Informacija

L-selektinas baltuosiuose kraujo kūneliuose

L-selektinas baltuosiuose kraujo kūneliuose


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Baltųjų kraujo kūnelių funkcija daugiausia yra kovoti su išoriniais antigenais. Tačiau dar vienas jo bruožas yra jo gebėjimas prisijungti prie kraujagyslių endotelio ląstelių naudojant L-selektiną. Koks to tikslas ir kaip tai mums padeda?


Kova su kenksmingais mikrobais (o ne antigenais per se, nors specifinis antigenų atpažinimas yra svarbus) apima daugybę procesų, kuriems reikia kelių lignadus surišančių molekulių ir ligandų ant WBC paviršiaus. Nors visas šių baltymų masyvas ir jų funkcijos yra labai sudėtingi, galime paimti atvejį, kai neutrofilas bando apginti organizmą nuo mikrobų vietinėje žaizdoje, vadinamojoje. ūminis vietinis uždegiminis atsakas.

1. Prilipimas prie endotelio

Čia tam tikrą vaidmenį atlieka keletas selektinų. Paprasta plati idėja yra ta, kad esant mikroorganizmams, kuriuos suvokia vietinės imuninės ląstelės (audinių makrofagai, kraujo ląstelės, jei kraujagyslė pažeidžiama ir tt), vietinėje aplinkoje vyksta chemokinų reguliavimas, dėl kurio endotelis padidina tam tikrų adhezinių molekulių (ligandų su leukocitų receptoriais ir atvirkščiai) ekspresija, taip pat kiti hemodinaminiai pokyčiai, dėl kurių neutrofilai glaudžiai kontaktuoja su jomis šalia žaizdos ir prisijungia prie endotelio. Tai suskirstyta į tris procesus, paraštės, riedantis ir Sukibimas. L-selektinas yra vienas iš šių adhezijos mediatorių, kartu su kitais selektinais ir integrinais.

2. Migracija per endotelį į audinius (diapedezė)

3. Chemotaksė mikrobų atžvilgiu

4. Veiksmas mikrobams

Taškai 2,3 ir 4 turi savo mediatorius (žr. CD31, chemokinai – AA, C5a, leukotrienai).

Nuoroda: Robbins ir Cortran: Pathologic Basis of Disease, 9e

Kiti šaltiniai: Vikipedijos puslapis


Tyrėjai arčiau suprato, kaip baltymai reguliuoja imuninę sistemą

Kalgario universiteto Mokslo fakulteto biologijos mokslų skyriaus mokslininkai atskleidė, kaip baltieji kraujo kūneliai patenka į infekciją ar uždegimą organizme, o tai gali padėti sukurti vaistų terapiją imuninės sistemos sutrikimams gydyti.

Tyrimas paskelbtas šį mėnesį Biologinės chemijos žurnalas.

Jau seniai žinoma, kad du žmogaus baltymai – L-selektinas ir kalmodulinas – yra susiję su baltųjų kraujo kūnelių perkėlimu į uždegimo ar infekcijos vietą organizme. L-selektinas yra įterptas į baltųjų kraujo kūnelių ląstelių membraną ir veikia kaip Velcro, pririšdamas baltuosius kraujo kūnelius prie lipnaus kraujagyslės sienelės paviršiaus.

Kai baltieji kraujo kūneliai pasiekia infekcijos ar uždegimo vietą, jie „išskiria“ baltymą L-selektiną, kuris leidžia jam išeiti iš kraujotakos ir patekti į pažeistą audinį. Šį išsiskyrimo procesą baltųjų kraujo kūnelių viduje kontroliuoja baltymas kalmodulinas.

„1998 m. ląstelių biologai išsiaiškino, kad kalmodulinas neigiamai reguliuoja L-selektino išsiskyrimo procesą“, – sako Hanso Vogelio vadovaujama doktorantė Jessica Gifford. "Jie žinojo, kad kalmodulinas tai padarė, bet nežinojo, kaip."

Naudodami galingus magnetus ir techniką, vadinamą branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopija, Giffordas ir Vogelis nustatė dviejų baltymų sąveikos molekulinę struktūrą, suteikdami svarbią įžvalgą molekuliniu lygiu, kaip kalmodulinas kontroliuoja L-selektino išsiskyrimą.

„Šių procesų molekulinių detalių supratimas padės mums suprasti, kaip mūsų organizmas reaguoja į uždegimą“, – sako Giffordas, – ir jei galime tai suprasti, tai pirmas žingsnis kuriant vaistų terapiją, skirtą manipuliuoti jūsų imunine sistema arba ją įjungti. arba išjunkite“.

Giffordas teigia, kad didėja susidomėjimas vaistų terapija, padedančia reguliuoti imuninę sistemą. „Daug žmonių problemų kyla dėl pernelyg aktyvios imuninės sistemos“, – sako ji. „Suprasdami, kaip jūsų baltieji kraujo kūneliai cirkuliuoja, galbūt galėsime neleisti jiems patekti ten, kai jiems to nereikia.


Raktažodžiai

  • APA
  • Standartinis
  • Harvardas
  • Vankuveris
  • Autorius
  • BIBTEX
  • UIP

Tyrimo rezultatai : Įnašas į žurnalą › Straipsnis › recenzija

T1 – neutrofilų su perskirstytu L-selektinu slinkimo dinamika

N2 – Dažniausias baltasis kraujo kūnelis yra neutrofilas, kuris lėtai rieda išilgai kraujagyslių sienelių dėl koordinuoto cheminių selektino ir angliavandenių ryšių susidarymo ir nutrūkimo. Mes parodome, kad L-selektino receptoriai greitai perskirstomi, kad susidarytų dangtelis viename ląstelės membranos gale riedėjimo metu per selektinus arba chemotaksinę stimuliaciją. Ši topografija žymiai pakeičia sukibimo dinamiką, kaip parodyta kompiuteriniu modeliavimu, kai neutrofilai rieda ant angliavandenių selektino-ligando substrato srauto metu. Nustatyta, kad neutrofilai su perskirstytu L-selektino dangteliu rieda ant sialil Lewis-x kvaziperiodiniu judesiu, kuriam būdingi santykinai maži greičio intervalai, įsiterpę į reguliarius riedėjimo greičio šuolius. Vidutiniškai neutrofilai su perskirstytu L-selektinu riedėjo mažesniu greičiu, palyginti su ląstelėmis, turinčiomis vienodą vienodo vidutinio tankio L-selektino pasiskirstymą. Mes spėliojame apie galimas biologines pasekmes, kurias šie adhezijos dinamikos skirtumai turės uždegiminio atsako metu.

AB – Labiausiai paplitęs baltasis kraujo kūnelis yra neutrofilas, kuris lėtai rieda išilgai kraujagyslių sienelių dėl koordinuoto cheminių selektino ir angliavandenių ryšių susidarymo ir nutrūkimo. Mes parodome, kad L-selektino receptoriai greitai perskirstomi, kad susidarytų dangtelis viename ląstelės membranos gale riedėjimo metu per selektinus arba chemotaksinę stimuliaciją. Ši topografija žymiai pakeičia sukibimo dinamiką, kaip parodyta kompiuteriniu modeliavimu, kai neutrofilai rieda ant angliavandenių selektino-ligando substrato srauto metu. Nustatyta, kad neutrofilai su perskirstytu L-selektino dangteliu rieda ant sialil Lewis-x kvaziperiodiniu judesiu, kuriam būdingi santykinai maži greičio intervalai, įsiterpę į reguliarius riedėjimo greičio šuolius. Vidutiniškai neutrofilai su perskirstytu L-selektinu riedėjo mažesniu greičiu, palyginti su ląstelėmis, turinčiomis vienodą vienodo vidutinio tankio L-selektino pasiskirstymą. Mes spėliojame apie galimas biologines pasekmes, kurias šie adhezijos dinamikos skirtumai turės uždegiminio atsako metu.


Ląstelių biologijos egzaminas 2

vidinė ribinė membranos sritis
- daug baltymų
- atlieka svarbų vaidmenį importuojant
mitochondrijų baltymai.

Taip pat turi ribosomas savo RNR ir baltymams gaminti.

DNR koduoja nedidelį skaičių mitochondrijų polipeptidų (13 žmonėms).
- tvirtai integruotas į vidinę mitochondrijų membraną
- kartu su polipeptidais, užkoduotais genų, esančių viduje
branduolys.

Gamina
-10 NAD+
-2 FAD
-12 H2O
-34 ATP

Sąlygos svyruoja nuo
ligų, kurios kūdikystėje baigiasi mirtimi
sutrikimams, sukeliantiems traukulius, aklumą, kurtumą ir (arba) į insultą panašius epizodus, iki lengvų būklių, tokių kaip netoleravimas mankštai ar nejudrios spermos.
MtDNR mutacijos gali sukelti priešlaikinį senėjimą

Trimeryje yra
nespiraliniai segmentai, įsiterpę išilgai molekulės ir
rutuliniai domenai kiekviename gale.

IV tipo kolageno genų mutacijos
nustatyta pacientams, sergantiems Alporto sindromu
Paveldima inkstų liga su glomerulų bazinės membranos pažeidimu

Išorinėje plazmos membranos pusėje tai jungiasi prie įvairių ligandų, esančių ekstraląstelinėje aplinkoje.

Tarpo jungties plazmos membranose yra kanalų, jungiančių 2 gretimų ląstelių citoplazmą.

Susideda iš vientiso membraninio baltymo konneksino, suskirstyto į kelių subvienetų kompleksus, jungtis, kurie apima membraną
- Konneksonas susideda iš šešių konneksino subvienetų
- išdėstyti žiedu aplink centrinę angą arba žiedą (apie 1,5 nm)

Tarpų jungtys yra vietos tarp gyvūnų ląstelių, kurios yra skirtos tarpląsteliniam ryšiui
- vaidina pagrindinį vaidmenį fiziologiniuose procesuose
Pvz. Širdies ląstelės (susikaupę diskai yra sudaryti iš tarpinių jungčių ir desmosomų)

Tarpų sankryžos yra labai arti viena kitos, bet tiesiogiai nesusiliečia.

Žinduolių tarpų jungčių riba yra 1000 daltonų (nieko didesnio už tai)
– yra santykinai neselektyvūs.

Tarpų sujungimo kanalai yra užtverti
-sukelia connexin subvienetų fosforilinimas ir įtampos pokyčiai sankryžoje.
Širdies raumenų ląstelės stimuliuojamos per tarpines jungtis
- per tarpines jungtis teka jonų srovė iš vieno širdies raumens
ląstelę savo kaimynams, todėl ląstelės susitraukia sinchroniškai.

Buvo nustatyta maždaug 20 skirtingų jungčių, turinčių skirtingus audinių specifinius pasiskirstymus
- lemia laidumo, pralaidumo ir reguliavimo skirtumus.

Kai kuriais atvejais gretimų ląstelių jungtys, sudarytos iš skirtingų jungčių, gali susijungti ir sudaryti funkcinius kanalus, o kitais atvejais – ne.


Padėkos

Autoriai norėtų padėkoti Barbarai Crain už jos apgalvotas pastabas kuriant ir rengiant šį pranešimą. Šis tyrimas buvo paremtas Nacionalinio širdies, plaučių ir kraujo instituto (NHLBI) ir Johnso Hopkinso ITCR/CTSA biologinių žymenų kūrimo centro, iš dalies finansuojamo nacionalinių institutų, apdovanojimų numeriais K12-HL087169 (JFC), U54HL090515 ir 5R01HL091759 (AE ir JFC). sveikatos (NIH) dotacijos U54RR023561 (JVE). Už turinį atsako tik autoriai ir jis nebūtinai atspindi oficialią NHLBI ar NIH nuomonę.


Diskusija

Šiame tyrime apibrėžiame Pak1 svarbą reguliuojant T ląstelių judėjimą į periferinius limfmazgius. Mes parodome, kad šis fermentas reguliuoja limfmazgių nukreipimo receptorių, L-selektino ir CCR7, ekspresiją aktyvuotų T ląstelių paviršiuje. L-selektino ir CCR7 lygiai Pak1 trūkumuose, palyginti su WT T ląstelėmis, buvo mažesni, matuojant baltymų ir mRNR lygiais. Šį sumažėjimą lėmė keli veiksniai. Transkripcijos faktorių Foxo1 ir Klf2, kurie skatina L-selektino ir CCR7 transkripciją, lygiai buvo mažesni Pak1(T) −/− T ląstelės. Be to, mes taip pat nustatėme, kad dėl Pak1 trūkumo padidėjo L-selektino išsiskyrimas T ląstelėse, kuriose trūksta Pak1, o tai koreliavo su kalmodulino pritraukimu į L-selektino citoplazminę uodegą. Taigi, mūsų duomenys suteikia įrodymų apie du nepriklausomus kelius pasroviui nuo Pak1 T ląstelėse, kurie susilieja, kad reguliuotų limfmazgių nukreipimo receptorių ekspresiją (S3D pav.).

Mes nustatėme, kad Pak1 trūkumo T ląstelės turi ryškių defektų in vivo patekimas į limfmazgius. Tačiau tų ląstelių, kurios pasiekia limfmazgius, judrumas buvo normalus. Siekdami nustatyti aktyvuotų, bet naïve Pak1 trūkumą turinčių T ląstelių periferinius limfmazgius mechanizmą, išanalizavome trijų svarbiausių molekulių – L-selektino, CCR7 ir LFA-1, kurios reguliuoja patekimą limfocitai patenka į limfmazgius (2). Mes nustatėme, kad leukocitų selektino L-selektino ir chemokino receptoriaus CCR7 ekspresija buvo sumažinta aktyvuotame. Pak1(T) −/− T ląstelės, o LFA-1 ekspresija nebuvo paveikta. L-selektino ir CCR7 ląstelių paviršiaus ekspresijos modifikavimas gali pakeisti limfocitų recirkuliacijos modelius ir turėti įtakos imuniniam atsakui (37�). Limfmazgius atitinkančių molekulių, L-selektino ir CCR7, transkripcijos sumažinimas po imuninės sistemos aktyvavimo neleidžia efektorinėms T ląstelėms vėl patekti į periferinius limfmazgius ir skatina jų migraciją į periferinius audinius, kur jos atlieka efektorinę funkciją (4, 37). Remiantis literatūra, mes nustatėme, kad L-selektino ir CCR7 trūkumas neturi įtakos patekimui į blužnį (25�).

Pak1 trūkumas turėjo įtakos transkripcijos mechanizmams, kurie sumažina L-selektino ir CCR7 ekspresiją aktyvuotose T ląstelėse, nes pastebėjome CCR7 ir L-selektino mRNR lygio sumažėjimą bei L-selektino transkripcijos faktoriaus Klf2 sumažėjimą. Transkripcijos faktorius FOXO1 prisijungia prie KLF2 promotoriaus T ląstelėse (28), o T ląstelėse, kuriose trūksta Foxo1, sumažėja L-selektino ekspresija (29). Be to, FOXO1 sukelia CCR7 mRNR ekspresiją Jurkat T ląstelėse (28), tuo tarpu Klf2 trūkumas reguliuoja paviršiaus CCR7 ekspresiją, bet ne jo transkripciją (40). Mes pastebėjome citoplazminio Foxo1 padidėjimą, kai nebuvo Pak1, be to, sumažėjo bendras Foxo1 kiekis. FOXO transkripcijos faktoriai yra glaudžiai reguliuojami potransliacinių modifikacijų, turinčių įtakos jų baltymų kiekiui, lokalizacijai ir aktyvumui (41, 42). Juos slopina proteinkinazės, tokios kaip AKT, perkeldamos FOXO1 iš branduolio į citozolį ir paskatindamos citoplazminių chaperonų 14-3-3 prisijungimą prie FOXO1 (51). Priešingai, FOXO1 aktyvuoja prieš srovę esantys reguliatoriai, tokie kaip JNK (30). JNK fosforilina FOXO1, užkertant kelią 14-3-3 pastolių baltymų sąveikai su FOXO1, taip skatindamas FOXO1 branduolio lokalizaciją. Ankstesni tyrimai parodė, kad PI3K signalizacija slopina Klf2, L-selektino ir CCR7 ekspresiją T ląstelių aktyvacijos metu (21, 34). Pastebėjome pAKT S473 aktyvacijos sumažėjimą Pak1 (T) −/− T ląstelių blastai, tačiau, nesant Pak1, pastebėjome didesnį JNK fosforilinimo sumažėjimą. Ankstesnis mūsų laboratorijos darbas parodė, kad Pak1 aktyvinimas padidina JNK aktyvaciją pirminėse ir Jurkat T ląstelėse (13). Nors AKT fosforilinimo sumažėjimo priežastis Pak1 trūkumo T ląstelėse yra neaiški, atrodo, kad JNK fosforilinimo sumažėjimas yra svarbesnis reguliuojant FOXO1 lokalizaciją šioje aplinkoje. Kartu šie duomenys rodo, kad Pak1, aktyvindamas JNK, kuris fosforilina Foxo1, kad skatintų jo branduolinę lokalizaciją, teigiamai reguliuoja L-selektino ir CCR7 geno transkripciją bei T ląstelių limfmazgių įsisavinimą.

Metaloproteinazių veikimas reguliuoja L-selektino ekspresiją paviršiuje (43). Po skilimo aktyvuotų T ląstelių supernatante padidėja tirpaus L-selektino (sL-selektino) kiekis. Atlikus ELISA, mes nustatėme didelį sL-selektino kiekį aktyvuoto supernatante Pak1(T) −/− T ląstelės, palyginti su aktyvintomis WT T ląstelėmis. Leukocitų prekybai įtakos turi sL-selektino gebėjimas surišti ligandą ir konkuruoti su ląstelėmis susietu L-selektinu. Be to, blokuojant L-selektino skilimą T ląstelėse, sutrikdoma jų migracija ir slopinamas antivirusinis T ląstelių atsakas (44�). Kalmodulinas konstituciškai suriša L-selektino citoplazminę uodegą ir pašalinamas padidinus kalcio antplūdį po GPCR arba imunoreceptorių įsijungimo, dėl kurio išsiskiria L-selektinas (35). Naudodami bendro imunoprecipitacijos eksperimentą, mes stebėjome kalmodulino prisijungimo prie L-selektino sumažėjimą Pak1 trūkumo T ląstelėse. Dėl Pak1 trūkumo T ląstelėse, mes nustatėme kalcio srauto padidėjimą po CCR7 aktyvacijos. Anksčiau mes aprašėme, kad Bam32 arba Pak1 ekspresija sumažina kalcio antplūdį po TCR įsitraukimo (12). Be to, mes pastebėjome, kad blokuojant kalcio srautą arba ADAM17 aktyvumą, sL-selektino kiekis Pak1(T) −/− T ląstelių mažėja. Kartu šie duomenys patvirtina modelį, kuriame Pak1 reguliuoja L-selektino kiekį dviem skirtingais lygiais – tiek transkripcijos, tiek membranos išsiskyrimo, o vėliau reguliuojamas priklausomai nuo kalcio.

Kadangi Foxo1 reguliuoja CD4 + T ląstelių diferenciaciją, įskaitant reguliuojančių T ląstelių vystymąsi ir funkciją (47�), būtų įdomu ištirti indukuotų T reguliuojančių ląstelių vystymąsi Pak1(T) −/− pelės. Be to, mūsų darbas rodo, kad tolesni Pak1 tyrimai T ląstelėse galėtų nustatyti terapiškai naudingus būdus, kaip selektyviau moduliuoti L-selektino aktyvumą ir aktyvuotą T ląstelių apyvartą. Dėl kai kurių ligų, tokių kaip lėtinis uždegimas, ūminis dermatitas, reumatoidinis artritas, diabetas ir astma (50), padaugėja kraujagyslių L-selektino ligandų, būtų įdomu atlikti tyrimus. Pak1(T) −/− pelėms dėl jautrumo ligoms šiomis skirtingomis sąlygomis.


Priverstas susieti

L-selektino jungtys išlieka ilgiau, nes jėga didėja iki optimalaus šlyties.

Dauguma šio srauto padidinto sukibimo paaiškinimų rodo, kad srautas padidina ryšių, susidarančių tarp L-selektino ant leukocitų ir PSGL-1 ar kitų ligandų ant kraujagyslių ląstelių, skaičių, galbūt sukant ar deformuojant kraujo ląsteles. Tačiau kai kurie mokslininkai mano, kad srauto sukuriama jėga taip pat gali pailginti esamų ryšių tarnavimo laiką.

Nauji rezultatai rodo, kad ryšiai, kurių gyvavimo trukmė pailgėja jėga, tarp L-selektino ir PSGL-1 kontroliuoja leukocitų riedėjimą. Autoriai susiejo ilgalaikę atskirų jungčių galią su ląstelių riedėjimo stabilumu. Didėjant obligacijoms taikomai jėgai, ilgėjo jų tarnavimo laikas. Taigi kraujo ląstelės lėčiau ritosi ant PSGL-1 substratų. Lėtas riedėjimas leidžia leukocitams reaguoti į chemokinus ir pereiti per endotelį. Jėgos reikalavimas tikriausiai apsaugo nuo uždegimo ir leukocitų susikaupimo kraujagyslių užsikimšimo metu.

Virš optimalaus šlyties, kai kraujo ląstelės rieda lėčiausiai, sugavimo jungtys tapo slydimo jungtimis, kurių tarnavimo laikas sutrumpėja jėga. Taip padidėjo riedėjimo greitis, o ląstelės atsiskyrė nuo substrato. Perėjimas prie slydimo jungčių gali paaiškinti, kodėl leukocitai dažniausiai nesilaiko arterijose, kur kraujotaka labai stipri. ▪


Abstraktus

Fonas - Šiuo tyrimu buvo patikrinta hipotezė, kad L-selektinas yra svarbus eksperimentiniam graužikų pilvo aortos aneurizmos (AAA) formavimuisi.

Metodai ir rezultatai – Žiurkių pilvo aortos buvo perfuzuotos fiziologiniu tirpalu (kontrolinė) arba kiaulių kasos elastaze ir tiriamos 1, 2, 4, 7 ir 14 dienomis po perfuzijos (n = 5 vienai gydymo grupei per dieną). Neutrofilai (polimorfobranduoliniai leukocitai, PMN) ir makrofagų skaičius viename didelio galingumo lauke (HPF) buvo atliktas fiksuotose sekcijose. L-selektino ekspresija ir baltymų lygis aortos audinyje buvo nustatyti atitinkamai polimerazės grandinine reakcija ir Western blot. Elastaze perfuzuotos aortos skersmuo buvo žymiai didesnis, palyginti su kontroline aorta visais laiko momentais, išskyrus 1 dieną (P<0,05). PMN skaičius žymiai padidėjo elastazės perfuzuotose aortose, palyginti su kontrolinėmis aortomis 1, 2 ir 4 dienomis, o didžiausias lygis buvo pasiektas 7 dieną (40,8 palyginti su 0,3 PMN/HPF, P=0,001). L-selektino mRNR ekspresija elastazės perfuzuotoje aortoje buvo 18 (P=0.018), 17 (P<0,001) ir 8 kartus (P=0,02) karto didesnis nei kontrolinės aortos atitinkamai 1, 2 ir 4 dienomis. Western blot tyrimas parodė reikšmingą 69% L-selektino baltymo padidėjimą 7 dieną elastazėje, palyginti su fiziologiniu tirpalu perfuzuotomis aortomis.P=0,005). Vėlesni eksperimentai apėmė panašius tyrimus su C57BL/6 laukinio tipo (WT) pelių (n = 21) ir L-selektino išmušimo (LKO) pelių (n = 19) aortos 4, 7 ir 14 dienomis po perfuzijos. LKO pelių aortos skersmuo 14 dieną buvo žymiai mažesnis, palyginti su WT pelėmis (88%, palyginti su 123%. P=0,02). PMN skaičius buvo žymiai didesnis elastaze perfuzuotose WT pelės aortose, palyginti su LKO pelės aortomis 4 dieną po perfuzijos (12,8 palyginti su 4,8 PMN/HPF, P=0,02). Makrofagų skaičius buvo žymiai didesnis visais laiko momentais po perfuzijos elastaze perfuzuotose WT pelių aortose, palyginti su elastaze perfuzuotomis LKO pelių aortomis, didžiausias skirtumas buvo 7 dieną po perfuzijos (13,3 palyginti su 0,5 makrofago/HPF, P<0,001).

Išvada - L-selektino sukeltas neutrofilų įdarbinimas gali būti svarbus ankstyvas AAA formavimo žingsnis.

Pilvo aortos aneurizmos (AAA) yra svarbi liga, turinti didelį mirtingumą. 2000 m. Nacionalinės gyvybinės statistikos ataskaitoje apie mirtį nustatyta, kad AAA yra 10-a pagrindinė baltųjų vyrų nuo 65 iki 74 metų mirties priežastis 1, o Nacionalinės ligoninės išrašymo suvestinėje užfiksuota daugiau nei 36 000 atvirų AAA remontų Jungtinėse Valstijose.

AAA patogenezė apima sudėtingą įvykių seriją, kuriai būdingas elastino ir kolageno skilimas terpėje ir adventicija per katalizinį procesą, kuris atsiranda po uždegiminių ląstelių infiltracijos į aortos sienelę. 2–9 Makrofagai ypač svarbūs patogenezei. 10 Neutrofilo (polimorfobranduolinio leukocito, PMN) svarba formuojant AAA taip pat buvo nustatyta 11–13 metų žmonėms, o pastaruoju metu – ir pelės aneurizmos formavimosi modelyje. 14 Svarbūs mechanizmai, kuriais neutrofilai ir makrofagai įdarbinami į aortos sienelę formuojantis aneurizmai. 15 Šiuo atžvilgiu svarbios adhezijos molekulės, įskaitant selektinus.

Selektinai yra 3 adhezinių molekulių šeima: E-selektinas aktyvuotų endotelio ląstelių paviršiuje, P-selektinas aktyvuotų trombocitų ir endotelio ląstelių paviršiuje ir L-selektinas, kuris yra konstituciškai ekspresuojamas daugumos leukocitų paviršiuje. 16,17 Pagrindinė selektinų funkcija yra skatinti leukocitų surinkimą uždegimo vietose. Be selektinų uždegiminių ląstelių skaičius žymiai sumažėja. 18–22 Selektinų vaidmuo formuojant AAA nebuvo ištirtas. Šiame tyrime siekėme įvertinti selektinų vaidmenį uždegiminių ląstelių įdarbinimui eksperimentinio AAA formavimosi metu.

Metodai

Sprague-Dawley žiurkių patinai (Charles River Laboratories, Wilmington, Mass), C57BL/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) ir L-selectin-knockout (LKO) pelių 18 (dr. John B. Lowe, Patologijos skyrius) , Mičigano universiteto medicinos mokykloje) buvo tiriami. Tyrimo metu visos žiurkės svėrė 200–250 g, o visos pelės svėrė ≈20–27 g ir buvo 8–10 savaičių amžiaus. Eksperimentus patvirtino Mičigano universiteto Visuotinis gyvūnų naudojimo ir priežiūros komitetas (8566 žiurkės, 8593 pelės).

Eksperimentinis AAA formavimas

Graužikai buvo anestezuoti naudojant 2% izofluorano inhaliacinį anestetiką, atlikta vidurinės linijos laparotomija ir izoliuota pilvo aorta nuo šiek tiek žemiau kairiosios inkstų venos iki bifurkacijos. 10,23 Aortos skersmuo (AD) buvo išmatuotas naudojant „Spot Insight“ spalvotą optinę kamerą (diagnostikos prietaisus), pritvirtintą prie operatyvinio mikroskopo („Nikon“), naudojant „Image Pro Express“ programinę įrangą („Media Cybernetics“). Tada aorta 30 minučių žiurkėms arba 5 minutes pelėms buvo perfuzuojama kiaulių kasos elastaze (specifinis aktyvumas 6,6 U/mg baltymo E1250 Sigma Chemical). Po aortos perfuzijos buvo gauti AD matavimai.

Eksperimentinis dizainas

Patinų Sprague-Dawley aortos buvo perfuzuotos 1 ml izotoninio fiziologinio tirpalo (kontrolinė) arba 6 U/ml kiaulių kasos elastazės 1 ml izotoninio fiziologinio tirpalo. Fiziologiniu tirpalu ir elastaze perfuzuotos aortos buvo išmatuotos praėjus 1, 2, 4, 7 ir 14 dienų po perfuzijos (n = 5 arba 6 kiekvienoje gydymo grupėje per dieną). Infrarenalinės aortos segmentai buvo tiriami genų ekspresijai ir baltymų gamybai naudojant realaus laiko polimerazės grandininę reakciją (PGR), Western blot ir histologijos bei imunohistochemijos tyrimus.

C57BL/6 (n = 21) ir LKO (n = 19) pelės buvo anestezuotos 2 dieną prieš perfuziją, o iš pašildytos ventralinės uodegos arterijos buvo paimta ≈0,25 ml kraujo ir ištirta naudojant HEMAVET 1500FS kelių rūšių hematologijos prietaisą. CDC technologijos). Pelės aortos buvo perfuzuotos elastaze (0, 332 U / ml) 0 dieną, po to išmatuotos ir surinktos 4, 7 ir 14 dienomis po perfuzijos. Prieš aortos derlių, kraujas buvo paimtas per širdies punkciją ir analizuojamas, kaip nurodyta anksčiau. Infrarenaliniai aortos segmentai buvo naudojami histologiniams ir imunohistocheminiams tyrimams. AD padidėjimas buvo praneštas kaip procentinis padidėjimas, palyginti su pradiniais matavimais, o AAA buvo apibrėžtas kaip ≥100% AD padidėjimas, palyginti su pradiniu lygiu.

Kiekybinė (realiojo laiko) PGR

mRNR geno lygiai buvo nustatyti kiekybine PGR. mRNR buvo išskirta iš aortos segmentų apdorojant TRIzol reagentu (Life Technologies) ir atvirkštine transkripcija, inkubuojant su Oligo-(dT) pradmeniu ir M-MLV atvirkštine transkriptaze (Life Technologies) 3 minutes 94 °C temperatūroje, po to 70 minučių 40°C. Gauta cDNR buvo amplifikuota Taq polimeraze (Promega) SmartCycler kiekybinėje PGR sistemoje (Cepheid). SYBR Intercalating Dye (Roche) buvo naudojamas kiekvieno geno cDNR amplifikacijos lygiams stebėti. Pradmenų sekos buvo gautos naudojant Primer Premier Software (Premier Biosoft International), remiantis pirminėmis žiurkės mRNR sekomis iš GenBank (//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). Pradmenų sekos yra tokios: L-selektinas (jutimas): 5′-AACGAGACTCTGGGAAGT-3′ (antisense): 5′-CAAAGGCTCACATTGGAT-3′ E-selektinas (jutimas): 5′-TGCGATGGCTGCCTACTT : 5′-AGAGAGTGCCACTACCAAGGGA-3′ P-selektinas (jutimas): 5′-CCTGGCAAGTGGAATGAT-3′ (antisensas): 5′-TAGCTCCCAATGGTCTCG-3′ β-aktinas (jutimas) : 5′-CTTCATGAGGTAGTCAGTCAGGTC-3′. SmartCycler kiekybiniai duomenys pateikiami kaip ciklo slenkstis (Ct). Visi rezultatai buvo normalizuoti naudojant β-aktino geną. iRNR lygių kiekybiniam įvertinimui naudotos ΔCt reikšmės, apskaičiuotos pagal formulę ΔCt=Cttikslinis genas−Ktβ-aktinas. Tikslinio geno ekspresija su β-aktino geno ekspresija buvo apskaičiuota kaip santykis pagal formulę tikslinio geno ekspresija / β-aktino ekspresija = 2 - (ΔCt).

Western blotavimas

Baltymai buvo išskirti iš aortos segmentų naudojant TRIzol reagentą ir ištirpinti 1% SDS. Baltymai buvo atskirti elektroforetiškai ant 7, 5% iki 12, 5% poliakrilamido gelių ir užpilami ant nitroceliuliozės membranų. Nespecifinis surišimas buvo užblokuotas inkubuojant membraną 1 valandą 20 mmol/l tris-HCl (pH 7,5), turinčiame 0,5 mol/l NaCl, 0,1% Tween 20 ir 5% neriebaus pieno. Elektroforezės ir Western blotting reikmenys buvo gauti iš BioRad. Pirminiai antikūnai buvo atskiesti tame pačiame buferyje ir įtraukti monokloniniai anti-pelės ir žiurkės L-selektino antikūnai (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija). Tada buvo pritaikyti su peroksidaze susieti rūšiai tinkami antriniai antikūnai. Imunoreaktyvios juostos buvo vizualizuotos naudojant ECL chemiliuminescencijos aptikimo rinkinį (Amersham). Densitometrinė baltymų juostų analizė buvo atlikta naudojant FOTO/Analyst CCD CAMERA (Fotodyne) ir GEL-Pro Analyzer programinės įrangos versiją 3.1 (Media Cybernetics). Visos įvertintos juostos buvo priimtino densitometrinių matavimų diapazone. Tada visi matavimai buvo pakoreguoti pagal bendrą ląstelių baltymų kiekį, nustatytą bicinchonino rūgšties baltymų tyrimu (Pierce).

Histologija ir imunohistochemija

Nuimtos aortos buvo fiksuotos šviežiame šaltame 4% paraformaldehido tirpale 16–24 valandas, po to 70% etanolio. Tada segmentai buvo įterpti į parafiną, o 5 μm sekcijos buvo sumontuotos ant stiklelių. Tie, kurie buvo paruošti imunohistocheminiams tyrimams, 10 minučių buvo gydomi H2O2 blokuoti endogeninės peroksidazės aktyvumą ir atitinkamą praskiestą serumą iš Vectastain ABC-AP rinkinio (Vector Laboratories) bent 30 minučių kambario temperatūroje. Vėliau sekcijos buvo inkubuojamos 30 minučių kambario temperatūroje su pirminiais antikūnais, įskaitant triušio anti-žiurkės PMN antikūnus (Accurate Chemical & Scientific, Westbury, NY) neutrofilų dažymui, pelės anti-žiurkės CD68 (Serotec, Raleigh, NC) žiurkių makrofagams. dažymas ir žiurkių anti-pelės Mac-3 monokloninis antikūnas (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Kalifornija) pelių makrofagų dažymui. Epitopo demaskavimas buvo atliktas, kai reikia, naudojant Trilogy Princess modelio greitpuodyje (Cell Marque Corporation). Buvo naudojami atitinkami antriniai antikūnai iš triušio, pelės ir žiurkės imunoglobulino G Vectastain ABC-AP rinkinio (Vector Laboratories), po to buvo atlikta standartinė dažymo šarmine fosfataze procedūra. Šios sekcijos buvo lengvai nudažytos hematoksilinu. Plaučių ir blužnies sekcijos buvo naudojamos kaip teigiamas kontrolinis audinys identifikuojant neutrofilus su specifiniais aukščiau išvardytais antikūnais. Blužnies sekcijos buvo naudojamos kaip teigiamas kontrolinis audinys makrofagų, turinčių aukščiau išvardytus specifinius antikūnus, identifikavimui. Apmokytas laboratorijos technikas, apakęs nuo mėginių klasifikavimo, PMN arba makrofagus suskaičiavo keliuose kiekvienos aortos sekcijos HPF.

Duomenų analizė

Duomenys buvo įvertinti nesuporuoti t testas arba ANOVA, kurių statistinis reikšmingumas priskirtas kaip P<0,05. Kai ANOVA pasiekė reikšmingumą, atskiroms grupėms palyginti buvo naudojamas post hoc Tukey testas. Statistinė analizė atlikta naudojant Sigma Stat Statistical Software V2.03 (SPSS Inc).

Rezultatai

Elastase perfuzuota aorta tapo aneurizma 7 dieną

Žiurkių AD 2, 4, 7 ir 14 dienomis žymiai padidėjo elastazės perfuzuotoje aortoje, palyginti su fiziologiniu tirpalu perfuzuotoje aortoje (P<0,05 visiems laiko taškams, 1A pav.). Elastazėmis perfuzuotos žiurkės aortos tapo aneurizminės 7 ir 14 dienomis, padidėjo atitinkamai 263 % ir 434 %. Be to, elastaze perfuzuotos AD 7 ir 14 dienomis labai skyrėsi, abi buvo žymiai didesnės nei elastazės perfuzuotos aortos 1, 2 ir 4 dienomis (visos P<0,05 1A pav.).

Figūra 1. A, AD padidėjimas (%), palyginti su fiziologiniu tirpalu arba elastaze perfuzuotos žiurkės aortos pradiniu lygiu. 2, 4, 7 ir 14 dienomis žymiai padidėjo elastazės perfuzuotų aortų skaičius, palyginti su fiziologiniu tirpalu perfuzuotų aortų.P<0,05). Aneurizmos, apibrėžiamos kaip ≥100 % AD padidėjimas, pastebėtas 7 ir 14 dienomis po perfuzijos. Dydžių skirtumai kiekvienu laiko momentu tarp elastaze perfuzuotų aortų buvo labai skirtingi (P<0,001, ANOVA). Post hoc Tukey testas parodė reikšmingus skirtumus tarp 7 ir 14 dienų (P<0,05). Klaidų juosta reiškia ±SEM. Tikimybių reikšmės buvo nustatytos nesuporuotas t- testas, kuriame lyginami elastazės ir fiziologinio tirpalo perfuzuotos aortos skersmenys. B, L-selektino mRNR santykis elastaze perfuzuotoje aortoje ir L-selektino mRNR santykis fiziologiniu tirpalu perfuzuotoje aortoje, pakoregavus β-aktiną, y ašyje pavaizduotas kaip L-selektino mRNR. L-selektino mRNR lygis elastazės perfuzuotoje aortoje buvo 18 (P=0.018), 17 (P<0,001) ir 8 kartus (P=0,02) didesnis nei fiziologiniu tirpalu perfuzuotos aortos atitinkamai 1, 2 ir 4 dienomis. Mažėjanti tendencija galiausiai lėmė neaptinkamą L-selektino mRNR ekspresijos lygį abiejose grupėse 7 ir 14 dienomis. C, Western blot L-selektino baltymo lygio analizė žiurkės aortoje. Pastebėta, kad elastazės perfuzuotose aortose L-selektino kiekis yra 1,7 karto didesnis nei fiziologiniu tirpalu perfuzuotose aortose.P=0,005). L-selektino baltymų kiekis buvo pakoreguotas pagal bendrus baltymų matavimus. D, reprezentatyvus Western blot tyrimas, rodantis padidėjusį L-selektino baltymų kiekį praėjus 7 dienoms po perfuzijos fiziologinio tirpalo (S) ir elastazės perfuzuotose (E) žiurkės aortose.

Su elastaze perfuzuota aorta parodė reikšmingą L-selektino kiekio padidėjimą

E- ir P-selektino mRNR lygių skirtumai negalėjo būti parodyti realaus laiko PGR metodu jokiu tirtu laiko momentu (duomenys nerodomi). Priešingai, aortos sienelės L-selektino mRNR lygis elastaze perfuzuotoje žiurkės aortoje buvo 18 (P=0.018), 17 (P<0,001) ir 8 kartus (P=0,02) karto didesnis nei fiziologiniu tirpalu perfuzuotos žiurkės aortos atitinkamai 1, 2 ir 4 dieną (1B pav.). L-selektino baltymo kiekis elastazės perfuzuotoje žiurkės aortoje buvo 1,7 karto didesnis nei fiziologiniu tirpalu perfuzuotoje žiurkės aortoje 7 dieną (P=0,005 1C, D pav.).

L-selektino ekspresija ir neutrofilų infiltracija yra prieš AAA susidarymą

PMNs were significantly increased in elastase-perfused rat aortas compared with saline-perfused rat aortas at days 1, 2, 4, and 14, reaching maximum levels at day 7 (40.8 versus 0.3 PMNs/HPF, P=0.001 Table 1). PMNs peaked on day 7, coinciding with the onset of an aneurysm phenotype. Macrophage counts in the aortic wall followed a trend similar to the PMNs, with macrophages/HPF steadily rising to a peak at day 7 (17.5 macrophages/HPF in elastase-perfused rat aortas versus 1.2 macrophages/HPF in saline-perfused rat aortas, P<0.001 Table 1).

TABLE 1. PMN and Macrophage Counts in Aortic Wall of Saline- and Elastase-Perfused Rats

L-Selectin Deficiency Suppressed Experimental AAA Formation

Because increased L-selectin levels in aneurysmal aortas could be secondary to increased numbers of PMNs in the aortic wall and therefore serve only as an inflammatory marker, LKO mice were studied to more accurately characterize the role of L-selectin in AAA formation. Elastase perfusion of LKO mouse aortas resulted in significantly smaller ADs at day 14 as compared with wild-type (WT) mouse aortas (88% versus 123%, P=0.02 Figure 2). In addition, the AAA phenotype incidence was reduced in LKO mice versus WT mice (38% versus 67%). These observations appear to be associated with a reduced neutrophil infiltration into the aortic wall, with fewer PMNs at day 4 after elastase perfusion in LKO mice as compared with WT mice (4.8 PMNs/HPF versus 12.8 PMNs/HPF, P=0.02 Table 2). In addition, there were significantly fewer macrophages in LKO mouse aortas compared with WT mouse aortas at all time points (P<0.002 Table 2). PMN counts in WT mice peaked on day 4, preceding macrophages, which peaked on day 7 (Table 2, Figure 3). Of note, PMN counts were significantly greater in LKO mouse aortas as compared with WT mouse aortas at day 14 only (2.73 PMNs/HPF versus 0.96 PMNs/HPF, P=0.02 Table 2). This observation may be a secondary effect, however, because macrophage counts were elevated in WT mouse aortas and could potentially have decreased PMN counts at day 14 in the WT mouse aortas via phagocytosis. Circulating levels of neutrophils and monocytes were not different between WT and LKO mice (data not shown).

2 pav. AD increases (%) at days 4, 7, and 14 in WT and LKO mice after elastase perfusion. WT mouse aortas became aneurysmal at day 14 with a mean of 123%, with LKO mouse aortas remaining below aneurysmal diameter, increasing 88%. Only 38% of LKO mice had aneurysmal aortas compared with 67% in WT mice. Error bars represent ± SEM. Probability values determined by unpaired t test comparing WT and LKO mouse ADs.

TABLE 2. PMN and Macrophage Counts in Aortic Wall in Elastase-Perfused WT and LKO Mice

3 pav. Representative histological sections (original magnification ×200) of WT and LKO mouse aortas at days 4 and 7 after perfusion depicting infiltration of neutrophils and macrophages, respectively. WT mouse aorta (A) and LKO mouse aorta (B) at day 4 after perfusion stained for PMNs WT mouse aorta (C) and LKO mouse aorta (D) at day 7 after perfusion stained for macrophage antibody. Infiltrating neutrophils and macrophages (arrows). A indicates adventitia M, media.

Diskusija

This investigation is the first to document a convincing association between L-selectin expression and AAA formation in 2 rodent models. L-selectin, by real-time PCR and protein analysis of the aortic wall, was the only member of this adhesion molecule family to be increased during rat experimental AAA formation. Furthermore, increases in L-selectin correlated with increases in neutrophil and macrophage counts in the aortic wall.

Although L-selectin is rapidly cleaved from the surface before extravasation across the vessel wall, in vitro studies have documented increased L-selectin mRNA levels and surface expression during activation. 24,25 Therefore, further studies elucidating the specific role of L-selectin after elastase perfusion of WT and LKO mouse aortas demonstrated that L-selectin deficiency results in decreased aneurysm size and incidence. In addition, peak neutrophil and macrophage counts in the aortic wall of WT mice at 4 and 7 days after perfusion, respectively, did not occur in the LKO mice.

L-selectin deficiency most likely functions to suppress AAA formation through impaired neutrophil and macrophage recruitment because neutrophils and macrophages have been documented as key participants in AAA pathogenesis and L-selectin mediates neutrophil and macrophage rolling to sites of inflammation. 5,9–14,22,26 Impaired macrophage recruitment may not be solely the result of L-selectin deficiency but could also be attributed to other mechanisms, including diminished recruitment of neutrophils, which produce proteolytic enzymes, and reactive oxygen species, which potentially stimulate the secretion of leukocyte chemotactic cytokines. 27–29 Furthermore, because the neutrophil appeared in the aortic wall before the macrophage in the WT mice, a decrease in neutrophils in the aortic wall of LKO mice most likely resulted from a lack of L-selectin. Unlike other studies, which have used WT bone marrow to rescue a phenotype in KO mice deficient in enzymes produced by bone marrow–derived cells and mesenchymal cells, bone marrow transplantation was not required in this study because L-selectin is found only on bone marrow–derived white blood cells. 8,10,17 Therefore, because the cell origin of L-selectin was known, it was not necessary to perform bone marrow transplantation. Finally, the roles of E- and P-selectin during this disease process cannot be ruled out on the basis of mRNA expression data from the initial rat experiments rather, they need to be further analyzed via the respective KO mice.

AAA pathogenesis is viewed as a multifactorial process. 30,31 Traditional concepts of this disease process implicate an initial injury to the aortic wall, followed by degradation of extracellular matrix proteins, which then serves as a catalyst for inflammation. After injury, increased cytokine production promotes further inflammatory cell recruitment and secretion of proteolytic enzymes, such as matrix metalloproteinases, and reactive oxygen species by inflammatory and mesenchymal cells. This culminates in extracellular matrix degradation, cell damage, and a proinflammatory environment that leads to aortic wall weakening and eventual AAA formation.

Most studies investigating AAA disease have focused on events taking place in the aortic wall during AAA formation. 8,10,14 A study by Ricci et al 15 was the first to focus on events initiating inflammatory cell recruitment. Antibody blockade of CD18, a subunit of the integrin adhesion molecules found on leukocytes that promote firm adhesion to the endothelial surface, decreases AAA size and macrophage recruitment after elastase perfusion. To date, the present investigation is the only one to have examined the role of selectins during AAA pathogenesis.

Limitations of the present investigation include the observation that only a partial reversal of the aneurysm phenotype occurred in the LKO mice. Clearly, other adhesion molecules, such as integrins, which were still present, also promote inflammatory cell recruitment and may play an important role. 32 In addition, it is difficult to determine the relevance of these observations to human AAA formation because many have criticized the elastase-perfusion aortic aneurysm model as an acute inflammatory aneurysm model. Furthermore, the importance of L-selectin during human AAA pathogenesis cannot be adequately assessed because L-selectin plays a functional role before AAA formation, as demonstrated by the early recruitment of inflammatory cells seen in the present study. The ability to analyze human aortic tissue before it becomes aneurysmal and to accurately predict which patients develop aneurysms is therefore not possible. Finally, the presence of L-selectin expression in human aortic aneurysm tissue would provide no direct evidence as to the mechanistic importance of L-selectin during human AAA pathogenesis because L-selectin, acting as an inflammatory marker, would be expected to be elevated.

Despite these limitations, L-selectin is required for neutrophil recruitment during the initial stages of aneurysm formation. Previous studies documenting the attenuation of ischemia-reperfusion injury during myocardial infarction 33 and thrombus resolution 34 through selectin blockade provide support for a potential L-selectin-targeted novel treatment to prevent AAA development.

This research was funded by NIH KO8 (HL67885-02), Von Liebig Award-Lifeline Foundation, the Lifeline Student Fellowship Award, the University of Michigan Summer Biomedical Research Program, and the Jobst Foundation. The authors acknowledge and thank John B. Lowe, MD, and Robert J. Kelly, PhD, for supplying the LKO mice.

Dr Wakefield and Daniel Myers have received research funding from Wyeth.

Išnašos


Snipping Inflammation In The Bud New Agents May Provide Relief

MADISON - Trying a new approach to controlling the process of inflammation, scientists have forged a new class of synthetic molecules that offer a new strategy for treating pain, swelling and the other hallmarks of injury or illness.

Writing this week (March 5) in the scientific journal Nature, University of Wisconsin-Madison chemist Laura L. Kiessling describes a new family of compounds that packs a novel one-two punch that effectively inhibits the cellular processes that cause us pain.

Inflammation is the body's response to irritation, infection or injury. It begins at the level of the cell when, in response to an injury or irritation, white blood cells in the bloodstream begin to stick to the cells lining the blood vessel wall. The end result of this process is inflammation and pain.

The cells stick together with the aid of a protein called L-selectin that, with many other proteins, populates the surface of cells.

"L-selectin helps mediate an inflammatory response by binding to the carbohydrate groups attached to protein molecules on the surface of an opposing cell," said Kiessling. "The many copies of L-selectin on the white blood cell surface bind with the many copies of the L-selectin-binding protein on the blood vessel, much like fingers fitting into a glove. The inflammatory response depends on the cells sticking together."

The traditional approach to controlling inflammation, through popular over-the-counter drugs such as ibuprofen, is to block events inside the cell. The synthetic molecules in Kiessling's approach act as inhibitors on the outside of the cell, attaching themselves to a L-selectin proteins and preventing the cell from linking with an opposing cell.

But synthetic molecules that only inhibit cells from linking up have to compete with the natural cell surface proteins involved in the cell-docking process, and they don't always win. The process is also reversible. The synthetic molecules, for example, can slip off their cellular targets and the L-selectin proteins can come back into play.

However, the new class of agents developed by Kiessling and colleagues Eva J. Gordon and William J. Sanders, dubbed "neoglycopolymers," also cause cells to shed the surface protein L-selectin and that prevents the cells from docking with each other.

"It's a completely different strategy," said Kiessling. "It's like doing surgery on a really small part of the cell's surface. We're removing a protein that facilitates an unwanted inflammatory response. One advantage of this strategy is that it's not reversible, so cells no longer adhere."

The neoglycopolymers work by causing the L-selectin proteins to bunch up on the cell's surface. This activates an enzyme within the cell that, like a chemical scissors, snips the L-selectin proteins from the cell surface.

When L-selectin is lost from the cell surface, the cell's docking mechanism is no longer available, and the sheared L-selectin proteins are turned loose in the bloodstream. There, the shed protein can attach themselves to the L-selectin-binding proteins on other cells, thereby acting as inhibitors to deter the inflammation response.

Does this mean an end to pain? No, said Kiessling, but the new agents suggest new ways to design far more effective tools than those now deployed in the multi-billion-dollar fight against inflammation.

Kiessling's group is now investigating whether this novel approach to removing L-selectin has potential implications for controlling other problematic proteins on the cell surface.

"We're trying to see how general the approach is and we're trying to find the enzyme that cuts L-selectin from the cell so that we can understand more about the process.

The work of Kiessling's group was funded by the National Institutes of Health and the Mizutani Glycoscience Foundation.

Istorijos šaltinis:

Pateiktos medžiagos University Of Wisconsin-Madison. Pastaba: turinys gali būti redaguojamas pagal stilių ir ilgį.


Simon Lab illuminates a non-classical selectin signalling pathway for neutrophils

Neutrophils are a circulating “first responder” white blood cell that protects the host from infection and help to heal injured tissues. They can access any site in the body by travelling in the blood stream and use specialized adhesion receptors to capture and migrate through the wall of blood vessels at the site of the injury.

Chemical signals instruct neutrophils to “roll” through the vasculature and activate anchor molecules called integrins. Scientists have discovered some of chemical signaling pathways, but others are less well known, especially those critical for targeting white cells under different disease conditions.

One of the classical pathways involves L-selectin, a type of glycoprotein that allows neutrophils to “roll” and signals neutrophils to initiate the next step, which is formation of stable β2-integrin bonds that mediate shear resistant cell arrest. L-selectin (on the neutrophil) binding by E-selectin (on the endothelium–the surface of the cell) results in the secretion of a protein that primes the integrin on the neutrophils. This allows neutrophils to form an impermanent attachment with the endothelium.

However, L-selectin/E-selectin are also shear sensitive, meaning that at specific blood flow rates the bonds function analogous to a Chinese finger trap– the more force you apply the stronger the bond between the cell and vessel wall. To better understand the role played by E-selectin, first author Vasilios Morikis, a graduate student in the Simon Lab, used Rivipansel to block the ability of E-selectin to form these force resistant bonds with L-selectin while still allowing for binding. They found that by blocking L-selectin, the E-selectin was unable to form the strong bonds required for adhesion and transport through the lining of the blood vessel.

The paper was published and featured in the November issue of the American Society of Hematology's Blood Journal.

Further study revealed that once force was applied to receptor clusters between E- and L-selectin bonds, a chemical signal (within the neutrophil) was transmitted from the outside-in that then completed a circuit to activate β2-integrin, pushing it one step further toward the state where the neutrophil can bind strongly to the endothelium, stopping the neutrophil from rolling and committing it to migrate into the tissue.

“Our work describes a non-classical pathway through which selectin signalling activates the cell,” says Morikis. “It enhances our knowledge of selectin mediated pathways for neutrophil activation.

The paper was published in the November issue Kraujas, which also selected an image from the article as a cover image and included it in an editorial review.


DISKUSIJA

Ectodomain shedding is critical for regulating the function of membrane proteins such as TNF-α and EGFR ligands. Because dysregulation of EGFR signaling occurs in diseases such as cancer, and TNF-α is a causative factor in rheumatoid arthritis, it is important to understand the underlying proteolytic machinery. Here, we used the ectodomain shedding of TNF-α, TGF-α, and other membrane proteins such as L-Selectin to identify ADAM10 as a sheddase that can, in principle, release these proteins almost as efficiently as their primary sheddase, ADAM17, but only in Adam17−/− cells stimulated with ionomycin. Nevertheless, despite the ability of ADAM10 to efficiently shed many substrates of ADAM17 in Adam17−/− cells, ADAM17 nevertheless clearly emerged as the functionally dominant enzyme, or “principal sheddase” for these substrates when both enzymes were present.

An important criterion for identifying ADAM10 as an efficient sheddase of ADAM17-substrates in Adam17−/− cells was its “fingerprint,” defined as its characteristic response to activators and inhibitors of ectodomain shedding (Overall and Blobel, 2007). ADAM10 emerged as the relevant IM-stimulated sheddase for TGF-α and other membrane proteins in Adam17−/− cells by all criteria we could apply, including its response to an ADAM10-selective metalloprotease inhibitor (GI), ADAM10-shRNA, and dominant-negative ADAM10. Į Adam10/17−/− double knockout cells, IM-stimulated shedding of TGF-α could be rescued by both ADAM10 and ADAM17, demonstrating that calcium influx activates both ADAMs. However, PMA-dependent shedding of TGF-α could only be rescued by ADAM17, corroborating that only ADAM17 responds to short-term stimulation with PMA. Interestingly, IM-stimulated ADAM10 is sensitive to low nanomolar concentrations of TIMPs 1, 2, and 3 in cell-based assays, whereas purified soluble ADAM10 is inhibited by TIMPs 1 and 3, but not TIMP2, in vitro (Amour ir kt., 2000) (Supplemental Figure 3). Evidently, ADAM10 has a different inhibitor profile in cell-based assays compared with biochemical assays. Because MMP7 is a known sheddase of TNF-α and other membrane proteins (Powell ir kt., 1999 Haro ir kt., 2000 Li ir kt., 2002 Lynch ir kt., 2005), we also ruled out its involvement in IM-stimulated shedding by using Mmp7−/−/Adam17−/− double-knockout cells (Supplemental Figure 4). Moreover, following up on a previous report of an aminophenylmercuric acetate (APMA)-activated TGF-α sheddase in CHO cells lacking functional ADAM17 (Merlos-Suarez ir kt., 2001), we showed that ADAM10-dependent TGF-α shedding can be activated by APMA in Adam17−/− cells (Supplemental Figure 5). Finally, we confirmed that TGF-α released by ADAM10 retains its biological activity (Supplemental Figure 6).

The stimuli described above, such as PMA, IM, and APMA, are pleiotropic and not physiological, so we also evaluated shedding activated by the P2X7 nucleotide receptor, which is involved in many physiological aspects of the immune response (Chen and Brosnan, 2006 Moore and MacKenzie, 2007). Eksperimentai Adomas−/− mEFs as well as ADAM17-deficient primary B cells clearly established that both ADAMs 10 and 17 can be stimulated by the P2X7R in adherent fibroblasts and nonadherent primary B cells. Moreover, ADAM10 stimulated via P2X7R was able to shed substrates such as TNF-α, ICAM, and L-Selectin. Nevertheless, selective ADAM inhibitors confirmed that ADAM17 is the major sheddase for TNF-α, TGF-α, HB-EGF, and ICAM in P2X7R-stimulated CHO cells, where both ADAMs 10 and 17 are present. So, the ability of ADAM10 to shed substrates such as TNF-α or TGF-α after activation of P2X7R is also only evident in the absence of ADAM17.

Interestingly, acute inhibition of ADAM17 with an ADAM17-selective inhibitor blocked stimulated shedding of ADAM17 substrates from wt mEFs or CHO cells, whereas chronic inhibition of ADAM17 generated conditions that mimicked those in Adam17−/− cells, i.e., ADAM10 could take over shedding of ADAM17 substrates. These observations could be relevant for chronic and specific inhibition of ADAM17 in patients. A compensatory up-regulation of ADAM10 activity during chronic treatment with SP26 is unlikely, because there was no detectably increase in shedding of the ADAM10-substrate BTC. Perhaps chronic inactivation of ADAM17 leads to an accumulation of its substrates, which then become more accessible to ADAM10, possibly by “spilling over” into a compartment where ADAM10 is most active. The results obtained in primary B cells with endogenously expressed L-Selectin are consistent with this interpretation, because higher levels of L-Selectin are seen in the absence of ADAM17. Moreover, activation of these cells with IM or ATP does not lead to complete consumption of L-Selectin in Adam17−/− cells, suggesting that a subpopulation of L-Selectin is not accessible to ADAM10, even in the absence of ADAM17.

We predict that the results obtained with TGF-α, TNF-α, and several other membrane proteins (Supplemental Figure 1) are likely representative for many, if not most or all, proteins whose constitutive and PMA-stimulated shedding depends on ADAM17. However, although ADAM10 can, in principle, process substrates of ADAM17, it nevertheless normally does not when both enzymes are present, and a role for ADAM10 as a secondary sheddase has yet to be demonstrated in vivo. For example, ADAM10 cannot efficiently compensate for the loss of ADAM17 with respect to activating the EGFR during mouse development (Peschon ir kt., 1998 Jackson ir kt., 2003 Sternlicht ir kt., 2005), or in terms of generating soluble TNF-α in a mouse model for endotoxin shock (Bell ir kt., 2007 Horiuchi ir kt., 2007a). Therefore, we predict that ADAM17 will also emerge as the physiologically or pathologically more relevant sheddase of other membrane proteins that can be shed by both ADAM10 and 17, such as the amyloid precursor protein (Buxbaum ir kt., 1990 Lammich ir kt., 1999) and Klotho (Chen ir kt., 2007). In contrast, we found no evidence that ADAM17 can substitute as a sheddase for substrates of ADAM10 in Adam10−/− cells, at least in the presence of the stimuli used here. Finally, it should be noted that other ADAMs or non-ADAM metalloproteinases may also play significant roles as sheddases in other cell types or under different conditions than those tested here.

In summary, loss of function studies with cells lacking ADAM10 or ADAM17 or both have provided new insight into the principal components of a general, yet differentially regulated cellular shedding machinery for TGF-α, HB-EGF, TNF-α, L-Selectin, and several other membrane proteins. Because ectodomain shedding is increasingly being recognized as a critical signaling switch that affects the function of a large number of membrane proteins, these results are likely to provide a framework for understanding the regulation of processing of other membrane proteins by ADAMs 10 and 17. Based on our findings, we hypothesize that the substrate repertoire of ADAM10 can, in principle, overlap with that of ADAM17 in cells activated with IM, APMA or via the P2X7R. Nevertheless, identifying ADAM10 as an alternative sheddase for ADAM17 substrates is only relevant in the case of the deletion or the chronic inhibition of ADAM17, and for stimuli that will normally activate ADAM10. Clearly, defining the individual fingerprints of these two major sheddases under various conditions is a prerequisite for probing the mechanism underlying their regulation under specific physiological and pathological conditions. Moreover, it will be important to consider the implications of these results for the use of selective ADAM inhibitors to treat human diseases.