We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Jei turėtumėte izoliuotų bakterijų mėginį, kaip nustatytumėte, ar jie fiksuoja azotą?
Nesvarbu, kad pats radau atsakymą, galite naudoti acetileno mažinimo testą.
Prieš atliekant eksperimentus, siūlyčiau pirmiausia atlikti bioinformatinę bakterijų genomų paiešką. Ten turėtumėte rasti „nif“ (azoto fiksavimo) genų homologus.
Ar mes jau čia? Ilgas žingsnis siekiant sukurti veiksmingus simbiotinius ryšius tarp azotą fiksuojančių bakterijų ir ne ankštinių augalų
Azotas yra esminis gyvenimo elementas, o azoto prieinamumas dažnai riboja pasėlių derlių. Nuo Žaliosios revoliucijos iš atmosferos azoto ir gamtinių dujų buvo gaminami didžiuliai kiekiai sintetinių azoto trąšų, o tai kelia grėsmę pasaulinės maisto gamybos tvarumui ir kenkia aplinkai. Reikia alternatyvių priemonių azotui tiekti pasėliams, o geresnis biologinio azoto fiksavimo pranašumas atrodo logiškas pasirinkimas. Ankštiniai augalai naudojami daugelyje pasėlių sistemų visame pasaulyje dėl azotą fiksuojančios simbiozės su rizobijomis. Tačiau trys pagrindiniai pasaulio javų augalai – ryžiai, kviečiai ir kukurūzai – nesusiję su rizobija. Šioje apžvalgoje mes apžvelgsime, kaip genetiniai metodai rizobijose ir jų ankštinių augalų šeimininkuose leido pasiekti didžiulę pažangą suprantant molekulinius mechanizmus, kontroliuojančius šaknų mazgelių simbiozes, ir kaip šios žinios sudaro sąlygas kurti tokias asociacijas ne ankštinių augalų pasėliuose. Taip pat aptarsime iššūkius, kylančius diegiant šias sistemas į lauką ir kaip juos galima įveikti tarpdisciplininiu sintetinių biologų, mikrobiologų, augalų biologų, selekcininkų, agronomų ir politikos formuotojų bendradarbiavimu.
- „Kelbėjimo faktorius“, kurį išskiria rizobijos ir ankštinių augalų šaknų plaukų ląstelės.
- Skirtingos rizobijos padermės gamina skirtingus Nod faktorius ir
- skirtingi ankštiniai augalai gamina skirtingo specifiškumo receptorius.
Jei derinys teisingas, bakterijos patenka į šaknies epitelio ląstelę, tada migruoja į žievę. [Nuoroda į šaknies struktūrą.] Jų kelias eina per tarpląstelinį kanalą, kuris auga per vieną žievės ląstelę po kitos. Tai infekcijos siūlas Jį sukuria šaknų ląstelės, o ne bakterijos, ir susidaro tik reaguojant į infekciją.
Kai infekcijos siūlas pasiekia giliai žievėje esančią ląstelę, jis sprogsta ir endocitozė patraukia rizobijas į membraną. simbiosomos citoplazmoje. Šiuo metu ląstelė patiria kelis mitozės etapus – be citokinezės –, todėl ląstelė tampa poliploidine.
Elektroninėje mikrografijoje dešinėje (dr. D. C. Jordano sutikimu) matyti, kad ląstelėje auga rizobijos pripildytas infekcijos siūlas (iš viršutinės kairės į apatinę dešinę). Atkreipkite dėmesį, kaip infekcijos gijos sienelė yra ištisinė su ląstelės sienele. Tamsūs ovalai yra simbiosomos.
Tada žievės ląstelės pradeda sparčiai dalytis ir susidaro a mazgelis. Šį atsaką lemia citokininų perkėlimas iš epidermio ląstelių į žievės ląsteles.
Kairėje esančioje nuotraukoje (The Nitragin Co. Milwaukee, Viskonsino valstija) pavaizduoti mazgeliai ant ankštinio augalo šaknų.
Rhizobia taip pat išgyvena greito dauginimosi mazgelių ląstelėse laikotarpį. Tada jie pradeda keisti formą ir praranda judrumą. The bakterioidai, kaip jie dabar vadinami, gali beveik užpildyti ląstelę. Tik dabar prasideda azoto fiksacija.
Dešinėje esančioje elektroninėje mikrografijoje (R. R. Heberto sutikimas) matyti, kad iš sojos pupelių mazgo esančios ląstelės yra užpildytos bakterijomis. Horizontali linija žymi sienas tarp dviejų gretimų mazgelių ląstelių.
Šaknų mazgeliai nėra tiesiog bestruktūrės ląstelių masės. Ksilemas ir floemas kiekvieną sujungia su augalo kraujagyslių sistema. Žemiau esančioje nuotraukoje kairėje pavaizduota besivystanti šoninė žirnio šaknies šaknis. Jo dešinėje yra žirnio šaknies segmentas, kuriame pavaizduotas a besivystantis mazgelis 12 dienų po to, kai šaknis buvo užkrėstas rizobijomis. Abi struktūros yra sujungtos su augalo maistinių medžiagų transportavimo sistema (tamsi sritis, besitęsianti per šaknies centrą). (Mikrofotografijos padarytos velionio Johno G. Torrey'io sutikimu.)
Taigi mazgelių vystymasis, nors ir priklausomas nuo rizobijos, yra gerai koordinuotas augalo vystymosi procesas.
Nors kai kurios dirvožemio bakterijos (pvz. Azotobakterijos) gali patys surišti azotą, o rizobijos negali. Akivaizdu, kad rizobija ir ankštiniai augalai yra vienas nuo kito priklausomi.
Nauda ankštinių augalų šeimininkui yra aiški. Rhizobia daro ją nepriklausomą nuo dirvožemio azoto.
Bet kodėl ankštiniai augalai reikalingi? Ankštiniai augalai tikrai naudingi tuo, kad aprūpina maistinėmis medžiagomis bakterioidus, su kuriais jie sintezuoja didelius ATP kiekius, reikalingus azotui paversti (N2) į amoniaką (NH3)
Be to, ankštinių augalų šeimininkas tiekia vieną svarbiausią komponentą azoto genazės &mdash pagrindinį fermentą, fiksuojantį azotą.
Bakteroidams reikia deguonies, kad susidarytų ATP (ląstelinio kvėpavimo būdu). Tačiau azoto genazę stipriai slopina deguonis. Taigi bakterioidai turi nueiti smulkią ribą tarp per daug ir per mažai deguonies. Jų darbą palengvina kitas šeimininko indėlis: hemoglobino.
Mazgeliai užpildyti hemoglobinu. Tiesą sakant, tiek daug, kad ką tik nupjautas mazgelis yra raudonas. Ankštinių augalų hemoglobinas (vadinamas leghemoglobinu), kaip ir stuburinių gyvūnų hemoglobinas, tikriausiai tiekia reikiamą deguonies koncentraciją bakterioidams, kad patenkintų jų prieštaringus poreikius.
Metalas molibdenas yra svarbi sudedamoji dalis azoto genazės ir todėl yra absoliučiai būtinas azoto fiksavimui. Tačiau reikalingos sumos yra nepaprastai mažos. Nustatyta, kad vienos uncijos (28,3 g) molibdeno, paskleistos į akrą (0,4 ha) Australijos dirbamos žemės, pakanka vaisingumui atkurti daugiau nei dešimčiai metų.
Nuotraukoje dešinėje matyti, kad ankštiniai dobilai normaliai auga tik ten, kur pakanka molibdeno. Čia parodytame dirvožemyje (Rytų Australijoje) natūraliai trūksta molibdeno. Nors visas aptvertas sklypas buvo pasėtas dobilais, augalas galėjo klestėti ir fiksuoti azotą tik ten, kur buvo įdėta molibdeno trąšų (priekiniame plane). (Nuotrauka suteikta A. J. Anderson.)
Dėl Nod faktoriaus ir ankštinių augalų receptorių sąveikos specifiškumo kai kurios rizobijos padermės užkrės tik žirnius, kai kurios – tik dobilus, kai kurios – tik liucerną ir tt Ankštinių augalų sėklų apdorojimas tinkama rizobijos atmaina yra įprastinė žemės ūkio praktika. (Vieną iš aukščiau pateiktų nuotraukų pateikusi bendrovė Nitragin specializuojasi rizobinių štamų, tinkamų kiekvienam ankštiniam augalui, gamyboje.)
Ar genetiškai modifikuoti, azotą kaupiantys augalai galėtų pakeisti teršiančias sintetines trąšas?
Kreditas: Augalų mokslo tendencijosDaug kas girdėjo apie maistinę medžiagą azotą, bet kodėl tai svarbu augalams?
Tai pagrindinė baltymų sudedamoji dalis tiek grūduose (sėklose), kuriuos valgome, tiek lapuose. Azoto badaujantys lapai gali pageltonuoti ir jų fotosintezės greitis lėtesnis, o tai paverčia anglies dioksidu iš atmosferos naujais augalais.
Kad maistas būtų įperkamas ir apsaugotų aplinką, pasėlių augalams reikia tik tinkamo azoto kiekio, tačiau tai yra iššūkis ir ūkininkams, ir mokslininkams. Per daug azoto trąšų pasėliams užteršia upes ir šulinių vandenį, o dėl jų kainos brangsta maistas. Esant per mažai azoto, sumažėja derlius, o dėl pasiūlos ir paklausos disbalanso maistas brangsta. Dėl aukštesnių grūdų kainų taip pat gali būti pelningiau kirsti atogrąžų miškus žemės ūkiui.
Biologinis azoto fiksavimas yra galimas šių problemų sprendimas. Ankštiniai augalai, tokie kaip pupelės, žemės riešutai, sojos pupelės ir liucerna, didžiąją dalį azoto gauna iš simbiotinių bakterijų, žinomų kaip rizobijos, kurios paima azoto dujas iš oro ir paverčia jas formomis, kurias augalai gali naudoti, pavyzdžiui, amoniaką. Anglies junginiai, kurių reikia šakniastiebiams, gaunami iš jų augalų šeimininkų. Kitu atveju šie ištekliai galėjo būti naudojami norint pagaminti daugiau sėklų, todėl ankštiniai augalai sukūrė sudėtingus mechanizmus, kurie palaiko ne daugiau azoto fiksavimo, nei jiems reikia. Kai dirvožemyje yra pigesnių azoto šaltinių, tokių kaip amoniakas ar nitratai, ankštiniai augalai sudaro mažiau šaknų mazgų, kuriuose gyvena bakterijos, ir netgi gali uždaryti esamus mazgelius.
Biologinis azoto fiksavimas: nauda aplinkai ir mažesnė kaina?
Ar ne ankštiniai augalai taip pat galėtų kažkaip panaudoti azoto fiksavimą, o tai turėtų panašią naudą aplinkai? Jei taip, ar ūkininkai sutaupytų pakankamai pinigų trąšų sąnaudoms, kad subalansuotų derliaus sumažėjimą dėl išteklių nukreipimo nuo sėklų auginimo prie azoto fiksavimo? O gal patikimesnis azoto tiekimas iš tikrųjų padidintų derlių, nepaisant energijos sąnaudų?
Kukurūzai, kviečiai ir ryžiai nesudaro šaknų mazgų, tačiau kai kurios bakterijos, gyvenančios ant jų šaknų ar šalia jų, gali sulaikyti nedidelį azoto kiekį. Į Gamtos mikrobiologija, Ryu ir kt. aptarti šių bakterijų genetinį pagerėjimą. Paprastai jie fiksuoja mažai azoto arba jo visai nefiksuoja, jei yra veikiami deguonies, kuris sunaikina pagrindinį fermentą – azotogenazę, arba jei yra amoniako. Ryu ir kt. sugebėjo pakeisti šiuos bruožus, tačiau praktinis jų darbo pritaikymas toli gražu nėra tikras, net ir ilgalaikėje perspektyvoje.
Kreditas: Ryu ir kt.
Aplinkosaugos požiūriu azoto fiksavimo slopinimo panaikinimas amoniaku gali atrodyti kaip žingsnis atgal. Galų gale, ankštinių augalų sugebėjimas surinkti ne daugiau azoto, nei reikia, yra labai svarbus siekiant apriboti mūsų vandens išteklių taršą nitratais. Tačiau norime, kad azoto fiksavimo greitis priklausytų nuo bendrų augalų poreikių, o ne tik nuo amoniako kiekio aplink bakterijas. Taigi Ryu ir kt. Sukonstruotos bakterijos, reguliuojančios azoto fiksavimo greitį, reaguojant į augalų signalus. Tačiau energijos vis tiek turės gauti iš augalų. Ar azoto fiksavimo nauda pateisintų šias išlaidas? Būkime optimistiški ir manykime, kad iš pradžių taip bus.
Tačiau bakterijos vystosi. Net jei iš pradžių jie tiektų azotą už priimtiną kainą, nauda gali sumažėti tik per kelias dienas. Straipsnyje minima azoto fiksavimo „sporto našta“, dėl kurios nyksta rizobijos, kurios daugiau fiksuojasi. „Apgaudinėjantis“ mutantas, fiksuojantis tik tiek azoto, kiek jam pačiam reikia, augalui nieko papildomai neturėdamas, atlaisvintų resursus savo reprodukcijai ir perimtų.
22.1: Azoto metabolizmo apžvalga
Organinė chemija paprastai apibūdinama kaip anglies turinčių molekulių chemija. Bet ar šis apibrėžimas nėra šiek tiek angliescentrinis, ypač todėl, kad deguonies turinčių molekulių paplitimas yra stulbinantis? O kaip su azotu? Mes gyvename atmosferoje, kurioje gausu azoto (80%), o azoto turi visos biomolekulių klasės (lipidai, angliavandeniai, nukleino rūgštys ir baltymai). Diazotas yra labai stabilus, atsižvelgiant į jo trigubą ryšį ir nepoliškumą. Mes pasikliaujame keliais organizmais, kad pataisytume N2 iš atmosferos susidaro amonis (NH4 + ), kurie nitrifikacijos ir denitrifikacijos būdu gali sudaryti nitritus (NO2 - ), nitratas (NR2 - ), azoto oksidas (NO) ir azoto oksidas (N2O), pastarosios yra stiprios šiltnamio efektą sukeliančios dujos. Kitoje dalyje mes sutelksime dėmesį į aminorūgščių ir baltymų aminogrupių metabolinį likimą. Prieš tyrinėdami jų likimus, pažiūrėkite į žemiau esantį paveikslą, kuriame parodytas bendras biologinio azoto ciklo vaizdas. Biochemijos studijos turėtų apimti daugiau nei homo sapiens ir apimti ekosistemą, kurioje mes esame tokia maža, bet žalinga dalis.
Išskaidykime diagramą iš biocheminės perspektyvos. Yra aerobiniai ir anaerobiniai procesai (vykdomi bakterijų). Azoto turinčios medžiagos apima ir neorganines (amonio, nitrato, nitrito) ir organines (aminorūgštis, nukleotidus ir kt.) molekules. Rodomos reakcijos yra oksidacinės ir redukcinės (pastaba: azoto atomų oksidacijos skaičius molekulėse rodomas raudonai). Daugumą reakcijų po žeme vykdo bakteriniai ir archealiniai mikroorganizmai.
Štai keletas pagrindinių reakcijų:
- N2 fiksacija (redukcija): N2 iš oro bakterijos paverčia amoniu (NH4 + ) dirvožemio prokariotų fermento azoto genazės dėka. Energetiškai nepalankiai reakcijai reikia daug ATP. Pagamintą amonį gali pasisavinti pirminiai gamintojai, pavyzdžiui, augalai, ir įtraukti į biomolekules, tokias kaip aminorūgštys, kurias vartoja gyvūnai. Tiems, kurie vis dar tiki, kad žmonės daro nedidelį poveikį mūsų biosferai, apsvarstykite tai. Netrukus galime pataisyti daugiau N2 į NH3 per pramoninę Born-Haber reakciją (naudojamą trąšoms ir sprogstamųjų medžiagų gamybai), kurią gamina biosfera. Didžioji dalis naudojamo azoto gaunama iš Born-Haber reakcijos. NH perteklius4 + (daugiau nei 50%) gaminamas pramoninis ir kuris patenka į dirvą trąšose (daugiausia kaip NH4NE3) yra priblokštas gamtos gebėjimo subalansuoti azoto ciklą ir jo nepasisavina augalai. Mikroorganizmai jį metabolizuoja į nitritus ir nitratus.
- Nitrifikacija: Amonį oksiduojantys aerobiniai mikroorganizmai amonis paverčia nitritu, o atskira nitritus oksiduojančių aerobinių bakterijų grupė paverčia nitratais. Čia pateikiamos reakcijos (Rx 1 ir 2), kai per hidroksilamino tarpinį produktą susidaro nitratai, po kurių susidaro nitratas (Rx 3).
Šie pridėtiniai jonai viršija dirvožemio talpą ir galiausiai nuteka vanduo, užteršdami mūsų upes ir ežerus.
- Denitrifikacija: Šis anaerobinės reakcijos kelias atkuria N2 iš nitrato Štai grynoji reakcija:
- Anamokso reakcija: šis neseniai atrastas bakterinės anaerobinės reakcijos kelias paverčia amonį ir nitratą į N2. Čia yra grynoji reakcija
- Amonifikacija (nepainioti su mumifikacija) įvyksta, kai augalai ir gyvūnai suyra, o tai grąžina amonį į dirvą, kad augalai ir mikrobai galėtų jį pakartotinai panaudoti.
Šios reakcijos parodytos toliau pateiktame sutrumpintame azoto cikle.
Azoto metabolitai yra maistinės medžiagos augalams ir bene labiausiai importuojamos maistinės medžiagos reguliuojant augalų augimą (pirminį produktyvumą) ir reguliuojant gyvybės įvairovę biosferoje. Visiems gyviems organizmams reikalingos žaliavos energijai gaminti ir kaip substratai biosintetinėms reakcijoms. Kurie bus naudojami, priklauso nuo organizmo. Augalai yra pirminiai gamintojai, todėl jie naudoja savo susintetintus angliavandenius tiek energijai gaminti, tiek biosintezei. Mėsėdžiams baltymai ir iš jų gautos aminorūgštys yra energijos šaltinis (oksidacijos būdu) ir yra biosintezės pirmtakai. Organizmams, kurie yra visaėdžiai, energijos šaltinis priklauso nuo „maitintojo“ būsenos. Esant gausiems maisto ištekliams, angliavandeniai ir lipidai yra energijos šaltinis. Skirtingai nuo angliavandenių ir lipidų, kurie gali būti saugomi kaip glikogenas ir triacilgliceridai, kad juos būtų galima naudoti ateityje, baltymų ir su jais susijusių aminorūgščių perteklius negali būti saugomas, todėl aminorūgštis galima pašalinti arba panaudoti oksidacinei energijai.
Pavalgius pagrindinis šaltinis yra angliavandeniai, o nepavalgius – lipidai. Badaujant organizmo baltymai suskaidomi ir naudojami oksidacinei energijai gaminti bei bet kokiai likusiai biosintezei. Sergant tokiomis ligomis kaip diabetas, kurią galima prilyginti badavimui, kai yra daug angliavandenių, tiek lipidai, tiek aminorūgštys tampa energijos šaltiniais.
Kaip oksidaciniu būdu metabolizuojamos gyvūnų aminorūgštys? Tam būtų galima naudoti daugybę būdų, bet atrodytų logiška, kad NH4 + būtų pašalintas, o likusioje molekulėje esantys anglies junginiai galiausiai patektų į glikolizę arba TCA ciklą ketorūgščių pavidalu. NH4 + yra toksiškas didelėje koncentracijoje. Amonis nėra oksiduojamas iki nitritų ar nitratų, kaip dirvožemyje veikia mikroorganizmai. Jis gali būti perdirbamas atgal į nukleotidus ar aminorūgštis, o pertekliniai kiekiai pašalinami iš organizmo. Abu procesai turi būti griežtai kontroliuojami. Kitame skyriuje atkreipsime dėmesį į aminorūgščių oksidaciją.
Nitrogenazė: įvadas
Grožis yra žiūrinčiojo akyse.
Kadangi biochemijos sritis apima visą biologinį pasaulį, tam tikros temos aprėpties vadovėliuose mastas iš dalies gali priklausyti nuo medžiagą pateikiančio (-ių) autoriaus (-ių) susidomėjimo ir patirties. Ar tinkamumas yra metrika, kuri turėtų nustatyti aprėptį? Jei taip, knygose, kuriose daugiausia dėmesio skiriama žmogaus ar medicinos biochemijai, fotosintezė tikrai būtų praleista. Jei temos parenkamos pagal jų svarbą gyvenimui, fotosintezė tikrai turi būti aprėpta. Jei taip, tuomet turi būti įtraukta ir azotogenazė. Jei atsižvelgiama į cheminės reakcijos cheminio sudėtingumo laipsnį ir nuostabų išsivysčiusio biocheminio tirpalo iškalbingumą, reikia pateikti ir fotosintezę, ir azoto fiksaciją. Nors azoto fiksacija yra redukcinė reakcija, ji turi daug panašumų su deguonies išskiriamu fotosintezės kompleksu. Jie katalizuoja nepaprastai svarbias redokso reakcijas, kurios apima daug atmosferos dujų, naudojant labai sudėtingą ir unikalų neorganinį metalinį kofaktorių, kurį evoliucija atrinko kaip unikaliai tinkamą šiam darbui.
Kiekvienas pirmo kurso chemijos studentas gali nupiešti Lewiso diazoto struktūrą, N2, kuriame yra triguba jungtis ir viena pora ant kiekvieno azoto. Jei Lewiso struktūros kalba su jais, jos turėtų galėti teigti, kad trigubas ryšys daro N2 nepaprastai stabilus, taip paaiškindamas, kodėl galime kvėpuoti atmosfera, kurioje yra 80 % N2 ir nemirti. Jei jie ėmėsi biologijos, jie taip pat žino, kad labai nedaug biologinių organizmų gali panaudoti N2 kaip substratą, nes tam reikia nutraukti ryšius tarp azoto atomų, tai yra cheminis procesas, skirtas azotą fiksuojančioms bakterijoms, randamoms tam tikrų augalų šakniastiebiuose. Galiausiai jie tikriausiai įsiminė, kad procese, vadinamame Haber-Bosch procesu, naudojamas aukštas slėgis ir temperatūra, naudojama react N.2 ir H2 sudaryti amoniaką, NH3. Kaip ir bet kuri mokslo pažanga, Haber-Bosch procesas atnešė ir žalos (jis naudojamas sprogstamiesiems ginklams), ir naudos (trąšos). Šis procesas dabar ištaiso pakankamai N2 Trąšų pavidalu, kad išlaikytų pusę pasaulio gyventojų, o likusius – azoto. Dedamos pastangos genetiškai modifikuoti augalus, kad jie patys pasigamintų azoto, pašalinant trąšų poreikį, bet galbūt sukuriant nenumatytų problemų.
Galbūt nustebsite sužinoję, kad kambario temperatūroje pusiausvyros konstanta skatina amoniako susidarymą, vadinasi, DG 0 < 0. Reakcija yra palankesnė entalpiškai, nes kambario temperatūroje ji yra egzoterminė. Jis yra nepalankus entropiškai, kaip turėtų matytis iš toliau pateiktos subalansuotos lygties: N2(g) + 3H2(g) &rarr 2 NH3(g)
Jei reakcija termodinamiškai palanki kambario temperatūroje, kodėl ji vyksta? Ši istorija skamba pažįstamai, nes tas pats deskriptorius taikomas organinių molekulių oksidacijai dioksidu. Ten, naudodami MO teoriją, parodėme, kad reakcija yra kinetiškai lėta. Tas pats su NH3 formavimas. Paviršutiniškas būdas tai pamatyti yra tas, kad turime nutraukti ryšius stabilioje N2 pradėti reakciją, o tai lemia didelę aktyvacijos energiją, todėl reakcijos kinetika tampa vangi.
Galima būtų pradėti reakciją pakeliant temperatūrą, bet tai sulėtintų egzoterminę reakciją. Keq (arba KD) ir DG0 akivaizdžiai yra temperatūros ir šios reakcijos funkcijos, o aukštesnėje temperatūroje reakcija tampa nepalanki. Haberis rastas sprendimas buvo aukštas slėgis, priversdamas reakciją į tą pusę, kurioje yra mažiau dujų molekulių, ir aukštą temperatūrą, kad būtų įveiktas aktyvacijos energijos barjeras ir reakcija būtų kinetiškai įmanoma. Sudėtingi metaliniai katalizatoriai (magnetitas - Fe3O4 -su metalų oksidais, tokiais kaip CaO ir Al2O3 kurios neleidžia sumažinti Fe su H2) suteikia sugeriantį paviršių, kad sujungtų reagentus ir palengvintų jungties nutraukimą H2 ir N2.
Matėme, kad gamta, atrodo, įtraukė mechanizmus, susijusius su labai keistu deguonies išskiriamu Mn, Fe, S ir Ca kompleksu, kad oksiduotų kitą labai stabilią ir visur esančią molekulę H.2O. Dabar tyrinėjame nuostabius mechanizmus, esančius už azoto komplekso, kuris fiksuoja N2 kad susidarytų NH3.
Ko gali prireikti norint biologiškai paskatinti šią reakciją? Galite manyti, kad į sąrašą įtraukta:
energijos šaltinis, greičiausiai ATP, kuris paskatins šią sunkią reakciją, ir jūs būsite teisūs
elektronų šaltinis, kai N atomai pereina iš oksidacijos būsenos 0 elementiniame N į 3- NH3, šis šaltinis pasirodo esąs baltymas, vadinamas flavodoksinu arba ferridoksinu. Žinoma, šie elektronai taip pat turi įdomių šaltinių, kol jie nebuvo šių baltymų elektronų nešikliuose
kai kurie gana nuostabūs metaliniai centrai, kurie kontroliuojamai priima ir dovanoja elektronus, šie centrai dažniausiai yra FeS klasteriai su papildomu klasteriu, kuriame yra molibdeno (Mo). Klasteriai pavadinti F, P ir M
vandenilio šaltinis, kurį galėjote teisingai atspėti, kad jis nėra H2 dujos (iš kur jos?), bet H + jonai, kurių yra gana visur.
grynoji reakcija, kuri skiriasi nuo Haber-Bauscho proceso (N2 + 3H2 &rarr 2 NH3).
Štai tikroji azoto katalizuojama reakcija:
Šiek tiek pagalvokime apie reakciją. Pridedant elektronus, traukos tarp azoto atomų turi mažėti. Galų gale ryšiai tarp jų turi nutrūkti. Protonus galima lengvai pridėti, kad būtų išlaikytas krūvio neutralumas. Pagrindinis mechanizmas gali apimti tarpinius produktus, kaip parodyta toliau:
Azotogenazė taip pat gali naudoti kitas mažas molekules su trigubomis jungtimis, įskaitant: C=O: ir H-C=C-H.
Nitrogenazės struktūra
Nitrogenazė yra daugelio baltymų kompleksas, kuriame yra:
Du identiški subvienetai, E ir F, turintys mobiliojo elektronų nešiklio (baltymo ferrodoksino arba flavodoksino), ATP ir FeS kofaktoriaus (4Fe-4S, vadinamo F klasteriu), kurie priima elektronus, surišimo vietas. Todėl šie subvienetai vadinami azoto reduktazės subvienetais
alfa ir beta subvienetų heterodimeras. A (alfa grandinė) jungia 8Fe-7S F klasterį ir Fe-S-Mo M klasterį. Šiuos subvienetus sudaro (di)nitrogenazės subvienetai
Žemiau parodyta bendra baltymų komplekso struktūra su surištais ATP ir metalo centrais.
Interaktyvią azoto Jsmol struktūrą rasite toliau pateiktoje nuorodoje.
Patobulintas surištų kofaktorių ir ATP vaizdas toliau pateiktame paveikslėlyje parodytas ta pačia erdvine orientacija.
Metaliniai centrai žemiau pateikiami išsamiau tiek linijų, tiek tarpo užpildymo rodiniuose.
Mo yra prijungtas prie 3 sieros jonų ir dviejų OH ir 3-hidroksi-3-karboksi-adipo rūgšties karboksilo grupės aukščiau parodytoje kristalinėje struktūroje.
M klasteris turi intersticinį karbido joną, kuris gaunamas iš -CH3 prijungtas prie S-adenozil-metionino (SAM) sieros, leidžiančios karbidą paženklinti 13 C arba 14 C temperatūra mechaniniams tyrimams. Šie žymėti karbidai nėra keičiami arba naudojami kaip substratas, kai fermentas katalizuojamas. Taigi atrodo, kad karbidas tikriausiai tik stabilizuoja M klasterį. jis nebus rodomas toliau pateiktuose paveikslėliuose, kuriuose pavaizduoti išsamesni mechanizmai.
Azoto reakcija: 1 dalis – Elektronų ir protonų pridėjimas
Iš aukščiau pateiktų paveikslų turėtų matytis nuoseklus elektronų kelias nuo reduktazės subvieneto, kuriame yra F klasteris, iki P ir M klasterių azoto subvienete. Mes sutelksime dėmesį į N įrišimą2 ir kaip ji priima elektronus iš M klasterio. Žemiau esančiame paveikslėlyje parodytas FeMo kofaktorius ir kai kurios gretimos aminorūgščių liekanos. Mo nerodomas užpildant erdvę.
1 klausimas: jei Val 70 yra mutavęs į Ile, substratas nepasiekia klasterio. Kuri klasterio dalis greičiausiai sąveikauja su N2?
2 klausimas: jo šoninės grandinės dažnai randamos fermentų aktyviose vietose. Kokį vaidmenį jie gali atlikti katalizėje?
Lowe ir Thorneley (LT) modelis buvo pasiūlytas kaip azoto mažinimo mechanizmas. Šiame modelyje elektronas ir protonas pridedami prie oksiduotos fermento formos (Eo) gaminti E1. Tai pakartojama dar 3 kartus, kad susidarytų nuosekliai, E2, E3 ir E4. Tik tada N2 surišti ir sumažinti N2 atsirasti. Du iš pridėtų elektronų priima H + jonai, kurie sudaro H2, kuri išlaisvinta ant N2 privalomas.
3 klausimas: remiantis N ir H oksidacijos skaičiais N2, NH3, H+ ir H2 ir aukščiau aprašytas mechanizmas, ar tikitės, kad reikės 8 elektronų?
Kristalinė struktūra rodo 2 ATP, susietus su reduktazės subvienetu. Reakcijos stechiometrija rodo, kad panaudota 16 ATP. Paprasta matematika rodo, kad 2 ATP yra suskaidomi, kad būtų palaikomas vieno elektrono patekimas į kompleksą.
1 dalis – E1-E4: Potenciali E4 tarpinio produkto struktūra parodyta žemiau. Atkreipkite dėmesį, kad karbidas nerodomas. Tai dažnai vadinama Janus tarpiniu, nes yra katalizinio ciklo pusė. Jis pavadintas Januso, romėnų pradžios ir perėjimų dievo, vardu ir buvo priskiriamas vartams, durims, durų angoms ir praėjimui. Janusas paprastai rodomas dviem veidais: vienas žvelgia į ateitį ir kitas į praeitį.
4 klausimas: kaip galite pasakyti, kad šis skaičius reiškia E4?
Hidridai sujungia 2 Fe jonus, todėl tai yra trijų centrų dviejų elektronų ryšių pavyzdžiai.
Kaip atsiranda ši reakcija? Turime pažvelgti į organometalinę chemiją, kuri padėtų mums suprasti šio ir tolesnių veiksmų mechanizmą. Akivaizdu, kad prie metalų buvo pridėtas hidrido ekvivalentas, susijęs su metalo jonų oksidacija centre. Ši ypatinga reakcija vadinama an oksidacinis priedas. Tikėtina, kad sieros jonai veikia kaip Lewiso bazės, nes jie gauna protonus iš Lewis rūgšties, tikriausiai HI 195.
Oksidacinės prisijungimo reakcijos
Žemiau pateiktas paveikslėlis, rodantis trijų skirtingų tipų reagentų oksidacinius priedus. Atkreipkite dėmesį į konkretų H įterpimo pavyzdį2, pavyzdys, šiek tiek panašus į hidrido priedus į M klasterį. Oksidacinė redukcija lengviausiai įvyksta, kai dvi metalo jonų oksidacijos būsenos yra stabilios. Jis taip pat tinka metaliniams centrams, kurie nėra steriškai trukdomi (prasminga, jei reikia pridėti A-B) ir jei A-B turi mažą ryšio disociacijos energiją.
5 klausimas. Kokį vaidmenį gali turėti H+ jonai aukščiau parodytame E4 komplekse? Kodėl jie gali būti gana arti hidridų?
Vienas iš būdų tirti reakcijos tarpinius produktus yra juos sugauti. Jeigu N2 negali pasiekti surišimo vietos ir temperatūra sumažėja, susikaupę hidridai ir H + E4 gali sąveikauti, kai reakcija grįžta į E1.
6 klausimas: koks gali būti produktas tokiu atveju? Koks mutantas gali būti naudojamas bandant šį eksperimentą.
Azoto reakcija: 2 dalis – N redukcija2
Žingsnis E4–E5 atrodo šiek tiek keistas, nes H2 išsiskiria dujos. Atrodytų, kad tai švaisto ATP, bet turi būti akivaizdu, kad turėtume pasitikėti evoliucija, kuri sukūrė šį fermentą. Ar manote, kad šią reakciją palengvintų hidridai ant vieno Fe jono, Fe6? Mechanizmas yra dar viena klasikinė organometalinė reakcija, redukcinis pašalinimas, atvirkštinis oksidacinis pridėjimas.
Redukcinės eliminacijos reakcijos
Šioje reakcijoje molekulė pašalinama arba pašalinama iš komplekso, nes metalo jonas redukuojamas ir pridedami du elektronai. Žemiau pateiktame paveikslėlyje parodytas redukcinis pašalinimas. Redukcinis pašalinimas lengviausiai vyksta aukštesnės oksidacijos būsenos metalų centruose, kurie gali būti stabilizuojami redukuojant. Tai lengviausiai atsiranda iš daug elektronų turinčių ligandų ir jei kiti aplinkiniai ligandai yra dideli. Atsiskiriančios rūšys taip pat turi būti cis viena kitos atžvilgiu, nes išeidamos sudaro ryšį viena su kita.
Oksidacinis pridėjimas ir redukcinis pašalinimas metalo centruose dažnai yra sujungti metalo organuose kataliziniai ciklai tarp jų įvykus tam tikram pertvarkymui ar kitokiam pakeitimui. Pagalvok apie tai. Po viso LT ciklo FeS klasteriai turi grįžti į pradinę oksidacijos būseną. Pridėjus N, susidursime su kita organometaline reakcija2, migruojantis įterpimas, antroje reakcijos pusėje.
Ar H2g) tikrai paleistas? Norėdami tai ištirti, tyrėjai naudojo alternatyvų substratą, acetileną, HC=CH, dalyvaujant D2 ir N2 vandeninėje sistemoje.
Acetilenas buvo redukuotas ir susidarė C2H2D2 ir C2H3D. Taigi E4 turėjo turėti 2 D, o E2 tikriausiai 1. Šie rezultatai patvirtina grįžtamasis redukcinis pašalinimo mechanizmas E4 į E4:N2 reakcija aukščiau. Anksčiau buvo parodyta, kad H + yra sumažintas D2 dalyvaujant D2 ir N2 vandeninėje sistemoje, todėl šie rezultatai yra nuoseklūs. Papildomai palaikomas deuteris iš D2 nėra įtrauktas į produktus (C2H2D2, C2H3D arba HD), jei nėra N2.
Trumpam grįžkime prie jungiamųjų hidridų, kaip parodyta toliau esančiame paveikslėlyje.
Norėdami suformuoti H2, H-hidridai turi būti protonuoti.
5 klausimas: Aukščiau pateiktame modelyje hidridai rodomi kaip tilteliai (susiję su 3 centro, 2 elektronų ryšiais), o ne kaip galiniai (kaip parodyta H + ). Kas būtų atsparesnis protonavimui, taigi ir redukcinei eliminacijai, tiltams ar galiniams hidridams?
Tilto hidridai dabar yra pakankamai stabilūs, kad galėtų reaguoti su norimu substratu N2. M kofaktorius yra pakankamai didelis, kad sukurtų keturių Fe jonų paviršių (žr. paveikslėlį žemiau), kurie yra suderinti su karbidu apatinėje pusėje. Norint sukurti šį Fe jonų paviršių, reikia pakankamo dydžio klasterio su 6 Fes ir 1 centriniu C, sudarančių trikampę prizminę geometriją.
Azoto Fe centrų oksidacijos būsenos
Pirmoji pusė: Sunku būtų priskirti specifines oksidacijos būsenas kiekvienam Fe jonui M komplekse. Vietoj to galime priskirti santykinius oksidacijos būsenų pokyčius, kai reakcija vyksta nuo E0 iki E4. Kiekviename LT modelio žingsnyje pridedamas 1 elektronas. Pirmiausia tai priskirsime vidutiniam Fe jonui M 0 , kurio savavališkai priskirta oksidacijos būsena yra 0. Pridėjus 1 elektroną, oksidacijos būsena pasikeis nuo M 0 iki M -1, kai metalas redukuojamas. Tada M -1 būsena oksiduojama, kai elektronas perkeliamas į H +, o kai perkeliami 2 elektronai, susidaro vienas H -. Žemiau esančioje diagramoje parodytas oksidacijos būsenos pokytis pereinant nuo E0 iki E4.
Raudoni langeliai pabrėžia termodinaminio ciklo veiksmus, kurie parodo, kaip galima vizualizuoti Fe jonų (M) redokso būsenos pokyčius. Atkreipkite dėmesį, kad pereinant nuo E0 iki E4, tikroji M oksidacijos būsena pasikeičia nuo 0 iki +1 iki 0 iki +1 ir atgal iki 0. Tai gana nuostabu, atsižvelgiant į tai, kad buvo pridėti 4 elektronai. Taip pat atkreipkite dėmesį, kad raudoname langelyje nuo E0 iki E1 M keičiasi nuo -1 iki +1, o tai atitinka mūsų aprašytą oksidacinį priedą, kai metalo centras praranda du elektronus. Šis mechanizmas rodo, kad azoto genazę galima laikyti "hidrido saugojimo įrenginiu".
Antrasis kėlinys (atsižvelgiama į gamybos NH3):
Kaip sekasi N2 iš pradžių bendrauti su E4? Tai turi priklausyti nuo to, kaip hidridai išsiskiria kaip H2, kuris, kaip rodo įrodymai, atsiranda iki redukcinis pašalinimas (re), o ne hidrido protonavimas (AG). Be to, N2 labai greitai paverčiamas diazenu, HN = NH, su išeinančiu H2 paėmus su savimi 2 H + s ir 2 elektronus (arba redukuojančius ekvivalentus). Šie įvykiai gali įvykti taip, kaip parodyta paveikslėlyje žemiau.
Dabar su N2 surištas kaip diazenas (N2H2) ir H2 išsiskiria, likusi reakcija gali vykti taip, kaip parodyta toliau. Rodomas vienas naujas žingsnis – migruojantis įterpimas.
Dvi reakcijos pusės yra panašios su naudojamais jungiamaisiais hidridais. E4 Janus tarpinė sujungia abi puses.
Kaip galima nustatyti, ar bakterijos fiksuoja azotą, ar ne? – Biologija
References herein to the writing of lab reports and posters were current through Fall Semester, 2006. Since then, report guidelines for any current semester are in the present lab manual for Microbiology 102. However, even though this website for our old Bacteriology 102 course (splammo.net/bact102) was "retired" as of the end of Fall Semester, 2006, subject matter details throughout the site are still current , and questions asked on this page are generally worth pursuing regarding isolation of microorganisms, lab reports on such experiments, and examinations.
I. GENERAL INTRODUCTION
This page on our Bacteriology 102 website expands on the material given in the introduction to Experiment 11 in the manual and also serves to summarize major points regarding the following specific isolation experiments: 11.1 (purple non-sulfur photosynthetic bacteria), 11.2 ( Bacillus ), 11.3 (N 2 -fixers), 10.2 ( Streptomyces ) and 9.3 (bacteriophages). Even though bacteriophages are not bacteria but, rather, viruses which infect bacteria, many of these general principles will apply.
In this course, the selective enrichment/isolation concept applies not only to the isolation of the organisms indicated in the above-named experiments, but wherever we are isolating a certain type of organism from a natural source. This includes gram-negative bacteria from hamburger (Exp. 4), lactic acid bacteria from sauerkraut (Exp. 12), Staphylococcus aureus from the body (Exp. 13.1) and coliforms from water (Exp. 15). The basic principles also apply to the isolation and identification of the mixed unknowns (Exps. 7.2, 14.1 and 17).
The generalized procedure for the isolation and identification of any particular type of bacteria can be represented in the following flow chart:
ENRICHMENT AND ISOLATION | PURE CULTURE WORK | |||||||
SOURCE MEDŽIAGA | BROTH ENRICHMENT | PLATING FOR ISOLATION | STOCK CULTURES | CHARACTERIZATION & IDENTIFICATION | ||||
Consider inoculum: what organisms may or may not be present. May pre-treat inoculum, e.g., by heat-shocking. | Usually is selective. May be skipped altogether. | Usually selective or selective-differential &ndash but not always!! | ||||||
Throughout procedure, appropriate media and incubation conditions must be considered. |
In these experiments, we show how this general plan is applied productively to several specific, naturally-found groups of organisms . Students who took our Bacteriology 320 course from the mid-1970s through the 1990s will recognize this approach and recall the dozen or so different kinds of bacteria we obtained from a variety of natural sources &ndash intestinal and otherwise. Naturally the successful isolation of the small set of organisms in either course will not make us experts in the isolation of all kinds of bacteria &ndash nor has this author ever claimed to be such an expert(!) &ndash but we can appreciate the general plan and how samples, media and incubation conditions can be chosen appropriately for each type of organism such that the desired growth is enhanced with the inhibition of as many other kinds of organisms as possible . So, we provide the basic framework upon which we can hang the specifics of a given isolation situation, and such can be kept in mind out in the real world if the student encounters an entirely new isolation project. The author has applied this concept in the isolation of Edwardsiella (with appropriate pH-based differential media) and the purple non-sulfur photosynthetic bacteria &ndash both of which have been great fun &ndash and may possibly consider iron-oxidizing bacteria his third area of expertise in bacterial isolation.
I often put a multiple-true/false question like this on a quiz or final. We expect all statements to be false and sincerely hope no one teaches such heresy.
To isolate a certain kind of organism from a natural source, utilizing the enrichment and isolation principles we learned about in our experiments:
We can examine a sample from anywhere to find any kind of organism, as bacteria do tend to get around and can be found everywhere .
It is best to utilize an all-purpose medium to isolate as many different kinds of bacteria as possible. Then we can study all of the colonies obtained and choose which ones we want to continue with.
We always wish to compare our results to a general key to find out if we isolated the correct strains and got the correct determination of CFUs per gram of the sample.
We always try to duplicate the original habitat of the organisms in the laboratory as much as possible such that all organisms in any sample can continue to grow in the laboratory as they did out in their normal habitat.
We can expect to find a pure culture growing in any selective enrichment.
In the experiment on purple non-sulfur photosynthetic bacteria, we expect each different kind of colony on a plate to represent a different genus .
Generally speaking, it would be unthinkable to streak out a plate of an all-purpose medium from a sample and then examine all of the resulting colonies to find what we are after . (That is the literal "looking for the needle in the haystack" approach.) Most likely, the desired type of organism would be totally overgrown. In looking for some obscure organism in the environment &ndash for example, Edwardsiella tarda from a swimming beach &ndash one would never be expected to have generated a list of genera or species in that environment that were encountered on the way to finding the E. tarda . You don't have to be an expert on the microbial flora in the environment &ndash that's a separate issue for those who care to do that. Using selective procedures you would be inhibiting or killing most of them anyway in your attempt to recover (more easily) the desired organism.
Hopefully for our experiments, we will have a variety of samples from various probable habitats of these organisms. (Note the admonition in the manual to bring in your own samples !) Habitats from which the samples are taken are not homogenous and will vary considerably from each other, and they will themselves vary over time. We must never expect to replicate exactly anyone else's results or any supposed "typical" result! There is no "key" to tell us if we are "correct" when we isolate anything &ndash that is, there is no tally of specific genera or species to check off for any given source! For any of our experiments, we may isolate representatives of several genera from one sample and several species of only one genus from another. We may spot a "trend," and we may isolate a new species these are things that are fun to follow up on. At least we will come up with some new strains &ndash as we define that term here.
Sooner or later in your lecture course you will learn about lithotrophic organisms such as the iron-oxidizing bacteria which we really should be including in our lab course. (A few views of a habitat in which they are found are shown here.) Similarly we could do something with the symbiotic nitrogen-fixers, but &ndash at least &ndash we get an appreciation of what "special" medium can help sort out free-living nitrogen-fixers from other soil organisms, and we have demonstration materials that feature the effects of Rhizobium , a genus of organisms that fix nitrogen whilst in symbiosis with leguminous plants.
Here are some items to consider as you collect, analyze and present your data and observations:
- Taking notes in lab of various observations can be greatly facilitated by the use of tables which are also valuable in reports and posters. Also, flow charts can summarize procedures in a general way and can be used to great advantage in posters and in day-to-day preparation for lab. The set-up of flow charts and tables is discussed here.
- In the highlighted box above, we show a six-part multiple-true/false question. Be sure you understand why each of the six statements is false.
- Questions are posed below in Sections III and V concerning the setup of the various experiments and what we hope to find out about the cultures we isolate.
- Also, look over the relevant quiz questions in Appendix X of the lab manual. They test basic understanding of the general concept of isolating bacteria as well as major points about the specific kinds of organisms we are looking for.
- Be sure to go over the requirements for reports and posters associated with these experiments. Some questions to think about are found on this page.
Reference material concerning the isolation of various organisms can include some professionally-produced web pages, a good textbook (such as recent editions of Brock ) and also these items:
- The Prokaryotes , a multi-volume set. The updated on-line edition is found here and is the primary source of reliable information I recommend when questions keep pouring in about how to isolate whatever. As stated above, I do not claim to be an expert on such things &ndash or a general consultant, for that matter. But The Prokaryotes is where the experts on specific kinds of bacteria hang out. As an example of how one can begin to use The Prokaryotes on-line, type "Edwardsiella AND isolation" in the search box (without the quotes), and you might find a surprise.
II. TAILORING THE ENRICHMENT/ISOLATION PLAN TO SPECIFIC TYPES OF ORGANISMS
Many specific kinds of microorganisms can be obtained from their natural habitats (soil, water, etc.) by the creation in the laboratory of an artificial environment which will enhance their growth over competing organisms. We would not get far by replicating exactly the habitat from which a sample was taken. Morphological and/or physiological characteristics of the desired organisms which can give them special advantages over others are exploited in the formulation of culture media, the choice of incubation conditions, and any special treatment of the original source material itself. We want to inhibit as many "undesirable" organisms as possible so they do not interfere with the isolations of the desired organisms, and we want to satisfy the nutritional requirements of the desired organisms such that they grow well.
To help us detect and isolate a certain kind of organism and minimize interference by other organisms, the following considerations are made:
- Choice of suitable source material likely to contain the desired organism. Also, one can consider where the desired organism may occur as a significant contaminant. As mentioned elsewhere, purple non-sulfur photosynthetic bacteria have been found in samples of snow, ice and rain &ndash surely not to be considered as habitats for microorganisms.
- Often the source material is inoculated directly into a broth medium which will encourage the proliferation of the desired organism this is called an enrichment . When an enrichment is formulated to suppress the growth of undesired competitors, it is then a selective enrichment . A selective enrichment (such as what is utilized in Experiments 11.1 and 11.3) increases the probability that colonies of the desired organism will be isolated upon subsequent streak-plating and not crowded out by others. Selective enrichment media are useful in recovering organisms which are in very low numbers, and they are often formulated like their corresponding isolation media. Selective enrichments can also be used for certain organisms that are not necessarily in low numbers the "most probable number" method of quantitation involves their use as we shall find out in the water analysis experiment (Exp. 15).
- When plate counts are to be performed and/or when the desired organism is relatively abundant, no enrichment is made and the source material is plated directly (as in Experiments 10.2 and 11.2).
- Water samples can be passed through a filter which is then placed on the appropriate selective plating medium. This method is useful in the direct plating of samples containing low numbers of the desired organism and is discussed further and illustrated here.
- Temperature: How high or low can we go without inhibiting or killing the desired organism?
- Oxygen or no oxygen?
- Does the desired organism need an increased-CO 2 atmosphere?
- Is light necessary?
Note how the blank table on this page can be filled in to summarize the above points for the organisms we are isolating in these experiments.
III. ENRICHMENT AND ISOLATION MEDIA
Essential medium components can be manipulated (these are items from Appendix D):
- Carbon source: As an example, one can leave organic compounds out of the medium to allow for the growth of autotrophs which can obtain their carbon from atmospheric CO 2 which diffuses into the medium.
- Nitrogen source: For example, one can leave nitrogenous compounds out for the growth of " nitrogen-fixers " which can obtain atmospheric nitrogen (N 2 ). The so-called "nitrogen-free media" are indeed free of nitrogenous compounds but not N 2 which diffuses in from the air.
- Energy source: For example, photosynthetic bacteria utilize light as their ultimate source of energy , and any compounds that can serve as energy sources for other types of organisms can be left out of the medium.
- Compounds which can be used as growth factors (vitamins, amino acids, nucleic acid bases, fatty acids, etc.) and other special medium ingredients can be added as needed.
Here are some questions about specific medium components and procedures:
- Regarding purple non-sulfur photosynthetic bacteria: What is the "magic" of succinate ? Why use it as the carbon source?
- What do we really mean when we say " non-sulfur " regarding the very metabolically-diverse group of photosynthetic bacteria we are working with? If we were to look for various kinds of photosynthetic bacteria that can grow autotrophically, why might one include a sulfide compound in the medium?
- Regarding Streptomyces : What kind of compound serves as the primary source of carbon and energy (and nitrogen)? What does an organism need to produce in order to utilize such a compound? Why is it beneficial to re-streak our initial colonies on an all-purpose medium?
- Regarding the nitrogen-fixers: Why is there so much sugar in the enrichment and isolation media? Is it possible for non -nitrogen-fixers to grow in our enrichments and on our plates? How do we really know that we are isolating nitrogen-fixers?
- Why don't we need a selective medium when isolating Bacillus from soil?
- Why does the combination of (1) heating the initial soil suspension to 80°C and (2) aerobic incubation assure us of having virtually only Bacillus on our isolation plates? What two genera would we expect if we were to incubate the isolation plates anaerobically ?
- When we get to Experiment 12 on the lactic acid bacteria, consider why the combination of (1) a "rich" plating medium with sodium azide and (2) aerobic incubation conditions assures us of having virtually only aerotolerant anaerobes on the plates.
IV. DETECTION OF THE DESIRED ORGANISMS DURING THE ENRICHMENT AND ISOLATION PROCESS
The following gives a few examples of recognizable cultural and/or morphological characteristics of certain organisms which aid in their detection during enrichment and/or isolation. Click on the highlighted text for images and further explanation.
V. CHARACTERIZATION AND IDENTIFICATION OF OUR ISOLATES
We have neither the time nor the materials necessary to identify any of our bacterial isolates to the species level. Find a copy of Bergey's Manual and see what it takes to identify the dozens of species for the various genera we consider in our isolation experiments. A little more about bacterial identification is given here.
We can at least run some tests on pure cultures of our isolates to see if they follow the general pattern of what is expected for the genus or type of organism under consideration. And we can perform some "special" tests which are not essential to identify anything to the genus level, such as testing Streptomyces isolates for the ability to produce antibiotics and Bacillus isolates for the production of amylase.
For the organisms in Experiments 10.2 and 11, consider the following:
- Exp. 10.2 ( Streptomyces ): How did we recognize probable Streptomyces colonies, and what do the cells look like microscopically? Should we expect all Streptomyces isolates to be able to produce an antibiotic? What is our official definition of antibiotic ?
- As we incubated one tube of Succinate Agar in the dark and one in the light, which tube shows the pigmented phototrophic growth? Where do you see it? (Aerobically or anaerobically?)
- As we expect most purple non-sulfur bacteria to be "facultative phototrophs," do you see any growth in the tube incubated in the dark? (Aerobically or anaerobically?) Is there corresponding growth in the "light" tube?
- Click here to see the appearance of a "facultative phototroph" in this test.
- Why do we expect virtually any isolate from these plates to be a member of the genus Bacillus ? If you don't see endospores for any isolate, what might you do with the isolation plates in order to see endospores eventually? (It's hinted at in the lab manual!)
- As we have mentioned a number of times, some species of Bacillus are strictly aerobic and the others are facultatively anaerobic. How does this relate to the tests for catalase and glucose fermentation? Recall what we did in Experiment 7 to show the oxygen relationships of the twelve known cultures without the use of Thioglycollate Medium.
- Must we expect all isolates of Bacillus to give positive results for the amylase test? Remember in Experiment 7 that we tested only three of the dozens of Bacillus species.
- Do not be concerned if you did not isolate anything resembling Azotobacter. Other nitrogen-fixers are possible, but they would be a bit harder to identify with what little we did in lab. A non-motile gram-negative rod might suggest Klebsiella. Sometimes Bacillus (identifiable if endospores are apparent) is isolated. Why would we not expect Clostridium on our plates? (Think about the incubation conditions of the plates.) Just characterize each isolate the best you can, and do not go beyond the recommendations and precautions mentioned in the latter part of Experiment 11.3 , although some semesters we have media available to see whether or not any non-motile gram-negative rod is a Klebsiella. If you can't identify anything to genus based on the observations made, don't go sleepless about it! At least you can indicate whether or not each one was a nitrogen-fixer or a non-nitrogen-fixer.
- As for the slants we inoculate our isolates onto: Would you expect nitrogen-fixers to grow on the all-purpose medium? (Why not?) Would you expect a non-nitrogen-fixer to grow by itself on the N-free medium? (Why?) For there to be any growth on the N-free medium, the growth has to be initiated by a nitrogen-fixer, so a pure culture inoculated onto such a medium which grows (without any "help" from another organism) is considered by us to be a confirmed nitrogen-fixer. We always strive to inoculate any of our test media with a pure culture and this test is no exception. Furthermore, if a mixed/contaminated culture were to be inoculated onto an N-free Agar slant and it subsequently grew, there must have been a nitrogen-fixer included in the mixed inoculum. But at this point in the semester, let's not expect to be rampant contaminators any more &ndash what with our aseptic technique skills which had better not be deteriorating!
VI. A FEW GENERAL WORDS OF CAUTION especially to those not taking Bact. 102 at UW-Madison
The growth of cultures from natural sources (soil, water, human body, etc.) can be a dangerous undertaking and should only be done in a for-real microbiology lab. One can never tell if the growth of pathogens is being enhanced. Make sure all cultures are handled with the utmost care and are completely sterilized before they are discarded!
I cannot advise about laboratory techniques (such as learning the various bacteriological manipulations) via e-mail or even the phone. Take the course in the appropriate laboratory environment at a college or university and get your techniques certified.
Scientists identify corn that fixes its own nitrogen, needing less fertilizer
The dripping gel from this corn plant harbors bacteria that convert atmospheric nitrogen into a form usable by the plant. Photo: Howard-Yana ShapiroA public-private collaboration of researchers at the University of Wisconsin–Madison, the University of California, Davis, and Mars Inc., have identified varieties of tropical corn from Oaxaca, Mexico, that can acquire a significant amount of the nitrogen they need from the air by cooperating with bacteria.
To do so, the corn secretes copious globs of mucus-like gel out of arrays of aerial roots along its stalk. This gel harbors bacteria that convert atmospheric nitrogen into a form usable by the plant, a process called nitrogen fixation. The corn can acquire 30 to 80 percent of its nitrogen in this way, but the effectiveness depends on environmental factors like humidity and rain.
Scientists have long sought corn that could fix nitrogen, with the goal of reducing the crop’s high demand for artificial fertilizers, which have monetary, energy and environmental costs. Further research is required to determine if the trait can be bred into commercial cultivars of corn, the world’s most productive cereal crop.
Jean-Michel Ané
The findings were reported Aug. 7 in the journal PLOS Biology.
“It has been a long-term dream to transfer the ability to associate with nitrogen-fixing bacteria from legumes to cereals,” says Jean-Michel Ané, a professor of bacteriology and agronomy at UW–Madison and a co-author of the new study.
Legumes, such as beans, are the only group of crop plants previously known to acquire a significant amount of nitrogen through fixation, which they perform in specialized tissues called root nodules.
Howard-Yana Shapiro, the chief agricultural officer at Mars, a senior fellow in the Department of Plant Sciences at UC Davis and a co-author of the report, identified the indigenous varieties of corn in a search for cultivars that might be able to host nitrogen-fixing bacteria.
The corn is grown in the Sierra Mixe region of Oaxaca in southern Mexico, part of the region where corn was first domesticated by Native Americans thousands of years ago. Farmers in the area grow the corn in nitrogen-depleted soils using traditional practices with little or no fertilizer, conditions that have selected for a novel ability to acquire nitrogen. The biological materials for this investigation were accessed and utilized under an Access and Benefit Sharing Agreement with the Sierra Mixe community and with the permission of the Mexican government.
Nitrogen-fixing corn varieties secreting large amounts of sugar-rich gel as they grow in Madison, Wisconsin. Photo: Jean-Michel Ané
The corn is striking. Most corn varieties grow to about 12 feet and have just one or two groups of aerial roots that support the plant near its base. But the nitrogen-fixing varieties stand over 16 feet tall and develop up to eight or 10 sets of thick aerial roots that never reach the ground. Under the right conditions, these roots secrete large amounts of sugar-rich gel, providing the energy and oxygen-free conditions needed for nitrogen-fixing bacteria to thrive.
Establishing that plants are incorporating nitrogen from the air is technically challenging.
“It took us eight years of work to convince ourselves that this was not an artifact,” says Ané, whose lab specializes in studying and quantifying nitrogen fixation. “Technique after technique, they’re all giving the same result showing high levels of nitrogen fixation in this corn.”
The group used five different techniques across experiments in Mexico and Madison to confirm that the Sierra Mixe corn’s gel was indeed fixing nitrogen from the air and that the plant could incorporate this nitrogen into its tissues.
“What I think is cool about this project is it completely turns upside down the way we think about engineering nitrogen fixation,” says Ané.
The gel secreted by the corn’s aerial roots appears to work primarily by excluding oxygen and providing sugars to the right bacteria, sidestepping complex biological interactions. The research team was even able to simulate the natural gel’s effects with a similar gel created in the lab and seeded with bacteria. The simplicity of the system provides inspiration to researchers looking to identify or create more crop plants with this trait.
Nitrogen-fixing corn varieties secreting large amounts of sugar-rich gel as they grow in Madison, Wisconsin. Photo: Jean-Michel Ané
Breeding the trait into commercial cultivars of corn could reduce the need for artificial nitrogen fertilizers, which have a host of disadvantages. More than 1 percent of the world’s total energy production goes toward producing nitrogen fertilizer. Developed countries contend with waterways polluted by leaching nitrogen, while adequate fertilizer is often inaccessible or too expensive for farmers in developing countries. Corn that fixes some of its own nitrogen could mitigate these issues, but more research will be required.
“Engineering corn to fix nitrogen and form root nodules like legumes has been a dream and struggle of scientists for decades,” says Ané. “It turns out that this corn developed a totally different way to solve this nitrogen fixation problem. The scientific community probably underestimated nitrogen fixation in other crops because of its obsession with root nodules.”
“This corn showed us that nature can find solutions to some problems far beyond what scientists could ever imagine,” Ané says.
This story was originally published on the UW–Madison News site.
Nitrogen cycle for IGCSE Biology: Grade 9 Understanding 4.11B
I will make a blog post on each of the three “cycles” you need to know about for iGCSE. By far the most complicated is the Nitrogen cycle, so we might as well start there….
The first bit of understanding you need to is be clear the difference between how energy moves through an ecosystem and how matter (i.e. atoms) are exchanged between organisms and their environment. Energy in the ecosystems moves in a linear flow: there is no recycling of energy. The energy comes in at one end (in the producers through the process of photosynthesis) and is ultimately all lost as heat to the environment through the process of respiration. There is no possible way energy can be recycled. The “circle of life” that students like so much from Disney certainly does not apply here…. People find this idea very difficult to appreciate. All the time students will tell me that the energy in dead plants and animals goes into the soil and is then absorbed through the roots of plants: “it’s the circle of life sir” they earnestly tell me. And in the words of the late, great Amy Winehouse, I say “NO,NO,NO”…
Matter on the other hand is perdirbta through the ecosystem. The individual atoms that make up your body (H,O,C,N,S etc.etc,) have all been in other organisms and indeed will be again in the future. You took them in through your food and use these atoms to build the molecules that make up your cells. But ultimately all these atoms will leave your body either through metabolic processes or when you die and are decomposed. You could draw up a cycle for any of the atoms that are found in living things but your specification only requires you to understand two. How are carbon atoms cycled – the Carbon cycle – and how are nitrogen atoms cycled – the Nitrogen cycle. (You will also look at the Water cycle as well…..)
Things to understand about the Nitrogen Cycle:
1) Which molecules in living things contain nitrogen atoms?
Well the answer is fairly simple. Baltymai yra aminorūgščių polimerai. Amino acids all contain an -NH2 group (amine group) and so Nitrogen is found in proteins. The bases in DNA (Adenine, Cytosine, Guanine and Thymine) are described as nitrogenous bases and so they contain nitrogen too.
2) Where are nitrogen atoms found in the ecosystem other than in the molecules of living organisms?
This is more complicated. Nitrogen gas makes up 78% of the atmosphere so clearly there is a lot of nitrogen in the air. In the soil, there will be urea from the urine of animals and urea contains nitrogen. There are also a range of ions found in the soil that contain nitrogen: the two most important are ammonium NH4+ and nitrate, NO3-. (I don’t know how to do subscript and superscript in WordPress and so you will have to excuse the rather ugly molecular formulae)
3) How do nitrogen atoms move from the abiotic (non-living) parts of the ecosystem and into the organisms?
There is only one way nitrogen atoms can move from the abiotic environment and into the organisms in an ecosystem. This is via plants that can absorb nitrate ions from the soil in their roots. This is a slight simplification but it will do at the moment. Look at the diagram above and find the arrow that shows assimilation of nitrates from the soil into plants.
4) How many different kinds of soil bacteria are involved in cycling nitrogen?
You need to know about keturi different kinds of bacterial that live in the soil that play a role in recycling nitrogen. Use the diagram above and your notes to describe the role each of these organisms play in the cycling of nitrogen atoms in the ecosystem.
- Decomposers (Putrefying Bacteria)
- Nitrifikuojančios bakterijos
- Nitrogen-Fixing Bacteria
- Denitrifying Bacteria
I am off to have my supper: another post about these bacteria will appear here later tonight or tomorrow. Please don’t read it until you have tried to write down a paragraph on each of the four types of bacteria in the bullet point list above.
Displaced Cholera
It seems that many microbes once had a good purpose but have changed as a result of the Fall and now cause disease.
Cholera is a severe intestinal illness that humans get from contaminated water or food. It leads to severe diarrhea, shock, and even death. In its most virulent form, it can kill within three hours of infection. Cholera is caused by the bacterium Vibrio cholera, which produces a variety of toxins. Interestingly, most species related to Vibrio cholera grow harmlessly on the surface of practically all shelled ocean creatures and some fish. There they perform a valuable task: breaking down chitin, the main component of the hard outside shell, or exoskeleton, of crabs, shrimp, lobsters, and many other sea creatures. Without their help, oceans and beaches would be littered with billions of shells. The breakdown of chitin also returns precious nutrients like carbon and nitrogen back to the ocean.
Even more fascinating, some of the cholera components that are toxic to the human intestines are used to break down chitin. So creationists hypothesize that Vibrio cholera originally broke down chitin in the ocean, but after Adam’s Fall, God allowed them to spread beyond their proper place.
Disease-causing versions of Vibrio cholera may also have been genetically modified after the Fall. We have discovered that they have some extra DNA, apparently inserted by viruses, which allows the bacteria to produce toxin. Other types of cholera lack this DNA and are typically nontoxic.
Farmers Can Now Buy Designer Microbes to Replace Fertilizer
Norėdami peržiūrėti šį straipsnį, apsilankykite „Mano profilis“, tada – „Peržiūrėti išsaugotas istorijas“.
Wichan Nikhrothanon/EyeEm/Getty Images
Norėdami peržiūrėti šį straipsnį, apsilankykite „Mano profilis“, tada – „Peržiūrėti išsaugotas istorijas“.
Jake Misch’s family has been growing corn in the sandy soils of northwestern Indiana for four generations. Like other farmers in the area, the Misches spray their fields with a nitrogen-rich fertilizer once in the spring when the seeds are planted, and once later in the year, when the corn is going through its growth spurt. Fertilizing is essential to yielding a healthy harvest, but it’s expensive enough that he stresses about it, and, as he’s well aware, it’s not great for the planet.
Which is why next year, Misch is trying something new. In the spring he’ll douse his freshly furrowed corn seeds with a liquid probiotic for plants. As the seedlings grow, these special microbes will colonize their roots, forming hairy nodes and converting atmospheric nitrogen into a form that plants can use to turn sunlight into sugar. If all goes as planned, those little critters will produce 25 pounds of usable nitrogen for every acre of corn.
At least, that’s what Pivot Bio is promising. The Berkeley, California, biotech startup announced today its commercial launch of the first and only nitrogen-producing microbial treatment for US corn farmers. It’s not a complete and total replacement for fertilizer, but the product aims to reduce farmer’s reliance on it. Fertilizer production is a huge contributor to greenhouse gases. Once it’s on fields, it can leach into aquifers or run off into rivers, leading to toxic algae blooms. According to Pivot, if every corn farmer in the US followed Misch’s lead, it would be the environmental equivalent of removing one million cars from the road.
“We’re trying to create an ecological zeitgeist,” says Karsten Temme, CEO and cofounder of Pivot. The company also announced that it had raised $70 million in series B funding, led by Bill Gates’ Breakthrough Energy Ventures, an investment fund that aims to drastically cut greenhouse gas emissions.
Using underground microbes to solve modern agriculture’s biggest challenges is not an altogether new idea. Farmers have been lacing their fields with pest-killing bacteria for decades. But money only recently started flowing into Big Ag microbials. Startups like Pivot and Indigo Ag began hunting down useful organisms to turn into products in 2014. Last year, German biotech giant Bayer launched a $100 million joint venture with Ginkgo Bioworks, an organism-engineering outfit, to create self-fertilizing crops with the help of designer bacteria.
That company, now called Joyn Bio, is using every trick in the synthetic biology trade to engineer organisms that can do for corn and wheat what naturally occurring microbes do for legume crops like soybeans. It’s still two to three years from field testing its first product.
Pivot, on the other hand, saw a way forward with what nature had already provided. There were bacteria, they knew, that lived on corn roots, that had nitrogen-fixing genes encoded in their DNA. But because the process is so energy-expensive, those bacteria only flipped those genes when needed. And because farmers always plant in fertilized fields, those genes had gone dormant over the decades. Someone just had to turn them back on. “What we’re trying to do is actually reawaken this function that the microbe has had all along,” says Temme.
But first, they had to find ’em. To start, Pivot bought buckets of soil from farmers throughout the US corn belt. Into that soil, the company’s scientists planted young corn seedlings called “bait plants” because of the substances they excrete to attract beneficial bacteria. Think of it like agricultural Tinder the corn swipes right on microbes that make its life easier. Out of thousands of bugs that might be in the soil, the plant pulls out maybe a dozen or so. Then Pivot’s scientists grind up the roots and dab the mixture onto a plate of agar devoid of nitrogen. Anything that survives must be making its own.
Once they’ve got some good candidate bacteria, says Pivot scientist Sarah Bloch, they use gene editing tools to rewire their gene expression programs. The goal is to keep the nitrogen-fixing activity turned on, even in the presence of fertilizer. “We’ll take a promising strain and remodel it 100 different ways and test all those approaches to see which one is best,” she says. Sometimes, big breakthroughs come from surprising places. The strain that makes up Pivot’s first product, which will be available to farmers in select states for the next growing season, came from land in Missouri belonging to Bloch’s father.
“A lot of our early samples came from people we know—friends and family,” says Bloch. “It just turned out that we hit the jackpot on my dad’s sample.”
That product was tested in five generations of small field trials before going into larger trials this summer. Pivot worked with twenty-five farmers across the US to each grow a few acres using the liquid probiotic treatment. The harvest has yet to come in, and the data with it, but farmers like Misch are already excited. He learned on Twitter that an associate of his was participating in the trial, so Misch stopped by his farm to walk the test rows last week. What he saw convinced him to sign up to be Pivot’s first customer in Indiana. “If you go back 10 years, biologics get a mixed review from farmers,” says Misch. “These are living organisms and they act with every environment differently, but the science has come a long way.” The way Misch crunches the numbers, using this kind of probiotic plant treatment could save him $20 an acre, or about a third of his current annual nitrogen investment.
Is it enough to save the planet? O gal ir ne. But at least it's a step in the right direction.