavyzdinė sąlyga kuriant technologiją tiek Evans’, tiek Smithies’ laboratorijose (žr. aukščiau). Viena iš priežasčių, dėl kurių buvo pasirinkta ši specifinė sveikatos būklė, buvo ta, kad HPRT buvo prieinamos transdukuotų ląstelių išskyrimo atrankos sąlygos. Pirmasis HPRT-/- pelių tyrimas nuvylė, nes nebuvo galima pastebėti nei neuropatologinių, nei elgsenos žmogaus ligos požymių [21, 39]. Tai paskatino analizuoti pelių purino gelbėjimo kelius ir padarė išvadą, kad pelės daugiausia priklauso nuo adenino fosforiboziltransferazės (APRT) purino gelbėjimui ir todėl nėra tokios jautrios HPRT trūkumui kaip žmonės. APRT inhibitorių skyrimas HPRT-/- pelėms sukėlė nuolatinį savęs žalojimą, panašų į klinikinius žmogaus ligos požymius [52]. Tai iliustracija, kad reikia atlikti sudėtingą integracinių funkcijų analizę, apibūdinant genų nukreiptų pelių fenotipą.

Cistinė fibrozė yra viena iš labiausiai paplitusių monogeninių ligų, kurią Smithies ir jo bendradarbiai pasirinko genų taikymo tyrimams [53, 54]. Sugedęs genas buvo nustatytas atliekant ryšio tyrimus pacientų šeimose, po kurio buvo atliktas molekulinis klonavimas. Paaiškėjo, kad tai yra cAMP aktyvuotas chorido kanalas ir buvo pavadintas cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatoriumi (CFTR). Pašalinus CFTR pelėms, buvo sukurta būklė, kuri atkartojo daugelį žmogaus ligos požymių. Taigi, CFTR-/- homozigotai pasižymėjo netinkamu chlorido transportavimu kvėpavimo takų ir žarnyno epitelyje, nesugebėjimu klestėti, mekonio nepraeinamumą ir patologinius virškinimo trakto liaukų pokyčius. Šie tyrimai buvo vieni pirmųjų, sukūrusių žmogaus ligos modelį, nukreiptą į genus pelėms. Po jų sekė tokių išmuštų modelių lavina.

Patogenezė paveldimos širdies ligosbuvo sėkmingai ištirti taikant genus [55, 56]. Pavyzdžiui, nukreipimas į genus, koduojančius kardiomiocitų susitraukimo aparato komponentus, sukelia kardiomiopatiją tikslinės mutacijos tarpo jungčių jungčių baltymuose, sukelia laidumo defektus, sutrinka širdies vystyme dalyvaujančių transkripcijos faktorių genai, sukelia įgimtus širdies apsigimimus, o nukreipimas į genus, kontroliuojančius energijos apykaitą. kardiomiopatija.

Sudėtingos ligos

Sudėtingos ligos, apimančios daugiau nei vieno geno veikimą, be to, genų ir aplinkos sąveika yra ypatingas iššūkis medicininiams tyrimams. Paveldėjimas, skverbimasis ir sąveika paprastai yra prastai suprantami, buvo sunku atskirti atskiro genetinio veiksnio indėlį, o priežastinio ryšio ir koreliacijos atskyrimas buvo problemiškas. Siekiant įrodyti priežastinį ryšį tokioje sudėtingoje sistemoje, eksperimentai turi leisti aptikti tik vieno kintamojo keitimo poveikį vienu metu. Genų taikymas leido atlikti tokius eksperimentus ir leido įrodyti priežastinį ryšį su sudėtingomis ligomis.

Širdies ir kraujagyslių ligos

Oliveris Smithiesas buvo šios plėtros lyderis. Kartu su Nobuyo Maeda jis daugiausia dėmesio skyrė dviem svarbioms sudėtingoms ligoms – hipertenzijai ir aterosklerozei (apžvelgta [57]). Dvynių tyrimai rodo, kad genetiniai veiksniai gali sudaryti apie 70% šeimyninės agregacijos esminė hipertenzija. Tačiau įrodyta, kad mažiausiai 10 genų keičia kraujospūdį, o jų genų produktai sąveikauja sudėtingai. Nepaisant atradimo, kad angiotenzinogeno (AGT) geno polimorfizmas yra susijęs su pirmine hipertenzija, šios ligos genetika liko menkai suprantama [58]. Mažai žinoma apie genų, iš tikrųjų susijusių su žmogaus esmine hipertenzija, skaičių, jų kiekybinį poveikį kraujospūdžiui, jų perdavimo būdą ar sąveiką su kitais genais ir aplinkos komponentais.

Smithies įtarė, kad genų dozės poveikis turės įtakos kraujospūdžio lygiui, ir sukūrė naują genų dozės titravimo metodą, pelėms gaminant vieną, dvi ar tris funkcines AGT geno kopijas [59]. “Konvencinis ” geno taikymas buvo naudojamas vienos ir dviejų egzempliorių pelėms gaminti, o atotrūkio geno taikymas-pelėms, turinčioms tris AGT geno kopijas. Dėl to proporcingai padidėjo genų produktų (ty plazmos angiotenzinogeno baltymo) kiekis ir, svarbiausia, proporcingai padidėjo kraujospūdis, didėjant genų kopijų skaičiui. Kai Smithies ir kt nukreiptas į kitą svarbų kraujospūdžio reguliavimo geną, koduojantį angiotenziną konvertuojantį fermentą (AKF), tokio linijinio ryšio nepastebėta, nepaisant AKF inhibitorių veiksmingumo mažinant kraujospūdį. Tyrėjai pateikė savo duomenis kompiuteriniam sudėtingų sąveikaujančių sistemų modeliavimui ir galėjo pasiūlyti kraujospūdžio kontrolės per renino-angiotenzino sistemą modelį, kuris pasirodė esąs naudingas siekiant suprasti esminę hipertenziją [60]. Tai rodo, kad vertinant genetinį kraujospūdžio reguliavimą reikia atsižvelgti į genų dozavimą, genų ekspresiją ir genų produktų klirensą/katabolizmą.

1992 m. Nobuyo Maeda, dirbęs Šiaurės Karolinos universiteto Smithies ’ skyriuje, sukūrė pelės modelį. aterosklerozė nukreipiant į apolipoproteino E geną (Apoe) [61]. Tą patį geną nepriklausomai taikė Rokfelerio universiteto tyrėjai [62]. The Apoe -/- pelėms išsivysto savaiminė aterosklerozė, kuri yra labai panaši į žmonių ligas. Kitais metais Michaelas Brownas ir Josephas Goldsteinas (1985 m. Nobelio premija už atradimus, susijusius su cholesterolio apykaita) ir jų bendradarbiai nukreipė mažo tankio lipoproteinų (MTL) receptorių geną (Ldlr) ir gavo pelę, kuriai išsivysto aterosklerozė, kai ji šeriama daug cholesterolio turinčia dieta [63]. Pristatyti du pelių modeliai su defektais Apoe ir Ldlr genai visiškai pakeitė aterosklerozės tyrimus. Kryžminus jas su kitomis į genus nukreiptomis pelėmis, buvo galima spręsti apie genų, reguliuojančių uždegimą, lipidų apykaitą, kraujospūdį ir kitus veiksnius, kurie gali būti susiję su aterosklerozine širdies ir kraujagyslių liga, svarbą [64]. Jie taip pat gausiai naudojami farmacijos pramonėje kuriant ir bandant naujus vaistus nuo vainikinių arterijų ligos.

Vėžys

Genų taikymas buvo ypač naudingas vėžio tyrimuose. Daugybė protoonkogenų, naviką slopinančių genų, angiogenetinių faktorių ir tt buvo nukreipti į skirtingus pelių audinius, siekiant išsiaiškinti navikų atsiradimą ir plitimą [65]. Genų taikymas į naviko slopinimo genus padėjo išsiaiškinti jų vaidmenį formuojant navikus. Pavyzdžiui, pelės, turinčios tikslinį p53 geną, buvo linkusios vystytis navikams [66]. Sąlyginis adenomatozinio polipozės (APC) geno taikymas (naudojant Cre-lox technologiją) pelėms sukelia kolorektalinius navikus, o pelės, nukreiptos į APC, tapo naudingais modeliais tiriant kietus navikus [67]. Genų nukreipimas į endotelio augimo faktorius ir proteolitinius fermentus buvo būtinas norint suprasti kietųjų navikų neoangiogenezės ir metastazių mechanizmus, taip pat naudojami kuriant terapines strategijas, siekiant užkirsti kelią plitimui [68].

Kitos ligos

Šiuolaikiniai daugelio, jei ne visų pagrindinių žmonių ligų tyrimai apima genų taikymą pelėms, o yra endokrininių, medžiagų apykaitos, neurologinių, uždegiminių ir kitų sutrikimų „išmušimo modeliai“. Į genus nukreipti pelių modeliai taip pat tampa vis svarbesni tiriant šeimininko apsaugą nuo patogenų. Iš tiesų, į genus nukreiptos pelės tapo nepakeičiamos praktiškai visuose medicininių tyrimų aspektuose.

Išvados

Genų taikymas pakeitė fiziologiją ir mediciną. Tarp pagrindinių biomedicinos mokslų sunku įsivaizduoti šiuolaikinius medicinos tyrimus, nenaudojant genų taikomų modelių. Galimybė generuoti nuspėjamas dizainerių mutacijas pelių genuose leido įgyti naujų įžvalgų apie vystymąsi, imunologiją, neurobiologiją, fiziologiją ir metabolizmą. Tai taip pat leido sukurti žmonių patologijų ligų modelius kontroliuojamoje žinduolių sistemoje ir dėl to eksperimentiškai išskaidyti ligos būsenas, nustatyti naujus gydymo tikslus ir sukurti farmakologijos tyrimų sistemas. Galiausiai akivaizdu, kad naujų žmonių genetinių defektų ištaisymo terapijos kūrimas ateityje bus grindžiamas pelių genų modifikavimo patirtimi, pagrįsta Mario Capecchi, Martin Evans ir Oliver Smithies atradimais.

Göranas K Hanssonas
Širdies ir kraujagyslių tyrimų profesorius Karolinska institute
Nobelio fiziologijos ir medicinos komiteto narys

Nuorodos
[1] Askanazy M. Die Teratome nach ihrem Bau, ihrem Verlauf, ihrer Genese und im Vergleich zum experimentellen Teratoid. Verhandl Deutsch Pathol. 190711:39-82.
[2] Stevens LC, Little, C. C. Spontaniškos sėklidžių teratomos, atsiradusios inbrredo pelių padermėje. Proc Natl Acad Sci (JAV). 195440:1080-7.
[3] Stevensas LC. Embrioninių kūnų embrioninis potencialas, gautas iš persodinamos pelės sėklidės teratomos. Dev Biol. 19602: 285-97.
[4] Kleinsmith LJ, Pierce, G. B. Vieno embriono karcinomos ląstelių daugiapotencialumas. Cancer Res. 196424:1544-52.
[5] Rosenthaal MD, Wishnow, R. M., Sato, G. H. Daugiafunkcinių pelių ląstelių, gautų iš persodinamos sėklidžių teratokarcinomos, kloninių populiacijų augimas ir diferenciacija. J Natl Cancer Inst. 197044:1001-14.
[6] Kahan BW, Ephrussi, B. Pelės sėklidžių teratomos kloninių in vitro kultūrų vystymosi galimybės. J Natl Cancer Inst. 197044:1015-36.
[7] Evansas MJ. Pluripotentinių pelių teratomos ląstelių kloninės audinių kultūros padermės išskyrimas ir savybės. J Embryol Exp Morphol. 197228: 163-76.
[8] Martin GR, Evans, M. J. Pluripotentinės teratokarcinomos ląstelių linijos ir jos darinių morfologija ir augimas audinių kultūroje. Ląstelė. 19742: 163-72.
[9] Martin GR, Evans, M. J. Teratokarcinomos ląstelių kloninių linijų diferenciacija: embrioninių kūnų susidarymas in vitro. Proc Natl Acad Sci (JAV). 197572: 1441-5.
[10] Papaioannou VE, McBurney, M., Gardner, R. L., Evans, M. J. Teratokarcinomos ląstelių, suleistų į ankstyvus pelių embrionus, likimas. Gamta. 1975258: 70-3.
[11] Brinster R. J Exp Med.104: 1049-56.
[12] Mintz B, Illmensee K. Įprastos genetiškai mozaikinės pelės, pagamintos iš piktybinių teratokarcinomos ląstelių. Proc Natl Acad Sci U S A. 197572:3585-9.
[13] Stinnakre MG, Evans, M.J., Willison, K.R., Stern, P.L. Forssman antigeno ekspresija pelės embrione po implantacijos. J Embryol Exp Morphol. 198161: 117-31.
[14] Evansas MJ. Kultūros pelė. Nat Med. 20017: 1081-3.
[15] Evansas MJ, Kaufmanas, M.H. Daugiapotencinių ląstelių iš pelių embrionų įkūrimas kultūroje. Gamta. 1981292:154-6.
[16] Martin GR. Pluripotentinės ląstelių linijos išskyrimas iš pelių embrionų, auginamų terpėje, kurią kondicionuoja teratokarcinomos kamieninės ląstelės. Proc Natl Acad Sci (JAV). 198178: 7634-8.
[17] Bradley A, Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Lytinių chimerų formavimasis iš embrionų gautų teratokarcinomos ląstelių linijų. Gamta. 1984:255-6.
[18] Evansas MJ, Bradley, A., Kuehnas, M. R., Robertsonas, E. J. EK ląstelių gebėjimas formuoti chimeras po klonų atrankos G418 ir kai kurie retrovirusinio vektoriaus provirusinės DNR integracijos į EK ląsteles stebėjimai. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 198550: 685-9.
[19] Robertson E, Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Genų, perduotų į kultivuojamas pluripotencialines ląsteles retrovirusiniu vektoriumi, perdavimas lytiniu keliu. Gamta. 1986323: 445-8.
[20] Gossler A, Doetschman, T., Korn, R., Serfling, E., Kemler. R. Transgenezė naudojant blastocistines embrionines kamieninių ląstelių linijas. Proc Natl Acad Sci (JAV). 198683:9065-9.
[21] Kuehn MR, Bradley A, Robertson EJ, Evans MJ. Galimas Lesch-Nyhan sindromo gyvūnų modelis, įvedus pelėms HPRT mutacijas. Gamta. 1987326:295-8.
[22] Hooper M, Hardy K, Handyside A, Hunter S, Monk M. Pelės embrionai, kuriems trūksta HPRT (Lesch-Nyhan), gauti iš lytinių ląstelių kolonizavimo kultivuojamose ląstelėse. Gamta. 1987326: 292-5.
[23] Thomas KR, Folger, K. R., Capecchi, M. R. Aukšto dažnio genų nukreipimas į konkrečias žinduolių genomo vietas. Ląstelė. 198644: 419-28.
[24] Smithies O, Gregg, R. G., Boggs, S. S., Doralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. DNR sekų įterpimas į žmogaus chromosomų beta-globino lokusą homologine rekombinacija. Gamta. 1985317:230-4.
[25] Jaenisch R, Mintz B. Simian virusas 40 DNR sekų sveikų suaugusių pelių DNR, gautos iš priešimplantacinių blastocistų, įšvirkštų viruso DNR. Proc Natl Acad Sci U S A. 197471: 1250-4.
[26] Jaenisch R. Moloney leukemijos viruso gemalo linijos integracija: homozigotiškumo poveikis m-mulV lokuse. Ląstelė. 197712: 691-6.
[27] Palmiter RD, Brinster RL. Transgeninės pelės. Ląstelė. 198541: 343-5.
[28] Wigler M, Silverstein S, Lee LS, Pellicer A, Cheng Y, Axel R. Išgryninto herpeso viruso timidinkinazės geno perkėlimas į auginamas pelių ląsteles. Ląstelė. 197711: 223-32.
[29] Capecchi MR. Didelio efektyvumo transformacija tiesiogine DNR injekcija į kultivuotas žinduolių ląsteles. Ląstelė. 198022: 479-88.
[30] Gordon JW, Scangos, G.A., Plotkin, D.J., Barbosa, J.A., Ruddle, F.H. Pelių embrionų genetinė transformacija mikroinjekcijos būdu išgryninus DNR. Proc Natl Acad Sci (JAV). 198077: 7380-4.
[31] Folger KR, Wong, E. A., Wahl, G., Capecchi, M. R. DNR, įpurškto į žinduolių ląsteles, integracijos modeliai: homologinės rekombinacijos tarp įšvirkštų plazmidžių DNR molekulių įrodymai. Mol Cell Biol. 19822: 1372-87.
[32] Capecchi MR. Pelių su tikslinėmis mutacijomis generavimas. Nat Med. 20017: 1086-90.
[33] Smithies O, Connell, G.E., Dixon, G.H. Chromosomų pertvarkymai ir haptoglobino genų evoliucija. Gamta. 1962196: 232-6.
[34] Slightorn JL, Blechl, A.E., Smithies, O. Žmogaus vaisiaus Gg ir Ag globino genai: Išsamios nukleotidų sekos rodo, kad tarp šių dubliuotų genų galima keistis DNR. Ląstelė. 198021: 627-38.
[35] Doetschman T, Gregg, R.G., Maeda, N., Hooper, M.L., Melton, D.W., Thompson, S., Smithies, O. Tikslinė mutantinio HPRT geno korekcija pelių embrioninėse kamieninėse ląstelėse. Gamta. 1987330:576-8.
[36] Thomas KR, Capecchi, M.R. Į vietą nukreipta mutagenezė, taikant genus iš pelių embrionų gautose kamieninėse ląstelėse. Ląstelė. 198751: 503-12.
[37] Mansour SL, Thomas, K.R., Capecchi, M.R. Gamta. 1988336:348-52.
[38] Thompson S, Clarke AR, Pow AM, Hooper ML, Melton DW. Gimdos linijos perdavimas ir pataisyto HPRT geno, pagaminto taikant genus embrioninėse kamieninėse ląstelėse, ekspresija. Ląstelė. 198956:313-21.
[39] Koller BH, Hagemann LJ, Doetschman T, Hagaman JR, Huang S, Williams PJ ir kt. Planuojamo hipoksantino fosforiboziltransferazės geno pakeitimo perdavimas gemalo linijai homologinės rekombinacijos būdu embrioninėse kamieninėse ląstelėse. Proc Natl Acad Sci U S A. 198986: 8927-31.
[40] Zijlstra M, Li E, Sajjadi F, Subramani S, Jaenisch R. Sutrikusio beta 2-mikroglobulino geno, gauto homologinės rekombinacijos būdu embrioninėse kamieninėse ląstelėse, perdavimas per gemalo liniją. Gamta. 1989342:435-8.
[41] Thomas KR, Capecchi, M. R. Tikslinis pelės int-1 protoonkogeno sutrikimas, dėl kurio atsiranda didelių smegenų vidurio ir smegenėlių vystymosi sutrikimų. Gamta. 1990346: 847-50.
[42] Lakso M, Sauer B, Mosinger B, Jr., Lee EJ, Manning RW, Yu SH ir kt. Tikslinis onkogeno aktyvinimas transgeninėse pelėse atliekant specifinę rekombinaciją. Proc Natl Acad Sci U S A. 199289: 6232-6.
[43] „Orban PC“, Chui D, Marth JD. Audinių ir vietos specifinė DNR rekombinacija transgeninėse pelėse. Proc Natl Acad Sci U S A. 199289:6861-5.
[44] Gu H, Zou YR, Rajewsky K. Nepriklausoma imunoglobulino perjungimo rekombinacijos kontrolė atskiruose perjungimo regionuose, įrodyta naudojant Cre-loxP tarpininkaujantį genų taikymą. Ląstelė. 199373: 1155-64.
[45] Branda CS, Dymecki SM. Kalbėjimas apie revoliuciją: vietoms būdingų rekombinazių poveikis genetinėms pelių analizėms. Dev Cell. 20046: 7-28.
[46] Gu H, Marth JD, Orban PC, Mossmann H, Rajewsky K. DNR polimerazės beta geno segmento ištrynimas T ląstelėse naudojant ląstelių tipui specifinį genų taikymą. Mokslas. 1994265:103-6.
[47] Kuhn R, Schwenk F, Aguet M, Rajewsky K. Indukuojamas genų taikymas pelėse. Mokslas. 1995269:1427-9.
[48] ​​Zou YR, Muller W, Gu H, Rajewsky K. Cre-loxP tarpininkaujantis genų pakeitimas: pelių padermė, gaminanti humanizuotus antikūnus. Curr Biol. 19944: 1099-103.
[49] Ehmke H. Pelės genų taikymas širdies ir kraujagyslių fiziologijoje. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003284:R28-R30.
[50] Bernard C. Įvadas à l ’étude de la médecine expérimentale. Paryžius: Baillière 1865 m.
[51] Koch R. Die Aetiologie der Tuberkulose. In: Schwalbe J, red. Gesammelte Werke von Robert Koch. Leipcigas: Georgas Thieme 1884: 428-55.
[52] Wu CL, Melton DW. Lesch-Nyhan sindromo modelio sukūrimas pelėms, kurioms trūksta hipoksantino fosforiboziltransferazės. Nat Genet. 19933: 235-40.
[53] Clarke LL, Grubb BR, Gabriel SE, Smithies O, Koller BH, Boucher RC. Sugedęs epitelio chlorido transportavimas į geną nukreiptu cistinės fibrozės pelės modeliu. Mokslas. 1992257:1125-8.
[54] Snouwaert JN, Brigman KK, Latour AM, Malouf NN, Boucher RC, Smithies O ir kt. Gyvūninis cistinės fibrozės modelis, sukurtas taikant genus. Mokslas. 1992257:1083-8.
[55] Christensen G, Chen, J., Ross, J., Chien, K. R. Žmogaus širdies ir kraujagyslių ligų pelių modeliai. In: Chein KR, red. Širdies ir kraujagyslių ligų molekulinė bazė. 2-asis leidimas red. Filadelfija: Saunders 2004:72-106.
[56] Wang J, Wilhelmsson, H., Graff, C., Li, H., Oldfors, A., Rustin, P., Bruning, JC, Kahn, CR, Clayton, DA, Barsh, GS, Thorén, P ., Larssonas, N.-G. Išsiplėtusi kardiomiopatija ir atrioventrikulinio laidumo blokai, kuriuos sukelia širdžiai būdingas mitochondrijų DNR geno ekspresijos inaktyvavimas. Gamtos genetika. 199921:73-7.
[57] Smithies O, Maeda, N. Genų taikymo metodai sudėtingoms genetinėms ligoms: aterosklerozei ir esminei hipertenzijai. Proc Natl Acad Sci (JAV). 199592:5266-72.
[58] Jeunemaitre X, Soubrier F, Kotelevtsev YV, Lifton RP, Williams CS, Charru A ir kt. Molekulinis žmogaus hipertenzijos pagrindas: angiotenzinogeno vaidmuo. Ląstelė. 199271: 169-80.
[59] Smithies O, Kim, H.S. Tikslinis genų dubliavimas ir sutrikimas analizuojant pelių kiekybinius genetinius požymius. Proc Natl Acad Sci (JAV). 199491: 3612-5.
[60] Smithies O, Kim HS, Takahashi N, Edgell MH. Hipertenzijos etiologijos kiekybinių genetinių variacijų svarba. Inkstų tarpt. 200058: 2265-80.
[61] Zhang SH, Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Science. 1992258:468-71.
[62] Plump AS, Smith JD, Hayek T, Aalto-Setala K, Walsh A, Verstuyft JG ir kt. Sunki hipercholesterolemija ir aterosklerozė pelėms, turinčioms apolipoproteino E trūkumo, sukurtos homologinės rekombinacijos ES ląstelėse. Ląstelė. 199271: 343-53.
[63] Ishibashi S, Brown MS, Goldstein JL, Gerard RD, Hammer RE, Herz J. Hipercholesterolemija mažo tankio lipoproteinų receptorių išjungtoms pelėms ir jos panaikinimas dėl adenoviruso sukelto geno pristatymo. J Clin Invest. 199392: 883-93.
[64] Hansson GK. Uždegimas, aterosklerozė ir vainikinių arterijų liga. N Engl J Med. 2005352: 1685-95.
[65] Tarantul VZ. Transgeninės pelės kaip limfomagenezės in vivo modelis. Intl Rev Cytol. 2004236:123-80.
[66] Donehower LA, Harvey M, Slagle BL, McArthur MJ, Montgomery CA, Jr., Butel JS ir kt. Pelės, kurioms trūksta p53, yra vystymosi normalios, tačiau jautrios spontaniškiems navikams. Gamta. 1992356: 215-21.
[67] Shibata H, Toyama K, Shioya H, Ito M, Hirota M, Hasegawa S ir kt. Greitas gaubtinės ir tiesiosios žarnos adenomos formavimasis, inicijuotas sąlyginio Apc geno taikymo. Mokslas. 1997278:120-3.
[68] Carmeliet P, Jain RK. Angiogenezė sergant vėžiu ir kitomis ligomis. Gamta. 2000407: 249-57.

Cituoti šį skyrių
MLA stilius: Išplėstinė informacija. NobelPrize.org. 2021 m. Nobelio premija Outreach AB. Antra. 2021 m. Birželio 22 d. & Lthttps: //www.nobelprize.org/prizes/medicine/2007/advanced-information/>

Sužinokite daugiau

Nobelio premijos 2020 m

Dvylika laureatų buvo apdovanoti Nobelio premija 2020 metais už pasiekimus, kurie žmonijai suteikė didžiausią naudą.

Jų darbas ir atradimai - nuo juodųjų skylių ir genetinių žirklių susidarymo iki pastangų kovoti su badu ir kurti naujus aukcionų formatus.


Laboratorijoje vystosi daugialąstelinis gyvenimas

Norėdami atšaukti šį straipsnį, apsilankykite Mano profilis, tada Peržiūrėkite išsaugotas istorijas.

Penkiakampis nori naudoti vaizdo žaidimus, kad stebėtų kareivių ir psichikos sveikatą Nuotrauka: Remy Free/Flickr

Norėdami atšaukti šį straipsnį, apsilankykite Mano profilis, tada Peržiūrėkite išsaugotas istorijas.

Evoliucinis perėjimas, kuriam prireikė kelių milijardų metų gamtoje, įvyko laboratorijoje ir jam prireikė vos 60 dienų.

Dirbtinai spaudžiant tapti didesnėmis, vienaląsčiai mielės tapo daugialąsčiais padarais. Šis esminis žingsnis yra atsakingas už gyvenimo progresavimą už dumblių ir bakterijų ribų, ir nors naujausias darbas nesikartoja priešistorinių perėjimų, tai gali padėti atskleisti jiems vadovaujančius principus.

& quot; Tai iš tikrųjų paprasta. Tam nereikia mistinio sudėtingumo ar daugybės dalykų, apie kuriuos žmonės iškėlė hipotezes – ypatingų genų, didžiulio genomo, labai nenatūralių sąlygų“, – sakė evoliucijos biologas Michaelas Travisano iš Minesotos universiteto, tyrimo bendraautoris. 17 Nacionalinės mokslų akademijos darbai.

Naujajame tyrime Travisano ir Williamo Ratcliffo vadovaujami tyrėjai augino alaus mieles – įprastą vienaląstį organizmą – maistinių medžiagų turinčio sultinio kolbose.

Kartą per dieną jie purtydavo kolbas, pašalindavo mieles, kurios greičiausiai nusėdo dugne, ir panaudodavo jas naujų kultūrų pradžiai. Laisvai plaukiojančios mielės buvo paliktos, o mielės, susibūrusios į sunkius, greitai krentančius gumulėlius, išliko daugintis.

Vos per kelias savaites atskiros mielių ląstelės vis dar išsaugojo savo išskirtinę tapatybę, tačiau lengvai susiliejo. Pasibaigus dviem mėnesiams, gumulai buvo nuolatinis susitarimas. Kiekviena padermė išsivystė į tikrai daugialąstę, turėdama visas tendencijas, susijusias su „aukštesnėmis“ gyvybės formomis: darbo pasidalijimu tarp specializuotų ląstelių, nepilnamečių ir suaugusių gyvenimo etapų bei daugialąsčių palikuonių.

„Daugialąsteliškumas yra didžiausias bendradarbiavimas“, – sakė Travisano, norintis suprasti, kaip bendradarbiavimas atsiranda savanaudiškai konkuruojančiuose organizmuose. & quot; Kelios ląstelės sudaro individą, kuris bendradarbiauja visumos labui. Kartais ląstelės atsisako savo gebėjimo daugintis artimų giminaičių labui."

Nuo 1990-ųjų pabaigos eksperimentiniais evoliucijos tyrimais buvo bandoma sukelti daugialąstes laboratorines sąlygas. Nors kai kurios žavios būtybės išsivystė – Richardas Lenskis kaleidoskopiškai prisitaiko E. coli, Paulo Rainey'io plika akimi matomos bakterijų bioplėvelės – tikras daugialąsteliškumas liko sunkiai suvokiamas.

Pasak Travisano, per didelis dėmesys buvo skiriamas tam tikros genetinės sudėtingumo esmės nustatymui. Naujas tyrimas rodo, kad aplinkos sąlygos yra svarbiausios: suteikite vienaląsčiams organizmams priežastį eiti daugialąsčiais, ir jie tai padarys.

Išskyrus sudėtingumo ir#x27 kilmės įžvalgas, išvados gali turėti įtakos kitų sričių tyrėjams. Nors daugialąsčiams būtų sunku dabar atsirasti gamtoje, kur esami gyvūnai turi konkurencinį pranašumą, pagrindinė greitos, radikalios evoliucijos pamoka yra universali.

„Ta lengvo transformavimo idėja keičia jūsų požiūrį“, - sakė Travisano. & quot; Esu tikras, kad vyksta sparti evoliucija. Mes tiesiog nežinome jo ieškoti. & Quot

Tikslinis vienaląsčių organizmų veisimas į sudėtingas, daugialąstelines formas taip pat galėtų tapti biotechnologine gamybos technika.

„Jei norite turėti kokį nors organizmą, gaminantį etanolį ar naują junginį, tuomet, be genų inžinerijos naudojimo, galėtumėte atlikti atrankos eksperimentus, kad suformuotumėte jų evoliuciją“, - sakė Travisano. "Tai, ką mes čia darome, inžinerija per dirbtinę atranką, yra tai, ką šimtmečius darėme su gyvūnais ir žemės ūkiu."

Vaizdas: kairėje, originalus alaus ir#x27 mielių štamas. Dešinėje – daugialąstė forma. (Ratcliff ir kt. / PNAS)

Citata: „Eksperimentinė daugialąsčių evoliucija.“ William C. Ratcliff, R. Ford Denison, Mark Borrello ir Michael Travisano. Nacionalinės mokslų akademijos darbai, 2012 m. sausio 17 d.


Įvadas į genetiką ir genomiką *

Caenorhabditis elegans Didžiąją dalį savo, kaip eksperimentinio organizmo, patrauklumo lėmė galingi genetiniai metodai, kuriuos jam buvo galima sukurti. Kitas ir didesnis populiarumo padidėjimas įvyko 1998 m., Kai jis tapo pirmuoju daugialąsčiu organizmu (ir tik antruoju eukariotu po Saccharomyces cerevisiae ), kuriai buvo gauta visa genomo seka. Kirmėlių ir 100 Mb genomo sekos anotacija ir naudojimas yra atitinkamai pažangesnis nei daugumos kitų eukariotų genomų.

Sąveika tarp genetinių ir genominių metodų tęsiasi vis sudėtingesniu lygiu, ir abu metodai yra daugelio dabartinių C. elegans tyrimus, todėl su jais susijusius metodus, principus ir mąstymą galima rasti beveik kiekviename „WormBook“ skyriuje. Be to, tiek genetikoje, tiek genomikoje metodika ir aiškinimas yra susipynę, todėl kai kurie pagrindiniai genetinės analizės dalykai, pvz., Genų kartografavimas, metodų skyriuje („Kirminų metodai“) nagrinėjami praktiškesniu požiūriu. Šis skyrius labiau susijęs su bendraisiais rezultatais ir išvadomis. Keletas temų, tokių kaip mutagenezė, epistazė ir pleiotropija (genetikai) ir chromosomų organizavimas, kartotinės sekos ir promotoriaus analizė (genomikai) yra paliečiamos tik trumpai, nors jos nusipelno ištisų skyrių.

Kalbant apie genetinę analizę, iš esmės patraukli savybė C. elegans yra lengva generuoti mutacijas. Keletas cheminių mutagenų, ypač EMS (etilo metano sulfonatas), labai efektyviai veikia kirminą, o mutacijos taip pat gali būti generuojamos naudojant jonizuojančiąją spinduliuotę, peršokant perkeliant ir kitomis priemonėmis. C. elegans yra diploidinis, todėl labai kenksmingos mutacijos gali būti sukeltos ir skleidžiamos nenužudant gyvūno. Tačiau pagrindinis reprodukcijos būdas, hermafroditų savaiminis apvaisinimas, reiškia, kad dėl Mendelio segregacijos gali būti automatiškai ištirtas bet kokios mutacijos homozigotiškumo poveikis. Mutagenezės ir recesyvinio fenotipo tikrinimo efektyvumas, taip pat lengva išsaugoti mutantines linijas kaip archyvuotas šaldytas atsargas reiškia, kad daugeliui genų yra daug mutacijų, o jų skaičius nuolat auga. Kelių mutacijų prieinamumas yra svarbus teikiant ne tik išmušamas mutacijas, kurios visiškai pašalina geno aktyvumą, bet ir dalines arba sąlygines mutacijas, kurios leidžia atskirti sudėtingas genų funkcijas. Didžioji dauguma šių mutacijų yra recesyvios, susijusios su daliniu ar visišku geno funkcijos praradimu, tačiau taip pat buvo sukurta daug retų funkcijų padidėjimo mutacijų, kurios dažnai suteikė esminių priemonių tolesniam tyrimui. Visai neseniai RNR pateikė naują būdą manipuliuoti genų aktyvumu.

Genetikos skyrius prasideda trumpu skyriumi „Kariotipas, ploidija ir genų dozavimas“ (Jonathan Hodgkin), kuriame apibendrinami kai kurie pasauliniai C. elegans genomą iš genetinės perspektyvos ir apžvelgia kai kuriuos didelius kariotipo pokyčius, kurie buvo sukurti ir išanalizuoti iki šiol. Šiame skyriuje taip pat apžvelgiama susijusi genų dozavimo tema ir tai, kokiu laipsniu gyvūnas gali toleruoti pavienių ir kelių genų dozės pakeitimus.

Antrame skyriuje „Esminiai genai“ (Kenneth Kemphues) aptariama, kas gali būti laikoma svarbiausiu gyvūno genų rinkiniu, be kurio jis yra negyvas arba sterilus. Daug darbo, naudojant tiek klasikinius genetinius metodus, tiek neseniai naudojant RNR, buvo atliktas tokių genų identifikavimas, skaičiavimas ir analizė. Dabartiniais skaičiavimais, mažiau nei 25 % genų atlieka esminę funkciją. Tačiau esminio genų skaičiaus įvertinimui kenkia žinojimas, kad yra didelis genų perteklius C. elegans , tikriausiai labiau nei daugelyje kitų modelinių organizmų. Ši tema aptariama kitame skyriuje „Genų dubliavimasis ir genetinis perteklius C. elegans “ (Alison Woollard). Atrodo, kad genų dubliavimosi lygis yra didesnis C. elegans nei viduje Drosophila arba mielės, kurios kartais gali apsunkinti analizę, bet taip pat gali padėti suprasti, jei kelios vieno sudėtingo geno funkcijos protėvių organizme buvo padalytos tarp dviejų ar daugiau genų C. elegans .

Keturi tolesni šio skyriaus skyriai aptaria kai kuriuos pagrindinius analitinius mutacijų savybių tyrimo metodus ir jų panaudojimą siekiant suprasti pagrindinę biologiją. Skyriuje „Komplementacija“ (Karen Yook) aptariamas svarbus pirmasis bet kokio reiškinio mutacinės analizės žingsnis: mutacijų rinkinių testavimas, siekiant išsiaiškinti, ar jos veikia tuos pačius ar skirtingus genus, ir taip gauti informacijos apie genetinį sudėtingumą, kuriuo grindžiamas bet koks konkretus bruožas. . Be to, kartais buvo susidurta su nenormaliais papildymo modeliais C. elegans , kaip ir daugumoje gerai ištirtų genetinių organizmų, taip pat apžvelgiama kai kurių labiau pamokančių atvejų fenomenologija.

Tolesnę bet kurios mutacijos analizę labai padeda atlikti sąveikaujančių genų paieška naudojant modifikavimo ekranus. Tai aptariama kituose dviejuose skyriuose, viename apie „Genetinį slopinimą“ (Jonathanas Hodgkinas) ir viename „Genetiniai stiprikliai“ (Robertas Hermanas ir Johnas Yochemas). Slopinimas buvo labai galinga priemonė genetinių metodų arsenale C. elegans , iš dalies todėl, kad dėl savaiminio apvaisinimo ir spartaus augimo savybių taip lengva ieškoti bet kurios konkrečios kirmėlės mutacijos slopintojų. Skirtingi slopinimo mechanizmai aprašyti skyriuje „Genetinis slopinimas“ kartu su pavyzdžiais, kaip slopinimo analizė buvo naudojama analizuojant molekulinius mazgus ir signalo perdavimo kelius.

Skyriuje „Genetiniai stiprikliai“ nagrinėjama kita medalio pusė. Įvairių genų mutacijų stiprinimo efektai dažnai pastebimi, ypač perteklinio pertekliaus kontekste, ir apžvelgiami galimi stiprinimo efekto tipai ir jų pasekmės. Vis dažniau genetiniai stiprikliai bus atrasti dėl specialių ekranų, skirtų tam tikrų mutantų fenotipų modifikatoriams jautrioje genetinėje aplinkoje, o tai yra labai galingas metodas Drosophila ir C. elegans .

Yochemas ir Hermanas taip pat prisideda prie skyriaus „Genetinės mozaikos“, kuriame pateikiamas kitokio pobūdžio metodas genų savybėms tirti, informacijai apie išraiškos vietas ir veikimo savarankiškumui generuoti. Mozaikos analizė C. elegans turi keletą unikalių aspektų, nes linijos nekintamumas ir pilnas jos aprašymas gali būti naudojami nustatant kiekvienos mozaikinio gyvūno ląstelės genotipą, leidžiantį tiksliau interpretuoti, kada ir kur genai veikė.

Genomikos skyriaus skyriai yra skirti apžvalgoms, o ne išsamiems katalogams. Be to, kaip pažymėta, daugelis susijusių temų yra aptariamos genomo požiūriu, kai kurių skyrių skyriuose kituose skyriuose.

Kirminų genomas šiuo metu yra unikalus tarp daugialąsčių organizmų, nes yra tikrai baigtas iki paskutinio nukleotido. Visuose kituose gyvūnų ir augalų genomose vis dar yra daug nenustatytos sekos megabazių, daugiausia centrinio heterochromatino. C. elegans yra kitoje lygoje, nes jos chromosomos yra holocentrinės, todėl kiekviena iš jų gali būti visiškai sekvenuota - nuo telomero iki telomero. Žinoma, keletas klaidų vis tiek turi išlikti net ir naujausioje versijoje C. elegans seka, tačiau šios klaidos nuolat šalinamos dėl patobulintos anotacijos, lyginamosios genomikos, dalinio pakartotinio sekos nustatymo ir SNP aptikimo. Be to, yra neaiškumų, tokių kaip tikslus pakartojimų skaičius lokusuose, tokiuose kaip rrn-1 ir rrs-1 , kuriuose yra tandeminių ribosomų RNR genų matricų. Šiuose pakartotiniuose masyvuose gali būti individualių variacijų, ir tiksliai skiriasi kiekvienos chromosomos telomerų pasikartojimas. Nepaisant to, V chromosoma C. elegans (20 921 718 bazinių porų ilgio, neįskaitant telomerų) yra didžiausia kada nors tiksliai ir visiškai suskirstyta DNR molekulė, ir tikėtina, kad ji šią būseną išlaikys dar kurį laiką. Visos genomo sekos tobulumas leidžia atitinkamai išsamesnę anotaciją, nei įmanoma naudojant kitus daugialąsčius organizmus.

Genomas C. elegans yra labai daug informacijos: atrodo, kad apie 25,5 % yra koduojantys baltymus, o genai (įskaitant intronus, 5’ ir 3’ neverčiamus regionus ir reguliavimo sritis) iš viso turi užimti mažiausiai 40% . John Spieth ir Daniel Lawson skyriuje „Genų struktūros apžvalga“ nagrinėjami bendrieji genų dydžio ir genų organizavimo bruožai, įskaitant alternatyvų sujungimą. Nemažas skaičius genų yra išdėstyti operonuose, kurie yra išsamiau peržiūrimi kitur „WormBook“. („Trans-splicing and operons“, Thomas Blumenthal). Spiethas ir Lawsonas taip pat aptaria pseudogeno skaičiaus klausimą, kuriam pateikti įvairūs įvertinimai. Žinoma, kirminas turi tam tikrų pseudogenų, ypač didelėse genų šeimose, kurios neseniai išsiplėtė, tačiau lieka neaišku, koks yra tikrasis skaičius. Apdoroti pseudogenai, kurie labai dažni stuburinių genomuose, yra nedažni.

Dauguma iki šiol nustatytų genų koduoja baltymus, ir daugelis jų patenka į atpažįstamas dideles šeimas. Ericho Schwarzo skyriuje „Genominė baltymus koduojančių genų šeimų klasifikacija“ apžvelgiami įrankiai, naudojami baltymams priskirti skirtingoms šeimoms, ir pateikiami didesnių genų šeimų sąrašai ir diagramos. Kai kurios iš šių šeimų yra peržiūrėtos kituose skyriuose (“Spermo judrumas ir MSP, Haroldas Smitas ir#8220 C. elegans” Hugh M. Robertson ir James H. Thomas).

Seano Eddy ir kt. Skyrius, ir#8220 C. elegans nekoduojančių RNR genų ", apibendrina ribosominę RNR ir perduoda RNR iš genomo perspektyvos ir toliau peržiūri sujungimo lyderio RNR, SNO-RNR, mikroRNR, spliceosominę RNR ir kitas funkcines RNR rūšis. Nors mikroRNR pirmą kartą buvo atrastos C. elegans ir buvo plačiai ištirtas šiame organizme, atrodo tikėtina, kad visas šių svarbių reguliatorių ir kitų nekoduojančių RNR molekulių papildymas ir poveikis dar turi būti apibrėžtas.

Didelė dalis C. elegans genomą sudaro transpozonai pagal įprastą gyvūnų ir augalų genomų modelį. Jean-Louis Bessereau skyriuje „Transposonai“ apžvelgiama tai, kas žinoma apie įvairius C. elegans transposonų šeimos. Transposonai suteikė svarbių įrankių tiek jų analizei C. elegans biologiją ir apskritai tiriant transposono savybes.

Galiausiai Bernardo Lemire ’s skyriuje „Mitochondrijų genetika“ apžvelgiama tai, kas žinoma apie mažo mitochondrijų genomo struktūrą ir funkciją. C. elegans . Taip pat aptariami mitochondrijų kopijų skaičiaus, mitochondrijų delecijos ir sąveikos su branduoliniu genomu tyrimai.

Apibendrinant galima prognozuoti, kad genetiniai ir genominiai tyrimai ir toliau bus aktyviai vykdomi C. elegans moksliniai tyrimai, laikantis nusistovėjusių principų, tačiau nauji atradimai ir nauji metodai jau keičia ir plečia galimas tyrimų rūšis. Visų pirma RNAi naudojimas suteikia visiškai naują matmenį eksperimentams ir ekranams, kuriuos galima atlikti. Kiti nauji metodai taip pat taps svarbesni, pavyzdžiui, gebėjimas atlikti efektyvų genų pakeitimą ir sudėtingesnių transgenų įrankių naudojimas, kurie turėtų leisti tiksliau kontroliuoti genų ekspresiją ir geriau. in vivo genų ekspresijos ir funkcijos tyrimai. Genominiu požiūriu beveik visiškos genomo sekos, kurios sukuriamos vis daugiau artimų giminaičių C. elegans ( Caenorhabditis briggsae , Caenorhabditis remanei ), kita Kaenorhabditas rūšys ir tolimesni pusbroliai, tokie kaip Pristionchus pacificus pateikia neįkainojamą patvirtinimą, naują informaciją ir naujas įžvalgas, o jau dabar nepaprasta lyginamosios genomikos galia ateityje gali tik didėti.

* Redagavo Philipas Andersonas. Paskutinį kartą peržiūrėta 2005 m. Balandžio 25 d. Paskelbta 2005 m. Rugsėjo 6 d. Šį skyrių reikia cituoti kaip: Hodgkin J. Introduction to genetics and genomics (2005 m. Rugsėjo 6 d.), WormBook , red. The C. elegans Tyrimų bendruomenė, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.17.1, http://www.wormbook.org.

Autorių teisės: & kopija 2005 Jonathanas Hodgkinas. Tai atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal „Creative Commons“ priskyrimo licencijos sąlygas, kuris leidžia neribotai naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje laikmenoje, su sąlyga, kad įskaitytas pirminis autorius ir šaltinis.

& sekta Kam turi būti skirta korespondencija. Paštas: [email protected]

Visas WormBook turinys, išskyrus atvejus, kai nurodyta kitaip, yra licencijuojamas pagal Creative Commons Attribution License.


2.1.10 Nurodykite vieną terapinį kamieninių ląstelių panaudojimą.

Kaulų čiulpų transplantacija yra vienas iš daugelio terapinių kamieninių ląstelių panaudojimo būdų. Kaulų čiulpuose esančios kamieninės ląstelės sukelia raudonųjų kraujo kūnelių, baltųjų kraujo kūnelių ir trombocitų susidarymą organizme. Šios kamieninės ląstelės gali būti naudojamos atliekant kaulų čiulpų transplantaciją, siekiant gydyti žmones, sergančius tam tikromis vėžio rūšimis.

Kai pacientas serga vėžiu ir jam skiriamos didelės chemoterapijos dozės, chemoterapija naikina vėžines ląsteles, bet ir normalias kaulų čiulpų ląsteles. Tai reiškia, kad pacientas negali gaminti kraujo ląstelių. Taigi prieš pacientui gydant chemoterapija, jis arba ji gali nuimti kaulų čiulpų derlių, kurio metu kamieninės ląstelės pašalinamos iš kaulų čiulpų, naudojant adatą, kuri įkišama į dubenį (klubo kaulą). Arba, jei negalima naudoti paciento kamieninių ląstelių, jas galima paimti iš atitinkamo donoro. Po chemoterapijos pacientui bus atlikta kaulų čiulpų transplantacija, kurios metu kamieninės ląstelės persodinamos atgal į pacientą lašeliniu būdu, dažniausiai per krūtinės ar rankos veną. Šios persodintos kamieninės ląstelės grįš į kaulų čiulpus ir pradės gaminti sveikus paciento kraujo ląsteles. Todėl kamieninių ląstelių terapinis panaudojimas kaulų čiulpų transplantacijose yra labai svarbus, nes kai kuriems vėžiu sergantiems pacientams gali būti taikomas intensyvus chemoterapinis gydymas. Be šio terapinio kamieninių ląstelių naudojimo pacientai galėtų vartoti tik mažas chemoterapijos dozes, o tai galėtų sumažinti jų galimybes išgydyti ligą.