Informacija

19: Transkripcijos reguliavimas eukariotuose - biologija

19: Transkripcijos reguliavimas eukariotuose - biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Rėmėjai

1. Eukariotų genai skiriasi savo raiškos būsena

Iš maždaug 30 000 žmogaus genų bet kuris konkretus audinys išreiškia kelis didelius kiekius (jie dažnai yra specifiniai audiniams, pvz., globino genai eritrocituose) ir iki kelių tūkstančių, kai jų gausa mažai (jie dažnai koduoja funkcijas, reikalingas visose ląstelėse. ty „namų tvarkymo genai“. Tai galite išmatuoti pagal mRNR ir cDNR hibridizacijos kinetiką.

Genai, kurie nėra išreikšti, dažnai yra „neaktyviame“ chromatino regione. Pagrindinis modelis yra tas, kad genai, kurie nebus išreikšti, yra laikomi numatytoje „išjungtoje“ būsenoje, nes jie yra supakuoti į chromatino konformaciją, kuri neleidžia ekspresijai. Geno ekspresijai tada reikia atidaryti chromatino domeną, o po to atlikti žingsnius, aptartus šio kurso trečiojoje dalyje: transkripcijos komplekso surinkimas. transkripcija, sujungimas ir kiti apdorojimo įvykiai, vertimas ir visi būtini pakeitimai po vertimo.

Įvairūs aktyvūs genai gali būti transkribuojami skirtingu greičiu, pirmiausia nustatomi pagal iniciacijos greičio skirtumus. Tai galiausiai sukuria būdingą kiekvienos mRNR gausą, svyruojančią nuo labai didelio iki labai mažo.

2. Tie genai, kurie yra išreikštą galima perrašyti a bazinis norma iš „bazinio“ arba „minimalaus“ promotoriaus, ir daugeliu atvejų jie taip pat gali būti sukeltas iki aukšto išraiškos lygio.

Procesas, pereinant nuo beraiškos prie pagrindinės išraiškos Gegužė iš esmės skiriasi nuo proceso, pereinančio nuo bazinės išraiškos iki aktyvuotos aukšto lygio išraiškos. Pavyzdžiui, kai kuriems genams pirmasis gali reikalauti, kad būtų pašalintas stiprus neigiamas chromatino slopinimo poveikis, o pastarasis gali apimti kovalentinį tam tikrų transkripcijos aktyvatorių modifikavimą. Tačiau visos abiejų procesų mechaninės detalės dar nėra žinomos, nors akivaizdu, kad kiekviename iš jų dalyvauja keletas fermentinių veiklų, daugelis iš jų susideda iš kelių polipeptidų subvienetų. Abiejuose procesuose buvo pasiūlyti chromatino struktūros ir transkripcijos aktyvatorių vaidmenų pokyčiai, todėl iš tikrųjų gali būti daugiau panašumų, nei būtų galima manyti iš pradžių. Faktas yra tas, kad šiuo metu mes tiesiog nežinome. Dviprasmiškumui darant sudėtingumą, reikėtų suprasti, kad mechanizmai gali skirtis tarp daugelio organizmo genų.

Abu procesai (pereinant nuo išraiškos prie bazinės išraiškos ir pereinant nuo bazinės prie suaktyvintos išraiškos) yra dalis transkripcijos aktyvinimas, kuri šiuo metu yra intensyvaus molekulinės genetikos tyrimo sritis. Taigi, nors viso šio proceso supratimo mums nepavyksta, svarbu ištirti, kas šiuo metu žinoma apie eukariotų genų reguliavimą, taip pat kai kuriuos vis dar neatsakytus klausimus. Tai mes darysime 19 ir 20 skyriuose.

4.5.1 pav. RNR polimerazės II promotorių ekspresijos būsenos. Kiekviena iš šių būsenų buvo aprašyta tam tikriems genams, tačiau neaišku, ar visos būsenos yra viename privalomame kelyje. Pavyzdžiui, gali būti, kad kai kurie genų aktyvavimo įvykiai gali pereiti nuo tylaus chromatino iki bazinės transkripcijos, neprarandant atviros, bet slopinamos ir pristabdytos transkripcijos.

a. Bazinė transkripcija

  1. Dažnai tiriamas į vitrotranskripcija, naudojant apibrėžtus šablonus ir ekstraktus iš branduolių arba išgrynintų komponentų.
  2. Reikalinga RNR polimerazė su bendrais transkripcijos veiksniais (pvz., TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF ir TFIIH RNR polimerazei II), kaip anksčiau aprašyta trečiojoje dalyje.

b. Suaktyvinta transkripcija

  1. Atsiranda per transkripcijos aktyvatorius, kurie tiesiogiai arba netiesiogiai sąveikauja su bendruoju transkripcijos kompleksu, kad padidintų inicijavimo efektyvumą.
  2. Transkripcijos aktyvatoriai gali prisijungti prie specifinių DNR sekų aukščiau esančiuose promotoriaus elementuose arba gali susieti su stiprikliais (žr. B skirsnį).
  3. Pagrindinė idėja yra padidinti vietinę bendrųjų transkripcijos faktorių koncentraciją, kad iniciacijos kompleksas būtų lengviau surenkamas. Tai, kad aktyvatoriai yra susieti su DNR, kuri yra arti tikslo (arba tampa artima dėl DNR kilpos), reiškia, kad vietinė to baltymo koncentracija yra didelė, todėl ji gali padidinti vietinę sąveikaujančios bendrosios transkripcijos koncentraciją faktoriai.

3. Sustingusios polimerazės

Kai kurių genų pradžioje RNR polimerazė transkribuos apie 20–40 nukleotidų, o tada sustos pauzės vietoje. Klasikinis pavyzdys yra Drosophila šilumos šoko genai, tačiau žinomi ir kiti atvejai. Šie genai suaktyvinami paleidžiant sustojusias polimerazes. Šilumos šoko genų atveju tam reikia šilumos šoko transkripcijos faktoriaus (HSTF). Mechanizmas vis dar tiriamas; keletas įdomių idėjos yra:

  1. Didelio RNR polimerazės II subvieneto CTD fosforilinimas sukelia išsiskyrimą į pailgėjimą („promotoriaus klirensas“). Vienas kandidatas (bet ne vienintelis) į CTD kinazę yra TFIIH.
  2. Procesyvumo koeficiento pridėjimas (analogiškas E. coliNus A?), Gal TFIIS.

B. Duslintuvai

Duslintuvai yra cis- veikiančios reguliavimo sekos, mažinančios promotoriaus ekspresiją nepriklausomai nuo padėties ar orientacijos, t. y. jos turi priešingą stipriklio poveikį. Du pavyzdžiai yra duslintuvai, kurie neleidžia išreikšti a arba mielių poravimosi tipo perjungimo sistemos tyliuosiuose lokusuose esantys genai ir mielių telomerų duslintuvai.

Duslintuvai veikia sekos specifiniams baltymams, tokiems kaip Rap1, jungiantis prie chromatino DNR. Šie baltymai tarnauja kaip inkarai represiniam chromatinui išplėsti. Jie tai daro įdarbindami slopinančius baltymus, vadinamus SIR baltymais, pavadintus jų veikla silentas informacija rreguliuotojai. SIR baltymai surenka chromatiną į didelį kompleksą, kuris nėra perrašomas. Šiame komplekse H3 ir H4 histonai nukleozomose turi hipoacetilintų N-galinių uodegų, DNR gali būti metilinama, o visas nutildytas kompleksas yra atsparus DNazės virškinimui in vitro, kurios visos būdingos kondensuotam, uždaram chromatinui. Didelis daugelio baltymų kompleksas gali būti neprieinamas teigiamiems transkripcijos faktoriams ir RNR polimerazei. Taigi nutildymas yra genų ekspresijos prevencijos procesas, supakuojant geną į heterochromatiną.

Atskiros DNR sekos gali būti susietos su garso slopintuvais, įvertinus šių sekų ištrynimo iš ląstelių chromosomų poveikį. Duslintuvo pašalinimas sukelia reguliuojamų genų slopinimą.

4.5.2 pav. Transkripciniu požiūriu tylus chromatinas, tarpininkaujantis Rap1 ir SIR baltymais.

C. Stiprintuvai

  1. Stiprintojai yra cis-vaidyba reguliavimo sekos, kurios padidina geno ekspresijos lygį, bet jie veikia nepriklausomaiapie padėtis ir orientacija. Šie du paskutiniai veiklos kriterijai skiria stiprintuvus nuo skatintojų.
  2. Pavyzdžiai

a. SV40 valdymo sritis

  1. SV40 (simian virusas 40) užkrečia beždžionių inkstų ląsteles ir taip pat sukels graužikų ląstelių transformaciją. Jis turi maždaug 5 kb dvigubos grandinės DNR genomą. Dėl dalyvavimo naviko genezėje jis buvo mėgstamiausias molekulinių virusologų objektas. Ankstyvasis regionas koduoja tumor antigens (T-Ag ir t-Ag) su daugybe funkcijų, įskaitant SV40 DNR replikacijos skatinimą ir endogeninių navikų slopintuvų, tokių kaip p53, veikimą (1993 m. „Metų molekulė“). Vėlyvasis regionas koduoja tris kapsidų baltymus, vadinamus VP1, VP2 ir VP3 (viralas pbaltymas n). Regionas tarp ankstyvųjų ir vėlyvųjų genų kontroliuoja abiejų genų klasių replikaciją ir transkripciją.
  2. Kontrolinė sritis turi replikacijos pradžią su T-Ag surišimo vietomis.

4.5.3 pav. SV40 ir jo kontrolės regionas.

(3) Transkripcijos inicijavimo vietos ankstyvieji genai sutampa su kilme. Prieš srovę nuo inicijavimo vietų yra an A+T turtingas regionas, analogiškas TATA dėžutei, kuri yra TFIID surišimo vieta. Iš karto prieš srovę yra trys 21 bp sekos kopijos. Kiekvienas 21 bp pakartojimas turi du „GC“ dėžutės kurios yra transkripcijos aktyvatoriaus surišimo vietos Sp1.

a) Iniciacijos vietos + AT turtingas regionas + 6 GC dėžės gali būti laikomos ankstyvojo genų transkripcijos SV40 promotoriumi.

b) Bendro sutarimo GC langelis yra GGGCGG (arba jo papildinys CCGCCC). Didelio giminingumo svetainė yra GGGGCGGGG.

(4) Prieš pradinį promotorių yra du 72 bp pakartojimai, kuriuos sudaro stipriklis.

a) Vienoje 72 bp regiono kopijoje yra trys domenai, kurie veikia stiprinant, vadinami A, C ir B.

(b) Kiekvienas domenas turi surišimo vietas dviem aktyvatoriaus baltymams, kuriuos koduoja ląstelė-šeimininkė.

B domene yra Oct1 ir AP1 svetainės (Aaktyvatorius Protein 1, baltymų šeima, kuriai priklauso Jun-Fos heterodimeras).

Domenas C turi vietas AP2 ir AP3 (baltymas, jungiantis su CAC motyvais DNR).

Domenas A turi svetaines AP1 ir AP4.

(5) Stipriklis buvo atrastas tiriant SV40 mutacijų poveikį.

4.5.4 pav

  1. Laukinio tipo SV40 ekspresuoja T-Ag, kai užkrėstos beždžionės ląstelės, ir lizuoja užkrėstas ląsteles. Tačiau viruso padermė, neturinti 72 bp pakartojimų, rodo labai sumažėjusį T-Ag lygį ir retai lizuoja užkrėstas ląsteles.
  2. Jei 72 bp pasikartojimai pridedami atgal į mutantinį SV40 genomą, išskyrus atvejus, kai jie yra tarp ankstyvųjų ir vėlyvųjų genų galų (180° nuo jų laukinio tipo padėties), T-Ag ekspresuojamas aukštu lygiu ir gaunamas produktyvios infekcijos.
  3. Jei 72 bp pakartojimų orientacija yra atvirkštinė, vis tiek pasireiškia aukšto lygio virusų genai ir produktyvi infekcija. Tiesą sakant, tai reikalinga laukinių tipų vėlyvųjų genų ekspresijai, kurie transkribuojami priešinga kryptimi nei ankstyvieji genai.
  4. Daroma išvada, kad stiprintuvas reikalingas efektyviam tikslinių promotorių transkripcijai, tačiau jis gali veikti bet kokia kryptimi ir įvairiose skirtingose ​​pozicijose bei atstumu nuo taikinių.
  5. Darbas, atliktas beveik tuo pačiu metu, kaip aprašyta aukščiau, parodė, kad 72 bp pakartojimai veikia su kitais „heterologiniais“ genais, todėl, pavyzdžiui, b-globino genai gali būti išreikšti ne eritroidinėse ląstelėse. Tiesą sakant, tai buvo vienas iš pagrindinių pastebėjimų atradus stipriklį.
  6. Viena 72 bp srities kopija veiks kaip stipriklis, tačiau dvi kopijos veikia geriau.

B. Imunoglobulino genai

  1. Tai buvo pirmasis atrastas ląstelių geno stipriklis. Tyrėjai pažymėjo, kad introno sritis buvo ypač gerai išsaugota tarp žmonių, triušių ir pelių sekų, o vėlesni ištrynimo eksperimentai parodė, kad ekspresijai reikalingas introninis stipriklis.
  2. Pertvarkius imunoglobulino geną, kad sujungtų VDJ sritis, tarp šio kombinuoto kintamos srities geno ir pastovios srities lieka didelis intronas. Tame introne randamas stiprintuvas, o kitas stipriklis randamas 3 ′ iki poliA pridėjimo vietos.

4.5.5 pav. Imunoglobulino geno introno ir 3 ’šono stiprikliai.

(3) Stiprikliai turi kelias transkripcijos reguliavimo baltymų surišimo vietas

(a) Kelios iš šių vietų pavadintos pagal stipriklį, kuriame jos buvo aptiktos. Pvz. mE1, mE2 ir kt. yra surišimo vietos enhancer baltymai, nustatyti imunoglobulino sunkiosios grandinės m (mu) gene.

Baltymas YY1 (ying yang 1) jungiasi prie mE1 vietos (CCAT yra konsensuso šerdis) ir ten sulenkia DNR.

The oktameras vietą (ATTTGCAT) jungia du susiję baltymai. Oct1 randamas visuose tirtuose audiniuose, o Oct2 yra specifinis limfoidams – pirmasis audiniams būdingo transkripcijos faktoriaus pavyzdys. Transkripcijos aktyvatoriai, kurie neturi savo DNR surišimo sekos, pvz., Herpes viruso VP16, prisijungs prie Oct baltymų, kurie jungiasi prie DNR, o kompleksas gali suaktyvinti transkripciją.

(b) Kai kurie baltymai prisijungs prie promotoriaus ir stipriklio vietų, pvz. Spalio baltymai. Atminkite, kad Oct1 taip pat veikia SV40 stiprintuvą.

C. Santrauka

  1. The stipriklio padėtis gali būti beveik bet kur, palyginti su genu, bet promotorius visada yra 5 'gale.
  2. Žinomi stiprintuvų pavyzdžiai 5' nuo geno (prieš srovę), greta promotoriaus (kaip SV40), pasroviui nuo geno (kai kurie globino genai), geno viduje (imunoglobulinai) arba toli prieš srovę lokuso valdymo srityje (globinas). genai, žr. 20 skyrių.)

4.5.6 pav.

3. Kelios transkripcijos aktyvatorių surišimo vietos

a. Visi stiprikliai, kurie iki šiol buvo apibūdinti, turi keletą aktyvatorių baltymų surišimo vietų.

b. Yra daug rišamųjų vietų reikia stiprintuvo funkcijai.

  1. Atliekant eksperimentus su SV40 stiprintuvu, buvo pastebėta, kad kai kurios mutacijos, mažinančios viruso užkrečiamumą, sukėlė vieno iš stipriklio domenų mutaciją, pvz. domenas A. Kai šie mutantai buvo atrinkti į laukinio tipo pseudo-revertantus, kurių užkrečiamumas iš esmės buvo atkurtas, buvo nustatyta, kad pseudo-revertantai dubliavo vieną iš likusių domenų. Vėliau buvo įrodyta, kad įvairių baltymų surišimo vietų multimerai yra aktyvūs, tačiau monomerai mažai aktyvūs.
  2. Domenas (pvz., A, C ir B SV40 stiprintuve) su mažiausiai dviem surišimo vietomis vadinamas an enhansonas. Keli enhansonai sudaro stipriklį.

4.5.7 pav.

C. Aktyvatorių baltymai ir kiti reguliatoriai

1. Modulinė konstrukcija

a. DNR surišimo sritis: specifinė seka, tiesioginis kontaktas su DNR

b. Multimerizacijos domenas: Leidžia susidaryti homo- arba heter-multimeriams

c. Aktyvinimo domenas: tiesioginė ar netiesioginė sąveika su taikiniais (tiesiogiai arba tiesiogiai veikiant transkripcijos efektyvumą).

2. Pavyzdys: GAL4

a. Po indukcijos galaktoze GAL4 baltymas paskatins genų ekspresiją GALmielių regulionas, kuris koduoja fermentus, kurie katalizuoja galaktozės patekimą į tarpinį metabolizmą. GAL1 koduoja galaktokinazę, kuri substratą paverčia galaktozės-1-fosfatu. GAL 80 išlaiko reguloną, kai nėra galaktozės.

b. Pirmąsias 100 aminorūgščių sudaro GAL4 DNR surišimo domenas. GAL4 baltymo dimeras jungiasi prie 17 bp sekos su diadų simetrija, vadinama UASG. upstream aaktyvinantis sekvivalentas už gAlaktozės regulonas.

c. Dimerizacijos domenas sutampa su DNR surišimo domenu, apimančiu 65–98 aminorūgštis.

d. Pagrindinis aktyvinimo domenas yra rūgštus regionas C gale.

4.5.8 pav. GAL4 baltymo modulinė struktūra.

e. Neigiamas reguliavimas pasiekiamas susiejant GAL80 C gale ir iš esmės slepiant aktyvinimo domeną. Kai sukelia galaktozė, GAL80 baltymas pasikeičia ir aktyvacijos sritis yra atskleista. Indukcija sukelia GAL80 baltymo išsiskyrimą arba perkėlimą į kitą GAL4 padėtį, kad būtų atskleistas aktyvinimo domenas.

f. Kitas aktyvinimo domenas nuo 148 iki 196 aminorūgščių yra aktyvus in vitro, bet gali būti ne labai svarbus mielių ląstelėje.

4.5.9 pav. Neigiamas GAL4 reguliavimas ir indukcija

3. Funkciniai domenai yra keičiami: „Domeno keitimo“ eksperimentai

(1) DNR surišimo domeno pakeitimas kitu, pakeis aktyvatoriaus veikimo vietą, bet neturės įtakos jo gebėjimui aktyvuoti tikslinį promotorių. Kitaip tariant, DNR surišimo domeną galima pakeisti nepažeidžiant aktyvinimo srities ir atvirkščiai.

4.5.10 pav. Domenų keitimo eksperimentai rodo, kad DNR surišimo domenai ir aktyvinimo domenai yra keičiami.

(2) Apsvarstykite GAL4 baltymo gebėjimą aktyvuoti GAL1 geno promotorių.

GAL1 promotorius turi GAL4 (UASG) surišimo vietą, o esant galaktozei, GAL4 suaktyvins jo ekspresiją. Jei UASG pakeičia LexA operatorius (represorius, reguliuojantis SOS funkcijas E. coli- prisiminkite tai iš antrosios dalies), tada GAL4 baltymas nebeaktyvins modifikuoto GAL1 promotoriaus. Tačiau hibridinis baltymas su LexA DNR surišimo domenu ir GAL4 baltymo aktyvinimo domenu suaktyvins modifikuotą promotorių su LexA operatoriumi. Panašūs domenų keitimo eksperimentai yra plačiai naudojami nustatant reguliavimo baltymų funkcines sritis.

e) Tas pats principas taikomas „dviejų hibridų“ sistemoje, siekiant nustatyti baltymų, kurie sąveikauja su paskirtu baltymu, cDNR.

4.5.11 pav. Dviejų hibridų ekranas sąveikaujantiems baltymams.

Dviejų hibridų atrankos metodas yra greitas ir jautrus būdas išbandyti didelę baltymų grupę, kad jie galėtų sąveikauti į vivosu tam tikru baltymu. Pavyzdžiui, galima apibūdinti vieną reguliavimo komplekso komponentą ir turėti cDNR. Ši „jauko“ baltymo cDNR yra sujungta su DNR segmentais, koduojančiais gerai žinomą DNR surišimo domeną, pvz., LexA, kuris jungiasi su lex o. Įvedus į mielių ląsteles su lacZkontroliuojamas genas (koduojantis beta-galaktozidazę). lex o, lacZgenas nėra išreikštas, nes hibridinis jauko baltymas neturi aktyvavimo domeno. Bandomų cDNR biblioteka yra sujungta su DNR, koduojančia GAL2 aktyvinimo domeną. Kai jie virsta mielių ląstelėmis, kuriose yra hibridinis LexA_DBD masalas ir lex o - lacZ reporteris, tik hibridiniai baltymai, kurie sąveikauja su masalu, paskatins lacZ ekspresiją. Transformuotos ląstelės, kurios yra teigiamos šiame tyrime, turi plazmidę su hibridiniu genu su cDNR, koduojančiu baltymą ("spąstus"), kuris sąveikauja su dominančiu baltymu (masalu).

D. DNR surišimo domenai

Kompiuteriniai trijų matmenų kelių transkripcijos veiksnių vaizdai, iliustruojantys daugelį čia aprašytų sričių, gali būti laikomi „Chime“ vadovėliais

  • www.bmb.psu.edu/pugh/514/mdls
  • www.clunet.edu/BioDev/OMM/cro/cromast.htm

1. Helix-turn-spiralė, homeodomenas

  1. „Homeodomeno“ seka sudaro tris sraigtus, atskirtus griežtais posūkiais.
  2. Helix three užima pagrindinį griovelį DNR surišimo vietoje. Tai atpažinimo spiralė, suformuojanti specifines sąveikas (H-jungtis ir hidrofobines sąveikas) su pagrindinių porų kraštais pagrindiniame grioveliu.
  3. Pirmoji ir antroji spiralės yra statmenos trečiajai spiralei ir virš jos, užtikrindamos suderinimą su fosfodiesterio stuburu. Sraigės N-galinė uodega sąveikauja su nedideliu DNR grioveliu priešingoje DNR pusėje.
  4. Sraigtas du + spiralė trys yra panašus į spiralės-posūkio spiralės motyvą, pirmą kartą nustatytą l Cro ir represoriaus sistemoje.

4.5.12 pav. Sraigto posūkio spiralė „homeodomain“

(5) Pavyzdžiai

a) Homeotiniai genai ir jų giminaičiai.

Visa tai yra susiję su ankstyvųjų vystymosi įvykių reguliavimu Drosophila. Jie yra transkripcijos faktoriai (reguliuojantys genus, lemiančius tolesnį vystymosi likimą), ir jie turi tą patį baltymo motyvą savo DNR surišimo domenams.

Kai kurie konkretūs pavyzdžiai yra šių genų produktai:

  • poros taisyklės genas išvakarės= net praleido
  • segmento poliškumo genas lt= išgraviruotas
  • homeotinis genas Antp= antenospedija

Naujausia apžvalga: Scott, M. (1994) Cell 79: 1121-1124.

b) Kiti baltymai

Spalio baltymai; Spalio 1 yra visose tirtose ląstelėse, o spalis 2 yra specifinis limfoidui. Abu jungiasi prie oktamero sekos. Abiejuose šiuose baltymuose prieš homeodomeną yra kitas svarbus baltymų motyvas, vadinamas POU domenu.

2. Cinko pirštai

(1) Cys2His2

a) Sutarimo seka:

Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-Jo-X3-Jo

(b) Kiekvieno iš 2 Cys tiolio ir vieno iš 2 His donoro elektronų porų imidazolo žiedinio azoto, kad susidarytų tetraedrinis koordinavimo kompleksas su Zn2+. Tai sudaro „piršto“ pagrindą.

c) „Kairė“ piršto pusė (su 2 Cys) sudaro du beta lakštus, o „dešinė“ (su 2 His) sudaro a-spiralę. Tai buvo prognozuojama iš numatomų šios sekos antrinių struktūrų, vėliau buvo parodyta 2-D BMR ir patvirtinta kristalų rentgeno difrakcijos analize.

4.5.13 pav. C2H2 Zn pirštas

(d) Baltyme su 3 gretimais Zn pirštais, pvz. Sp1 (prisiminkite šį baltymą iš ankstyvojo SV40 promotoriaus), kiekvienas pirštas susieja pagrindinį griovelį ir liečiasi su trimis gretimomis bazinėmis poromis. Didelio afiniteto surišimo vietai vienas pirštas susiliečia su GGG, kitas pirštas – GCG, o likęs pirštas – GGG. Taigi trys pirštai išlenkti, kad susiliestų su pagrindiniu grioveliu daugumoje vieno spiralės posūkio.

e) Šios klasės Zn pirštų baltymų nariai turi kelis pirštus, dažniausiai tandemo masyve. Pavyzdžiai yra TFIIIA (šio baltymo motyvas buvo aptiktas) 9 pirštais, CAC surišantis baltymas (tam tikru mastu susijęs su Sp1) 3 pirštais ir Drosophila ADR1 2 pirštais.

(2)Cys2Cys2

a) Konsensuso seka:

Cys-X2-Cys-X1-3-Cys-X2-Cys

(b) Sudaro aiškiai skirtingą struktūrą nuo Cys2His2 Zn pirštų.

  1. Atminkite, kad aminorūgščių skaičius tarp 2 piršto pusių (šiuo atveju nuo 1 iki 3) yra daug mažesnis nei 12, skiriančių dvi Cys2His2 Zn piršto puses.
  2. Vykdant domenų apsikeitimo eksperimentus, Cys2Cys2 pirštai nėra keičiami su Cys2His2 Zn pirštais.
  3. Baltymai neturi didelių motyvų pasikartojimų, priešingai nei baltymai su Cys2His2 Zn pirštais.

c) randama steroidinių hormonų receptorių, pvz. gliukokortikoidų receptorių

Kiekvienas receptoriaus monomeras turi du Cys2Cys2 pirštus, vieną DNR surišimui, o kitą dimerizacijai. Kiekvienas dimero monomeras jungiasi prie nuoseklių pagrindinio griovelio posūkių, kad užimtų surišimo vietą (su diadų simetrija).

(3)Cys6

a) DNR surišimo domenas GAL4turi 6 Cys šioje sekoje:

Cys-X2-Cys-X6-Cys-X6-Cys-X2-Cys-X6-Cys

(b) 6 cisteinos koordinuojasi su 2 Zn2+ atomais, sudarydamos binuklearinę grupę.

(c) Puikus „Chime“ pristatymas, rodantis GAL4 DNR surišimo domeną ir dimerizacijos domenus, gali būti matomas

http://www.umass.edu/microbio/chime/...c/2frmcont.htm

Šis filmas gana aiškiai parodo daugelį baltymų savybių. Pvz., Atkreipkite dėmesį, kad DNR surišimo domenas daugiausia liečiasi su DNR cukraus fosfato pagrindu ir labai mažai liečiasi su pagrindiniais ar mažesniais grioveliais. Tai akivaizdžiai prieštarauja sąveikai, pastebėtoms kitų šiame skyriuje aptartų transkripcijos veiksnių.

(d) Šis konkretus Zn koordinuotas cisteinų spiečius buvo pastebėtas keliuose mielių reguliavimo baltymuose, tačiau nėra labai paplitęs kituose iki šiol ištirtuose organizmuose.

(4) GATA1

a ) GATA1 yra transkripcijos faktorius, gausus eritroidinėse ląstelėse, reikalingas eritroidų diferenciacijai. Jį įrišančios vietos sutaria WGATAR (W = A arba T, R = A arba G). GATA1 surišimo vietos yra įprastos eritroidinių genų promotoriuose, stiprintuvuose ir lokuso kontrolės srityse.

( b ) DNR surišimo domenas turi Zn pirštus, tačiau jo struktūra aiškiai skiriasi nuo kitų, aptartų anksčiau.

(c) Šis surišimo domenas yra keliuose akivaizdžiai nesusijusiuose DNR surišančiuose baltymuose, įskaitant kai kuriuos grybelius reguliuojančius baltymus.

(d) Keli į GATA panašūs baltymai turi 2 Zn pirštus. Vienas jungiasi prie konkrečios DNR vietos, kitas pirštas sąveikauja su kitais baltymais.

3. Leucino užtrauktukas

(1) Leucino užtrauktukas per seyra dimerizacijos sritis. Kiekviename monomere užtrauktuko sritis sudaro spiralę su leucinu kas 7 aminorūgštis, ty kas 2 spiralės apsisukimus. Dėl to susidaro leucinų eilė išilgai hidrofobinio spiralės paviršiaus. Abu monomerai sąveikauja, interkaluodami leuciną išilgai jų hidrofobinių paviršių. Abi spiralės sudaro ritę. Kitos alifatinės amino rūgštys, tokios kaip valinas, gali pakeisti leuciną.

4.5.14 pav. Pagrindiniai leucino užtrauktuko baltymai

(2) Pagrindinė sritis yra tik leucino užtrauktuko N-galo pusėje daugelyje baltymų. Pagrindinis regionas ir leucino užtrauktukas (bZip) yra DNR surišanti sritis.

(3) Pavyzdžiai

a) C/EBP = CCAAT/stipriklis, jungiantis baltymą, sudaro homodimerą

( b ) AP1 šeima apima c-Fos ir c-Jun heterodimerus

4. Pagrindinė spiralė-kilpa-spiralė

(1) Sraigto kilpos-spiralės (HLH) motyvą sudaro dvi amfipatinės spiralės, atskirtos kintamo ilgio kilpa. Amfipatinė spiralė tiesiog turi hidrofobinę ir hidrofilinę pusę. Dimerizacija vyksta sąveikaujant tarp hidrofobinių veidų.

(2) DNR surišimo domenas susideda iš bazinės srities ir spiralės-kilpos-spiralės regiono (bHLH).

4.5.15 pav. Pagrindiniai spiralės-kilpos-spiralės baltymai

(3) Pavyzdžiai apima heterodimerus, kurie gali keistis partneriais

(a) MyoD yra pagrindinis baltymas, įpareigojantis mezoderminius audinius raumenų diferenciacijai. Kiti giminaičiai, tokie kaip miogeninas ir myf5, yra vienodai svarbūs ir atlieka nereikalingas funkcijas. Visi jie yra specifiniai raumenims ir turi panašią surišimo sritį. MyoD yra aktyvus, kai jo heterodimerinis partneris yra E12 arba E47; kai jis bus aktyvus, jis stimuliuos specifinių raumenų genų, pvz., koduojančių kreatino kinazę, transkripciją. Iš pradžių E12 ir E47 buvo atrasti kaip baltymai, kurie jungiasi su imunoglobulino genų stiprikliais, tačiau randami beveik visų tipų ląstelėse. Kitas baltymas, vadinamas Id, taip pat gali prisijungti prie E12 arba E47 pagal savo HLH domeną. Tačiau Id trūksta pagrindinio domeno, todėl heterodimeriai su Id nėra aktyvūs. Taigi bHLH baltymų aktyvumą galima reguliuoti keičiantis partneriais.

(b) Plėtojama tema yra ta, kad vienas iš bHLH heterodimero partnerių yra visur (pvz., E12, E47 žinduoliams, da = be dukterų Drosophila), o kitas yra specifinis audiniui (MyoD arba AC-S = achaete-scute, a Drosophila neurogenezės reguliatorius). Visur esantys komponentai gali būti susiję su įvairių kitų audiniams būdingų baltymų, turinčių bHLH domenus, reguliavimu.

c) Myc, vienas iš daugelio ląstelių ciklo reguliatorių, yra bHLH baltymas. Tai sudaro partnerius su Maxu, ir gali būti, kad tai svarbu reguliuojant ląstelių ciklą.

E. Transkripcijos aktyvinimo domenai

1. Rūgštinis

Manoma, kad ši sritis yra „rūgšties dėmė“ arba amfipatinė spiralė su rūgštinėmis liekanomis viename veide. Naujausi fizikiniai ir cheminiai GAL4 tyrimai parodė b lapo struktūrą. Šiuo metu nėra sukurta viena struktūra. Pavyzdžiai:

GAL4 baltymas, VP16, GCN4, gliukokortikoidų hormono receptorius, AP1 ir l represorius (PRM aktyvavimas).

2. Gln turtingas

Šiame domene gausu glutamino, kaip rodo jo pavadinimas. Baltymų, turinčių domeną, pavyzdžiai yra Sp1, Antp, Oct1 ir Oct2

3. Pro turtingas

Vėlgi, domene gausu prolino. Pavyzdžiai yra CTF/NF1 (susiję su replikacijos reguliavimu kaip nbranduolinis faktorius 1ir pasiūlė būti vienu iš daugelio baltymų, jungiančių CCAAT motyvus).

4. Iki šiol atliktas darbas šioms sritims nenustatė aiškiai apibrėžtų antrinių ar tretinių struktūrų.

Viena iš galimybių yra tai, kad aktyvinimo domenai prisiima tinkamą struktūrą, kai jie prisijungia prie jo tikslo, ty an sukeltas tinkamas modelis.

4.5.1 lentelė. Pasirinkti eukariotinės transkripcijos faktoriai ir jų savybės

vardas

Sistema

Įrišimo vieta (viršutinė dalis)

Ketvirtinė struktūra

DNR surišimo sritis

Aktyvinimo domenas

Kiti komentarai

Išgraviruotas

ankstyvas vystymasis

homeodomain

Sp1

SV40, ląstelių namų tvarkymo genai

GGGGCGGGG

monomeras

3 Zn pirštai

Cys2His2

Turtingas gln

fosfoproteinas

AP1

SV40, ląstelių stiprikliai

TGASTCA

heterodimeras, Jun-Fos, Jun2 ir kt

pagrindinis regionas + Leu užtrauktukas

rūgštus

reguliuojamas fosforilinimo

spalio 1 d

limfoidiniai ir kiti genai

ATTTGCAT

monomeras, bet gali surišti VP16

POU domenas + namų domenas (HTH)

Gln turtingas, taip pat jungiasi su VP16

Spalio 1 yra visur, spalio 2 yra specifinis limfoidams

GAL4

mielių galaktozės regulonas

CGGASGACWGTCSTCCG

homodimeras

Zn2Cys6, dvibranduolinis klasteris

rūgštus

Gliukokortikoidų receptoriai

į gliukokortikoidus reaguojantys genai

TGGTACAAATGTTCT

citoplazma: su „šilumos šoko“ baltymais;

branduolys: homodimeras

2 Zn pirštai,

Cys2Cys2

arti Zn piršto

hormono ligando prisijungimas keičia konformaciją, pereina į branduolį ir aktyvuoja genus

MyoD

miogenezės nustatymas

CAGCTG

heterodimeras su E12/E47: aktyvus;

heterodimeras su ID: neaktyvus

pagrindinis-spiralė-kilpa-spiralė

perjunkite partnerius, kad įjungtumėte arba išjungtumėte

HMG (I) Y

interferono genas ir kiti

nedidelis griovelis

monomeras (?)

lenkia DNR, kad užtikrintų palankią kitų baltymų sąveiką

VP16

Herpes simplex virusas

neprisiriša prie DNR

prisijungia prie baltymų, tokių kaip spalio 1 d

rūgštinis aktyvacijos domenas; labai stiprus

jungiasi prie kitų baltymų, kurie patys jungiasi specifiškai prie DNR

F. Stiprintojai gali veikti padidindami tikimybę, kad genas bus transkripciškai kompetentingame chromatino regione.

4.5.16 pav. Kai kurie stiprikliai padidina transkripcijos pradžios greitį

Bet…

4.5.17 pav. Kai kurie stiprikliai padidina tikimybę, kad genas bus transkripcijai kompetentingos būsenos.

Pastarasis stebėjimas reiškia chromatinu pagrįstą šių stipriklių veikimo būdo mechanizmą. Pavyzdžiui, jie gali veikti pakeisdami chromatino struktūrą aplink geną, įtraukdami jį į „atvirą“ arba „aktyvų“ chromatino domeną. Manoma, kad „atviro“ chromatino genai yra labiau prieinami transkripcijos mechanizmui. Tai išsamiau aptariama 20 skyriuje.

G. Ryšys tarp promotoriaus ir stipriklio

1. Modeliai: ciklas prieš sekimą

4.5.18 pav.

a. Kilpos modeliuose aktyvatoriai, susieti su stiprintuvu, yra priartinami prie savo taikinių prie promotoriaus, formuojant kilpas DNR.

  1. Aktyvatoriai gali užmegzti tiesioginį ryšį su savo taikiniu (galbūt priešiniciacijos kompleksu) arba jie gali veikti per tarpininką, vadinamą koaktyvatoriusarba tarpininkas.
  2. Jei susidaro kilpa, iš esmės nesvarbu, kokio dydžio ji yra, ar aktyvatoriaus surišimo vieta yra 5' ar 3' atstumu nuo taikinio. Tai galėtų paaiškinti stiprintuvų gebėjimą veikti nepriklausomai nuo padėties.

b. Į sekimo modeliai, stipriklis yra veiksnių, kurie turi surinkti transkripcijos kompleksą ant promotoriaus, įėjimo vieta. Kai aktyvatoriaus baltymai prisijungia prie stipriklio, jie palengvina patekimą, pvz. bendrieji transkripcijos faktoriai ir RNR polimerazė į chromosomą. Tada šie komponentai juda palei chromosomą, kol pasiekia promotorių, kur surenka iniciacijos kompleksą. Jei komponentai gali judėti bet kuria kryptimi, stiprintuvas gali veikti iš bet kurios padėties, palyginti su promotoriumi. Šiame modelyje nėra tiesioginio kontakto tarp aktyvatoriaus baltymų, prijungtų prie stipriklio, ir išankstinio inicijavimo komplekso promotoriuje.

4.5.19 pav.

c. Šiuo metu pirmenybė teikiama kilpiniam modeliui. Tačiau buvo sunku sukurti eksperimentus, kurie neabejotinai atmeta stebėjimą. Keletas stebėjimų rodo, kad DNR gali sudaryti kilpas in vitro, leidžiantis kontaktuoti tarp stiprintuvo ir promotoriuje esančių baltymų. Pavyzdžiui:

  1. Naudojant elektroninę mikroskopiją, galima vizualizuoti DNR kilpas, kurias laikosi sąveika tarp su stiprintuvu susietų aktyvatoriaus baltymų ir baltymų, sujungtų su promotoriumi.
  2. Biocheminiai metodai rodo, kad transkripcijos faktorių aktyvavimo sritys galijungiasi su išankstinio inicijavimo komplekso komponentais, tokiais kaip TFIID (žr. H skyrių).

Tačiau, kaip bus aptarta toliau, genetiniai eksperimentai rodo, kad šios sąveikos nėra reikalaujamabent kai kurių genų transkripcijos aktyvavimui. Net jei tokia sąveika vyksta fiziologiškai, ar ji yra stabilaus ciklo komplekso dalis, ar tai laikina sąveika, kuri atsirastų transkripcijos faktorių įvedimo metu stebėjimo modelio stiprintuve?

Viena įrodymų linija, kuri buvo naudojama palaikant kilpinį modelį, yra ta, kad stiprintuvas, esantis vienoje DNR molekulėje, gali veikti kitos DNR molekulės tikslinį promotorių, jei abi molekulės fiziškai laikomos kartu su biotino ir avidino jungtimi. Šis ryšys sulaiko DNR molekules arti, o tai gali būti aiškinama kaip imituojanti kilpą. Tačiau taip pat galima teigti, kad stebėjimas įvyko per biotino-avidino tiltą. Galimybė paaiškinti eksperimentinius rezultatus abiejų modelių požiūriu reiškia, kad dizainas ir turimos technologijos nebuvo pakankamai tvirtos, kad būtų galima atskirti du modelius.

Perhaps the strongest argument against the tracking model is that the physical basis for the tracking is not specified. Of course, this makes it more difficult to design experiments to test it.

As is the case for many issues in eukaryotic gene regulation, different genes may be regulated by different mechanisms.

2. Stereospecific complex: Role of proteins that bend DNA

a. Recent experiments have shown the importance of a highly specific three-dimensional nucleoprotein complex at some promoters [reviewed in Tjian and Maniatis (1994) Cell 77:5-8].

Figure 4.5.20. DNA bending by HMGI(Y) in formation of enhanceosome at IFNBpromoter.

b. į enhancer for the interferon-bgenas, which is located just upstream from the promoter, has binding sites for three dimeric "conventional" transcription factors: NFKB (p50 + p65), IRF, and a heterodimer of ATF2 + Jun (a relative of AP1). Be to, yra three specific binding sites for HMGI(Y).

  1. HMGI(Y) is a member of the "high mobility group" of nonhistone chromosomal proteins. Most HMG proteins are abundant in the nucleus, albeit not as abundant as histones.
  2. HMGI(Y) binds in the minor groove of DNA and bends the DNA.
  3. It also makes specific protein-protein contacts with IRF, ATF2 and NFkB, even in the absence of DNA.
  4. By bending the DNA at precise positions by a defined amount, and by aiding the binding of other proteins, HMGI(Y) seems to play a critical role in assembly of the enhancer complex in juxtaposition with the promoter.
  5. In general, proteins that bend DNA can be the agents that cause the looping to bring the enhancer-binding proteins in proximity to their targets.

c. Other proteins that bend DNA

cAMP-CAP (recall this from catabolite repression in E. coli), IHF = integration host factor (required for integration of l DNA to form a prophage, via a large complex called an intasome), and YY1 (ying yang 1) which has either negative or positive effects on a large variety of genes in mammals.


By James D. Watson, Cold Spring Harbor Laboratory Tania A. Baker, Masačiusetso Technologijų Institutas Alexander Gann, Cold Spring Harbor Laboratory Michael Levine, Kalifornijos universitetas, Berklis Richard Losick, Harvardo universitetas

Now completely up-to-date with the latest research advances, the Seventh Edition of James D. Watson’s classic book,Molecular Biology of the Gene retains the distinctive character of earlier editions that has made it the most widely used book in molecular biology. Twenty-two concise chapters, co-authored by six highly distinguished biologists, provide current, authoritative coverage of an exciting, fast-changing discipline.


Positive and negative regulation of gene expression in eukaryotic cells with an inducible transcriptional regulator

To facilitate the understanding of the complex process of target gene expression and its control, we report a modified inducible system for activation or repression of target gene expression in response to an exogenously administered compound. The main component of this inducible system is a chimeric transcriptional activator (GLVP) consisting of an N-terminal VP16 transcriptional activation domain fused to a yeast GAL4 DNA binding domain and a mutated human progesterone receptor (hPR) ligand binding domain (LBD). This chimeric regulator binds to a target gene containing the 17-mer GAL4 upstream activation sequence (UAS) in the presence of anti-progesterone, RU486. We showed that the combination of two different types of domains (VP16 and poly-glutamine stretch) into one chimeric molecule could result in a further increase in transcriptional activation potency. Through mutational analysis, we modified the original GLVP and generated a more potent version of the RU486 inducible regulator GL914 VPc with a 19 amino acid deletion of the hPR-LBD (delta C19) and a C-terminally located VP16 activation domain. More importantly, this new chimeric regulator can effectively activate target gene expression at a much lower concentration of RU486 (0.01 nM). The concept of RU486 regulatable gene expression is not limited to gene activation. By replacing the VP16 activation domain with a KRAB transcriptional repression domain, we are able to achieve inducible repression of target gene expression. We also present evidence that individual functional domains within a chimeric protein could modulate each other's function depending on their relative positions within the molecule. Using this potent regulator, we demonstrate that inducible nerve growth factor (NGF) secretion into conditioned media can elicit neurite outgrowth in co-cultured PC12 cells. This new versatile inducible system can potentially be used to control target gene expression in a mammalian system in vivo.


19: Transcriptional regulation in eukaryotes - Biology

Molecular Biology of the Gene (7E) by James D. Watson

MathSchoolinternational contain 5000+ of Mathematics Free PDF Books and Physics Free PDF Books . Which cover almost all topics for students of Mathematics, Physics and Engineering. Here is extisive list of Molecular Biology Free PDF Books . We hope mathematician or person who’s interested in science like these books.

We need Your Support, Kindly Share this Web Page with Other Friends

Congratulations, the link is avaliable for free download.

About this book :-
Molecular Biology of the Gene (7E) written by James D. Watson
The field of molecular biology as we understand it today was born out of the discovery of the DNA structure and the agenda for research that that structure immediately provided. The paper by Watson and Crick proposing the double helix ended with a nowfamous sentence: “It has not escaped our notice that the specific pairingwe have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.” The structure suggested how DNA could replicate, opening the way to investigate, in molecular terms, how genes are passed down through generations. It was also immediately apparent that the order of bases along aDNAmolecule could represent a “genetic code,” and so an attack on that second great mystery of genetics—how genes encode characteristics—could also be launched.
The current edition of Molecular Biology of the Gene celebrates both the central intellectual framework of the field put in place in that first edition and the extraordinary mechanistic, biological, and evolutionary understanding that has since been achieved.
(James D. Watson)

Book Detail :-
Title: Molecular Biology of the Gene
Edition: 7-oji
Author(s): James D. Watson
Leidėjas: Pearson
Serija:
Metai: 2013
Puslapiai: 911
Tipas: PDF
Language: Anglų
ISBN: 0321762436,9780321762436
Country: JAV
Get Similar Books from Amazon

About Author :-
Autorius James Dewey Watson KBE (born 1928) is an American molecular biologist, geneticist and zoologist. In 1953, he co-authored with Francis Crick the academic paper proposing the double helix structure of the DNA molecule. Watson, Crick and Maurice Wilkins were awarded the 1962 Nobel Prize in Physiology or Medicine "for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material". In subsequent years, it has been recognized that Watson and his colleagues did not properly attribute colleague Rosalind Franklin for her contributions to the discovery of the double helix structure.
Watson earned degrees at the University of Chicago (BS, 1947) and Indiana University (PhD, 1950). Following a post-doctoral year at the University of Copenhagen with Herman Kalckar and Ole Maaløe, Watson worked at the University of Cambridge's Cavendish Laboratory in England, where he first met his future collaborator Francis Crick. From 1956 to 1976, Watson was on the faculty of the Harvard University Biology Department, promoting research in molecular biology.
Watson has written many science books, including the textbook Molecular Biology of the Gene (1965) and his bestselling book The Double Helix (1968). Between 1988 and 1992, Watson was associated with the National Institutes of Health, helping to establish the Human Genome Project, which completed the task of mapping the human genome in 2003.

All Famous Books of this Author :-
Here is list all books/editions avaliable of this author, We recomended you to download all.
• Download PDF Molecular Biology of the Gene (7E) by James D. Watson

Book Contents :-
Molecular Biology of the Gene (7E) written by James D. Watson cover the following topics.
PART-1 HISTORY
1. The Mendelian View of the World
2. Nucleic Acids Convey Genetic Information
PART-2 STRUCTURE AND STUDY OF MACROMOLECULES
3. The Importance of Weak and Strong Chemical Bonds
4. The Structure of DNA
5. The Structure and Versatility of RNA
6. The Structure of Proteins
7. Techniques of Molecular Biology
PART-3 MAINTENANCE OF THE GENOME
8. Genome Structure, Chromatin, and the Nucleosome
9. The Replication of DNA
10. The Mutability and Repair of DNA
11. Homologous Recombination at the Molecular Level
12. Site-Specific Recombination and Transposition of DNA
PART-4 EXPRESSION OF THE GENOME
13. Mechanisms of Transcription
14. RNA Splicing
15. Translation
16. The Genetic Code
17. The Origin and Early Evolution of Life
PART-5 REGULATION
18. Transcriptional Regulation in Prokaryotes
19. Transcriptional Regulation in Eukaryotes
20. Regulatory RNAs
21. Gene Regulation in Development and Evolution
22. Systems Biology
PART-6 APPENDICES
1. Model Organisms
2. Answers
Indeksas

We are not the owner of this book/notes. We provide it which is already avialable on the internet. For any further querries please contact us. We never SUPPORT PIRACY. This copy was provided for students who are financially troubled but want studeing to learn. If You Think This Materials Is Useful, Please get it legally from the PUBLISHERS. Ačiū.


Žiūrėti video įrašą: Регулировка клапанов Д 245 (Gruodis 2022).