Informacija

7.11: Viruso replikacija - biologija

7.11: Viruso replikacija - biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ar pastebėjote virusus, sėdinčius ant bakterijų?

Kodėl virusas sėdi čia? Atminkite, kad virusai nėra gyvi. Taigi, kaip jie replikuojasi?

Virusų replikacija

Virusų populiacijos neauga per ląstelių dalijimąsi, nes jos nėra ląstelės. Vietoj to, jie naudoja ląstelių šeimininko mašinas ir metabolizmą, kad sukurtų naujas savo kopijas. Užkrėtęs ląstelę-šeimininkę, virionas naudoja ląstelės ribosomas, fermentus, ATP ir kitus komponentus, kad galėtų daugintis. Virusai skiriasi tuo, kaip jie tai daro. Pavyzdžiui:

  • Kai kurie RNR virusai yra tiesiogiai paverčiami virusiniais baltymais šeimininko ląstelės ribosomose. Priimančiosios ribosomos viruso RNR traktuoja taip, tarsi tai būtų paties šeimininko mRNR.
  • Kai kurie DNR virusai pirmiausia ląstelėje -šeimininke perrašomi į virusinę mRNR. Tada viruso mRNR šeimininko ląstelės ribosomos paverčiama virusiniais baltymais.

Bet kuriuo atveju naujai pagaminti virusiniai baltymai susirenka ir sudaro naujus virionus. Tada virionai gali nukreipti fermento, kuris suardo šeimininko ląstelės sienelę, gamybą. Tai leidžia virionams išsiveržti iš ląstelės. Proceso metu sunaikinama ląstelė-šeimininkė. Naujai išleistos viruso dalelės gali laisvai užkrėsti kitas šeimininko ląsteles.

RNR virusų replikacija

An RNR virusas yra virusas, kurio genetinė medžiaga yra RNR. Jų nukleorūgštis dažniausiai yra viengrandė RNR, bet gali būti ir dvigrandė RNR. Svarbūs žmogaus patogeniniai RNR virusai yra sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo (SARS) virusas, gripo virusas ir hepatito C virusas. Gyvūnų RNR virusai gali būti suskirstyti į skirtingas grupes, atsižvelgiant į jų replikacijos tipą.

  • Kai kurių RNR virusų genomas naudojamas tiesiogiai, tarsi tai būtų mRNR. Užsikrėtus virusu, viruso RNR paverčiama tiesiai į naujus viruso baltymus.
  • Kai kurie RNR virusai turi fermentų, kurie leidžia jų RNR genomui veikti kaip šablonas ląstelės šeimininkei, kad susidarytų virusinė mRNR.
  • Retrovirusai replikuoti naudokite tarpinius DNR produktus. Atvirkštinė transkriptazė, viruso fermentas, kilęs iš paties viruso, paverčia viruso RNR į papildomą DNR grandinę, kuri nukopijuojama, kad susidarytų dvigubos grandinės viruso DNR molekulė. Šią virusinę DNR perrašo ir išverčia šeimininko mašinos, nukreipdamos naujų virionų susidarymą. Įprasta transkripcija apima RNR sintezę iš DNR; todėl atvirkštinė transkripcija yra atvirkščiai šio proceso. Tai pagrindinės molekulinės biologijos dogmos išimtis.

DNR virusų replikacija

A DNR virusas yra virusas, kurio genetinė medžiaga yra DNR ir dauginasi naudojant nuo DNR priklausomą DNR polimerazę. Nukleino rūgštis paprastai yra dvigrandė DNR, bet gali būti ir viengrandė DNR. DNR virusų DNR ląstelė šeimininkė perrašo į mRNR. Tada viruso mRNR verčiama į virusinius baltymus. Tada šie virusiniai baltymai susirenka ir sudaro naujas viruso daleles.

Atvirkštiniai virusai

A atvirkštinio transkripcijos virusas yra bet koks virusas, kuris dauginasi naudojant atvirkštinę transkripciją - DNR susidarymą iš RNR šablono. Kai kurių atvirkštinio transkribavimo virusų genomai yra sudaryti iš vienos grandinės RNR ir replikuotis naudoja DNR tarpinę medžiagą. Kiti šios grupės genomai turi dvigubos grandinės DNR ir naudoja RNR tarpinę medžiagą replikacijos metu. Retrovirusai, kaip minėta aukščiau, yra įtraukti į šią grupę, kuriai priklauso ŽIV. Kai kurie dvigubos grandinės DNR virusai dauginasi naudojant atvirkštinę transkriptazę. Hepatito B virusas yra vienas iš šių virusų.

Bakteriofagai

Bakteriofagai yra virusai, užkrečiantys bakterijas. Jie jungiasi prie bakterinės ląstelės paviršiaus receptorių molekulių, o tada jų genomas patenka į ląstelę. Baltymų sluoksnis nepatenka į bakterijas. Per trumpą laiką, kai kuriais atvejais, vos kelias minutes, bakterinė polimerazė pradeda versti viruso mRNR į baltymą. Šie baltymai tampa arba naujais virionais ląstelėje, pagalbiniais baltymais, padedančiais surinkti naujus virionus, arba baltymais, dalyvaujančiais ląstelių lizėje. Virusiniai fermentai padeda suardyti ląstelės membraną. Su kai kuriais fagais, praėjus daugiau nei dvidešimčiai minučių po to, kai fagas užkrečia bakteriją, galima surinkti ir paleisti iš šeimininko daugiau nei tris šimtus fagų.

Santrauka

  • Užkrėtęs ląstelę šeimininkę, virusas naudoja ląstelės mechanizmus ir medžiagų apykaitą, kad sukurtų naujas savo kopijas.

Apžvalga

  1. Apskritai, apibūdinkite viruso replikaciją.
  2. Apibūdinkite, kaip dauginasi DNR virusai.
  3. Kas yra atvirkštinio perrašymo virusai?

JK B.1.1.7 variantas padidina nežmoginių primatų kvėpavimo replikaciją ir išsiskyrimą

Nuolatinis SARS-CoV-2 variantų atsiradimas reikalauja reguliaraus vertinimo, siekiant nustatyti viruso replikacijos, išsiskyrimo ir susijusių ligų skirtumus. Šiame tyrime Afrikos žaliosios beždžionės buvo užkrėstos nosimi šiuolaikiniu D614G arba JK B.1.1.7 variantu. Abu variantai sukėlė lengvą kvėpavimo takų ligą, o klinikiniai vaizdai reikšmingai nesiskyrė. Žymiai didesnis viruso RNR ir infekcinio viruso kiekis nustatytas B.1.1.7 infekuotų gyvūnų viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų mėginiuose ir audiniuose. Įdomu tai, kad D614G užsikrėtę gyvūnai parodė žymiai didesnį viruso RNR ir infekcinio viruso kiekį tiesiosios žarnos tamponuose ir virškinimo trakto audiniuose. Mūsų rezultatai rodo, kad Afrikos žaliųjų beždžionių B.1.1.7 infekcija yra susijusi su padidėjusia kvėpavimo takų replikacija ir išsiliejimu, bet ne ligos paūmėjimu, panašiu į žmogaus B.1.1.7 atvejus.

Vieno sakinio santrauka JK B.1.1.7. Afrikos žaliųjų beždžionių infekcija padidina kvėpavimo takų replikaciją ir išsiskyrimą, bet nepagerina ligų


Daktaras RICHARDAS KUHNAS

(Molekulinė biologija ir gyvūnų virusologija) Viruso genų ekspresijos viruso ir šeimininko sąveika patogenezės viruso receptoriai ir viruso surinkimas.

Mano laboratorija domisi RNR virusų replikacija, surinkimu ir struktūra, pabrėždama jų sąveiką su šeimininku. Mūsų molekuliniai tyrimai naudoja pažangiausius funkcinės genomikos, didelio našumo sistemų technologijų, ląstelių biologijos ir struktūrinės biologijos įrankius. Pastaraisiais metais daugiausia dėmesio skyrėme modelių sistemoms alfa ir flavivirusų grupėse, įskaitant tokius virusus kaip Sindbis, Chikungunya, dengės karštligė, Vakarų Nilo virusai ir hepatito C virusai. Daugumą šių žmogaus virusų perduoda vabzdžių vektoriai, todėl jie pakaitomis keičiasi tarp labai įvairių šeimininkų. Tiesiogiai su mūsų pagrindiniais tyrimais susiję taikymu pagrįsti tyrimai, kuriais siekiama nustatyti naujus ligos intervencijos gydymo būdus.

Išsilavinimas

Ph.D. SUNY Stony Brook mieste, 1986 m

Apdovanojimai

  • Purdue universiteto fakulteto mokslininkas, 2004-2009 m
  • 1000 biologijos fakultetas-fakulteto narys (nuo 2004 m.)
  • JAV ir Japonijos medicinos mokslų kooperatyvo programos JAV virusinių ligų grupės narys, 2007 m.
  • Amerikos mikrobiologijos akademijos bendradarbis, nuo 2007 m
  • Amerikos mokslo pažangos asociacijos bendradarbis, nuo 2007 m
  • Herberto Newby McCoy apdovanojimas už puikų mokslinių tyrimų indėlį (2008)
  • CIC bendradarbis, akademinės lyderystės programa (2008-2009)
  • Amerikos mikrobiologijos draugijos lektorė, nuo 2011 m
  • Purdue universiteto pasaulinės tarybos narys, nuo 2011 m

Kita veikla

  • Virusologijos žurnalas
  • Virologija
  • Virusai
  • Mikrobiologijos ir molekulinės biologijos apžvalgos, Asocijuotasis redaktorius (2012–2015 m.)

Suteikite atsiliepimus/studijų skyrius

  • Austrijos mokslų akademija
  • Austrijos mokslo fondas
  • Europos Sąjunga
  • Airijos mokslo fondas
  • Sveiki pasitikėję
  • Purdue vėžio centro dotacijų grupė
  • Fort Detrick encefalomielito programos apžvalga (AIBS 3/98)
  • NIH Biodefense ir infekcinių ligų ypatingo dėmesio grupė, pirmininkas (03/03, 04/04)
  • NIH studijų skyrius (ypatingas dėmesys infekcinėms ligoms), pirmininkas, Vašingtonas, 2004 m. vasario 29 d.–kovo 2 d.
  • NIH eksperimentinės virusologijos studijų skyrius, ad hoc apžvalgininkas (2/99) narys (7-99-6/03)
  • CDC Vakarų Nilo viruso ypatingo dėmesio grupė, pirmininkas (8/04)
  • NIH virusologijos studijų skyrius, ad hoc recenzentas (6/05, 2/07)
  • NCI apsilankymo svetainėje apžvalga, Nanobiologijos programa ir struktūrinės biofizikos laboratorija (5/06)
  • NIH Special Emphasis Study Section on Viral Patogenesis, pirmininkas (2/07, 6/07)
  • NIH Patogeninių virusų tyrimo skyrius (07-10)
  • NIH studijų skyrius virusologijos temomis, pirmininkas (6/08)
  • NIH ypatingas dėmesys patogenezei, pirmininkas (7/08)
  • NIH tyrimų skyrius apie vakcinas nuo mikrobų ligų, pirmininkas (10/08)
  • Tarpusavio medicinos tyrimų programos (PRMRP) Vakarų Nilo viruso vakcinų grupės apžvalga (AIBS 7/09)
  • NIH tyrimo skyrius apie ne ŽIV infekcines terapijas,
  • Pakviestas Europos Komisijos vertintojas, mokslinių tyrimų pasiūlymai FP7-Health-2011 Single Stage (2011 m.)
  • Mokslinės darbo grupės NIAID virusinių patogenų duomenų bazės ir analizės išteklių narė (2010–2012 m.)
  • ĮSA apžvalgų kolegijos narys, (2010–2012 m.)
  • (AIBS) virusinių ligų grupės narė, JAV armijos medicininių tyrimų ir Materijos vadovybė, Karinių infekcinių ligų tyrimų programa, 2012 m.-dabar

  • Čikagos Ilinojaus universiteto SARS patariamosios tarybos narys (2008–2009 m.)
  • Didžiųjų ežerų regioninio kompetencijos centro „Biodefense“ ir „Biodefense“ bei infekcinių ligų (GLRCE) vykdomosios valdybos narys, 09/04-dabar
  • Purdue universiteto „Discovery Learning Research Center“ vidinė patariamoji taryba (2010–2012 m.)
  • „Sentinext Therapeutics“ mokslinės patariamosios tarybos narys (2010–2012 m.)
  • Manoa Havajų universiteto Biomedicininių tyrimų kompetencijos centro išorinio patariamojo komiteto narys (2009–2014 m.)
  • Amerikos virusologijos draugijos programų planavimo komiteto pirmininko pavaduotojas, 2011 m

Konferencijos ir seminarai

  • 6-asis tarptautinis asamblėjos virusų asamblėjos simpoziumas, Kreta, Graikija, 2009 m. gegužės 3–7 d. Pakviestas pranešėjas „Struktūriniai ir funkciniai tyrimai, tiriantys alfaviruso surinkimą“
  • Tarpdisciplininis seminaras apie fizinius viruso surinkimo ir infekcijos aspektus, Kalifornijos NanoSystems institutas, Los Andželas, CA, 2009 m. Gegužės 7–9 d.
  • Indo-JAV dvišalė konferencija „Infekcinės ligos: naujos vaistų ir vakcinų kūrimo strategijos“ (CID2010), Mumbajus, Indija, 2010 m. Sausio 5–8 d. Programos pirmininkas ir pakviestas pranešėjas.
  • Keystone simpoziumas, Viruso patekimo, replikacijos ir patogenezės ląstelių biologija, Taosas, Naujoji Meksika, 2010 m. vasario 16–21 d. Programos dėstytojai ir pakviestas pranešėjas „Dengės karštligės viruso struktūra ir funkcija surinkimo, brendimo ir patekimo metu“
  • 9-asis tarptautinis teigiamų grandinių RNR virusų simpoziumas, Atlanta, GA, 2010 m. Gegužės 17–21 d.
  • 44-asis kasmetinis JAV ir Japonijos virusologijos grupės posėdis ir gleivinės imuniteto seminaro simpoziumas, Hokaido universitetas, Saporas, Japonija, 2010 m. birželio 28–30 d. Narys ir pakviestas pranešėjas „Insights into Alphavirus Assembly and Budding“
  • Nacionalinis alergijos ir infekcinių ligų institutas Regioniniai kompetencijos centrai „Biodefense“ seminare apie dengės viruso infekciją ir imunitetą, Beaverton, Oregonas, 2010 m. Rugpjūčio 24–25 d.
  • JAV Japonijos medicinos mokslo kooperatyvo programa „Emerging and Re-Emerging Vector Borne and Zoonotic Viral Infectious Diseases in Pietryčių Azijoje seminaras, 2010 m. rugsėjo 9-10 d., Hanojus, Vietnamas. Pakviestas pranešėjas „Dengės karštligės viruso dinamika: poveikis antivirusiniam ir vakcinos vystymuisi“
  • „Cold Spring Harbor Asia“ konferencijos susitikimas apie naujas infekcines ligas, Sudžou, Kinija, 2010 m. Spalio 18–22 d. Pakviestas pranešėjas „Membranų vaidmuo Dengės viruso infekcijose“
  • Kitos kartos dengės karštligės vakcinų ir diagnostikos seminaras, kurį remia Pasaulio sveikatos organizacijos vakcinų tyrimų iniciatyva (PSO/IVR), Atlanta, GA, 2010 m. Lapkričio 1–2 d. 10 minučių diskusijai “
  • Antrasis visos Amerikos dengės karštligės tyrimų tinklo susitikimas, Kankunas, Meksika, 2010 m. Lapkričio 16–19 d. Pakviestas pranešėjas „Biocheminis ir biofizinis dengės karštligės apibūdinimas“
  • „Dengės karštligės virusas: besivystantis XXI a. Skalė“ pranešėjas dalyvavo pirmojoje metinėje Richardo McCullough paskaitoje „Saddleback College“ mokslo paskaitų cikle, 2011 m. Vasario 11 d., „Saddleback College“, „Mission Viejo“, Kalifornija.
  • „Membranų vaidmuo užsikrėtus dengės karštligės virusu“ pakviestas pranešėjas į Dengės karštligės tyrimų konferenciją „Pakartotinis iššūkis: naujos galimybės bendradarbiauti su dengės karštligės tyrimu“, remiama NIAID, 2011 m. vasario 15–18 d., San Chuanas, Puerto Rikas
  • „Lyginamieji flaviviruso ir alfa viruso surinkimo tyrimai“ pakviestas pranešėjas Džordžijos valstijos universiteto išskirtinių paskaitų cikle, 2011 m. Vasario 24 d., Atlanta, Džordžija.
  • Pakviestas 2-ojo metinio SAB „Sentinext Therapeutics“ susitikimo dalyvis, 2011 m. Gegužės 20–26 d., Penangas, Malaizija
  • „Dengės karštligės virusas: svarbaus žmogaus patogeno išskyrimas“ pakviestas pranešėjas „Viruses Forever“ Wimmer Fest simpoziume profesoriaus Eckardo Wimmerio 75-ojo gimtadienio proga, 2011 m. gegužės 27 d., Wang centras, Stony Brook universitetas, Stony Brook, NY.
  • Pakviestas PDVI (vaikų dengės karštligės iniciatyvos) 8-ojo dengės karštligės tyrimo susitikimo dalyvis, 2011 m. Birželio 9–12 d., Dulles Virginia
  • „Antikūnų sukeltas flavivirusų neutralizavimas suteikia įžvalgų apie virionų biologiją“, pakviestas pranešėjas 45-ojoje JAV ir Japonijos medicinos mokslo programos jungtinėje darbo konferencijoje imunologijos ir virusinių ligų klausimais, remiamoje NIAID, 2011 m. birželio 20–22 d. Stanforde, Kalifornijoje.
  • „Dengės karštligės viruso replikacija ir surinkimas“ pakviestas pranešėjas, Kalifornijos universitetas-Davis, 2011 m. birželio 28 d.
  • „Interrogation of Flavivirus Replication and Assembly“ pakviestas pranešėjas, Rocky Mountain Laboratories, NIAID/NIH, 2011 m. liepos 13 d., Hamiltonas, MT.
  • Sesijos apie flavivusus pirmininkas ir kviestinis pranešėjas XV-ajame tarptautiniame virusologijos kongrese (ICV), 2011 m. rugsėjo 11–16 d., Saporas, Japonija.
  • Pagrindinis pranešėjas, kasmetinis COBRE susitikimas dėl vėžio tyrimų plėtros ir kamieninių ląstelių biologijos, 2011 m. spalio 14 d., Providence, RI.
  • „Dengės karštligės viruso infekcija sukelia ląstelių membranų struktūros pokyčius“, pakviesta pagrindinio pranešėjo, Nacionalinio proteomikos kongreso nacionalinio susitikimo, lapkričio 8–11 d., Puebla, Meksika.
  • „Žmonių ir uodų šeimininkų indėlis į dengės karštligės viruso infekciją ir patogenezę“ pranešėjas ir dalyvis, Tsinghua-Purdue bendradarbiavimo seminaras apie infekcinių ligų struktūrinę biologiją, 2011 m. Gruodžio 3-4 d., Pekinas, Kinija.
  • „Dengės karštligės viruso replikacija ir jų įtaka ląstelės šeimininkei“ ​​pakviestas pranešėjas, Paryžiaus Pasteuro institutas, 2012 m. Sausio 16 d., Paryžius, Prancūzija.
  • „Dengės karštligės viruso surinkimas ir replikacija“ pakviestas pranešėjas, Heidelbergo universitetas, 2012 m. sausio 17 d., Heidelbergas, Vokietija.
  • „Dengės karštligės viruso surinkimas ir dauginimas, pakviestas pranešėjas, Viskonsino medicinos koledžas, Mikrobiologijos ir molekulinės genetikos departamentas, 2012 m. Vasario 21 d., Milvokis, WI.
  • „Dengės karštligės viruso dauginimasis, virionų surinkimas ir struktūra“ pakviestas pagrindinis pranešėjas, Rio Grande Amerikos mikrobiologijos draugijos (ASM) regioninis susitikimas, 2012 m. Vasario 24–25 d., Las Cruces, NM.
  • „Dengės karštligės viruso dauginimasis, virionų surinkimas ir struktūra“ pakviestas pranešėjas, Kolorado universiteto Anschutz medicinos miestelis, Mikrobiologijos departamentas, Denveris, CO., 2012 m. Gegužės 4 d.

Richardas Kuhnas per pastaruosius trejus metus skaitė pranešimus šiose institucijose: Šiaurės vakarų universitetas, Džordžtauno universiteto medicinos centras, Pensilvanijos universitetas, Montanos valstijos universitetas, Teksaso universiteto medicinos skyrius, Masačusetso technologijos institutas, Ilinojaus universitetas, Urbana-Champaign , John Hopkins universiteto medicinos mokykla, Viskonsino-Madisono universitetas, Chiang Mai universitetas ir Mahidol universitetas (Tailandas), Stokholmas (Švedija), Jeilio universiteto medicinos mokykla


Rezultatai

Pasaulinio gripo A (H9N2) virusų skilimo vietų bioinformatinė analizė

Siekiant geriau suprasti pasaulinio gripo A (H9N2) virusų skilimo vietų evoliuciją, paplitimą ir molekulines ypatybes, hemagliutinino (HA) sekos buvo tiriamos iš genetinės perspektyvos, atliekant kelių sekų derinimą ir filogenetinę analizę. Dėl P2, P4 ir P5 padėčių lankstumo HACS, skilimo vietos skirtinguose kladuose buvo kintamos, kaip pavaizduota WebLogo (1a, d, e pav.). HA1/HA2 jungties skilimo vietų aminorūgščių sekos turėjo 5 pagrindinius skilimo motyvus, įskaitant PARSSR/G-motyvą, PSRSSR/G-motyvą, PAKSSR/G-motyvą, PAKSKR/G-motyvą ir PAASDR/G-motyvą. motyvas (2 pav.). Mes nustatėme, kad po 2006 m. Kinijoje smarkiai išaugo PSRSSR/G motyvų skaičius (1b, d ir 2 pav.). Netrukus PSRSSR/G-motyvas pakeitė PARSSR/G-motyvą kaip dominuojantį Y280 tipo H9N2 virusų skilimo motyvą viščiukams ir žmonėms. PARSSR/G ir PAKSSR/G motyvai buvo plačiai paplitę kai kuriose šalyse, daugiausia Kinijoje, Irane, Pakistane, Bangladeše, Kuveite ir Saudo Arabijoje iki 2010 m. (2 pav.). Pažymėtina, kad nuo 2010 m. Bangladeše atsirado į G1 panašaus viruso trišakis PAKSKR/G-motyvas, o PAKSKR/G-motyvo virusai 2011–2019 m. Pasitaikė beveik visuose H9N2 virusuose (1c pav., E). Pažymėtina, kad H9N2 virusų PAASDR/G motyvas cirkuliavo daugumoje Europos ir Šiaurės Amerikos šalių. Į Y439 panašių virusų HACS buvo polimeriškesnis migruojantiems paukščiams, daugiausia įskaitant PATSGR/G, PAASDR/G ir PAASYR/G motyvus.

a H9N2 gripo viruso HA geno didžiausios tikimybės (ML) filogenija. Visų turimų H9N2 virusų HA genų sekos buvo atsisiųstos iš GISAID „EpiFlu“ duomenų bazės filogenetinei analizei. ML medis buvo nustatytas naudojant RAxML programinę įrangą pagal GTRGAMMA modelį su 1000 įkrovų. Nuorodos H9N2 virusai iš kiekvieno HACS motyvo žymimi skirtingomis spalvomis. Skirtingų gripo A (H9N2) virusų HACS motyvų pasiskirstymas iš GISAID EpiFlu ir GenBank duomenų bazės.Šakos ilgis nustatomas pagal keitimų skaičių vienoje vietoje (subs/svetainė). b reiškia HACS amino rūgščių pasiskirstymą, išskyrus Kiniją, ir c reiškia HACS amino rūgštis Kinijoje. Skirtingų spalvų juostos žymi kelis A(H9N2) gripo virusų HACS motyvus. Visų turimų A(H9N2) gripo virusų HACS aminorūgščių dažnis. Kiekvienos HACS pozicijos dažniai nuo P6 iki P4’ iliustruojami naudojant WebLogo 3.4 (http://weblogo.threeplusone.com/). d atstovauja Kinijai, ir e atstovauja visoms šalims, išskyrus Kiniją.

Žmonių užsikrėtimo H9N2 virusais vietas nurodo mėlyna animacinė figūra. Skritulinėse diagramose dydis rodo H9N2 izoliatų skaičių, o spalvos – skirtingus HA skilimo vietų (HACS) motyvus. Taškinės skritulinės diagramos dydis neatspindi H9N2 izoliatų skaičiaus Kinijoje dėl didelio padermių kiekio. Duomenys pateikiami iš GISAID „EpiFlu“ duomenų bazės, „GenBank“ duomenų bazės, Pasaulio sveikatos organizacijos, Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacijos ir Kinijos Liaudies Respublikos nacionalinės sveikatos ir šeimos planavimo komisijos. Žemėlapis buvo sukurtas naudojant ArcGIS Desktop 10.4 programinę įrangą (http://www.esri.com/software/arcgis/arcgis-for-desktop/).

P2 ir P4 padėtis H9N2 virusų skilimo vietose turi įtakos viruso replikacijai ir skilimo efektyvumui

Atvirkštinė H9N2 viruso genetinė sistema A/chicken/Guangdong/V/2008 (rV08-PARSSR) su HA-PARSSR/G skilimo motyvu buvo sukurta anksčiau 28 . Skirtingi H9N2 virusai su vienbazėmis, dvibazėmis ir trišakėmis skilimo vietomis buvo sukurti atliekant į vietą nukreiptą mutagenezę (1 papildomi duomenys), įskaitant PSRSSR/G, PAKSSR/G, PAKSKR/G ir PAASDR/G skilimo motyvus. Norėdami palyginti H9N2 virusų replikacinius gebėjimus, pasėjome Madin-Darby šunų inkstų (MDCK) ir vištienos embriono fibraoblastų (CEF) ląsteles, kurių infekcijos dažnis (MOI) yra atitinkamai 0, 001 ir 0, 001. Tada mes nustatėme supernatantų virusų titrus praėjus 12, 24, 36 ir 48 valandoms po užsikrėtimo (hpi) po užsikrėtimo. MDCK ląstelėse rV08-PSRSSR ir rV08-PAKSKR augimo greitis buvo didesnis nei tėvų viruso (3a pav. 2 papildomi duomenys). Priešingai, rV08-PAASDR replikacija pastebimai sumažėjo, lyginant su tėvų virusu, kiekvienu laiko momentu (3a pav. 2 papildomi duomenys). CEF ląstelėse rV08-PAKSSR, rV08-PSRSSR ir rV08-PAKSKR replikacinis gebėjimas nebuvo reikšmingas, palyginti su tėvų virusu. Tačiau rV08-PAASDR išaugo iki mažesnio titro kiekvienu laiko momentu (3b pav. Papildomi duomenys 3). Norint nustatyti H9N2 virusų įtaką HA pirmtako HA0 skilimo aktyvavimui, buvo atlikta Western blot analizė su virusu užkrėstomis A549 ir ​​CEF ląstelių kultūromis, inokuliuotomis H9N2 virusais, esant 0,01 MOI, esant 1 μg /ml tosilsulfonilfenilalanilo chlorometilketono (TPCK) apdoroto tripsino 24 val. Mūsų rezultatai parodė, kad CEF užaugintų ir A549 užaugintų rV08-PARSSR, rV08-PAKSSR, rV08-PSRSSR ir rV08-PAKSKR skilimo efektyvumas buvo panašus, o CEF užaugintų ir A549 užaugintų rV08-PAASDR HA0 pirmtakų. negali būti veiksmingai skaldomas, nors turi papildomą TPCK apdorotą tripsiną (3d pav., e papildomi 1–2 pav.). Be to, mes nustatėme H9N2 virusų skilimo efektyvumą esant skirtingoms TPCK apdoroto tripsino koncentracijoms CEF ląstelėse (papildomi 1–2 pav.) ir nustatėme, kad rV08-PSRSSR ir rV08-PAKSKR skilimo efektyvumas nebuvo reikšmingas nei padarė tėvų virusą. Šie rezultatai parodė, kad HACS P2 ir P4 pozicijos buvo labai svarbios viruso replikacijai ir skilimo efektyvumui.

Augimo kreivės po kiekvieno viruso inokuliacijos, esant daugybei infekcijos (MOI) 0,001 į (a) MDCK ląstelės ir esant 0,001 MOI į (b) CEF ląstelės. Kiekvienas kreivės taškas yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± standartinis nuokrypis. Nepriklausomi mėginiai t testas buvo naudojamas analizei. c A gripo (H9N2) virusų terminis stabilumas. Gripo A (H9N2) virusai buvo inkubuojami 1, 2, 3, 4 ir 5 valandas 50 ° C temperatūroje. Termiškai apdorotų rekombinacijos virusų titrai buvo nustatyti TCID50 tyrimas MDCK ląstelėse. CEF Western blot (d) ir A549 (e) ląstelių kultūros, užkrėstos penkiais A(H9N2) gripo virusais, kurių MOI yra 0,01, esant 1 μg/ml tripsino 24 val. f Sincitų susidarymas, kurį sukelia penki gripo A (H9N2) virusai Vero ląstelėse. Vero ląstelių kultūros buvo inokuliuotos H9N2 virusais, esant 1 MOI 16 valandų, po to inkubuojamos su 10 val. μg/ml TPCK-tripsino 15 min., kad suskaldytų išreikštas HA0. Norėdami sukelti sincitijos susidarymą, Vero ląstelės buvo inkubuojamos 5 minutes su suliejimo buferiais, kurių pH vertė svyravo nuo 5,0 iki 5,8, su 0,2 vieneto žingsniais ir buvo vizualizuota po 3 valandų. Rodomi reprezentatyvūs vaizdai, kurių pH yra nuo 5,0 iki 5,8, gauti iš trijų pakartojimų. Penkios dešimties 5 savaičių amžiaus SPF viščiukų grupės buvo užsikrėtusios į nosį 106 EID50/200 μl kiekvieno viruso. g Virusiniai titrai trijų įskiepytų viščiukų plaučiuose. h Viruso titrai trijų inokuliuotų viščiukų dvylikapirštėje žarnoje. i Virusiniai titrai trijų inokuliuotų viščiukų inkstuose. j Virusiniai titrai trijų įskiepytų viščiukų smegenyse. k Inokuliuotų ir paveiktų viščiukų antikūnų titrai esant 14 dpi. HI titras ≥1: 16 buvo laikomas serokonversija. Penkioms trijų BALB/c pelių patelių grupėms į nosį buvo pasėta 106 EID.50/50 μl H9N2 virusų. Trys pelės iš kiekvienos grupės buvo nužudytos esant 4 dpi. Virusų titrai pelių plaučiuose (l) buvo rodomi. Punktyrinės linijos reiškia aptikimo ribą. Nepriklausomi mėginiai t testas buvo naudojamas analizei.

P2 ir P4 padėtis H9N2 virusų skilimo vietose turi įtakos pH stabilumui ir termostabilumui

Čia mes ištyrėme HA skilimo mutacijų įtaką šiluminiam stabilumui. Priešingai nei kiti H9N2 virusai, rV08-PAKSKR virusas parodė žymiai padidintą infekcinį titrą po inkubacijos 5 hpi, palyginti su tėvų H9N2 virusais (3c pav. 4 papildomi duomenys). Priešingai, rV08-PAASDR virusas buvo pastebėtas kiekvienu laiko momentu mažiau stabilus nei tėvų virusas (3c pav. 4 papildomi duomenys). RV08-PAKSSR ir rV08-PSRSSR virusų, palyginti su tėvų virusu, reikšmingo skirtumo nepastebėta (3c pav. Papildomi duomenys 4). Šie rezultatai parodė, kad tribazinis H9N2 virusas buvo stabilesnis, tačiau vienbazis H9N2 virusas buvo mažiau stabilus nei kiti skilimo motyvo virusai. Norint įvertinti penkių H9N2 virusų rūgštinį stabilumą, buvo atliktas sincito susidarymo tyrimas, siekiant išmatuoti pH slenkstį, reikalingą HA tarpininkaujamam ląstelių suliejimui. Vero ląstelės buvo inokuliuotos penkiais H9N2 virusais ir veikiamos tripsinu, kad vėliau suskaldytų ir aktyvuotų HA, ląstelių kultūra buvo parūgštinta pH gradientu pH 5,0, 5,2, 5,4, 5,6 ir 5,8. Norint nustatyti pH slenkstį, sukeliantį konformacinius pokyčius ir vėlesnę membranos suliejimą, buvo naudojamas vizualus ląstelių kultūrų patikrinimas, ar nėra sincitijos. PH reikšmės, kuriomis esant ląstelių ir ląstelių suliejimą sukėlė PARSSR/G, PAKSSR/G, PSRSSR/G ir PAASDR/G-motyvo virusai, buvo atitinkamai 5,6, 5,6, 5,4 ir 5,4 (3f pav.). Tačiau pH vertė, kai PAKSKR/G-motyvo virusas susiliejo tarp ląstelių, buvo 5,2 (3f pav.), O tai rodo, kad P2 ir P4 padėtis skilimo vietoje turi įtakos ląstelių suliejimui. H9N2 virusai.

P2 ir P4 padėtys skilimo vietoje turi įtakos H9N2 viruso virulentiškumui ir pernešamumui viščiukuose

Norint nustatyti, kurios skilimo vietos mutacijos panaikino viščiukų virulentiškumą ir užkrečiamumą, dešimt 5 savaičių amžiaus „White Leghorn“ specifinių patogenų neturinčių (SPF) viščiukų buvo intranazaliai inokuliuoti 10 50% kiaušinių infekcijos doze (EID).50)/200 μl H9N2 virusų. Po 24 valandų dešimt neužkrėstų viščiukų buvo laikomi su skiepytomis grupėmis. Visi H9N2 virusai gali būti aptikti inokuliuotų viščiukų plaučių mėginiuose, išskyrus rV08-PAASDR grupę (3g pav. Papildomi duomenys 5). Pažymėtina, kad įskiepyti ir paveikti rV08-PAKSKR grupės viščiukai parodė padidėjusį viruso išsiskyrimą iš dvylikapirštės žarnos mėginių (3 pav. Papildomi duomenys 5). RV08-PAKSKR viruso titrus galima aptikti inokuliuotų ir paveiktų viščiukų dvylikapirštės žarnos mėginiuose, vidutiniškai

10 1,5 rąstų10EID50/200 μl, atitinkamai (5 papildomi duomenys). Kiekvienos grupės inokuliuotų viščiukų inkstų ir smegenų mėginiuose viruso neaptikta (3i pav., J papildomi duomenys 5).

Be to, virusų išsiskyrimas taip pat buvo aptiktas trachėjos ir kloakos tepinėlių mėginiuose 3, 5, 7, 9 ir 11 dienų po inokuliacijos (dpi). Inokuliuoti viščiukai rV08-PARSSR, rV08-PAKSSR, rV08-PSRSSR ir rV08-PAASDR grupėse išskyrė virusus esant 3 ir 5 dpi, tačiau viruso išsiskyrimas rV08-PAKSKR grupėje truko 7 dpi (6 papildomi duomenys). Visų inokuliuotų viščiukų trachėjoje esantis virusas stipriai išsiskyrė esant 3 dpi ir 5 dpi, tuo tarpu kloakinio viruso išsiskyrimas parodė skirtingus kiekvienos grupės laiko taškus. RV08-PAASDR viruso išsiskyrimas iš trachėjos truko tik 3 dienas, tačiau kitos grupės išskyrė panašų infekcinio viruso kiekį iš trachėjos iki 7 dpi (6 papildomi duomenys). Pažymėtina, kad rV08-PAKSKR virusas parodė kloakos viruso išsiskyrimą visose inokuliuotose viščiukuose esant 3 dpi ir 5 dpi, tačiau kitus H9N2 virusus kloakiniu būdu išmeta mažiau nei pusė įskiepytų viščiukų kiekvienu laiko momentu (papildomi duomenys 6). Perdavimo tyrimas parodė, kad atviros rV08-PAASDR grupės vištos nesugebėjo išmesti virusų ir neparodė serokonversijos (3k pav. Papildomi duomenys 7). Pažymėtina, kad tėvų ir kiti rekombinantiniai virusai galėjo perduoti paveiktiems viščiukams. Virusų išskyrimas iš veikiamų viščiukų rV08-PARSSR, rV08-PAKSSR ir rV08-PSRSSR grupėse daugiausia pasiekė nuo 5 iki 7 dpi ir sumažėjo po 9 dpi. Tačiau rV08-PSRSSR grupėje 4/7 paveiktų viščiukų trachėjos virusas išsiskyrė esant 9 dpi, o tėvų virusas nebuvo pašalintas (6 papildomi duomenys). Iš rV08-PAKSKR viruso paaiškėjo, kad paveiktos vištos virusą išskiria aukščiausiu lygiu ir ilgiausiai. Šios grupės viščiukai 5, 7 ir 9 dpi skleidžia virusą kloakos ir trachėjos keliais, o rV08-PAKSKR virusu užkrėstos grupės viščiukų skaičius buvo didesnis nei rV08-PAASDR H9N2 virusų 7 ir 9 dpi (6 papildomi duomenys). Visi rezultatai parodė, kad H9N2 virusas, turintis monobazinį PAASDR/G skilimo motyvą, nesukėlė produktyvios infekcijos ir perdavimo viščiukams, tačiau tribazinis H9N2 virusas sukėlė didesnį infekcijos sunkumą ir pernešamumą, ilgesnį plitimą ir virškinimo viruso plitimą. viščiukuose.

Tribazinis H9N2 virusas padidino patogeniškumą pelėms

Norint ištirti H9N2 virusų, turinčių skirtingas skilimo vietas žinduoliams, poveikį, 10 6 EID50/50 μl kiekvieno viruso buvo intranazaliai įskiepytas į 4 savaičių amžiaus BALB/c pelių patelę. Visi penki H9N2 virusai galėjo efektyviai daugintis inokuliuotų pelių plaučiuose 4 dpi. RV08-PAKSSR virusų titrai nebuvo reikšmingi, palyginti su tėvų rV08-PARSSR viruso titrais. Tačiau rV08-PAKSKR (0,001 < p & lt 0,01) plaučiuose buvo žymiai didesnis nei tėvų rV08-PARSSR virusas esant 4 dpi, o rV08-PAASDR viruso titras plaučiuose buvo mažesnis nei rV08-PARSSR viruso (0,0001 & lt p < 0,001) (3l pav. 5 papildomi duomenys). Smegenyse, užkrėstose rV08-PARSSR, rV08-PAKSSR ir rV08-PAASDR virusais, H9N2 virusų neaptikta. Tačiau H9N2 virusai buvo aptikti vienos pelės smegenyse, užkrėstose rV08-PSRSSR ir rV08-PAKSKR virusais (5 papildomi duomenys).

Padidėjusi kamieninės kilpos RNR antrinė skilimo vietų H9N2 viruse struktūra pagreitino nukleotidų įterpimą į HACS.

Norėdami įvertinti nukleotidų įterpimų dažnį skirtinguose H9N2 virusų HACS regionuose, mes išsamiai palyginome skirtingų skilimo vietų regionų kamieninių kilpų struktūras H5, H7 ir H9 potipiuose. Palyginti su mažai patogeniškais H5 ir H7 potipių pirmtakais, daugumos H9 potipio virusų HACS gerai išdėstyta kilpos struktūra pasireiškė rečiau, o skirtingų H9N2 virusų skilimo vietų regionų kamieno kilpos struktūros vietos ir dydžiai nebuvo reikšmingi pakanka (papildomi 3–5 pav.). Daugumos H9N2 virusų HACS paprastai turi vieną mažą kamieninės kilpos struktūrą, susidedančią iš šešių nukleotidų, kurie apima vienas po kito einančius adeninus arba guaninus (5'-AGGGGA-3'). Tačiau stiebo kilpos struktūros vietos pasikeitė, kai buvo keičiamos skilimo vietos, todėl susidarė dvi ar trys mažos nepertraukiamos stiebo kilpos struktūros (4c pav. Papildomi 6–8 pav.). Įdomu tai, kad vienos trikampio skilimo vietos kamieninių kilpų struktūra, Bangladeše cirkuliuojantis PAKSKR/G motyvas, buvo didesnė už H9N2 virusų HACS (4c pav. Papildomi 6–8 pav.). Šią didelę HACS kamieninės kilpos struktūrą sudarė dešimt nukleotidų ir ji visiškai apėmė nuoseklaus adenino arba guanino (5'-AAAAAGAGGA-3') kodonus.

DF-1 ląstelės buvo transfekuotos plazmide. Parodytos numatomos kiekvieno HA skilimo vietos motyvo RNR antrinės struktūros ir kiekvieną kodoną atitinkančios aminorūgštys. Nukleotidai, kurie skiriasi nuo PARSSR/G motyvo, rodomi raudonai. a Liuciferazės aktyvumas buvo išreikštas, palyginti su „Link30-PARSSR“ plazmida, ir buvo lyginamas tarp reporterių plazmidžių, kuriose yra skirtingų jungčių, įskaitant „Link28-PARSSR“, „Link29-PARSSR“, „Link29-PSRSSR“, „Link29-PAKSSR“, „Link29-PAKSKR“, „Link29-PAASDR“, „Link29-PAKKKR“ , Link29-PAKSKR-NL ir Link29-PAKKKR-NL. Kiekvienas kreivės taškas yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± standartinis nuokrypis. Nepriklausomi mėginiai t analizei buvo naudojamas testas. b Linkeriai 29 ir 30 polinukleotidų buvo įterpti tarp starto kodono ir ugniagesių luciferazės geno, neturinčio pradžios kodono. c HACS sekų greito nuspėjimo RNR struktūros. Numatoma RV08-PARSSR (i), rV08-PAKSSR (ii), rV08-PSRSSR (iii), rV08-PAASDR (iv), rV08-PAKSKR (v), rV08-PAKSKR-NL (vi) antrinė RNR struktūra, Rodomi rV08-PAKKKR (vii) ir rV08-PAKKKR-NL (viii). Nukleotidai, kurie skiriasi nuo pirminio rV08-PARSSR, rodomi raudonai.

Siekiant įvertinti koreliaciją tarp nukleotidų įterpimo dažnio ir skirtingų HACS kamieninių kilpų struktūrų, buvo sukurtas reporterio tyrimas 24, skirtas nukleotidų įterpimams RNR sekose, koduojančiose aminorūgštis HACS (turinčių 29 nukleotidus), aptikti. rV08-PARSSR virusas (papildomas 9 pav.). Mūsų reporterių plazmidėse ugniažolės luciferazės genas, neturintis pradinio kodono, buvo įterptas pasroviui nuo pradžios kodono, o ugniažolės luciferazė buvo išreikšta, kai nukleotidai buvo įterpti į skilimo vietos sritis, kad seka būtų rėmelyje su atviru skaitymo rėmu (ORF) (4b pav.). Norint išbandyti šią sistemą, vištienos fibroblastų (DF-1) ląstelės buvo transfekuotos Link29-PARSSR ir Link30-PARSSR plazmidėmis ir išmatuotas luciferazės aktyvumas. Mes pastebėjome, kad aukštas luciferazės aktyvumas transfekuojant su Link30-PARSSR, palyginti su Link29-PARSSR (4a pav. Papildomi duomenys 8). Tada mes sukūrėme reporterio plazmides su skirtingais skilimo vietos motyvais (ty PARSSR/G, PSRSSR/G, PAKSSR/G, PAKSKR/G ir PAASDR/G) ir palyginome luciferazės aktyvumą. Mūsų rezultatai parodė, kad Link29-PAKSKR žymiai padidino luciferazės ekspresiją, palyginti su Link29-PARSSR plazmide, o luciferazės aktyvumas nepadidėjo, kai buvo transfekuotas kitomis reporterio plazmidėmis (4a pav., 8 papildomi duomenys). Tada mes sukūrėme „Link29-PAKKKR“ plazmidę, kuri dar labiau padidino HACS kamieno kilpos struktūrą. Mes nustatėme, kad žymiai padidėjo luciferazės aktyvumas „Link29-PAKKKR“. Šie radiniai parodė, kad išsiplėtusios stiebo kilpos struktūros pagreitino nukleotidų įterpimą į skilimo vietą. Norėdami dar labiau patvirtinti savo hipotezę, sukonstravome kitas modifikuotas Link29-PAKSKR-NL ir Link29-PAKKKR-NL plazmides, kurios buvo dirbtinai sukurtos taip, kad turėtų adeninus iš eilės ir sumažintų kilpų struktūras (4c pav.). Kaip ir tikėtasi, palyginti su padidėjusia Link29-PAKKKR kilpos struktūra, DF-1 ląstelėse buvo pastebėta žymiai mažesnė luciferazės ekspresija, kai ji buvo transfekuota su Link29-PAKKKR-NL, tačiau luciferazės ekspresijos skirtumas tarp Link29-PAKSKR ir Link29-PAKSKR -NL nebuvo reikšmingas (4a pav. Papildomi duomenys 8). Šie rezultatai parodė, kad padidėjęs kamieno kilpos dydis buvo susijęs su luciferazės ekspresijos efektyvumu.

Norėdami patikrinti nukleotidų įterpimų buvimą skirtinguose H9N2 virusų HACS, mes išanalizavome skirtingų HACS jungiamąją RNR DF-1 ląstelėse, kai jos buvo transfekuotos skirtingomis plazmidėmis, įskaitant Link29-PARSSR, Link29-PAKSSR, Link29-PSRSSR, Link29- PAKSKR, Link29-PAKKKR ir Link29-PAASDR plazmidės. Naudojant Sangerio sekos nustatymą, vieno nukleotido ir dvigubo nukleotido intarpai arba dvigubo nukleotido delecija įvyko sintetinant mRNR arba vRNR išsiplėtusios kamieninės kilpos RNR antrinėje HACS struktūroje H9N2 virusuose, o jungiklio RNR įterpimų nepastebėta. kitų H9N2 virusų HACS motyvų, kai jie buvo transfekuoti kitomis plazmidėmis (papildomas 10 pav.), Tai rodo, kad padidėjusi kamieno kilpos struktūra pagreitino nukleotidų įterpimo dažnį.

Padidėjusi RNR antrinė HACS stiebo kilpos struktūra neturi įtakos viruso replikacijai H9N2 viruse

Norėdami įvertinti koreliaciją tarp viruso replikacijos ir padidėjusių HACS kamieninių kilpų struktūrų, mes sukūrėme sinoniminę HACS mutaciją H9N2 viruse, žymėdami rV08-PAKSKR-S, kuri galėtų sumažinti HACS kamieninių kilpų struktūras (1 pav.). 5a). Palyginti su rV08-PAKSKR, rV08-PAKSKR-S replikacinis gebėjimas nebuvo reikšmingas. Vėliau mes atkūrėme HACS kamieno kilpos struktūros dydį ir nustatėme, kad H9N2 virusų replikacinis gebėjimas nepadidėjo (5b pav. Papildomi duomenys 9), o tai rodo, kad viruso replikacija nebuvo atsakinga už padidėjusią RNR antrinę kamieno kilpą struktūra H9N2 virusuose. Tada išanalizavome trijų dimensijų (3D) skirtingų H9N2 virusų HACS struktūrinį pagrindą. HACS struktūra parodė, kad esant atvirai konformacijai, skilimo vietos kilpa su K 319 liekanoje buvo labiau veikiama glikoproteinų paviršiaus, todėl galimos proteazės galėjo lengviau pasiekti skilimo vietą. Tačiau, kai P2 ir P4 liekanos buvo nepagrindinės aminorūgštys, likučiai potencialiai užblokavo paviršių ir nebuvo veikiami vienodai, todėl buvo prasta galimybė gauti proteazę (5c pav.). Šios išvados parodė, kad viruso replikacija nebuvo atsakinga už padidėjusią tribalinio H9N2 viruso RNR antrinės kamieno kilpos struktūrą, tačiau galbūt dėl ​​HA baltymo 3D aminorūgščių struktūros.

a Parodytos prognozuojamos tribazių HA skilimo vietų ir aminorūgščių, atitinkančių kiekvieną kodoną, RNR antrinės struktūros. „Quickfold“ programa (http://unafold.rna.albany.edu/?qDINAMelt/Quickfold) ir „RNAfold“ programa iš „ViennaRNA Web Services“ (http://rna.tbi.univie.ac.at/) ir „ViennaRNA“ paketas buvo naudojamas prognozuoti HA genų skilimo vietos regionų RNR sekas. b Augimo kreivės po kiekvieno viruso inokuliacijos, kai į MDCK ląstelę buvo įtraukta 0,001 infekcija.Kiekvienas kreivės taškas yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± standartinis nuokrypis. c Trimatė (3D) struktūrinė aminorūgščių analizė HA skilimo vietoje. A gripo viruso HA trimerio struktūros šoninis vaizdas, pagrįstas neskaldytu H3 monomeru (baltymų duomenų banko ID 4BSE) kaip šablonas. Atitinkamos aminorūgštys, skirtos HA baltymo 3D struktūrai, turinčiai skirtingų skilimo motyvų, buvo susietos naudojant „MacPymol“ (http://www.pymol.org/).

Naudojant numatytas mutacijų schemas, siekiant atsekti HACS evoliuciją H9N2 virusuose

Bioinformatikos įrankis, aprašytas Lee DW29, AAScatterPlot, buvo naudojamas aminorūgščių liekanų įvairovei HA proteolitinio skilimo vietoje nuo P6 iki P1 parodyti. Išsklaidymo brėžiniai aiškiau nei „WebLogo“ parodė įvairovę ir retas liekanas kiekvienoje padėtyje. Taškų dydis ir spalva atitiko atsiradimo dažnumą ir unikalias likučių savybes (žalia = poliarinė neutrali, mėlyna = poliarinė teigiama, raudona = polinė neigiama, ruda = prolinas arba glicinas, žalsvai mėlyna = surišantis cisteinas ir pilka = nepolinis alifatinis). Atsitiktinė taško likučio mutacija kodone buvo nurodyta tuščiaviduriu apskritimu, uždengiančiu sklaidos brėžinius. Savo tyrime nustatėme, kad viruso evoliucijos metu P6 ir P1 padėtys buvo stabilios, palyginti su kitomis liekanomis. Tačiau P4 ir P3 buvo pastebėti pakaitalai su hidrofobinėmis liekanomis (6a pav.). Atrodė, kad P5 ir P2 mutavo apibrėžtame regione, o P2 pirmenybę teikė hidrofilinėms liekanoms nuo 2010 iki 2019 m. (Papildomas 11 pav.). Tada nurodėme „Vengiamąjį regioną“, kad parodytume biochemines savybes, o tai buvo nepalanki P2 mutacijai (6b pav.). AAScatterPlot taip pat buvo naudojamas prognozuoti ribotus HA proteolitinio skilimo vietos evoliucijos kelius. Pagal įrankį nustatėme, kad būtų du pagrindiniai būdai, kaip P2 padėtis mutuoti tarp liekanų G ir N, įskaitant S ⇄ G ⇆ D arba S ⇄ N ⇆ K (6b pav.), o tai patvirtino, kad perėjimas tarp likučių G ir N P2 D ir K greičiausiai apimtų atitinkamai P2 G ir N tarpinį produktą. Pažymėtina, kad pastaraisiais metais P2 N didėjo G1 ir Y280 linijos H9N2 virusuose (papildomas 11 pav.), O tai parodė, kad galimas P2 padėties kelias nuo N iki K. Šios išvados leido manyti, kad P2 liekana buvo patiriant atrankos spaudimą, ir H9N2 virusuose buvo pastebėta HACS tendencija vystytis iš dvibazio į tribazę.

a Išsklaidykite kiekvienos AA liekanos brėžinius 1550 HA sekų HACS. The X-ašys yra HPI (be vieneto) ir Y-ašis yra Y-ašis yra VdWV (Å 3). b P2 padėties likučių sklaidos diagramos. Galimi mutacijos keliai rodomi rodykle. Pažymėtas „vengtas regionas“, rodantis biochemines savybes, kurios atrodo nepalankios P2 padėties mutacijai.


Poliovirusas: reikšmė, morfologija ir jo replikacija

Poliovirusas priklauso enterovirusų pogrupiui, Picornaviridae šeimai. Pikornavirusai yra maži, eteriui nejautrūs virusai, turintys RNR genomą. Yra trys poliomielito viruso serotipai: 1, 2 ir 3 serotipas. 1 serotipas yra dažnas epideminis tipas, 2 serotipas dažniausiai siejamas su endeminėmis infekcijomis, o 3 serotipas kartais sukelia epidemijas.

Poliovirusas turi afinitetą nerviniam audiniui ir siaurą šeimininkų diapazoną. Jautrūs tik žmonės ir kai kurie primatai, tokie kaip kinomolginės ir rezus beždžionės.

Polioviruso morfologija:

Polioviruso virionas turi ikosaedrinę struktūrą, kurios viename virione yra 60 morfologinių vienetų, kurių kiekvienas susideda iš keturių skirtingų viruso baltymų (VP1-VP4). VP1 yra išorėje ir yra pagrindinė antigeninė vieta, skirta derinti su specifiniais serotipams neutralizuojančiais antikūnais.

Polioviruso genomas yra linijinė teigiamo jausmo, vienos grandinės RNR molekulė, susidedanti iš 7440 bazių ilgio. Virusinės RNR 5′ gale yra baltymas, vadinamas VPg baltymu, kuris kovalentiškai prijungtas prie RNR. 3 RNR gale yra C poli-A uodega.

Polioviruso replikacija:

Vienos grandinės teigiamo jutimo (+) RNR veikia kaip pasiuntinio RNR (mRNR). 5 ir#8242 RNR galas turi ilgą seką, kuri gali būti sulankstyta į kelias kamienines kilpas. VPg baltymas ir kamieninės kilpos imituoja dangtelį surišantį kompleksą, ir tai leidžia polioviruso mRNR prisijungti prie ląstelės šeimininkės ribosomos. Viruso RNR koduoja visus viruso baltymus į vieną didelę baltymų molekulę, vadinamą poliproteinu.

Šis baltymas suskaidomas į atskirus baltymus, įskaitant struktūrinius apvalkalo baltymus ir RNR replikazę, kuri sukelia polioviruso RNR replikaciją. Toliau seka nepažeisto polioviruso surinkimas iš apvalkalo baltymų molekulių ir RNR. Visas polioviruso replikacijos procesas, kurio apžvalga pavaizduota 14.11 pav., Vyksta ląstelių citoplazmoje.

Polioviruso auginimas:

Poliovirusas lengvai auga primatų kilmės audinių kultūrose. Pirminės beždžionių inkstų kultūros naudojamos diagnozei ir vakcinos gamybai. Užkrėstos ląstelės suapvalėja ir tampa įtraukiamos bei piknotiškos. Dažytuose preparatuose galima pastebėti eozinofilinių intrabranduolinių inkliuzų kūnų. Gerai susiformavusios plokštelės susidaro užkrėstuose vienarūšiuose sluoksniuose su agaro pertekliumi.


SARS-CoV-2 replikacijos ciklas 3-D

Užkrėstos ląstelės buvo vaizduojamos fokusuotu jonų pluošto nuskaitymo elektronų mikroskopu, galingu metodu, leidžiančiu atskleisti ląstelės organizavimą subcelluliniame lygmenyje 3-D. Šiame paveikslėlyje vienos ląstelės dalinis tūris buvo suskirstytas į segmentus, kad būtų rodomos su membrana surištos organelės (pilkos spalvos) ir dvigubos membranos pūslelės (raudonos spalvos) - specifinis viruso skyrius, kuriame viruso genomas dauginamas. Kreditas: Julian Hennies/EMBL

Tęsiantis pasaulinei koronaviruso pandemijai, mokslininkai ne tik bando rasti vakcinų ir vaistų, skirtų kovoti su ja, bet ir nuolatos sužinoti daugiau apie patį virusą. „Iki šiol galime tikėtis, kad koronavirusas taps sezoninis“, - aiškina Heidelbergo universiteto Užkrečiamųjų ligų katedros profesorius Ralfas Bartenschlageris. „Todėl būtina skubiai sukurti ir įgyvendinti tiek profilaktines, tiek terapines strategijas prieš šį virusą. Naujame tyrime Bartenschlageris, padedamas „Schwab“ komandos EMBL Heidelberge ir naudodamas EMBL elektronų mikroskopijos pagrindinį įrenginį, atliko išsamią vaizdo analizę, kad nustatytų, kaip virusas perprogramuoja užkrėstas ląsteles.

Ląstelės, užsikrėtusios SARS-CoV-2, miršta gana greitai, vos per 24–48 valandas. Tai rodo, kad virusas pažeidžia žmogaus ląsteles taip, kad ji yra perjungiama ir iš esmės priversta gaminti viruso palikuonis. Todėl pagrindinis projekto tikslas buvo nustatyti morfologinius pokyčius ląstelėje, būdingus šiam perprogramavimui. „Norint sukurti geresnius biologinius mechanizmus, skatinančius viruso replikacijos ciklą, labai svarbu sukurti vaistus, kurie slopina viruso dauginimąsi ir kartu infekcijos pasekmes, taip pat viruso sukeltą ląstelių mirtį“,-aiškina Bartenschlager. Komanda naudojo EMBL vaizdo gavimo įrenginius ir naujausius vaizdo gavimo metodus, kad nustatytų SARS-CoV-2 užkrėstų ląstelių 3-D architektūrą, taip pat viruso sukeltus ląstelių architektūros pokyčius.

Komanda sugebėjo sukurti 3-D visų ląstelių ir jų tarpląstelinių skyrių rekonstrukcijas. „Mes pateikiame kritinių įžvalgų apie viruso sukeltus struktūrinius pokyčius tirtose žmogaus ląstelėse“,-aiškina Ralfas Bartenschlageris. Vaizdai atskleidė akivaizdų ir didžiulį infekuotų ląstelių endomembraninių sistemų pasikeitimą - sistemą, leidžiančią ląstelėms apibrėžti skirtingus skyrius ir vietas. Virusas sukelia membranos pokyčius taip, kad gali gaminti savo replikacijos organelius. Tai yra mini replikacijos skyriai, kuriuose viruso genomas yra labai sustiprintas. Tam virusui reikalingi membraniniai paviršiai. Jie sukurti naudojant ląstelių membranų sistemą ir sukuriant labai skirtingą organelę. Mokslininkai tai apibūdina kaip didžiulį burbuliukų kaupimąsi: du membraniniai sluoksniai sudaro didelį balioną. Šiuose balionuose, kurie sudaro labai ekranuotą skyrių, viruso genomai padauginami ir išleidžiami, kad būtų įtraukti į naujas viruso daleles.

Užkrėstos ląstelės dalis stebima transmisijos elektronų mikroskopu, kurio metu SARS-CoV-2 būdingos struktūros (raudonai, iš veidrodinio vaizdo dešinėje) gali būti aptiktos jau praėjus šešioms valandoms po užsikrėtimo. Viruso genomas yra daug kopijuojamas dviem membranos sluoksniais, sudarydamas didelį balioną (didelės struktūros raudonai), kuris sudaro labai ekranuotą skyrių. Nauji virionai (mažos raudonos struktūros) susidaro pumpuruojant endoplazminio tinklelio ir Golgi aparato sąsajoje. Kreditas: Yannick Schwab / EMBL

Šis ryškus pokytis gali būti matomas ląstelėse tik praėjus kelioms valandoms po užsikrėtimo. „Mes matėme, kaip ir kur virusas dauginasi ląstelėje, ir kaip jis užgrobia savo šeimininko mašiną, kad būtų paleistas po dauginimo“, - sako Schwabas. Iki šiol mažai žinoma apie SARS-CoV-2 sukelto poveikio žmogaus organizme kilmę ir vystymąsi. Tai apima žinių trūkumą apie mechanizmą, kuriuo infekcija sukelia užkrėstų ląstelių mirtį. Šios informacijos turėjimas dabar paskatins terapijos, mažinančios viruso dauginimąsi, o kartu ir ligos sunkumą, kūrimą.

Komanda pasirūpino, kad surinkta informacija ir visų pirma precedento neturinčia 3-D struktūrinės informacijos saugykla apie viruso sukeltus posistemius galėtų naudotis visi. "Manau, kad sukuriame precedentą faktui, kad dalijamės visais duomenimis, kuriuos sukūrėme, su mokslo bendruomene. Tai yra įspūdingas bendruomenės išteklius", - sako Yannickas Schwabas. „Tokiu būdu galime paremti pasaulines pastangas tirti, kaip SARS-CoV-2 sąveikauja su savo šeimininku. Komanda tikisi, kad jų surinkta informacija padės kurti antivirusinius vaistus.

Komanda sugebėjo parengti tyrimą per neįtikėtinai trumpą laiką, nepaisant sudėtingų aplinkybių. "Pusė pasaulio - ir, žinoma, taip pat ir Heidelbergas - buvo visiškai uždaryti, ir mes turėjome beveik kasdien improvizuoti, kad prisitaikytume prie situacijos. Nesvarbu, ar EMBL, ar namuose, visi buvo labai įsitraukę ir dosniai atidavė savo laiką žinių“, – sako Schwabas. „Greitis, kuriuo mes dirbome, ir surinktų duomenų kiekis yra puikus.


7.11: Viruso replikacija - biologija

Visi MDPI paskelbti straipsniai yra nedelsiant prieinami visame pasaulyje pagal atviros prieigos licenciją. Norint pakartotinai naudoti visą ar dalį MDPI paskelbto straipsnio, įskaitant paveikslus ir lenteles, specialaus leidimo nereikia. Straipsniams, paskelbtiems pagal atviros prieigos „Creative Common CC BY“ licenciją, bet kuri straipsnio dalis gali būti pakartotinai naudojama be leidimo, jei aiškiai nurodytas originalus straipsnis.

Funkcijų dokumentai yra pažangiausi tyrimai, turintys didelį potencialą daryti didelį poveikį šioje srityje. Pagrindiniai straipsniai pateikiami gavus individualų mokslinių redaktorių kvietimą arba rekomendaciją ir prieš paskelbiant juos peržiūrimi.

Teminis dokumentas gali būti originalus mokslinis straipsnis, esminis naujas mokslinis tyrimas, kuriame dažnai naudojami keli metodai ar metodai, arba išsamus apžvalgos dokumentas su glaustais ir tiksliais atnaujinimais apie naujausią pažangą šioje srityje, kuriame sistemingai apžvelgiami įdomiausi mokslo pasiekimai literatūra. Šio tipo popieriuje pateikiama ateities tyrimų krypčių ar galimų pritaikymų perspektyva.

„Editor's Choice“ straipsniai pagrįsti mokslinių MDPI žurnalų redaktorių iš viso pasaulio rekomendacijomis. Redaktoriai pasirenka nedaug neseniai žurnale paskelbtų straipsnių, kurie, jų nuomone, bus ypač įdomūs autoriams arba svarbūs šioje srityje. Tikslas yra pateikti įdomiausių darbų, paskelbtų įvairiose žurnalo tyrimų srityse, momentinę nuotrauką.


Alfavirusų replikacija: Alfavirusų patekimo į ląsteles proceso apžvalga

1 Molekulinės RNR virusologijos ir antivirusinių strategijų laboratorija, Mikrobiologijos skyrius, Yong Loo Lin medicinos mokykla, Nacionalinė universiteto sveikatos sistema, 5 Science Drive 2, Nacionalinis Singapūro universitetas, Singapūras

Abstraktus

Alfavirusai yra maži, apvalkalu turintys virusai,

70 nm skersmens, turintis vienos grandinės, teigiamo jausmo, RNR genomą. Šiai genčiai priklausantys virusai daugiausia yra nariuotakojų platinami virusai, kurie, kaip žinoma, sukelia žmonių ligas. Jų potencialią grėsmę žmonių sveikatai neseniai įrodė 2005 m. Chikungunya viruso protrūkis La Reunione, pabrėždamas būtinybę suprasti šių mediciniškai svarbių žmonių patogenų gyvavimo ciklo įvykius. Virusų dauginimasis ir dauginimasis priklauso nuo patekimo į leistinas ląsteles. Virusinis patekimas pradedamas prijungus virionus prie ląstelių, dėl to atsiranda internalizacija ir padengiama danga, kad būtų išleista genetinė medžiaga replikacijai ir dauginimui. Tyrimai su alfa virusais atskleidė patekimą per receptorių sukeltą endocitinį kelią. Šiame darbe nagrinėjami skirtingi alfa viruso patekimo etapai, aprašyti Semliki Forest viruso, Sindbis viruso, Chikungunya viruso ir Venesuelos arklių encefalito viruso pavyzdžiai.

1. Alfavirusai

Alfavirusai pirmiausia yra šeimos nariuotakojų pernešami virusai (arbovirusai) Togaviridae. Šiai genčiai priklausantys virusai dažnai klasifikuojami kaip Naujojo pasaulio alfavirusai arba Senojo pasaulio alfavirusai, priklausomai nuo geografinės vietos, iš kurios jie buvo iš pradžių išskirti [1]. Naujojo pasaulio alfa virusai, įskaitant Rytų arklių encefalito virusą (EEEV), Venesuelos arklių encefalito virusą (VEEV) ir Vakarų arklių encefalito virusą (WEEV), paprastai sukelia encefalitą žmonėms ir kitiems žinduoliams, o Senojo pasaulio alfa virusai, tokie kaip Chikungunya virusas (CHIKV) , O'Nyong-Nyong virusas (ONNV), Ross River virusas (RRV), Semliki Forest virusas (SFV) ir Sindbis virusas (SINV) sukelia karščiavimą, bėrimą ir artralgijos sindromą, kuris retai sukelia mirtį [2]. Nors ankstyvieji alfavirusų tyrimai buvo sutelkti į prototipinius SFV ir SINV dėl jų gebėjimo augti iki aukštų titrų ląstelių kultūroje, nors jie nėra patogeniški žmonėms, pastaruoju metu dėmesys buvo nukreiptas į CHIKV tyrimą. 2005 m. CHIKV protrūkis La Reunione užkrėtė 40% 785 000 gyventojų, todėl 250 atvejų buvo mirtini [3]. Pasikartojęs CHIKV pakartoja galimą grėsmę, kurią alfa virusai kelia žmonių sveikatai, ir būtinybę suprasti alfa viruso biologijos mechanizmus.

2. Genominė sudėtis ir Viriono sandara

Alfavirusai yra maži, ikosaedro formos, apvalkalu, maždaug 70 nm skersmens virusai [4–6]. Alfaviruso virione yra ląstelės šeimininkės įgyta lipidų membrana [6–9]. Šioje membranoje yra 80 smaigalių, išdėstytų a

ikosaedras [6, 9]. Glikoproteinai E1 ir E2 asocijuojasi kaip heterodimeriniai subvienetai, kurie savo ruožtu surenkami į trimerius, kad susidarytų smaigalių iškyšos [9–11]. Tiek E1, tiek E2 yra transmembraniniai baltymai su C-galinėmis citoplazminėmis sritimis, kurios, kaip manoma, sąveikauja su nukleokapsidu [12, 13].

Alfaviruso genomas yra vienos grandinės teigiamas RNR genomas, maždaug 12 Kb ilgio [14, 15]. Be genomo ilgio RNR, taip pat sukuriama subgenominė RNR, koduojanti struktūrinius baltymus, abiejose rūšyse yra 5 ′ dangtelis ir poli (A) uodega [14–16]. Kodavimo seka susideda iš dviejų didelių atvirų skaitymo kadrų (ORF), N-galo ORF koduoja nestruktūrinį poliproteiną, o C-galo ORF koduoja struktūrinį poliproteiną (1 pav.). Du poliproteinai po transliacijos yra suskaidomi virusinių (cisteino) ir šeimininkų proteazių. Keturi nestruktūriniai baltymai (nsP1–4) ir jų skilimo tarpiniai produktai dalyvauja RNR replikacijoje, o penki struktūriniai baltymai (C, E3, E2, 6K, E1) ir jų skilimo tarpiniai produktai reikalingi viruso užsikimšimui ir pumpuravimui (1 pav.) [ 15, 17, 18].


Alfaviruso genomas. Alfaviruso genomas yra viengrandė, teigiamo jausmo RNR, koduojanti du atvirus skaitymo rėmus. Nestruktūriniai baltymai verčiami iš genomo RNR, o struktūriniai baltymai - iš subgenominės 26S RNR (promotorius, kaip nurodyta). Du poliproteinus skaldo virusinis cisteinas ir šeimininko proteazės, kad susidarytų atskiri baltymų produktai. *reiškia nesandarų stop kodoną.

Alfavirusas nsP1 turi ir guanino-7-metiltransferazės, ir guanililtransferazės aktyvumą, reikalingą naujai susintetintoms viruso genominėms ir subgenominėms RNR ribojimui ir metilinimui [19, 20]. Manoma, kad RNR replikacijos metu nsP1 pritvirtina replikacijos kompleksus prie ląstelių membranų [21]. Alfavirusas nsP2 turi RNR trifosfatazės / nukleozidų trifosfatazės, taip pat helikazės aktyvumą N-galinėje pusėje [22–24], o C-galinė pusė koduoja virusinę (papainą panašią) cisteino proteazę, reikalingą nestruktūrinio poliproteino apdorojimui. 17, 25]. CHIKV ir VEEV nsP3 N-galo kristalinės struktūros rodo ADP-ribozės 1-fosfato fosfatazės ir RNR surišimo aktyvumą [26], o mutagenezės tyrimai taip pat atskleidžia nsP3 vaidmenį moduliuojant pelių patogeniškumą [27, 28]. NsP4 baltymas veikia kaip nuo RNR priklausoma RNR polimerazė (RdRp), turinti katalizatorių. GDD motyvas C-gale [29]. Taip pat buvo iškelta hipotezė, kad nsP4 veikia kaip karkasas sąveikai su kitais nsP arba šeimininko baltymais per savo N-galą [30], taip pat stebimas adenililo transferazės aktyvumas [31].

Kuriant nukleokapsidę, alfa viruso kapsidės baltymas (C) suriša viruso genomo RNR per N-galines Arg, Lys ir Pro liekanas [32, 33]. Mutagenezės tyrimai nustatė leucino užtrauktuką, esantį šiame regione, būtiną į nukleokapsidą panašių dalelių susidarymui, tariamai tarpininkaujant dimerizacijai viruso surinkimo metu [34]. Baltymų C galas yra serino-proteazės domenas [18, 35], kuriame taip pat yra hidrofobinė kišenė glikoproteinams jungtis greta substrato surišimo vietos [12]. Struktūrinio baltymo E3 vaidmuo šiuo metu neapibrėžtas ir, atrodo, skiriasi tarp skirtingų alfavirusų. Nors SFV E3 baltymas yra susijęs su virionais [36], E3 baltymas nėra įtrauktas į kitų alfa virusų, įskaitant CHIKV, SINV ar WEEV, virionus [37]. Alfavirusų E2 glikoproteinas, atsakingas už receptorių surišimą, yra įterptas į membraną, nes 30 C-galinių liekanų [38–40]. Aminorūgščių pokyčiai nustatė, kad E2 baltymas yra neurovirulencijos veiksnys [41–43]. Vietos nukreipta mutagenezė nustatė Tyr-X-Leu tripeptidą endodomene, reikalingą sąveikai su kapsido proteazės domenu [12, 13, 44], kartu su konservuotomis Cys liekanomis, kurios modifikuojamos palmitoilinimo būdu [45]. 6K yra palmitoilintas struktūrinis baltymas, būtinas alfaviruso dalelių surinkimui [46, 47], kur manoma, kad jis turi įtakos transportavimui į virionų surinkimo vietas plazmos membranoje, prieš įtraukiant jį į virionus nedideliais kiekiais [46, 48, 49]. Alfaviruso 6K baltymas taip pat buvo klasifikuojamas kaip viroporinas dėl jo gebėjimo formuoti katijonams selektyvius jonų kanalus ir keisti membranos pralaidumą bakterijų ir žinduolių ląstelėse [50–52]. E1 baltymas yra sulietas alfa viruso baltymas [53, 54], kurio sulietas peptidas yra labai konservuotame hidrofobiniame domene [38].

3. Alfaviruso gyvavimo ciklas

Patekusios į vidų, alfaviruso dalelės išardomos, į užkrėstų ląstelių citoplazmą išleidžiant genominę RNR (2 pav.).Tada viruso genomas verčiamas iš dviejų ORF, kad būtų generuojami nestruktūriniai (P1234) ir struktūriniai poliproteinai [55]. Infekcijos pradžioje P1234 yra suskaidomas cis tarp nsP3 ir nsP4, kad gautųsi P123 ir nsP4 [56, 57]. P123 ir nsP4 sudaro nestabilų pradinį replikacijos kompleksą, galintį sintetinti neigiamos grandinės RNR [1, 58–60]. P123 skilimas į nsP1 ir P23 gali įvykti tik transir tik esant pakankamai didelei poliproteino koncentracijai. Poliproteinų produktai nsP1, P23 ir nsP4 sudaro replikacijos kompleksą viruso sukeltose citopatinėse vakuolėse (CPV I), kurios aktyviai dalyvauja sintezės neigiamose grandinėse, taip pat genomo RNR sintezėje, bet ne subgenominėje RNR sintezėje [60–64] . Visiškai suskaidžius į nsP1, nsP2, nsP3 ir nsP4, neigiamos grandinės sintezė yra inaktyvuota, o dabar stabilus replikacijos kompleksas pereina prie teigiamos grandinės genominės ir subgenominės RNR sintezės [58, 59]. Daugelyje alfa virusų po nsP3 yra nesandarus galutinis kodonas (parodyta 2 paveiksle), o nuskaitymas įvyksta tik 10–20% efektyvumu [65]. Tai lemia P123 nestruktūrinio poliproteino perteklių, palyginti su P1234, ir nsP4 išeikvojimą, palyginti su kitais nsP. Toliau mažėjantis tarpląstelinis nsP4 yra destabilizuojanti tirozino liekana N gale, o tai rodo greitą skilimą N galo taisyklės keliu [66]. Verta paminėti, kad nedidelės nsP4 frakcijos ekspresija ląstelėse yra santykinai stabili, greičiausiai replikacijos kompleksų pavidalu, o tai rodo, kad nsP4 suskaidomas tik tada, kai jo yra per daug [66]. Pašalinus destabilizuojančią Tyr liekaną, prasta RNR replikacija [67].


Alfaviruso gyvavimo ciklas. Alfaviruso patekimas į ląsteles pradedamas jungiantis prie receptorių, po to-klatrino sukelta endocitozė. Susiliejimas su endosominėmis membranomis nukleokapsidę (NC) perneša į citoplazmą, kur po išardymo išsiskiria RNR. Genominė RNR naudojama tiek baltymų vertimui iš genominės ir subgenominės (26S) RNR, tiek atsirandančios (+)RNR transkripcijai naudojant (-)RNR šabloną. Struktūriniai baltymai, išversti iš 26S RNR, apgaubia besiformuojančią genominę RNR, prieš pradėdami formuotis iš ląstelių ir galiausiai išlaisvinti.

Struktūrinio poliproteino skilimas vyksta kotransliacijos būdu, pradedant nuo autoproteolitinio kapsido baltymo skilimo nuo likusio poliproteino [18, 68, 69]. Tada C baltymas gali būti susietas su naujai susintetinta RNR, atpažįstant specifinius pakavimo signalus 5 ′ genomo pusėje, kad į nukleokapsidę panašias daleles būtų supakuota tik viso ilgio genominė RNR [32, 33]. E3 baltymas veikia kaip signalinė seka likusiam poliproteinui įterpti į endoplazminį tinklą, kur jį apdoroja šeimininko signalo peptidazė [18, 70]. Panašiai 6K baltymas veikia kaip signalinė seka E1 baltymo apdorojimui pasroviui [51].

Po sintezės E2 glikoproteino pirmtakas PE2 (p62 SFV) ir E1 glikoproteinai sąveikauja tarpusavyje (pageidautina cis) sudaryti heterodimerus [71–73]. Tada šie heterodimeriniai kompleksai per Golgi kompleksą pernešami iš endoplazminio tinklo į ląstelės paviršių [74–76]. Vėlyvame transportavimo etape PE2 pirmtakas suskaidomas į savo spindžio domeną šeimininko furino tipo proteazės pagalba, kad susidarytų subrendę E2 ir E3 baltymai [74, 76, 77]. Šis skilimas sukelia konformacinius pokyčius, kurie susilpnina smaigalio heterodimero E1-E2 sąveiką [11], pradėdami sintezės peptidą aktyvuoti, kai veikiamas žemas pH [78]. C baltymo ir E2 baltymo citoplazminio domeno sąveika skatina pumpurų atsiradimą, o E1-E2 heterodimerai sudaro apvalkalą aplink į nukleokapsidę panašias daleles [12, 79, 80]. Išsiskyrę iš ląstelių, virionai įgyja dvigubą membranos sluoksnį, gautą iš ląstelės šeimininkės plazmos membranos [6–9].

4. Receptorių sukelta endocitozė

Virusai patenka į ląsteles plazmos membranoje, susiliejant su membranos komponentais ląstelės paviršiuje, arba prijungiant receptorius ir internalizuojant, o po to susiliejant su endocitinių pūslelių ląstelinėmis membranomis. Receptorių sukelta endocitozė yra vyraujantis patekimo būdas, dažniausiai tarpininkaujant susidariusiai klatrinu dengtoms duobėms ir vėliau gabenant į ankstyvąsias endosomas, kur žemo pH aplinka sukelia susiliejimą [81]. Arba kai kurie virusai naudoja nuo klatrino nepriklausomus kelius, kad patektų į ląsteles. Kaveolinis/plaustas kelias perkelia internalizuotą virusą į neutralaus pH kavasomas, prieš perskirstydamas jį į ER. Taip pat yra keletas nuo klatrino nepriklausomų, nuo caveolino nepriklausomų kelių, kuriuos virusai naudoja patekimui į ląsteles ir kurie priklauso nuo mažų GTPazių, nors jie nėra gerai suprantami [81].

Alfa virusų patekimą į ląsteles palengvina smaigalio E2 komponento sąveika su baltymų receptoriais tikslinių ląstelių paviršiuje (2 pav.) [40, 82]. 63 KDa baltymas paukščių ląstelių paviršiuje buvo pirmasis pastebėtas alfa viruso receptorius, nors jo tapatybė nebuvo nustatyta [83]. Antikūnai, sukurti prieš BHK membranos baltymus, buvo tikrinami, siekiant nustatyti 67 KDa laminino receptorių kaip didelio afiniteto prisijungimo receptorių SINV infekcijai žinduolių ląstelėse [84]. Buvo įrodyta, kad tolesni SINV surišimo eksperimentai su dendritinėmis ląstelėmis priklauso nuo SIGN, o DC-SIGN ir L-SIGN veikia kaip receptorių molekulės [85]. Heparano sulfatas, ląstelės paviršiaus glikozaminoglikanas, taip pat gali veikti kaip alfa virusų prisirišimo receptorius [86–88]. Tačiau atrodo, kad alfa viruso prisijungimo prie heparano sulfato giminingumas įgyjamas po serijinio pasėlio ląstelių kultūroje, o lauko izoliatai turi daug mažesnį afinitetą heparano sulfatui nei laboratorijoje pritaikytos padermės [86–88].

Prisijungę prie ląstelių receptorių, alfa virusai greitai internalizuojasi ir patenka į endosomas (2 pav.) [89–91]. Klatrinu padengtų pūslelių susidarymui reikalingas dinaminas, a

100 KDa baltymas, palengvinantis klatrinu dengtų duobių pumpuravimąsi, dėl kurio susidaro dengtos pūslelės, priklausomai nuo GTP [92]. Kai buvo išreikšti dominuojantys neigiami dinamino mutantai, specifiškai blokuojantys klatrinu dengtų duobučių ir pūslelių susidarymą [93, 94], buvo užkirstas kelias alfavirusams CHIKV, SFV ir SINV [89, 95]. Panašiai dominuojantis neigiamas Eps15 mutantas, kitas nuo klatrino priklausomos endocitozės tarpininkas, neleidžia VEEV patekti į ląsteles [96]. Tyrimai, atlikti naudojant dominuojančias neigiamas mutantines Rab5 ir Rab7 formas, genus, svarbius endocitiniam judėjimui atitinkamai į ankstyvąsias ir vėlyvąsias endosomas [97, 98], rodo, kad tiek SFV, tiek VEEV yra pernešami į ankstyvąsias endosomas, o tik VEEV yra pernešami į vėlyvąsias endosomas. endosomos, prieš susiliejimą su tikslinėmis membranomis [96, 99].

Nors plačiai pripažįstama, kad alfavirusų patekimas priklauso nuo klatrino sukeltos endocitozės ir susiliejimo su endosominėmis membranomis, taip pat pranešta apie alfa virusų gebėjimą patekti į šeimininko ląsteles alternatyviais mechanizmais. Šią hipotezę patvirtina ankstyvas SINV patekimo tyrimas, kuris parodė viruso RNR transliaciją ląstelių citozolyje, net kai užkrėstos ląstelės buvo gydomos silpnomis bazėmis chlorokvinu ir amonio chloridu, o tai rodo, kad galima apeiti infekciją, apimančią rūgštines endosomas [100, 101 ]. Visai neseniai buvo įrodyta, kad įvairių ląstelių linijų infekcija SINV vyksta nesant žemo pH sukeltos endocitozės, o tai rodo patekimą per nuo klatrino nepriklausomą kelią [102–104]. Panašiai, BHK ir CHO ląstelių SFV infekcija po normalios viruso suliejimo endosomose arba eksperimentiniu būdu sukeltos suliejimo ląstelės paviršiuje, pabrėžė alfa virusų gebėjimą užkrėsti ląsteles alternatyviu keliu. Nors CHO ląstelės galėjo būti užkrėstos tik po endocitinio kelio, BHK ląstelės galėjo būti veiksmingai užkrėstos po suliejimo arba endosomose, arba prie plazmos membranos, tai patvirtina viruso RNR ir baltymų sintezė [105]. Tam pritarė išvada, kad SFV galima rasti nedengtų duobių ir pūslelių viduje [106]. Kai siRNR buvo naudojama klatrino sunkiajai grandinei numušti, tiek HEK293, tiek HeLa ląstelių CHIKV infekcija nepakito [107]. Įdomu tai, kad eksperimentai, naudojant antikūnus prieš klatriną, parodė tik a

60% blokuoja SFV infekciją [90]. Šis dalinis infekcijos blokavimas gali reikšti, kad arba antikūnai visiškai neslopina klatrino kelio, arba kad SFV gali patekti ir kitu būdu, kuriam nereikia klatrino. Toks scenarijus gali būti teisingas ir CHIKV atveju, kai dominuojantys neigiami Eps15, Rab5 mutantai ir vaistų endocitozės inhibitoriai parodė tik dalinį infekcijos blokavimą, patvirtinantį hipotezę, kad CHIKV užgrobė kelis kelius, kad prasiskverbtų į tikslines ląsteles [107]. ].

5. Sujungimas

Ankstyvieji tyrimai atskleidė, kad alfavirusų E1 baltymas yra sulietas baltymas [38, 53, 54, 108–110]. Be to, pašalinus E2 baltymą virškinant proteazę, galima teigti, kad vien tik E1 baltymo pakanka membranos suliejimui [111]. Tačiau E1 baltymo fuzogeninį aktyvumą slopina sąveika su E2 baltymu [11]. Endosominėse pūslelėse E1-E2 heterodimeras patiria negrįžtamus konformacinius pokyčius veikiant pH

6 arba žemiau [91, 109, 112–115]. Ši žemo pH aplinka išlaisvina E1 subvienetą iš asociacijos su E2 subvienetu, leidžiant pertvarkyti į homotrimerinį kompleksą, aktyvų sintezei [108, 109, 116, 117]. E1 homotrimeriai susiejami su tiksline membrana, įterpdami hidrofobinio suliejimo peptido membraną, kad susidarytų poros tiek ląstelinėse, tiek virusinėse membranose, kad nukleokapsidas išsiskirtų į citoplazmą (2 pav.) [111, 118, 119]. Susiliejimo procesas vyksta labai greitai, kol alfavirusams negresia lizosomų degradacija [115]. Ląstelių apdorojimas lizosomotropinėmis silpnomis bazėmis chlorokvinu, konkanamicinu, amonio chloridu, bafilomicinu ar monenzinu neutralizuoja endosomų pH, užkertant kelią susiliejimui su membranomis [91, 96, 99, 107, 120, 121].

Be priklausomybės nuo žemo pH, alfavirusų susiliejimui su membranomis reikia ir cholesterolio [107, 108, 114, 115, 122–125]. Nedideli sfingolipidų kiekiai taip pat reikalingi tikslinėse membranose, kad jie galėtų atlikti dar nenustatytą vaidmenį pačios sintezės reakcijos metu [114, 123, 126]. Atrodo, kad cholesterolis yra būtinas hidrofobinei alfa1 viruso E1 ektodomeno sąveikai su tiksline membrana, dėl kurios susilieja [113, 127]. Tačiau ši priklausomybė nuo cholesterolio skiriasi tarp alfa virusų, o CHIKV, SFV ir SINV patekimą slopina cholesterolio išeikvojimas, VEEV vis dar gali patekti į ląsteles panašiomis sąlygomis [96, 107]. Buvo pasiūlyta, kad VEEV apvalkalo baltymų skirtumai, palyginti su kitais alfa virusais, gali lemti šiuos pastebėtus skirtumus [125]. Kaip buvo prognozuota, SFV ir SINV priklausomybė nuo cholesterolio buvo priskirta konkrečiai E1 baltymo liekanai 226 padėtyje [125]. Virusai, turintys E1-P226S mutaciją, yra efektyvesni suliejant, nesant cholesterolio, palyginti su laukinio tipo, o E1 baltymas lengviau virsta aktyviu suliejimo homotrimeriu [128, 129]. VEEV E1 baltymo sekos analizė rodo, kad ši mutacija jau yra [96]. Buvo įrodyta, kad ankstyvųjų endosomų membranos yra prisodrintos cholesterolio, tuo tarpu vėlyvosios endosomos neturi cholesterolio membranos [130, 131]. Tai buvo naudojama paaiškinant cholesterolio poreikio skirtumus, nes atrodo, kad SFV susilieja ankstyvosiose endosomose, o VEEV eina į vėlyvas endosomas, kad sulietų [96].

6. Nukleokapsidės išardymas

Dėl sterinių kliūčių tik nedidelė dalis E1 sulietų baltymų molekulių, esančių atskiros viruso dalelės paviršiuje, galėtų dalyvauti sintezės reakcijose endosominėje membranoje [132]. Buvo pasiūlyta, kad likę sulieti baltymai, kurie nereagavo su tiksline membrana, gali susilankstyti atgal ir reaguoti su viruso membrana, kurioje jie yra įtvirtinti, todėl susidaro jonams pralaidžios poros [132]. Kartu šie procesai leidžia nukleokapsidą patekti į citoplazmą (2 pav.) Ir jonų srautą per tikslinę membraną.

Nustatyta, kad viruso baltymai jonų pralaidžias poras formuoja patekimo metu su kitais virusais, tokiais kaip gripo virusas, o M2 baltymas susijęs su protonų srautu iš endosomos esant žemam pH [133]. Panaši funkcija buvo pasiūlyta ir alfa viruso E1 baltymui [111, 119]. Iš tiesų, viruso struktūrinių baltymų kaupimasis ląstelės membranoje viruso dauginimosi metu keičia membranos pralaidumą esant žemam pH vėlyvai infekcijai [118, 134]. Įvertinus ląstelių, inkubuotų su SINV ir SFV esant žemam pH, membranos pralaidumą, įtampos matavimai patvirtino jonų pralaidžių porų susidarymą [135]. Dėl to protonų srautas iš endosomos į citoplazmą per šią porą sukeltų žemo pH sritį, atitinkančią atradimą, kad žemo pH aplinka stipriai skatina alfa-viruso nukleokapsido išardymą [136].

Susiliejus viruso apvalkalui su endosomine membrana, nukleokapsidas išsiskiria į ląstelių citoplazmą (2 pav.). Alfaviruso nukleokapsidų danga padengiama beveik iš karto (

1 minutę) po to, kai jie prasiskverbia į citoplazmą [137]. 60S ribosominė RNR sąveikauja su C baltymu, palengvindama nukleokapsidės dangos pašalinimą ir virusinės RNR išsiskyrimą, kad būtų pradėta baltymų sintezė (2 pav.) [55, 137–139].

7. Išvada

Alfavirusų tyrimas suteikė daug įžvalgų, susijusių su viruso patekimu. Tiesą sakant, ataskaitos apie SFV buvo pirmosios, kurios parodė virusų patekimą per receptorių sukeltą endocitozę ir klatrinu padengtų pūslelių naudojimą [91]. Toliau buvo išaiškintas alfa virusų patekimo kelias, leidžiantis geriau suprasti tokius įvykius kaip prekyba virusais, susiliejimas ir genominės medžiagos išsiskyrimas į ląsteles. Tačiau lieka nemažai klausimų, kurie dar turi būti išspręsti. Viena tyrimo sritis yra receptorių, naudojamų alfa viruso prijungimui prie ląstelių, identifikavimas. Iki šiol receptoriai buvo nustatyti tik SFV ir SINV patekimui į ląsteles. Išskyrus receptorius, gali atsirasti naujų antivirusinių vaistų, skirtų patekti į alfa virusą. Kita tyrimo tema yra alternatyvių alfa viruso patekimo į ląsteles būdų naudojimas. Vis daugiau įrodymų, kad alfa virusai gali užkrėsti ląsteles nepriklausomai nuo klatrino sukeltos endocitozės, naudodamiesi visiškai skirtingu patekimo keliu arba gali patekti į ląsteles keliais keliais. Įrodyta, kad CHIKV atveju patekimas įvyksta ir nesant cav-1 (reikalingas kaveolinėms pūslelėms formuotis) [140]. Gali būti, kad alfa virusai, tokie kaip CHIKV, gali panaudoti nuo dinamino priklausomą kelią, priklausantį nuo mažos GTPazės RhoA [141]. Šis kelias neapima klatrino, caveolae ar Eps15, tačiau jį labai slopina dinamino, RhoA išnykimas arba cholesterolio ar sfingolipidų išeikvojimas, sutampa su ankstesniu darbu. Tikimasi, kad tolesnis alfa virusų tyrimas atskleis naujus procesus, susijusius su patekimu.

Pripažinimas

Pripažįstama NUS pradžios dotacija (R182-000-165-133, R182-000-165-733) ir Biomedicinos tyrimų tarybos (BMRC) stipendija (R182-000-158-305). Dėl erdvės apribojimų daugeliui kolegų, kurių pirminio indėlio nepavyko paminėti šioje apžvalgoje, iš anksto pripažinama ir atsiprašoma.

Nuorodos

  1. J. H. Strauss ir E. G. Strauss, „Alfavirusai: genų ekspresija, replikacija ir evoliucija“, Mikrobiologinės apžvalgos, t. 58, ne. 3, p. 491–562, 1994. Žiūrėti: Google Scholar
  2. K. D. Ryman ir W. B. Klimstra, „Šeimininko atsakai į alfavirusinę infekciją“, Imunologinės apžvalgos, t. 225, Nr. 1, p. 27–45, 2008. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  3. F. Simon, H. Tolou ir P. Jeandel, „Netikėtas Čikungunijos protrūkis“, Revue de Medicine Interne, t. 27, ne. 6, p. 437–441, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  4. E. J. Mancini, M. Clarke, B. Gowen, T. Rutten ir S. D. Fuller: „Kriotelektroninė mikroskopija atskleidžia apvalkalo viruso, Semliki Forest viruso, funkcinę organizaciją“. Molekulinė ląstelė, t. 5, ne. 2, p. 255–266, 2000. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  5. C. Morgan, C. Howe ir H. M. Rose: „Virusų struktūra ir vystymasis, stebimas elektronų mikroskopu. V. Vakarų arklių encefalomielito virusas “ Eksperimentinės medicinos žurnalas, t. 113, p. 219–234, 1961. Žiūrėti: „Google Scholar“
  6. S. D. Fulleris: „Sindbis viruso apvalkalas T = 4 yra sudarytas sąveikaujant su papildomu T = 3 kapsidu“. Ląstelė, t. 48, Nr. 6, p. 923–934, 1987. Žiūrėti: „Google Scholar“
  7. N. H. Achesonas ir I. Tammas, „Semliki miško viruso replikacija: elektronų mikroskopinis tyrimas“ Virologija, t. 32, ne. 1, p. 128–143, 1967. Žiūrėti: „Google Scholar“
  8. R. A. Laine, H. Söderlund ir O. Renkonen, „Semliki miško viruso cheminė sudėtis“, Intervirologija, t. 1, Nr. 2, p. 110–118, 1973. Žiūrėti: Google Scholar
  9. R. H. Vogel, S. Provencher ir C. H. von Bonsdorff, „Semliki Forest viruso vokų struktūra, rekonstruota iš krioelektroninių mikrografijų“, Gamta, t. 320, ne. 6062, p. 533–535, 1986. Žiūrėti: Google Scholar
  10. C. M. Rice ir J. Strauss, „Sindbis viriono glikoproteinų ir jų pirmtakų asociacija“, Molekulinės biologijos žurnalas, t. 154, Nr. 2, p. 325–348, 1982. Žiūrėti: Google Scholar
  11. J. Wahlberg, W. A. ​​M. Boere ir H. Garoff: „Heterodimerinis ryšys tarp Semliki Forest viruso membraninių baltymų keičia jo jautrumą žemam pH viruso brendimo metu“. Virusologijos žurnalas, t. 63, Nr. 12, p. 4991–4997, 1989. Žiūrėti: Google Scholar
  12. K. E. Owen ir R. J. Kuhn: „Alfaviruso augimas priklauso nuo sąveikos tarp nukleokapsidės ir hidrofobinių aminorūgščių E2 apvalkalo glikoproteino citoplazminiame domene. Virologija, t. 230, ne. 2, p. 187–196, 1997. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  13. H. Zhao, B. Lindqvist, H. Garoff, C. H. von Bonsdorff ir P. Liljeström: „Tirozinu pagrįstas motyvas, esantis alfa viruso apvalkalo baltymo citoplazminėje srityje, yra būtinas pumpurai“. EMBO žurnalas, t. 13, Nr. 18, p. 4204–4211, 1994. Peržiūrėti adresu: Google Scholar
  14. D. T. Simmons ir J. Strauss, „Sindbis viruso replikacija. I. Santykinis 26 ir 49 s RNR dydis ir genetinis turinys “ Molekulinės biologijos žurnalas, t. 71, Nr. 3, p. 599–613, 1972. Žiūrėti: Google Scholar
  15. E. G. Strauss, C. M. Rice ir J. Strauss, „Sindbis viruso genominės RNR pilna nukleotidų seka“, Virologija, t. 133, Nr. 1, p. 92–110, 1984. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  16. R. Cancedda ir A. J. Shatkinas, „Ribosomomis apsaugoti fragmentai iš sindis 42-S ir 26-S RNR“ Europos biochemijos leidinys, t. 94, Nr. 1, p. 41–50, 1979. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  17. W. R. Hardy ir J. Strauss, "Sindbis viruso nestruktūrinių poliproteinų apdorojimas: nestruktūrinė proteinazė yra nsP2 C-galinėje pusėje ir veikia tiek cis, tiek trans" Virusologijos žurnalas, t. 63, Nr. 11, p. 4653–4664, 1989. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  18. P. Melançon ir H.Garoffas, „Semliki miško viruso struktūrinio poliproteino apdorojimas: kapsido proteazės vaidmuo“ Virusologijos žurnalas, t. 61, Nr. 5, p. 1301–1309, 1987. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  19. T. Ahola ir L. Kääriäinen, „Alfaviruso mRNR ribojimo reakcija: kovalentinio nestruktūrinio baltymo nsP1 komplekso su 7-metil-GMP susidarymas“. Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 92, ne. 2, p. 507–511, 1995. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  20. S. Mi ir V. Stollar, „Sindbis viruso nsP1 ekspresija ir metiltransferazės aktyvumas Escherichia coli“, Virologija, t. 184, Nr. 1, p. 423–427, 1991. Žiūrėti: Google Scholar
  21. J. Peränen, P. Laakkonen, M. Hyvönen ir L. Kääriäinen: „Alfaviruso replikazės baltymas nsP1 yra susijęs su membrana ir turi afinitetą endocitinėms organelėms“. Virologija, t. 208, Nr. 2, p. 610–620, 1995. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  22. M. Gómez de Cedrón, N. Ehsani, M. L. Mikkola, L. Kääriäinen ir J. A. García, „Semliki Forest viruso replikacijos baltymo NSP2 RNR helikazės aktyvumas“, FEBS laiškai, t. 448, Nr. 1, p. 19–22, 1999. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  23. M. Rikkonen, J. Peränen ir L. Kääriäinen, „ATPazės ir GTPazės veikla, susijusi su Semliki Forest viruso nestruktūriniu baltymu nsP2“, Virusologijos žurnalas, t. 68, ne. 9, p. 5804–5810, 1994. Peržiūrėti adresu: Google Scholar
  24. L. Vasiljeva, A. Merits, P. Auvinen ir L. Kääriäinen, „Naujos Alphavirus capping aparato funkcijos identifikavimas. Nsp2 RNR 5'-trifosfatazės aktyvumas “, Biologinės chemijos žurnalas, t. 275, Nr. 23, p. 17281–17287, 2000. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  25. Y. S. Hahn, E. G. Strauss ir J. Strauss, „Sindbis viruso RNR temperatūrai jautrių mutantų kartografavimas: A, B ir G komplementacijos grupių priskyrimas nestruktūriniams baltymams“, Virusologijos žurnalas, t. 63, Nr. 7, p. 3142–3150, 1989. Žiūrėti: Google Scholar
  26. H. Malet, E. A. Gould, S. Jamal ir kt., „Chikungunya ir Venesuelos arklių encefalito viruso nsP3 makrodomenų kristalinės struktūros apibrėžia konservuotą adenozino surišimo kišenę“, Virusologijos žurnalas, t. 83, Nr. 13, p. 6534–6545, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  27. E. Park ir D. E. Griffin: „nsP3 makro sritis yra svarbi Sindbis viruso replikacijai neuronuose ir neurovirulencijai pelėse“. Virologija, t. 388, Nr. 2, p. 305–314, 2009. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  28. M. T. Tuittila ir A. Hinkkanen, „Aminorūgščių mutacijos Semliki miško viruso replikazės baltyme nsP3 kartu daro įtaką neurovirulencijai“. Bendrosios virusologijos žurnalas, t. 84, ne. 6, p. 1525–1533, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  29. Y. S. Hahn, A. Grakoui, C. M. Rice, E. G. Strauss ir J. Strauss, „Sindbis viruso RNR temperatūrai jautrių mutantų kartografavimas: F komplementacijos grupės mutantai turi nsP4 pažeidimų“, Virusologijos žurnalas, t. 63, Nr. 3, p. 1194–1202, 1989. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  30. Y. Shirako, E. G. Straussas ir J. Straussas: „Slopinimo mutacijos, leidžiančios Sindbis viruso RNR polimerazei veikti su nearomatinėmis amino rūgštimis N gale: įrodymai apie sąveiką tarp nsP1 ir nsP4 minusinės grandinės RNR sintezėje“. Virologija, t. 276, Nr. 1, p. 148–160, 2000. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  31. S. Tomaras, R. W. Hardy, J. L. Smithas ir R. J. Kuhnas: „Katalitinė alfa struktūros nestruktūrinio baltymo nsP4 šerdis turi galutinį adeniltransferazės aktyvumą“. Virusologijos žurnalas, t. 80, ne. 20, p. 9962–9969, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  32. K. E. Owenas ir R. J. Kuhnas: „Sindbis viruso nukleokapsidinio baltymo regiono, kuris yra susijęs su RNR kapsuliavimo specifiškumu, identifikavimas“ Virusologijos žurnalas, t. 70, Nr. 5, p. 2757–2763, 1996. Žiūrėti: Google Scholar
  33. B. G. Weissas, H. Nitschko, I. R. Ghattas, S. Schlesinger ir R. N. Wright, „Sindbis viruso RNR inkapsidacijos specifiškumo įrodymai“, Virusologijos žurnalas, t. 63, Nr. 12, p. 5310–5318, 1989. Žiūrėti: „Google Scholar“
  34. R. Perera, C. K. Navaratnarajah ir R. J. Kuhn, „Heterologinė spiralė gali pakeisti Sindbis viruso kapsidės baltymo spiralę I“, Virusologijos žurnalas, t. 77, ne. 15, p. 8345–8353, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  35. H. K. Choi, L. Tong, W. Minor ir kt., „Sindbis viruso pagrindinio baltymo struktūra atskleidžia į chimotripsiną panašią serino proteinazę ir viriono organizavimą“. Gamta, t. 353, Nr. 6348, p. 37–43, 1991. Žiūrėti: Google Scholar
  36. H. Garoff, K. Simons ir O. Renkonen, „Semliki Forest viruso membraninių baltymų išskyrimas ir charakteristika“, Virologija, t. 61, Nr. 2, p. 493–504, 1974. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  37. B. Simizu, K. Yamamoto, K. Hashimoto ir T. Ogata, „Chikungunya viruso struktūriniai baltymai“, Virusologijos žurnalas, t. 51, ne. 1, p. 254–258, 1984. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  38. H. Garoff, A. M. Frischauf ir K. Simons, „Semliki miško viruso membranos glikoproteinus koduojančios cDNR nukleotidų seka“, Gamta, t. 288, Nr. 5788, p. 236–241, 1980. Žiūrėti: Google Scholar
  39. N. Liu ir D. T. Brownas, „I tipo membranos glikoproteino citoplazminio (endo) domeno trumpalaikis perkėlimas į ląstelių membranas“, Ląstelių biologijos žurnalas, t. 120, Nr. 4, p. 877–883, 1993. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  40. T. Smithas, R. H. Chengas, N. Olsonas ir kt., „Tariamos alfa virusų receptorių surišimo vietos, vizualizuotos krioelektronine mikroskopija“ Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 92, Nr. 23, 10648–10652, 1995. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  41. N. L. Davisas, F. J. Fulleris ir W. G. Dougherty: „Vienas nukleotidų pokytis Sindbis viruso E2 glikoproteinų genuose turi įtakos ląstelių kultūros įsiskverbimo greičiui ir naujagimių pelių virulentiškumui“. Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 83, Nr. 18, p. 6771–6775, 1986. Žiūrėti: „Google Scholar“
  42. P. C. Tucker, S. H. Lee, N. Bui, D. E. Griffin ir D. Martinie, „Aminorūgščių pokyčiai sindbio viruso E2 glikoproteine, kurie padidina neurovirulentiškumą, pagerina patekimą į neuroblastomos ląsteles“, Virusologijos žurnalas, t. 71, Nr. 8, p. 6106–6112, 1997. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  43. S. Ubol, P. C. Tucker, D. E. Griffin ir J. M. Hardwick: „Neurovirulentinės Alphavirus padermės sukelia apoptozę bcl-2 ekspresuojančiose ląstelėse: vieno aminorūgščių pasikeitimo vaidmuo E2 glikoproteine“. Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 91, Nr. 11, p. 5202–5206, 1994. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  44. U. Skoging-Nyberg ir P. Liljeström: „Konservuotas leucinas, esantis Semliki miško viruso spygliuočių baltymo citoplazminėje srityje, yra svarbus pumpurui“, Virologijos archyvas, t. 145, Nr. 6, p. 1225–1230, 2000. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  45. L. Ivanova ir M. Schlesinger, „Sindbis viruso E2 glikoproteino mutacijos nustato palmitoilinimo vietas ir veikia viruso augimą“, Virusologijos žurnalas, t. 67, ne. 5, p. 2546–2551, 1993. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  46. K. Gaedigk-Nitschko ir M. J. Schlesinger, „Sindbis viruso 6K baltymas gali būti aptiktas virionuose ir yra acilintas riebalų rūgštimis“, Virologija, t. 175, Nr. 1, p. 274–281, 1990. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  47. L. Ivanova, L. D. Le ir M. J. Schlesinger, „Sindbis viruso 6K geno mutanto, turinčio įtakos proteolitiniam apdorojimui ir viruso surinkimui, revertantų apibūdinimas“, Virusų tyrimai, t. 39, Nr. 2-3, p. 165–179, 1995. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  48. S. Lusa, H. Garoff ir P. Liljeström, „Semliki Forest viruso 6K membraninio baltymo likimas surinkimo metu“, Virologija, t. 185, Nr. 2, p. 843–846, 1991. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  49. M. A. Sanz ir L. Carrasco, „Sindbis viruso variantas su 6K geno ištrynimu rodo glikoproteinų apdorojimo ir prekybos trūkumus: trūksta papildymo laukinio tipo 6K geno trans“. Virusologijos žurnalas, t. 75, ne. 16, p. 7778–7784, 2001. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  50. J. Melton, G. Ewart, R. C. Weir, E. K. Lee, P. G. Board ir P. W. Gage, „Alphavirus 6K proteins form ion channels“ Biologinės chemijos žurnalas, t. 277, Nr. 49, p. 46923–46931, 2002. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  51. M. A. Sanz, V. Madan, L. Carrasco ir J. L. Nieva, „Sindbis viruso 6K baltymo sąsajos domenai: aptikimas ir funkcinis apibūdinimas“, Biologinės chemijos žurnalas, t. 278, Nr. 3, p. 2051–2057, 2003. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  52. M. A. Sanz, L. G. Perez ir L. Carrasco, „Semliki miško viruso 6K baltymas modifikuoja membranos pralaidumą po indukuojamos ekspresijos Escherichia coli ląstelėse“, Biologinės chemijos žurnalas, t. 269, Nr. 16, p. 12106–12110, 1994. Žiūrėti: Google Scholar
  53. W. M. Boggs, C. S. Hahn, E. G. Strauss, J. Strauss ir D. E. Griffin, „Nuo pH priklausomas Sindbis viruso sukeltas BHK ląstelių susiliejimas: skirtumai tarp padermių koreliuoja su aminorūgščių pokyčiais E1 glikoproteine“. Virologija, t. 169, Nr. 2, p. 485–488, 1989. Žiūrėti: Google Scholar
  54. A. Omaras ir H. Kobletas: „Semliki miško viruso dalelės, kuriose yra tik E1 apvalkalo glikoproteinas, yra užkrečiamos ir gali sukelti ląstelių suliejimą“. Virologija, t. 166, Nr. 1, p. 17–23, 1988. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  55. N. T. Glanville, M. Ranki ir J. Morser, „Persikėlimo inicijavimas, vadovaujamas 42S ir 26S RNR iš Semliki Forest viruso in vitro“ Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 73, ne. 9, p. 3059–3063, 1976. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  56. R. J. de Groot, W. R. Hardy, Y. Shrako ir J. Strauss: „Sindbis viruso poliproteinų skilimo vietos nuostatos turi nestruktūrinę proteinazę. Įrodymai dėl laikino poliproteinų apdorojimo in vivo reguliavimo “, EMBO žurnalas, t. 9, ne. 8, p. 2631–2638, 1990. Žiūrėti: Google Scholar
  57. K. Takkinen, J. Peränen ir L. Kääriäinen, „Semliki Forest virusui būdingo nestruktūrinio poliproteino proteolitinis apdorojimas“, Bendrosios virusologijos žurnalas, t. 72, Nr. 7, p. 1627–1633, 1991. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  58. J. A. Lemm, T. Rümenapf, E. G. Strauss, C. M. Rice ir J. Strauss, „Polipeptidų reikalavimai funkcinių Sindbis viruso replikacijos kompleksų surinkimui: minios ir pliuso RNR sintezės laikino reguliavimo modelis“. EMBO žurnalas, t. 13, Nr. 12, p. 2925–2934, 1994. Žiūrėti: Google Scholar
  59. Y. Shirako ir J. Strauss, „Sindbis viruso RNR replikacijos reguliavimas: neskaldytos P123 ir nsP4 funkcijos sintezės minuso grandinėje metu, o skaldyti produktai iš P123 reikalingi efektyviai pliuso grandinės RNR sintezei“. Virusologijos žurnalas, t. 68, ne. 3, p. 1874–1885, 1994. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  60. I. Dé, S. G. Sawicki ir D. L. Sawicki, „Sindbis viruso RNR neigiami mutantai, kuriems nepavyksta konvertuoti iš minusinės grandinės į pliusinės grandinės sintezę: nsP2 baltymo vaidmuo“, Virusologijos žurnalas, t. 70, Nr. 5, p. 2706–2719, 1996. Žiūrėti: Google Scholar
  61. S. A. Froshauer, J. Kartenbeck ir A. Helenius, „Alfaviruso RNR replikazė yra endosomų ir lizosomų citoplazminiame paviršiuje“, Ląstelių biologijos žurnalas, t. 107, ne. 6, p. 2075–2086, 1988. Žiūrėti: Google Scholar
  62. P. Kujala, A. Ikäheimonen, N. Ehsani, H. Vihinen, L. Kääriäinen ir P. Auvinen, „Biogenesis of the Semliki Forest virus RNA replikation complex“, Virusologijos žurnalas, t. 75, ne. 8, p. 3873–3884, 2001. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  63. A. H. Salonen, L. Vasiljeva, A. Merits, L. Kääriäinen, J. Magden ir E. Jokitalo, „Tinkamai sulankstytas nestruktūrinis poliproteinas nukreipia semliki miško viruso replikacijos kompleksą į endosominį skyrių“. Virusologijos žurnalas, t. 77, ne. 3, p. 1691–1702, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  64. M. W. LaStarza, J. A. Lemm ir C. M. Rice, „Sindbis viruso nsP3 srities genetinė analizė: įrodymai dėl vaidmenų minusinės grandinės ir subgenominės RNR sintezėje“, Virusologijos žurnalas, t. 68, ne. 9, p. 5781–5791, 1994. Peržiūrėti adresu: Google Scholar
  65. G. Li ir C. M. Rice'as: „Signalas, skirtas UGA kodono transliaciniam skaitymui sindbiso viruso RNR, apima vieną citidino likutį, esantį iškart po terminacijos kodono“, Virusologijos žurnalas, t. 67, ne. 8, p. 5062–5067, 1993. Žiūrėti: Google Scholar
  66. R. J. de Groot, T. Rümenapf, R. J. Kuhn, E. G. Strauss ir J. Strauss, „Sindbis viruso RNR polimerazę skaido N-galo taisyklės kelias“, Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 88, Nr. 20, p. 8967–8971, 1991. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  67. Y. Shirako ir J. Strauss, „Reikalavimas aromatinei amino rūgščiai arba histidinui sindbis viruso RNR polimerazės N gale“, Virusologijos žurnalas, t. 72, Nr. 3, p. 2310–2315, 1998. Žiūrėti: Google Scholar
  68. G. Aliperti ir M. Schlesinger, „Sindbis viruso kapsidės baltymo autoproteazės aktyvumo įrodymai“, Virologija, t. 90, ne. 2, p. 366–369, 1978. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  69. H. Garoff, K. Simons ir B. Dobberstein, „Semliki miško viruso membranos glikoproteinų surinkimas endoplazminio tinklo membranoje in vitro“ Molekulinės biologijos žurnalas, t. 124, Nr. 5, p. 587–600, 1978. Žiūrėti: Google Scholar
  70. M. Lobigs, Z. Hongxing ir H. Garoff, „Semliki Forest viruso E3 peptido funkcija viruso surinkime: E3 pakeitimas dirbtiniu signaliniu peptidu panaikina smaigalių heterodimerizaciją ir E1 ekspresiją paviršiuje“, Virusologijos žurnalas, t. 64, Nr. 9, p. 4346–4355, 1990. Žiūrėti: Google Scholar
  71. W. A. ​​Duffus, P. Levy-Mintz, M. R. Klimjack ir M. Kielian, „Semliki Forest viruso numanomo suliejimo peptido mutacijos veikia smailių baltymų oligomerizaciją ir viruso surinkimą“, Virusologijos žurnalas, t. 69, ne. 4, p. 2471–2479, 1995. Žiūrėti: Google Scholar
  72. H. H. Andersson, B. U. Barth, M. Ekström ir H. Garoff, „Nuo oligomerizacijos priklausomas semliki miško viruso suliejimo baltymo lankstymas“, Virusologijos žurnalas, t. 71, Nr. 12, p. 9654–9663, 1997. Žiūrėti: Google Scholar
  73. B. U. Barth, J. M. Wahlberg ir H. Garoff, „Semliki miško viruso membranos baltymų subvienetų oligomerizacijos reakcija“, Ląstelių biologijos žurnalas, t. 128, ne. 3, p. 283–291, 1995. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  74. I. de Curtis ir K. Simons, „Semliki Forest viruso glikoproteino pristatymo iš trans-Golgi tinklo į ląstelės paviršių permeabilizuotose BHK ląstelėse išskaidymas“, Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 85, ne. 21, p. 8052–8056, 1988. Žiūrėti: „Google Scholar“
  75. J. Green, G. Griffiths ir D. Louvard, „Virusinės membranos baltymų perėjimas per Golgi kompleksą“ Molekulinės biologijos žurnalas, t. 152, Nr. 4, p. 663–698, 1981. Žiūrėti: Google Scholar
  76. M. Sariola, J. Saraste ir E. Kuismanen, „Post-Golgi elementų bendravimas su ankstyvuoju endocitiniu keliu: Semliki miško viruso p62 pirmtako endoproteolitinio skilimo reguliavimas“. Ląstelių mokslo žurnalas, t. 108, 6 dalis, 2465–2475, 1995. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  77. A. Ziemiecki, H. Garoff ir K. Simons, „Semliki Forest viruso membraninių glikoproteinų kompleksų susidarymas užkrėstoje ląstelėje“, Bendrosios virusologijos žurnalas, t. 50, ne. 1, p. 111–123, 1980. Žiūrėti: „Google Scholar“
  78. M. Lobigs ir H.Garoffas, „Semliki Forest viruso smaigalio sintezės funkcija aktyvuojama proteolitiniu būdu skaidant apvalkalo glikoproteino pirmtaką p62“, Virusologijos žurnalas, t. 64, Nr. 3, p. 1233–1240, 1990. Žiūrėti: Google Scholar
  79. K. Metsikkö ir H. Garoff, „Semliki Forest viruso p62/E2 membraninio baltymo citoplazminio domeno oligomerai jungiasi prie nukleokapsidės in vitro“, Virusologijos žurnalas, t. 64, Nr. 10, p. 4678–4683, 1990. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  80. D. Vaux, A. Helenius ir I. Mellman: „Smeigtuko ir nukleokapsido sąveika Semliki miško viruse, rekonstruotame naudojant tinklo antikūnus“, Gamta, t. 336, Nr. 6194, p. 36–42, 1988. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  81. S. Mayor ir R. E. Pagano, „Nuo klatrino nepriklausomos endocitozės keliai“ „Nature Reviews“ molekulinė ląstelių biologija, t. 8, ne. 8, p. 603–612, 2007. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  82. A. L. Smith ir G. H. Tignor, „Dviejų Sindbis viruso padermių šeimininkų ląstelių receptoriai“, Virologijos archyvas, t. 66, Nr. 1, p. 11–26, 1980. Žiūrėti: Google Scholar
  83. K. S. Wang, A. L. Schmaljohn, R. J. Kuhn ir J. Strauss: „Antiidiotipiniai antikūnai kaip Sindbis viruso receptorių zondai“ Virologija, t. 181, Nr. 2, p. 694–702, 1991. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  84. K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, J. Strauss ir S. Ou: „Didelio afiniteto laminino receptorius yra Sindbis viruso receptorius žinduolių ląstelėse“. Virusologijos žurnalas, t. 66, Nr. 8, p. 4992–5001, 1992. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  85. W. B. Klimstra, E. M. Nangle, M. S. Smith, A. D. Yurochko ir K. D. Ryman: „DC-SIGN ir L-SIGN gali veikti kaip alfa virusų prisirišimo receptoriai ir atskirti uodų ląstelių bei žinduolių ląstelių virusus“. Virusologijos žurnalas, t. 77, ne. 22, p. 12022–12032, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  86. K. Bernard, W. B. Klimstra ir R. E. Johnston: „Venesuelos arklių encefalito viruso E2 glikoproteino mutacijos suteikia heparano sulfato sąveiką, mažą sergamumą ir greitą pelių pašalinimą iš kraujo“. Virologija, t. 276, Nr. 1, p. 93–103, 2000. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  87. M. Heil, A. Albee, J. Strauss ir R. J. Kuhn: „Aminorūgščių pakaitalas E2 glikoproteiną koduojančiame regione pritaiko Ross River virusą, kad panaudotų heparano sulfatą kaip prijungimo dalį“, Virusologijos žurnalas, t. 75, ne. 14, p. 6303–6309, 2001. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  88. W. B. Klimstra, K. D. Ryman ir R. E. Johnston, „Sindbis viruso prisitaikymas prie BHK ląstelių pasirenka naudoti heparano sulfatą kaip prijungimo receptorių“, Virusologijos žurnalas, t. 72, Nr. 9, p. 7357–7366, 1998. Žiūrėti: Google Scholar
  89. L. DeTulleo ir T. Kirchhausen, „Klatrino endocitinis kelias virusinėje infekcijoje“, EMBO žurnalas, t. 17, Nr. 16, p. 4585–4593, 1998. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  90. S. Doxsey, F. M. Brodsky, G. Blank ir A. Helenius, „Endocitozės slopinimas antiklatrininiais antikūnais“ Ląstelė, t. 50, ne. 3, p. 453–463, 1987. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  91. A. Helenius, J. Kartenbeck, K. Simons ir E. Fries, „Dėl Semliki miško viruso patekimo į BHK-21 ląsteles“ Ląstelių biologijos žurnalas, t. 84, ne. 2, p. 404–420, 1980. Žiūrėti: Google Scholar
  92. A. M. van der Bliek, T. Redelmeier, H. Damke, S. L. Schmid, E. M. Meyerowitz ir E. J. Tisdale, „Mutations in Human dinamin blokuoja tarpinį padengtų pūslelių susidarymo etapą“, Ląstelių biologijos žurnalas, t. 122, Nr. 3, p. 553–563, 1993. Žiūrėti: Google Scholar
  93. T. Baba, H. Damke, J. E. Hinshaw, D. Warnock, K. Ikeda ir S. L. Schmid, „Dinamino vaidmuo formuojant klatrinu padengtas pūsleles“ Cold Spring Harbor kiekybinės biologijos simpoziumai, t. 60, p. 235–242, 1995. Žiūrėti: „Google Scholar“
  94. H. Damke, T. Baba, D. Warnock ir S. L. Schmid: „Mutanto dinamino indukcija specifiškai blokuoja endocitiniu būdu padengtų pūslelių susidarymą“. Ląstelių biologijos žurnalas, t. 127, Nr. 4, p. 915–934, 1994. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  95. M. Sourisseau, C. Schilte, N. Casartelli ir kt., „Atsinaujinančio chikungunya viruso charakteristika“, PLoS patogenai, t. 3, Nr. 6, straipsnis e89, 2007. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  96. A. A. Kolokolcovas, E. H. Flemingas ir R. A. Davey: „Venesuelos arklių encefalito viruso patekimo mechanizmui reikia vėlyvo endosomų susidarymo ir jis priešinasi ląstelių membranos cholesterolio išeikvojimui“. Virologija, t. 347, Nr. 2, p. 333–342, 2006. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  97. C. Bucci, R. G. Parton, I. H. Mather ir kt., „Maža GTPazės rab5 veikia kaip reguliavimo veiksnys ankstyvame endocitiniame kelyje“. Ląstelė, t. 70, Nr. 5, p. 715–728, 1992. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  98. C. Bucci, P. D. Thomsen, P. Nicoziani, J. McCarthy ir B. Van Deurs, „Rab7: raktas į lizosomų biogenezę“, Ląstelių molekulinė biologija, t. 11, ne. 2, p. 467–480, 2000. Žiūrėti: Google Scholar
  99. T. M. Colpitts, A. Moore, A. A. Kolokoltsov ir R. A. Davey: „Venesuelos arklių encefalito viruso infekcija uodų ląstelėse reikalauja parūgštinimo, taip pat endocitinių baltymų Rab5 ir Rab7 uodų homologų“. Virologija, t. 369, Nr. 1, p. 78–91, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  100. S. Cassell, J. Edwards ir D. T. Brown, „Lizosomotropinių silpnųjų bazių poveikis BHK-21 ląstelių infekcijai Sindbis virusu“. Virusologijos žurnalas, t. 52, Nr. 3, p. 857–864, 1984. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  101. K. Coombsas, E. Mannas, J. Edwardsas ir D. T. Brownas, „Chlorokvino ir citochlazino B poveikis ląstelių užkrėtimui Sindbis virusu ir vezikulinio stomatito virusu“. Virusologijos žurnalas, t. 37, ne. 3, p. 1060–1065, 1981. Žiūrėti: „Google Scholar“
  102. R. Hernandezas, T. Luo ir D. T. Brownas: „Sindbis viruso skverbimasis į uodų ląsteles nereikalauja žemo pH“, Virusologijos žurnalas, t. 75, ne. 4, p. 2010–2013, 2001. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  103. A. Paredes, D. F. Ferreira, M. Horton ir kt., „Konformaciniai Sindbis virionų pokyčiai, atsirandantys dėl žemo pH poveikio ir sąveikos su ląstelėmis, rodo, kad ląstelės paviršiuje gali prasiskverbti nesant membranos suliejimo“. Virologija, t. 324, Nr. 2, p. 373–386, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  104. G. Wang, R. Hernandez, K. R. Weninger ir D. T. Brown, „Ląstelių užkrėtimas Sindbis virusu žemoje temperatūroje“, Virologija, t. 362, Nr. 2, p. 461–467, 2007. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  105. M. Marsh ir R. Bron, „SFV infekcija CHO ląstelėse: specifiniai ląstelių tipo apribojimai produktyviam viruso patekimui į ląstelės paviršių“, Ląstelių mokslo žurnalas, t. 110, 1 dalis, p. 95–103, 1997. Žiūrėti: Google Scholar
  106. T. Hase, P. L. Summers ir W. H. Cohenas: „Lyginamasis Semliki miško Japonijos encefalito virusų patekimo į C 6/36 ląsteles tyrimas“, Virologijos archyvas, t. 108, Nr. 1-2, p. 101-114, 1989. Žiūrėti: Google Scholar
  107. E. A. Bernard, M. Solignat, B. Gay ir kt., „Chikungunya viruso endocitozė į žinduolių ląsteles: klatrino ir ankstyvųjų endosominių skyrių vaidmuo“ PLoS One, t. 5, ne. 7, Straipsnio ID e11479, 2010. Peržiūrėti: Leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  108. M. Kielian ir A. Helenius, „pH sukeltos Semliki Forest viruso fuzogeninio smaigalio baltymo pakitimai“, Ląstelių biologijos žurnalas, t. 101, ne. 6, p. 2284–2291, 1985. Žiūrėti: „Google Scholar“
  109. J. Justmanas, M. R. Klimjackas ir M. Kielianas, „Smailių baltymų konformacinių pokyčių vaidmuo Semliki Forest viruso sintezėje“, Virusologijos žurnalas, t. 67, ne. 12, p. 7597–7607, 1993. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  110. M. A. Sanz, M. T. Rejas ir L. Carrasco, „Individuali Sindbis viruso glikoproteinų ekspresija. Vien tik E1 skatina ląstelių suliejimą “. Virologija, t. 305, Nr. 2, p. 463–472, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  111. C. Spyr, F. Käsermann ir C. Kempf, „Semliki Forest viruso šuolių porų formavimo elemento identifikavimas“, FEBS laiškai, t. 375, Nr. 1-2, p. 134–136, 1995. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  112. R. Bron, J. Wahlberg, H. Garoff ir J. Wilschut, „Semliki Forest viruso membranos sintezė modelio sistemoje: koreliacija tarp sintezės kinetikos ir apvalkalo glikoproteino struktūrinių pokyčių“, EMBO žurnalas, t. 12, ne. 2, p. 693–701, 1993. Žiūrėti: Google Scholar
  113. M. R. Klimjack, S. Jeffrey ir M. Kielian, „Tirpios Semliki Forest viruso sulietos formos membranos ir baltymų sąveika“, Virusologijos žurnalas, t. 68, ne. 11, p. 6940–6946, 1994. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  114. J. M. Smitas, R. Bittmanas ir J. Wilschutas: „Nuo žemo pH priklausomas Sindbis viruso suliejimas su cholesterolio ir sfingolipidų turinčiomis liposomomis be receptorių“. Virusologijos žurnalas, t. 73, ne. 10, 8476–8484, 1999. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  115. J. White ir A. Helenius, „Nuo pH priklausanti Semliki miško viruso membranos ir liposomų sintezė“, Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 77, ne. 6, p. 3273–3277, 1980. Žiūrėti: Google Scholar
  116. J. Wahlberg, R. Bron, J. Wilschut ir H. Garoff, „Semliki miško viruso membranos sintezė apima sulieto baltymo homotrimerius“. Virusologijos žurnalas, t. 66, Nr. 12, p. 7309–7318, 1992. Žiūrėti: Google Scholar
  117. J. Wahlberg ir H. Garoff, „Semliki miško viruso I membranos suliejimo procesas: mažas pH sukeltas smaigalinių baltymų ketvirtinės struktūros pertvarkymas prieš viruso įsiskverbimą į ląsteles“. Ląstelių biologijos žurnalas, t. 116, Nr. 2, p. 339–348, 1992. Žiūrėti: Google Scholar
  118. M. Lanzrein, R. Weingart ir C. Kempf, „nuo PH priklausomas porų susidarymas Semliki miško virusu užkrėstose Aedes albopictus ląstelėse“ Virologija, t. 193, Nr. 1, p. 296–302, 1993. Žiūrėti: Leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  119. A. Schlegel, A. Omar, P. Jentsch, C. Kempf ir A. Morell: „Semliki Forest viruso apvalkalo baltymai veikia kaip protonų kanalai“. Bioscience Reports, t. 11, ne. 5, p. 243–255, 1991. Žiūrėti: „Google Scholar“
  120. A. Helenius, M. Marsh ir J. M. White: „Semliki miško viruso įsiskverbimo slopinimas lizosomotropinėmis silpnomis bazėmis“ Bendrosios virusologijos žurnalas, t. 58, ne. 1, p. 47–61, 1982. Žiūrėti: „Google Scholar“
  121. M. Marsh, J. Wellsteed ir H. Kern: „Monensinas slopina Semliki miško viruso įsiskverbimą į kultūros ląsteles“. Jungtinių Amerikos Valstijų Nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. 79, ne. 17, p. 5297–5301, 1982. Žiūrėti: Google Scholar
  122. T. Phalen ir M. Kielian: „Cholesterolis reikalingas infekcijai Semliki miško virusu“, Ląstelių biologijos žurnalas, t. 112, Nr. 4, p. 615–623, 1991. Žiūrėti: „Google Scholar“
  123. J. Wilschut, J. Corver, J. L. Nieva ir kt., „Semliki Forest viruso susiliejimas su cholesterolio turinčiomis liposomomis esant žemam pH: specifinis reikalavimas sfingolipidams“, Molekulinė membranos biologija, t. 12, ne. 1, p. 143–149, 1995. Žiūrėti: Google Scholar
  124. A. Ahn, D. L. Gibbons ir M. Kielian, „Semliki Forest viruso sulietas peptidas yra susijęs su daug sterolių turinčiomis membranų sritimis“. Virusologijos žurnalas, t. 76, Nr. 7, p. 3267–3275, 2002. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  125. Y. E. Lu, T. Cassese ir M. Kielian: „Cholesterolio reikalavimas sindis virusui patekti ir išeiti bei apibūdinti smaigalių baltymų regioną, susijusį su priklausomybe nuo cholesterolio“. Virusologijos žurnalas, t. 73, ne. 5, p. 4272–4278, 1999. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  126. J. L. Nieva, R. Bron, J. Corver ir J. Wilschut, „Semliki Forest viruso membranos sintezei reikia sfingolipidų tikslinėje membranoje“, EMBO žurnalas, t. 13, Nr. 12, p. 2797–2804, 1994. Žiūrėti: Google Scholar
  127. M. Kielian ir A. Helenius, „Cholesterolio vaidmuo susiliejant su Semliki miško virusu su membranomis“ Virusologijos žurnalas, t. 52, Nr. 1, p. 281–283, 1984. Peržiūrėti: „Google Scholar“
  128. P. K. Chatterjee, M. Vashishtha ir M. Kielian: „Biocheminės mutacijos pasekmės, kontroliuojančios Semliki miško viruso sintezės priklausomybę nuo cholesterolio“, Virusologijos žurnalas, t. 74, Nr. 4, p. 1623–1631, 2000. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  129. M. Vashishtha, T. Phalen, M. T. Marquardt, J. S. Ryu, M. Kielian ir A. C. Ng: „Vieno taško mutacija kontroliuoja Semliki miško viruso patekimo ir išėjimo priklausomybę nuo cholesterolio“. Ląstelių biologijos žurnalas, t. 140, ne. 1, p. 91–99, 1998. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  130. W. H. Evans ir W. G. Hardison, „Kepenų endosomų subfrakcijų fosfolipidų, cholesterolio, polipeptidų ir glikoproteinų sudėtis“, Biocheminis žurnalas, t. 232, Nr. 1, p. 33–36, 1985. Žiūrėti: „Google Scholar“
  131. T. Kobayashi, M. H. Beuchat, J. Chevallier ir kt., „Vėlyvųjų endosomų membranų domenų atskyrimas ir apibūdinimas“ Biologinės chemijos žurnalas, t. 277, Nr. 35, p. 32157–32164, 2002. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  132. G. Wengleris, A. Koschinskis, G. Wengleris ir H. Reppas: „Įeinant į alfa virusus, E1 glikoproteinų molekulės tikriausiai sudaro dvi atskiras populiacijas, kurios sukuria arba susiliejančias poras, arba jonus pralaidžias poras“. Bendrosios virusologijos žurnalas, t. 85, ne. 6, p. 1695–1701, 2004. Žiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  133. K. C. Duff ir R. H. Ashley: „Gripo A M2 baltymo transmembraninis domenas sudaro amantadinui jautrius protonų kanalus plokščiuose lipidų dvisluoksniuose sluoksniuose“, Virologija, t. 190, ne. 1, p. 485–489, 1992. Peržiūrėti: leidėjo svetainėje | „Google Scholar“
  134. M. Dickas, B. U. Barthas ir C. Kempfas: „E1 baltymas yra privalomas Semliki miško viruso spygliams susidaryti poroms“, Virologija, t. 220, ne. 1, p. 204–207, 1996. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  135. G. Wengler, A. Koschinski, G. Wengler ir F. Dreyer, „Alfavirusų patekimas į plazmos membraną paverčia viruso paviršiaus baltymus į jonams pralaidžias poras, kurias galima aptikti atliekant elektrofiziologinę visos ląstelės membranos srovių analizę“. Bendrosios virusologijos žurnalas, t. 84, ne. 1, p. 173–181, 2003. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  136. G. Wengleris ir G. Wengleris, „In vitro veiksnių, susijusių su Sindbis viruso šerdies išardymu 60S ribosomų subvienetais, analizė nustato galimą žemo pH vaidmenį“, Bendrosios virusologijos žurnalas, t. 83, 10 dalis, p. 2417–2426, 2002. Žiūrėti adresu: Google Scholar
  137. I. R. Singhas ir A. Helenius, „Ribosomų vaidmuo Semliki miško viruso nukleokapsidės padengime“, Virusologijos žurnalas, t. 66, Nr. 12, p. 7049–7058, 1992. Žiūrėti: Google Scholar
  138. I. Ulmanen, H. Söderlund ir L. Kääriäinen, „Semliki miško viruso kapsido baltymas asocijuojasi su 60S ribosominiu subvienetu užkrėstose ląstelėse“. Virusologijos žurnalas, t. 20, Nr. 1, p. 203–210, 1976. Žiūrėti: „Google Scholar“
  139. G. Wengleris, D. Wurkneris ir G. Wengleris „Alfaviruso šerdies baltymo sekos elemento identifikavimas, kuris tarpininkauja šerdies sąveikai su ribosomomis ir šerdies išardymui“, Virologija, t. 191, Nr. 2, p. 880–888, 1992. Žiūrėti: leidėjo svetainė | „Google Scholar“
  140. M. Solignat, B. Gay, S. Higgs ir kt., „Chikungunya replikacijos ciklas: vėl atsirandantis arbovirusas“ Virologija, t. 393, Nr. 2, p. 183–197, 2009. Žiūrėti: Google Scholar
  141. C. Lamaze, A. Dujeancourt, T. Baba ir kt., „Interleukino 2 receptoriai ir plovikliams atsparios membranos domenai apibrėžia nuo klatrino nepriklausomą endocitinį kelią“. Molekulinė ląstelė, t. 7, ne. 3, p. 661–671, 2001. Žiūrėti: Google Scholar

Autorių teisės

Autorių teisės © 2011 Jason Yat-Sing Leung ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License, kuris leidžia neribotai naudoti, platinti ir dauginti bet kokioje laikmenoje, jei originalus darbas yra tinkamai cituojamas.


Autorių informacija

1 apžvalgininko ataskaita: Eugene'as Kooninas (Nacionalinis biotechnologijų informacijos centras, JAV)

Tai tikrai įdomus dokumentas, kuriame pranešama apie visiškai netikėto subjekto atradimą, akivaizdų hibridą tarp ssDNA viruso, susijusio su cirovirusais, ir RNR viruso, susijusio su tombusvirusais. Šis atradimas kelia didelį susidomėjimą dviem lygiais.Pirma, mano žiniomis, tokia chimera tarp RNR ir DNR virusų - ne tik šių konkrečių šeimų, bet ir apskritai - niekada nebuvo pastebėta. Žinoma, virusų pasaulyje yra daug maišymo ir derinimo pavyzdžių, bet kažkodėl iki šiol jie apsiribojo tos pačios rūšies nukleino rūgštimis. Antra, šis darbas pabrėžia naują virusologijos atradimo kelią - metagenominį kelią. Tai tiesiogine žvejybos ekspedicija su visais privalumais ir trūkumais. Pagrindinis privalumas yra gebėjimas atrasti iš esmės viską, kas yra „ten“, net ir esant mažam jų kiekiui, nereikalaujant sudėtingų ir šališkų virusų ir šeimininkų augimo procedūrų. Tačiau čia taip pat yra griežtas metagenomikos apribojimas: nei šeimininkas, nei griežtai kalbant, virusas nėra identifikuojamas pagal įprastus mikrobiologijos ir virusologijos standartus. Bet kokiu atveju, bet ypač kai buvo atrasta keista chimera, labai svarbu kuo įtikinamiau parodyti, kad pateikta seka iš tikrųjų yra viruso genomas, o ne koks nors surinkimo artefaktas ar chimerinis klonas. Manau, kad šiame dokumente tai daroma patenkinamai, naudojant atvirkštinį PGR iš nepriklausomo aplinkos mėginio. Taigi manau, kad tai tikras virusas. Be to, pastebėtina, kad artimiausi tiek Rep baltymo, tiek kapsido baltymo homologai buvo aptikti kituose metagenominiuose mėginiuose, iš GOS. Labai įdomu, ar tai yra tos pačios rūšies chimeriniai genomai, ar siūlomas RNR-DNR rekombinacijos įvykis yra palyginti neseniai, o šie kaimynai yra artimiausi giminaičiai iš atitinkamų RNR ir DNR virusų šeimų. Išleidus BSL-RDHV genomą, tai neturėtų būti per sunku patikrinti. Žvelgiant bendresne prasme, negalima susimąstyti, kiek tokių netikėtų virusų pasaulio stebuklų laukia įvairiausiose aplinkose, o praktiškiau – ar greitai pasikeis naujo viruso atpažinimo kriterijai.

Turiu keletą nedidelių specifinių problemų su straipsniu. Pavadinimas gali būti suprantamas kaip šiek tiek klaidinantis, nes atrodo, kad „evoliucinis ryšys“ reiškia, kad ssDNR virusas (-ai) išsivystė iš ssRNR viruso (-ų) arba atvirkščiai. Siūlyčiau paminėti chimerinį genomą pačiame pavadinime.

Autoriaus atsakymas : Pavadinimas peržiūrėtas.

Mane nustebino 3 paveiksle naudojama medžių kūrimo metodika („grubių klasterių kladogramos“). Kodėl naudoti šį neapdorotą metodą, o ne įprastą didžiausios tikimybės metodą (RaxML), o gal net ir Bajeso metodą? Nesitikiu, kad rezultatas kardinaliai pasikeis, bet naujasis virusas yra pakankamai įdomus ir neįprastas, kad būtų galima dėti pagrįstas pastangas, kad filogenetinė analizė būtų kuo patikimesnė.

Autoriaus atsakymas : Šis skyrius buvo peržiūrėtas ir pateikiami daug platesni lygiavimai bei atlikta filogenetinė analizė (paveikslai 3 , 4 ir 6 ).

Manau, kad apskrito ssDNA viruso, kuris, matyt, yra BSL-RDHV, ir ssRNA tombusvirusų, genomo organizavimo panašumas yra gana keistas. Ar panašumas su cirkovirusais nėra daug aiškesnis? Man tai atrodo kaip cirkovirusas, kuriame baltymas iš kapsidės buvo išstumtas iš į kapą panašaus viruso.

Autoriaus atsakymas : Tai buvo peržiūrėta visame tekste. Tačiau mes manome, kad genomo išdėstymas ryškiai skiriasi nuo daugumos cirkovirusų, todėl išlaikė paveikslą1.

2 apžvalgininko ataskaita: Dr Mart Krupovic (iškėlė dr. Patrick Forterre) (Pasteur institutas, Prancūzija):

Diemeris ir Stedmanas praneša apie tariamo viruso genomo apibūdinimą, kuris buvo gautas atliekant Boiling Springs ežere surinktų viromų mėginių metagenominę analizę. Tariamas viruso genomas (BSL-RDHV) koduoja keturis baltymus, iš kurių dviejų seka yra panaši į anksčiau apibūdintų virusų baltymus. Vienas iš šių baltymų yra susijęs su tipiškais II šeimos šeimos riedėjimo rato replikacijos iniciacijos baltymais, kurie yra gausiai randami DNR virusuose ir plazmidėse. Stebina tai, kad kitas yra labiausiai panašus į eukariotinių ikosaedrinių teigiamų jausmų RNR virusų kapsidinius baltymus. Stebėjimas, kad dviejų pagrindinių virusinių funkcijų - virionų susidarymo ir genomo replikacijos - genai, matyt, yra kilę iš nesusijusių RNR ir DNR virusų/replikų, kad susidarytų naujas chimerinis virusinis darinys, yra įdomus, nors ir ne visiškai naujas (žr. Toliau). Šiame dokumente pateiktos išvados iš esmės skatina mūsų supratimą ne tik apie genetinę įvairovę virosferoje, bet ir apie galimus mechanizmus, atsakingus už naujų virusų tipų atsiradimą. Todėl manau, kad leidinys tikrai vertas leidimo. Tačiau kai kurias rankraščio dalis dar galima patobulinti, kaip aprašyta toliau.

Pagrindas: šią skiltį sudaro penkios eilutės, kuriose giriamas metagenomikos naudingumas tiriant viruso evoliuciją, po kurių seka kelios pastraipos, kurios labiau primena rezultatus, o ne įvadą. Atsižvelgiant į tai, kad dokumente kalbama apie virusų evoliuciją, skyriuje „Fonas“ galima pateikti tam tikros informacijos apie dabartines hipotezes apie virusų kilmę ir jų evoliucijos mechanizmus. Tai leistų skaitytojams geriau suprasti rezultatų skyriuje pateiktų išvadų svarbą. Autoriams gali būti naudingos naujausios apžvalgos šia tema (Koonin ir Dolja, 2011 Krupovic ir kt., 2011 Forterre ir Prangishvili, 2009). Dolja VV, Koonin EV: Bendra augalų ir gyvūnų viromų kilmė ir nuo šeimininko priklausoma įvairovė. Curr Opin Virol 2011, 1 (5): 322–31. Krupovic M, Prangishvili D, Hendrix RW, Bamford DH: Bakterijų ir archeologinių virusų genomika: dinamika prokariotinėje virosferoje. Microbiol Mol Biol Rev 2011, 75 (4): 610–35. Forterre P, Prangishvili D: Virusų kilmė. Res Microbiol 2009, 160 (7): 466–72.

Autoriaus atsakymas : Šis skyrius buvo plačiai peržiūrėtas.

Rezultatai: I. Kapsido baltymas: BSL-RDHV kapsidės baltymo panašumas į RNR virusų panašumą atrodo labai reikšmingas (ypač sklerophthora macrospora A viruso CP). Tačiau panašumas apsiriboja RNR viruso CP domenais S ir P, kurie apima tik centrinį BSL-RDHV kapsido baltymo regioną (156–302 liekanos). BSL-RDHV yra 542 aa. Ar autoriai galėtų pakomentuoti BSL-RDHV CP N ir C galinius regionus, kurie nerodomi S1 paveiksle pateiktame derinime?

Autoriaus atsakymas : Mes peržiūrėjome tekstą, kad aptartume šiuos aspektus, ir įtraukėme BLASTp įvykių lenteles ir išsamius derinimus (pav 2 6 ).

Ar šių regionų sekos yra panašios į duomenų bazių baltymus? Kokia jų numatoma antrinė struktūra? Ar jie gali būti sujungti į nepriklausomas funkcines sritis? Kaip tai gali paveikti kapsidų susidarymą? Be to, autoriai turėtų pateikti daugiau informacijos apie Sclerophthora macrospora virusą A (SmV-A) ir Plasmopara halstedii A virusą (PhV-A), abu virusai turi didžiausią sekų panašumą su BSL-RDHV CP. Neužtenka pasakyti, kad jie yra neklasifikuojami ssRNR virusai. Pavyzdžiui, koks yra SmV-A ir PhV-A šeimininkų diapazonas (jei žinomas), koks yra šių virusų ir tembusvirusų genominis ryšys ir kt.

Autoriaus atsakymas : Šis skyrius taip pat buvo peržiūrėtas ir tikimės, kad šis darbas paskatins nepakankamai tirtų SmV-A ir PhV-A virusų tyrimus, nes jie taip pat gali suteikti informacijos apie BSL RDHV tipo virusų genomų susidarymo mechanizmą.

Galbūt ši informacija gali suteikti užuominų apie BSL-RDHV kilmę? S-P domeno organizacija nėra būdinga visiems ikosaedriniams (+) ssRNR virusams. Informacija apie tai, kaip plačiai paplitusi ši CP architektūra tarp RNR virusų, būtų labai įdomi. Ar jis randamas tik Tombusviridae ir keliuose neklasifikuojamuose virusuose?

Autoriaus atsakymas : Ši SS konfigūracija yra žinoma ir pademonstruota tik rentgeno kristalografijos būdu „į karmovirusą panašioje“ Tombusviridae grupėje.

Iš derinimo (S1 pav.) Atrodo, kad S domenas yra žymiai labiau išsaugotas tarp BSL-RDHV ir tombusvirusų. Ar tas pats pasakytina, kai BSL-RDHV CP lyginamas tik su SmV-A ir PhV-A?

Autoriaus atsakymas : Kaip ir aukščiau, šis skyrius buvo gerokai peržiūrėtas.

Be to, SP organizacija nėra vadinama „dvigubos želė ritinėlio konfigūracija“, kaip teigia autoriai 5 puslapyje. Dvigubo želė ritinio raukšlė randama įvairiuose dsDNR virusuose ir struktūriškai visiškai skiriasi nuo tombusvirusų CP (Krupovic ir Bamford) , 2008). Krupovic M, Bamford DH: Viruso evoliucija: kiek tęsiasi dvigubos beta statinės viruso linija? Nat Rev Microbiol 2008, 6 (12): 941–8.

Autoriaus atsakymas : Tai ištaisyta.

Be to, 2A paveiksle esantis CP modelio Qres dažymas nėra labai prasmingas ir gali būti pašalintas.

Autoriaus atsakymas : Mes nustatėme, kad kadangi suderinimas nerodo didelio aminorūgščių sekų panašumo į CP baltymų P sritį, reikalingas struktūrinis įvertinimas, siekiant geriau pagrįsti teiginius apie BSL ir SP tipo CP tarpvandeninį perkėlimą ir homologiją. tombusvirusų. Tai, kad struktūrinis suderinamumas apima visą struktūrą, geriausiai parodo Qres balas.

II. Rep baltymas: autoriai galėtų trumpai pristatyti riedėjimo rato replikacijos inicijavimo baltymus (RCR Reps). „RCR Reps“ yra trys konservuoti motyvai (ne tik aktyvioji Tyr vieta): „Ilyina TV“, „Koonin EV“: konservuotų sekų motyvai iniciatoriaus baltymuose, skirti sukimosi apskritimo DNR replikacijai, užkoduotiems įvairių replikonų iš eubakterijų, eukariotų ir archebakterijų. Nucleic Acids Res 1992, 20(13):3279-85. Ar visi trys motyvai yra išsaugoti BSL-RDHV? S2 paveiksle pavaizduotas derinimas tarp BSL-RDHV ir PCV2 RCR Reps nukleazės domenų (beje, legenda neatitinka šio paveikslo). Galima būtų palyginti labiau įtraukiantį RCR pakartojimų rinkinį (ir ne tik nukleazės, bet ir helikazės domeno atžvilgiu).

Autoriaus atsakymas : Žr. pataisytą paveikslą6.

Be to, tai, kad prieš Rep geną yra stiebo kilpa, nebūtinai rodo, kad virione esantis BSL-RDHV genomas yra vienagrandė (6 psl., antra pastraipa). dsDNR virusai replikacijai taip pat naudoja RCR Reps (pvz., kortikovirusas PM2).

Autoriaus atsakymas : Nors tai visiškai neatmeta galimybės, kad BSL RDHV virusas turi dvigrandį genomą virione, stiebo kilpa, sekos panašumas į PCV Rep ir Rep struktūrinis įvertinimas aiškiai rodo viengrandį. į cirkovirusą panašus genomas ir replikacijos ciklas. Kol negalima gaminti virionų ir išgauti DNR analizei, to negalima galutinai parodyti. Vykdomi eksperimentai, skirti aptikti ssDNR BSL mėginiuose. Be to, nebuvo aptiktas aptinkamas BSL / cirkoviruso ir PM2 Rep sekų panašumas, o tarp BSL ir PM2 replikacijos pradžios nebuvo aptiktas nukleorūgščių sekų panašumas, o tai rodo, kad BSL virusas greičiausiai nėra susijęs su PM2 kortikovirusu.

III. Medžiai: siūlau pakeisti grubiai susitelkusius medžius (3 pav.) atitinkamais išlyginimais, nes tokie medžiai nėra labai prasmingi. 3A paveiksle pavaizduotas BSL-RDHV, tombusvirusų, palydovinių virusų, geminivirusų ir nanovirusų CP medis. Autoriai teigia, kad BSL-RDHV susitelkia su tombusvirusais, „išskyrus kapsidų baltymus, randamus ssDNR augalus užkrečiančiuose virusuose, kurie taip pat koduoja Rep“. Nė vienas iš šių kitų baltymų (apie kuriuos yra informacijos apie struktūrą) neturi S ir P domenų, o informacija apie nanoviruso CP, mano žiniomis, apskritai nėra. Todėl nėra prasmės dėti tų pačių medžio baltymų, kurie gali būti net nehomologiški. Panašiai ir 3B paveiksle, kuriame parodytas RCR Reps medis – mikrovirusų ir cirkovirusų Reps panašumas apsiriboja trimis nukleazės domeno motyvais (mikrovirusinis Rep taip pat neturi helikazės domeno). Papildomi failai 2 („Blast“ balai) ir 3 (prisijungimo numeriai) turėtų būti sujungti. Taip pat būtų naudinga, jei autoriai galėtų lentelę papildyti porinėmis tapatybės reikšmėmis.

Autoriaus atsakymas : Tai buvo padaryta.

Išvados: „...RNR-DNR rekombinacija buvo tik numanoma“: Galbūt čia būtų galima paminėti, kad neseniai įvairių eukariotinių šeimininkų genomuose buvo aptikta daugybė RNR viruso genomų (iš skirtingų šeimų), o tai rodo, kad RNR-DNR rekombinacija gali būti nėra toks neįprastas, kaip manyta anksčiau.

Autoriaus atsakymas : Tai buvo pridėta ir žr. autoriaus atsakymą į apžvalgininką 3.

Autoriai atkreipia dėmesį į „kad šoninis kapsido genų perkėlimas įvyko tarp ssRNR palydovinių virusų protėvio ir apskrito, ssDNA geminiviruso ar nanoviruso infekcijos metu [32]“. Tačiau nuorodoje [32] buvo pasiūlyta, kad geminivirusai atsirado iš fitopatogeninių bakterijų (fitoplazmos) plazmidžių, gaudami kapsidą koduojantį geną iš augalus užkrečiančio RNR viruso, ty įvyko rekombinacija tarp dviejų nesusijusių DNR (plazmidės) ir RNR. (viruso) replikonus, kad atsirastų naujas elementas - geminivirusų protėvis. Teiginys, kad „ssRNR palydovinio viruso kapsidės baltymai randami tik didelių ir gerai apibūdintų Geminiviridae ir Nanoviridae šeimų ssDNA genomuose“, taip pat nepalaikomas: (i) nėra įrodymų, kad nanovirusinis CP priima želė ritinėlį tai tikriausiai tiesa), (ii) tarp DNR virusų ši raukšlė neapsiriboja geminivirusais, nes taip pat randama parvovirusų ir mikrovirusų (ir tam tikrų dsDNR virusų) CP, iii) svarbiausia, kad vieno želė ritinio raukšlė yra labiausiai plačiai paplitę virusuose su RNR genomais (12 skirtingų šeimų!). Pasiūlymas, kad „ssRNR palydoviniai virusai greičiausiai savo kapsidinius baltymus įgijo iš gemininių ir nanovirusų“, neturi pagrindo. Tai, kad „palydoviniai, gemininiai ir nanovirusai dažnai užkrėsta tais pačiais šeimininkais“, savaime nėra įrodymas, ypač turint omenyje, kad pagrindinis ssRNR palydovinių virusų infekcijos partneris yra kiti ssRNR virusai (su želė ritinio CP).

Autoriaus atsakymas : Mes nusprendėme pašalinti šį konkretų pavyzdį kaip galimą tarpvirusinės RNR-DNR rekombinacijos precedentą, nes Krupovic ir kt., 2009 m. Pareikšti teiginiai dar nebuvo pagrįsti. Mes sutinkame, kad pati želė ritinio raukšlė tikriausiai atsirado iš RNR virusų ir kad CP geno filogenija rodo bendrą RNR palydovo, DNR gemino ir nanoviruso protėvių kilmę. Tačiau teiginys, kad geminų ir nanovirusų CP buvo tiesiogiai ir neseniai gauti iš RNR palydovo tipo viruso, yra spėliojamas. Nors ištirti želė ritinio raukšlės evoliucines trajektorijas ir nustatyti jo galutinę kilmę DNR virusų grupėse yra tikrai intriguojanti perspektyva, tačiau tokios pastangos neapima šios ataskaitos.

Autoriai teikia pirmenybę scenarijui, pagal kurį „kapsido genas buvo perkeltas iš ssRNR viruso į ssDNA virusą tariamos RDHV šeimos pirmtake“. Tačiau ar autoriai gali būti tikri, kad RDHV protėvio kilmė buvo virusas, o ne plazmidė? Iš esmės į tombusvirusą panašaus kapsido geno akceptorius galėjo būti bet koks replikonas (pvz., Plazmidė), turintis į cirkovirusą panašų RCR atstovą. Be to, plazmidės taip pat galėjo būti ciroviruso kilmė nurodė anksčiau.

Autoriaus atsakymas : BSL Rep baltymų seka mažai primena plazmidę Reps, tuo pačiu parodydama esminį panašumą į į cirovirusą panašius Reps. Jei nėra kitų neapibūdintų plazmidžių su į cirovirusą panašiais Reps, duomenys rodo, kad labiau tikėtina, kad rekombinacija įvyko į cirkovirusą panašus genomas. Nors galima įsivaizduoti, kad cirkovirusai galiausiai atsirado iš plazmidžių, mažas BSL RDHV Rep, CP ir kitų susijusių baltymų sekų skirtumas rodo, kad CP baltymą neseniai įsigijo jau į cirkovirusą panašus protėvis. Alternatyviai hipotezei būtų reikalinga konvergencinė BSL ir į tombusvirusą panašių CP evoliucija, kurią laikome labai mažai tikėtina.

Paskutinė išvadų pastraipa: Mano nuomone, per daug teigiama, kad šiame dokumente pateiktos pastabos rodo virusų perėjimą iš RNR pasaulio į DNR pasaulį.

Autoriaus atsakymas : Ši išvados dalis buvo pakeista, kad būtų aiškiau, tačiau norime patvirtinti savo nuomonių skirtumą šiuo klausimu.

Tačiau aš tikrai sutinku, kad išvados „išplečia modulinę viruso evoliucijos teoriją, kad apimtų daug daugiau galimybių“. Man taip pat įdomu apie tokius chimerinius virusus, kaip jų atradimas gali paveikti mūsų požiūrį į virusų kilmės laiko juostą, taip pat mūsų bandymus sukurti aukštesnį virusų klasifikacijos lygį. Dažnai manoma, kad virusai atsirado maždaug tuo pačiu metu arba net anksčiau nei ląsteliniai organizmai, o galimybė, kad šiuolaikinėje biosferoje gali atsirasti naujų virusų grupių, retai diskutuojama. Remdamiesi Koonino ir Iljinos (1992) hipoteze, mes pasiūlėme, kad geminivirusai galėtų būti viena iš tokių „naujų“ virusų grupių [32]. Koonin EV, Ilyina TV: Geminiviruso replikacijos baltymai yra susiję su prokariotiniais plazmidės riedėjimo ratu DNR replikacijos iniciatorių baltymais. J Gen Virol 1992, 73:2763–6. RDHV gali būti dar įtikinamesnis pavyzdys, patvirtinantis nuolatinį naujų virusų grupių atsiradimą iš jau egzistuojančių mobiliųjų genetinių elementų (virusų ir plazmidžių).

Autoriaus atsakymas : Mes labai sutinkame su jūsų vertinimu.

Aukštesnės eilės virusų klasifikacijai aš asmeniškai pritariu į kapsidę orientuotam požiūriui (Krupovic ir Bamford, 2009, 2010), pagal kurį virionų architektūrą lemiantys veiksniai yra paveldimi tam tikroje virusų grupėje iš jų bendro protėvio, o genetinis veiksnys lemia kitas funkcines moduliai (pvz., genomo replikacijos baltymams) gana laisvai juda į šiuos viruso genomus ir iš jų. Kitaip tariant, funkcinių modulių judėjimas vyksta, palyginti su kapsidus koduojančiais genais. Krupovic M, Bamford DH: Ar virusinių polimerazių raida atspindi virusų kilmę ir evoliuciją? Nat Rev Microbiol 2009, 7 (3): 250. Krupovic M, Bamford DH: užsakymas virusinei visatai. J Virol 2010, 84 (24): 12476–9. Priešingai, remiantis kita mintimi, skirtingi funkciniai virusų genomų moduliai nusipelno vienodo svorio, kai kalbama apie ryšius tarp virusų: Koonin EV, Wolf YI, Nagasaki K, Dolja VV: The complexity of virus world. Nat Rev Microbiol 2009, 7 (3): 250. Lawrence JG, Hatfull GF, Hendrix RW: Virusinės taksonomijos įtrūkimai: genetiniai mainai ir fenetinių metodų trūkumai.J Bacteriol 2002, 184 (17): 4891–905. Todėl, atsižvelgiant į požiūrį, RDHV gali būti laikomas tombusvirusų giminaičiu, kurio pradinė genomo replikacijos mašina (RdRp) buvo pakeista RCR Rep genu. Kita vertus, tai taip pat gali būti vertinama kaip cirovirusas, kuriame protėvių CP genas buvo pakeistas tombusviruso genu. Ką autoriai mano apie RDHV ir kitų chimerinių virusų, kurie greičiausiai bus atrasti ateityje, klasifikaciją (ir priklausomybę esamiems virusiniams taksonams)?

Autoriaus atsakymas : Šiuos dalykus labai įdomu apsvarstyti ir šis komentaras yra labai vertinamas. Pirma, tolesnis metagenomikos naudojimas žada turėti didelį poveikį dabartinėms virusų taksonomijos schemoms. Mes galime tik spėlioti, kokį poveikį šiems taksonominiams pagrindams turės BSL RDHV virusas ir jo artimieji. Antra, šis klausimas, susijęs su „Rep“ ir „CP“ modulių trajektorijomis, iškelia svarbų klausimą apie linijinių ir apskritųjų ssDNA virusų kilmę. Mažai tikėtina, kad į BSL RDHV panašus genomas palaipsniui išsivystė iš RdRp turinčio RNR viruso. Tačiau nuomonė, kad linijiniai ir apskriti ssDNR virusai pirmiausia išsivystė iš ssRNR virusų, pirmiausia paverčiant juos DNR, o paskui įsigyjant RCRE domeną (Rep S3H domenas taip pat yra gautas iš RNR viruso), priešingai. neabejotinai, kad ji atsirado daugiausia per modulinius mainus, tai tikrai verta tyrimo tema.

3 apžvalgininko ataskaita: Dr. Arcady Mushegian (Kanzaso universiteto medicinos mokykla, JAV)

Diemerio ir Stedmano rankraštyje teigiama, kad egzistuoja naujas virusas, kuriam būdingas žiedinis vienos grandinės DNR genomas ir nauja dviejų genų konfigūracija, ty 1. nanoviruso arba cirkoviruso tipo replikacijos baltymas su įprastiniu numatomu DNR nikavimu ir NTPazės domenai ir 2. želė ritinėlio kapsidės baltymas, aiškiai susijęs su teigiamų grandinių RNR virusų (tombusvirudae) ir dviejų neklasifikuotų grybelių RNR virusų kapsidiniais baltymais. Eksperimentai rodo, kad metagenominiame mėginyje iš karšto ežero yra visas apskritas genomas ir kad panašūs genomai greičiausiai egzistuoja vandenyno mėginiuose (tuo atveju jų apskrita forma nebuvo parodyta, bet greičiausiai bus). Tai žavus naujos virusų grupės atradimas, rodantis senovinį genetinės medžiagos mainų tarp RNR ir DNR viruso genomų aktą. Visiškai palaikau šio tyrimo paskelbimą, bet turiu paprašyti, kad kai kurie platesni teiginiai dokumente būtų pakoreguoti, kad būtų geriau sutikti su įrodymais. Santrauka: „mažai žinoma apie jų kolektyvinę kilmę ir evoliucijos istoriją“-žr. Kitą komentarą. Ten pat „Šiuo metu neįmanoma nustatyti, ar pagrindinės virusų grupės atsirado nepriklausomai, ar jos turi bendrą evoliucijos istoriją“-hipotezė, kad RNR virusai atsirado dar prieš DNR genomų atsiradimą, kai buvo sukurti baltymų koduojantys genomai. RNR, nėra nepagrįsta. Tai reikštų nepriklausomą ar bent jau laiko atžvilgiu atskirą DNR ir RNR viruso genomų kilmę. Todėl pirmame sakinyje esantis žodis „kolektyvas“ sunkiai pakelia, ko tikriausiai neturėtų. Kita vertus, retrotranskribuojantys virusai ir RNR virusai, atrodo, tenkina bet kurį dviejų „pagrindinių virusų grupių“ apibrėžimą, tačiau yra daug įrodymų, kad jie turi bendrą evoliucijos istoriją, bent jau jų replikacijos fermentą.

Autoriaus atsakymas : Šis skyrius buvo plačiai peržiūrėtas.

Ten pat. "dar nenustatytas joks RNR-DNR rekombinacijos mechanizmas" --- o kaip dėl II grupės intronų retrohomingo?

Autoriaus atsakymas : Prie išvadų skyriaus buvo pridėta ši ištrauka, pagrįsta Mushegiano ir Krupovičiaus pasiūlymais: „Ne retrovirusinių RNR viruso genų buvimas ląstelių genomuose.[61–66]] rodo, kad egzistuoja koks nors ląstelių mechanizmas, leidžiantis RNR-DNR rekombinaciją vietoj viruso gauto RT. Nors II grupės introno retro-homing reiškinys [[67]] ir nepastebėta, kad transpozoniniai mainai tarpininkautų tarpvirusiniam šoniniam genų perkėlimui, šie ar panašūs mechanizmai-šeimininkės ląstelės galėjo palengvinti į BSL RDHV panašių virusų susidarymą.

5 p.: Turi būti pravardė „RNR-DNR hibridinis virusas“ (RDHV). Tai visiškai klaidinantis pavadinimas. Autoriai rodo daugybę įrodymų apie cirkovirusą ar nanovirusą panašų virusą su vienos grandinės DNR genomu, kuris praeityje iš RNR viruso gavo kapsido baltymą. Nepaisant to, dabar tai yra DNR virusas. Tai net ne pirmas tokio tipo mozaikos pavyzdys-dvipusių geminivirusų BL1/BC1 baltymai yra panašūs į augalų RNR virusų judėjimo baltymų 30 K šeimą, tačiau dėl to niekas nevadina dvipusių geminivirusų „DNR-RNR virusais“. . Klosterovirusų RNR genomai koduoja ląstelių HSP70 baltymų homologus, tačiau šie virusai taip pat nėra RNR-DNR virusai. Aprašomasis pavadinimas, pvz., „Verdantis pavasario ežero virusas 1“ ar kažkas panašaus, turėtų tikti. Atkreipkite dėmesį, kad šis prieštaravimas „RDHV“ nėra nomenklatūrinis karas, o juo siekiama nustatyti tikslų molekulinį rekordą.

Autoriaus atsakymas : Vardas „RDHV“ tekste minimas kaip laikinas. Manome, kad glaustas aprašomasis šio naujo viruso genomo tipo pavadinimas yra bent jau laikinai pagrįstas. Atrodo, kad kitų įmanomų pavadinimų nepakanka naujai ir tikriausiai plačiai paplitusiai virusų grupei ir jos protėviams apibūdinti, be to, jie būtų daug painesni arba pernelyg sudėtingi (pvz., „Boiling Springs Lake virusas iš Sargasso jūros“). Visiškai sutinkame, kad atrastas genomas yra DNR virusas. Kai nustatysime viruso šeimininką ir (arba) struktūrą, per televiziją pasiūlysime taksonomiškai tinkamą pavadinimą (ir leisime siautėti nomenklatūriniams karams).

5 p. ir vėliau: Esu tikras, kad yra aiškus sekos ir panašumo argumentas dėl „RDHV“ kapsidinio baltymo ir tombusvirusų evoliucinio ryšio. PSI-BLAST ir HHPred metodais galėčiau gauti statistiškai reikšmingą pirmojo ir antrojo panašumą. Rekomenduoju tą patį padaryti ir autoriams. Vietoj to mes skaitome „Numatoma BSL RDHV kapsido baltymo struktūra atitinka S-P domeno dvigubo želė ritinėlio konfigūraciją, randamą ssRNA Tomato Bushy Stunt (TBSV) ir Melon Necrotic Spot (MNSV) tombusvirusuose [12, 13]. Aminorūgščių sekos yra vidutiniškai konservuotos tarp trijų baltymų, pagrįstų BLOSUM80 [14], o procentinė sekos tapatybė yra maža (2A pav.) (žr. papildomą 1 pav. Tai dviprasmiška: jei sekos panašumo/duomenų bazės paieškos statistikos argumentų (ne tas pats, kas sekos tapatybė!) Nepakanka evoliuciškai reikšmingam panašumui nustatyti, tada nėra pagrindo sriegti ir modeliuoti struktūrą ir jei sekos panašumo argumentai buvo naudojamas, kodėl nepasakius?

Autoriaus atsakymas : Šis skyrius buvo plačiai peržiūrėtas ir pridėta paveikslėlių (paveikslai 2 6 ).

p. 7: „Pats nuoširdžiausias scenarijus“-labiau nuoširdus nei kiti scenarijai?

Autoriaus atsakymas : Šis skyrius taip pat buvo peržiūrėtas. Apie linijinių ir apskritųjų ssDNA virusų kilmę žr. Atsakymą Krupovičiui.

p. 7–8: Keletas palydovinių RNR virusų paminėjimų atrodo netinkami - tombusvirusai nėra palydovai ir grybeliniai virusai nėra aptariami straipsnyje?

Autoriaus atsakymas : Šios nuorodos buvo patikslintos.

p. 8–9: (paskutinė straipsnio pastraipa) „Darant prielaidą, kad RNR virusai evoliuciškai buvo pirmiau už visas DNR virusų grupes [33, 34], įrodymai apie genų perkėlimą iš RNR į DNR virusus papildo pirmąją RNR teoriją [35]“. --- Nesuprantu, ką tai reiškia. Pirma, jei darysime prielaidą, kad RNR virusai evoliuciškai buvo pirmesni už visas DNR virusų grupes, mes turime dalinį atsakymą į klausimą, į kurį, kaip teigiama, šiuo metu neįmanoma atsakyti santraukoje (žr. aukščiau). Antra, „papildyti“ daugiau ar mažiau reiškia pateikti trūkstamą dalį arba papildomą, suderinamą argumentų liniją, tiesa? Nesu tikras, ką šiame tyrime aprašytas virusas turi bendro su RNR virusų evoliucine pirmenybe prieš DNR virusus: tikrai, kad šis virusas atsirastų, tiek RNR virusai, tiek DNR virusai jau turi būti šalia?

Autoriaus atsakymas : Ši paskutinė pastraipa buvo peržiūrėta ir patikslinta.


Žiūrėti video įrašą: Replikacija (Gruodis 2022).