We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Ką išmoksite daryti: aptarkite gyvūnų audinių struktūras
Daugialąsčių sudėtingų gyvūnų audiniai yra keturi pagrindiniai tipai: epiteliniai, jungiamieji, raumeniniai ir nerviniai. Organų sistemos susijungia, kad sukurtų visą organizmą.
Pirminės ląstelių kultūros pagrindai
Pirminės ląstelės labiausiai atspindi kilmės audinį. Jie paimami tiesiai iš audinio ir apdorojami, siekiant sukurti optimalias auginimo sąlygas. Kadangi jie yra gauti iš audinio ir nėra modifikuoti, jie yra panašesni į in vivo būklė ir normali fiziologija. Dėl šios priežasties jie suteikia puikias modelių sistemas normaliai ląstelių fiziologijai ir biochemijai (pvz., medžiagų apykaitos tyrimams, senėjimui, signalizacijos tyrimams) ir vaistų bei toksinių junginių poveikiui ląstelėms tirti. Atminkite, kad pirminės ląstelės turi ribotą gyvenimo trukmę ir nustos dalytis (arba sensta) po tam tikro skaičiaus ląstelių dalijimosi, todėl jas kultivuoti ir prižiūrėti gali būti sunkiau nei ištisinę ląstelių liniją. Pirminių ląstelių, gautų iš donorų ir subkultūros praktikos metu, kintamumas yra pagrindinis iššūkis, su kuriuo susiduria mokslininkai, tyrinėjantys ląstelių signalizacijos kelius. Prieš pradėdami signalizacijos tyrimus, mokslininkai nori patikrinti ląstelių jautrumą bendriems dirgikliams. Iš anksto patikrintos pirminės ląstelės taupo vertingus išteklius, nes jos skatinamos aktyvuoti pagrindinius signalizacijos kelius.
Populiariausios pirminių ląstelių rūšys, naudojamos tyrimams, yra epitelio ląstelės, fibroblastai, keratinocitai, melanocitai, endotelio ląstelės, raumenų ląstelės, kraujodaros ir mezenchiminės kamieninės ląstelės. Iš pradžių kultūros yra nevienalytės (atstovauja audinyje esančių ląstelių tipų mišiniui) ir gali būti palaikomos. in vitro tik ribotą laiką. Pirminėmis ląstelėmis galima manipuliuoti neribotai subkultūrai naudojant in vitro procesas vadinamas transformacija. Transformacija gali vykti spontaniškai arba gali būti sukelta chemiškai ar virusais. Kai pirminėje kultūroje vyksta genetinė transformacija (pateikiama atitinkama šviežia terpė ir erdvė), jos dalijasi neribotą laiką ir tampa įamžinta antrine ląstelių linija.
Figūra 1. Biomedicininiuose tyrimuose dažniausiai naudojamų pirminių ląstelių pavyzdžiai.
Įvadas
Kasmet visame pasaulyje eksperimentams arba biomedicinos pramonei tiekti naudojama daugiau nei 115 milijonų gyvūnų. 1 Eksperimentai su gyvūnais (toliau – ȁ gyvūnais”) skirstomi į dvi kategorijas: pagrindinius (t. y. pagrindinės biologijos ir žmogaus ligų tyrimas) ir taikomuosius (t. y. vaistų tyrimus ir kūrimą bei toksiškumo ir saugos bandymus). Nepaisant suskirstymo į kategorijas, eksperimentai su gyvūnais yra skirti informuoti žmogaus biologijos ir sveikatos mokslus bei skatinti galimų gydymo būdų saugumą ir veiksmingumą. Nepaisant didžiulių išteklių naudojimo, sukeltų gyvūnų kančių ir poveikio žmonių sveikatai, eksperimentų su gyvūnais veiksmingumo klausimas buvo mažai sistemingai nagrinėjamas. 2
Nors plačiai pripažįstama, kad medicina turi būti paremta įrodymais, eksperimentai su gyvūnais, kaip priemonė informuoti apie žmonių sveikatą, praktiškai neatitinka šio standarto. Dėl šio fakto stebina tai, kad eksperimentai su gyvūnais paprastai laikomi numatytuoju ir auksiniu ikiklinikinių bandymų standartu ir paprastai palaikomi be kritinio jų pagrįstumo tyrimo. 2008 m. paskelbta anekdotinių atvejų ir pareiškimų, kuriais remiamas eksperimentai su gyvūnais, tyrimas rodo, kad jis nebuvo ir negalėjo būti patvirtintas kaip būtinas biomedicininių tyrimų žingsnis, o apklausa kelia abejonių dėl jo nuspėjamumo. 3 Parodau, kad eksperimentai su gyvūnais prastai nuspėja žmonių rezultatus, 4 kad jie yra nepatikimi įvairiose ligų srityse, 5 ir kad esama literatūra rodo eksperimentų su gyvūnais nepatikimumą, todėl pažeidžiami moksliniai argumentai, kuriais jie remiasi. Be to, parodau, kad kolektyvinė žala, atsirandanti dėl nepatikimos praktikos, paverčia etinę žalos ir naudos skalę, o ne tęsiant daugumą, jei ne visų, eksperimentų su gyvūnais. 6
Atsižvelgiant į kultūros gyvavimo trukmę, ląstelių linijos skirstomos į du tipus:
Baigtinės ląstelių linijos
Ląstelių linijos, kurios praeina per ribotą ląstelių dalijimosi skaičių ir turi ribotą gyvenimo trukmę, yra žinomos kaip baigtinės ląstelių linijos. Ląstelės praeina keletą kartų ir praranda gebėjimą daugintis, o tai yra genetiškai nulemtas įvykis, žinomas kaip senėjimas. Ląstelių linijos, gautos iš pirminių normalių ląstelių kultūrų, yra baigtinės ląstelių linijos.
Nepertraukiamos ląstelių linijos
Kai baigtinė ląstelių linija transformuojasi ir įgyja galimybę neribotai dalytis, ji tampa ištisine ląstelių linija. Tokia transformacija/mutacija gali įvykti spontaniškai arba gali būti sukelta chemiškai ar virusais arba sukūrus ląstelių kultūras iš piktybinio audinio. Tokiu būdu paruoštos ląstelių kultūros gali būti subkultūruojamos ir auginamos neribotą laiką kaip nuolatinės ląstelių linijos ir yra nemirtingos.
Šios ląstelės yra mažiau prilipusios, greitai auga, mažiau reikalauja mitybos reikalavimų, gali augti iki didesnio ląstelių tankio ir skiriasi nuo pradinio audinio fenotipais. Tokios ląstelės labiau auga suspensijoje. Jie taip pat turi tendenciją augti vienas ant kito daugiasluoksniais kultūros indo paviršių.
Gyvūnų ląstelių kultūros tipai
Atsižvelgiant į ląstelių augimą ir dalijimąsi, gyvūnų ląstelių kultūra skirstoma į šiuos du tipus:
Pirminė ląstelių kultūra
Jis apibrėžiamas kaip ląstelė, auganti iš šeimininko audinio. Ląstelės gali būti gaunamos tiesiogiai mechaniniu metodu ir netiesiogiai, naudojant fermentinį poveikį. Gavus ląsteles, jos turi būti kultivuojamos tinkamoje talpykloje, kurioje turi būti visos maistinės medžiagos, reikalingos ląstelių dalijimuisi ir augimui. Pirminių ląstelių augimas vyksta arba kaip prilipęs monosluoksnis ant kietosios laikmenos arba kaip a sustabdymas skystoje terpėje.
- Prilipusios ląstelės: Šios ląstelės prilimpa prie kieto paviršiaus ir sukuria vieno sluoksnio ląstelių populiaciją. Prilipusios ląstelės kartais vadinamos a susiliejanti ląstelė, kuriame ląstelės susilieja arba susitraukia, kad užpildytų paviršiaus plotą. Fibroblastai ir epitelio ląstelės yra prilipusių ląstelių pavyzdžiai. Prilipusių ląstelių savybės apima:
- Prilipusios ląstelės priklauso nuo tvirtinimo vietos.
- Auga vienasluoksniu modeliu.
- Augimas vyksta ant kieto paviršiaus arba, galima sakyti, ant kietos terpės.
- Prilipusios ląstelės užpildo visą konteinerio arba indo paviršiaus plotą kaip vienasluoksnis sluoksnis.
- Prilipusios ląstelės vadovaujasi kontrakto slopinimo savybe, kai pati ląstelė sustabdo kai kurių ląstelių augimą, kad išlaikytų sinchronizuotą būseną per cheminį signalizavimą. Susidarius monosluoksniui, naujų ląstelių susidarymą slopina prilipusios ląstelės.
- Pakabos ląstelės: Tai ląstelės, kurios neprilimpa prie terpės paviršiaus. Suspensijos ląstelės yra ląstelės, kurios plūduriuoja kaip suspensija virš skystos terpės. Suspensijos elementų savybės yra šios:
- Pakabos ląstelės nepriklauso nuo tvirtinimo vietos.
- Plūduriuoja kaip ląstelių suspensija virš skystos auginimo terpės.
- Augimas vyksta skystoje maistinėje terpėje.
- Suspensijos ląstelės auga daug greičiau nei prilipusios ląstelės.
- Suspensijos ląstelėse yra trumpa vėlavimo fazė.
- Ląstelių disociacijai fermentų veikimo nereikia.
Antrinė ląstelių kultūra
Tai apibrėžiama kaip pirminių ląstelių, kurios vėliau gamina antrines ląstelių linijas, subkultūra. Pirminių ląstelių perėjimas arba subkultūra lemia fenotipinį ir genotipinį ląstelių populiacijos vienodumą. Po subkultūros ląstelių linijos skirsis nuo pradinių ląstelių. Atsižvelgiant į ląstelės gyvavimo trukmę, ląstelių linijas galima suskirstyti į:
- Baigtinės ląstelių linijos: Čia ląstelės turi ribotą gyvenimo trukmę ir rodo ribotą ląstelių dalijimąsi. Perėjimo vertė yra mažesnė, nes ląstelės po kurio laiko praranda gebėjimą augti ar daugintis ir pereina į senėjimo arba senėjimo fazę.
Pavyzdys: normalios ląstelės gamina baigtines ląstelių linijas. - Nepertraukiamos ląstelių linijos: Ištisinėse ląstelių linijose ląstelių dalijimosi skaičius ir perėjimo reikšmė yra neapibrėžta. Perėjimo reikšmė yra daugiau, nes ištisinės ląstelės nepraranda gebėjimo dalytis, t. y. jos gali augti ir dalytis be galo daug kartų.
Pavyzdys: vėžinės ląstelės gamina begalines arba ištisines ląstelių linijas.
Procesas
Gyvūnų ląstelių kultūros procesą galima apibendrinti į šias serijas:
- Audinių eksplantas: Tai apima audinių pašalinimą iš organo.
- Ląstelių ekstrahavimas: Tai atliekama mechaniškai arba fermentiniu būdu. Ekstrahavimas dažniausiai atliekamas veikiant fermentams arba tripsinizacijos procesu.
- Kultivavimas maistinėje terpėje: Po to ląstelės kultivuojamos kietoje maistinėje terpėje arba skystoje maistinėje terpėje. Pirminės ląstelės sudaro monosluoksnį ant kietos maistinės terpės, o atrodo kaip ląstelių suspensija virš skystos terpės.
- Subkultūrinimas: Jis taip pat vadinamas ląstelių perėjimas. Subkultūra atliekama susiformavus pirminėms ląstelėms, todėl svarbu nuolat tirti arba auginti ląsteles. Tai yra svarbiausias žingsnis ląstelių kultūroje, padedantis suprasti ląstelės tipą.
Normalios ląstelės: Šios ląstelės turi mažą perėjimo vertę, nes po kurio laiko jos praranda gebėjimą dalytis dėl ląstelių senėjimo. Todėl ląstelė dalijasi, kad susidarytų tam tikros ląstelių linijos.
Nuolatinės ląstelės: Šios ląstelės turi didelę pralaidumo vertę, nes ląstelės turi galimybę nuolat dalytis. Todėl ląstelė dalijasi, kad susidarytų neapibrėžtos ląstelių linijos.
Praėjimo vertė yra tiesiogiai proporcinga ląstelės tipui ir ląstelių dalijimuisi.
- Ištisinėms ląstelėms padidėja praėjimo vertė, todėl ląstelių dalijimasis bus didesnis.
- Normalioms ląstelėms praėjimo vertė mažėja ląstelei senstant, todėl sumažės ir ląstelių dalijimosi pajėgumas.
Skirtumas tarp normalių ir nuolatinių ląstelių
- Normali ląstelė gamina vienasluoksnį sluoksnį, o ištisinė ląstelė ne.
- Ištisinė ląstelė nesilaiko susitraukimo slopinimo savybių, o normalios ląstelės seka.
- Įprasta ląstelė turi savybę dalytis tam tikrą laiką, o ištisinė ląstelė turi savybę dalytis vėl ir vėl.
- Nepertraukiamos ląstelės turi didelę pralaidumo vertę, o normalios ląstelės turi mažą pralaidumo vertę.
- Dalijimosi gebėjimas ištisinėje ląstelėje išlieka toks pat kaip ir pirmojo pasėjimo metu, o dalijimosi gebėjimas mažėja dėl ląstelių senėjimo normaliose ląstelėse.
Privalumai
- Gyvūnų ląstelių kultūroje naudojamas mažas reagentų kiekis.
- Serijinis pasėjimas palaiko ląstelių tipų homogeniškumą.
- Suteikia kontroliuojamas fiziologines sąlygas.
- Suteikia kontroliuojamas fizikines ir chemines sąlygas, tokias kaip temperatūra, deguonies koncentracija, pH ir kt.
Trūkumai
- Gyvūnų ląstelių kultūrai reikia aukšti techniniai įgūdžiai aiškinti ir reguliuoti gyvūnų ląstelių auginimą.
- Tai labai brangus būdas atlikti.
Programos
Gyvūnų ląstelių kultūra yra modelis, leidžiantis ištirti vaistų poveikį, ląstelės biochemiją ir kt. Pagal gyvūnų ląstelių kultūrą galime atlikti audinių inžinerija. Tai taip pat padeda mums nustatyti vėžinė ląstelė nes ir normalios, ir ištisinės ląstelės gali būti auginamos gyvūnų ląstelių kultūroje.
Taip pat galime ištirti viruso replikaciją ir gyvavimo ciklą, todėl jis atlieka svarbų vaidmenį viruso srityje virusologija. Gyvūnų ląstelių kultūroje taip pat galime ištirti skirtingų vaistų poveikį skirtingiems ląstelių tipams, todėl tai taip pat padeda toksiškumo bandymas.
Gyvūnų ląstelių auginimo terpė: apžvalga
Tinkamos auginimo terpės parinkimas ląstelių auginimui in vitro yra svarbus ir esminis žingsnis. Organizmo organo žinduolių ląstelės maistines medžiagas gauna iš kraujotakos.
Kultivuojant šias ląsteles in vitro, tikimasi, kad jos turi būti aprūpintos komponentais, panašiais į esančius kraujyje. Apskritai terpės pasirinkimas labiausiai priklauso nuo auginamų ląstelių tipo ir kultūros paskirties (augimo, diferenciacijos ir norimų produktų gamybos). Auginimo terpė gali būti natūrali arba dirbtinė.
Natūrali medija:
Pirmaisiais metais buvo naudojamos natūralios terpės, gautos iš įvairių biologinių šaltinių.
Plazma, serumas, limfa, amniono skystis, ascito ir pleuros skysčiai, akių vandeninis skystis ir vabzdžių hemolimfa buvo plačiai naudojami. Šie skysčiai buvo išbandyti dėl sterilumo ir toksiškumo prieš juos panaudojant.
Tarp audinių ekstraktų dažniausiai buvo naudojamas viščiukų embriono ekstraktas. Kepenų, blužnies, kaulų čiulpų ir leukocitų ekstraktai taip pat buvo naudojami kaip auginimo terpė. Kai kurie darbuotojai organų kultūrai vis dar teikia pirmenybę natūralioms terpėms.
Dirbtinė laikmena:
Dirbtinės terpės (kuriose yra iš dalies apibrėžtų komponentų) buvo naudojamos ląstelių kultūrai nuo 1950 m.
Minimalūs kriterijai, reikalingi renkantis terpę gyvūnų ląstelių kultūroms, yra išvardyti žemiau:
i. Terpė turėtų aprūpinti ląsteles visomis maistinėmis medžiagomis.
ii. Palaikykite fiziologinį pH maždaug 7,0 naudodami tinkamą buferį.
iii. Terpė turi būti sterili ir izotoninė ląstelėms.
Ląstelių auginimo terpės pagrindas buvo subalansuotas druskos tirpalas, kuris iš pradžių buvo naudojamas sukurti fiziologinį pH ir osmoliarumą, reikalingą ląstelių palaikymui in vitro. Ląstelių augimui ir dauginimuisi skatinti buvo pridėta įvairių sudedamųjų dalių (gliukozės, amino rūgščių, vitaminų, augimo faktorių, antibiotikų ir kt.), sukurtos kelios terpės.
Serumo įpylimas į įvairias terpes yra įprasta praktika. Tačiau kai kurie darbuotojai pastaraisiais metais pradėjo naudoti terpę be serumo. Trumpai aprašomos audinių kultūroms reikalingos terpės fizikinės ir cheminės savybės. Po to trumpai aprašomi subalansuoti druskos tirpalai, dažniausiai naudojamos auginimo terpės ir terpės be serumo.
Kultūrinių terpių fizikinės ir cheminės savybės:
Tikimasi, kad auginimo terpė pasižymės tam tikromis fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis (pH, O2, CO2, buferiškumas, osmoliariškumas, klampumas, temperatūra ir kt.), kad būtų palaikomas geras kultivuojamų ląstelių augimas ir dauginimasis.
Dauguma ląstelių gali augti, kai pH yra 7,0–7,4, nors yra nedidelių skirtumų, priklausomai nuo ląstelių tipo (ty ląstelių linijų). Indikatorius fenolio raudonasis dažniausiai naudojamas matomam terpės pH aptikimui.
Jo spalva esant skirtingam pH parodyta žemiau:
CO2, bikarbonatas ir buferis:
Anglies dioksidas terpėje yra ištirpęs, kurio koncentracija priklauso nuo atmosferos CO2 įtampa ir temperatūra. CO2 terpėje egzistuoja kaip anglies rūgštis (H2CO3) ir bikarbonatą (HCO – 3) ir H + jonus, kaip parodyta toliau.
Kaip matyti iš aukščiau pateiktos lygties, CO koncentracijos2, HCO – 3 ir pH yra tarpusavyje susiję. Didinant atmosferos CO2, pH bus sumažintas, todėl terpė bus rūgštinė.
Natrio bikarbonato (kaip bikarbonato buferio komponento) pridėjimas neutralizuoja bikarbonato jonus.
Tiesą sakant, komercinėje terpėje yra rekomenduojama bikarbonato ir CO koncentracija2 įtempimas reikalingam pH. Pastaraisiais metais auginimo terpėje naudojamas HEPES (hidroksietilpiperazino 2-sulfonrūgšties) buferis, kuris yra efektyvesnis už bikarbonatinį buferį.
Tačiau dauguma darbuotojų teikia pirmenybę bikarbonato buferiui dėl mažos kainos, mažesnio toksiškumo ir maistinės naudos terpei. Tai skiriasi nuo HEPES, kuris yra brangus, be to, toksiškas ląstelėms. Piruvato buvimas terpėje padidina endogeninę CO gamybą2 pagal ląsteles. Tai yra naudinga, nes priklausomybė nuo išorinio CO tiekimo2 ir HCO – 3 bus mažiau. Tokiu atveju buferį galima pasiekti naudojant didelę aminorūgščių koncentraciją.
Didžioji dauguma ląstelių in vivo yra priklausomos nuo O2 aprūpinimas aerobiniu kvėpavimu. Iš tikrųjų tai įmanoma dėl nuolatinio O tiekimo2 į audinius hemoglobinu. Kultivuojamos ląstelės daugiausia priklauso nuo ištirpusio O2 terpėje, kuri didelėje koncentracijoje gali būti toksiška dėl laisvųjų radikalų susidarymo. Todėl būtina tiekti reikiamą kiekį O2 kad būtų patenkinti ląstelių reikalavimai, išvengiant toksinio poveikio.
Kai kurie darbuotojai prideda laisvųjų radikalų valiklių (glutationo, merkaptoetanolio), kad panaikintų toksiškumą. Taip pat rekomenduojama pridėti seleno į terpę, siekiant sumažinti O2 toksiškumas. Taip yra todėl, kad selenas yra glutationo sintezės kofaktorius.
Apskritai, glikolizė, vykstanti kultivuojamose ląstelėse, yra anaerobesnė, palyginti su in vivo ląstelėmis. Kadangi auginimo terpės gylis turi įtakos O greičiui2 difuzija, terpės gylį patartina išlaikyti 2-5 mm ribose.
Apskritai, optimali tam tikros ląstelių kultūros temperatūra priklauso nuo organizmo kūno temperatūros, kuri yra ląstelių šaltinis. Atitinkamai, ląstelėms, gautoms iš žmonių ir šiltakraujų gyvūnų, optimali temperatūra yra 37 °C.
In vitro ląstelės negali toleruoti aukštesnės temperatūros ir dauguma jų miršta, jei temperatūra viršija 40°C. Todėl būtina palaikyti pastovią temperatūrą (± 0,5°C), kad rezultatai būtų atkuriami.
Jei ląstelės gautos iš paukščių, optimali temperatūra auginimui yra šiek tiek aukštesnė (38,5°C). Šaltakraujams gyvūnams (poikiltermams), kurie nereguliuoja kūno šilumos (pvz., šaltavandenių žuvų), auginimo temperatūra gali būti 15–25 °C. Be tiesioginės įtakos ląstelių augimui, temperatūra taip pat turi įtakos CO tirpumui2 y., aukštesnė temperatūra padidina tirpumą.
Apskritai, daugumos kultivuojamų ląstelių (iš skirtingų organizmų) osmoliškumas yra 260–320 mosm/kg. Tai panašu į žmogaus plazmos osmoliškumą (290 mosm/kg). Pasirinkus auginimo terpės osmoliškumą, jis turi būti palaikomas tokio lygio (su ± 10 mosm/kg nuolaida). Kai į terpę pridedama rūgščių, bazių, vaistų ir pan., osmoliškumas nukenčia. Instrumentinis osmometras naudojamas osmolumui matuoti laboratorijoje.
Subalansuoti druskos tirpalai:
Subalansuotus druskos tirpalus (BSS) daugiausia sudaro neorganinės druskos. Kartais į BSS taip pat galima pridėti natrio bikarbonato, gliukozės ir HEPES buferio. Fenolio raudonasis yra pH indikatorius.
Svarbios subalansuotų druskos tirpalų funkcijos išvardytos toliau:
i. Tiekti esminius neorganinius jonus.
ii. Pateikite reikiamą pH.
iii. Palaikykite norimą osmoliškumą.
iv. Tiekti energiją iš gliukozės.
Tiesą sakant, subalansuoti druskos tirpalai sudaro pagrindą ruošiant visą terpę su reikalingais priedais. Be to, BSS taip pat naudingas trumpam (iki 4 valandų) ląstelių inkubavimui.
Dviejų plačiausiai naudojamų BSS, ty Earle’s BSS ir Hank’s BSS, sudėtis pateikta 34.1 lentelėje.
Pilna kultūros laikmena:
Pirmaisiais metais subalansuoti druskos tirpalai buvo papildyti įvairiomis maistinėmis medžiagomis (aminorūgštimis, vitaminais, serumu ir kt.), kad būtų skatinamas ląstelių dauginimasis kultūroje. Eagle buvo žiniasklaidos formulavimo pradininkas. Jis nustatė (1950–1960 m.) maistinių medžiagų poreikį žinduolių ląstelių kultūroms. Nuo to laiko įvyko daug žiniasklaidos rengimo pokyčių. Dabar yra daugiau nei tuzinas terpių, skirtų įvairių tipų kultūroms.
Kai kurie iš jų nurodyti žemiau:
EMEM – Eagle’ minimali esminė terpė
DMEM – „Dulbecco’s Eagle’s“ terpės modifikacija
CMEM – Glazgo „Eagle’s“ terpės modifikacija
RPMI 1630 ir RPMI 1640 – laikmena iš Rosewell Park Memorial Institute.
Kitos svarbios auginimo terpės yra Ham’s F10 ir F12, TC 199 ir CMRL 1060. Išsami trijų dažniausiai naudojamų terpių, būtent Eagle’s MEM, RPMI 1640 ir Ham’s F12, sudėtis pateikta 34.2 lentelėje. Visoje terpėje, be serumo, apskritai yra daug komponentų aminorūgščių, vitaminų, druskų, gliukozės, kitų organinių papildų, augimo faktorių ir hormonų bei antibiotikų. Priklausomai nuo terpės, skiriasi ingredientų kokybė ir kiekis. Trumpai aprašomi kai kurie svarbūs žiniasklaidos sudedamųjų dalių aspektai.
Į terpę turi būti pridėtos visos nepakeičiamos aminorūgštys (kurių negali susintetinti ląstelės). Be to, net neesminės aminorūgštys (kurias gali susintetinti ląstelės) taip pat paprastai pridedamos, kad būtų išvengta bet kokių jų ląstelių sintezės apribojimų. Tarp neesminių aminorūgščių glutaminas ir (arba) glutamatas dažnai dedami į terpę dideliais kiekiais, nes šios aminorūgštys yra geras energijos ir anglies šaltinis.
Vitaminų kokybė ir kiekis priklauso nuo terpės. Pavyzdžiui, Eagle’s MEM sudėtyje yra tik vandenyje tirpių vitaminų (pvz., B komplekso, cholino, inozitolio). Kiti vitaminai gaunami iš pridėto serumo. M 199 terpėje taip pat yra visi riebaluose tirpūs vitaminai (A, D, E ir K). Apskritai terpei be serumo reikia daugiau vitaminų didesnės koncentracijos.
Įvairiose terpėse esančios druskos iš esmės yra tos, kurios yra subalansuotuose druskos tirpaluose (Eagle’s BSS ir Hank’s BSS). Druskos prisideda prie katijonų (Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+ ir kt.) ir anijonų (CI –, HCO –) 3, SO 2- 4, PO 3- 4) ir yra daugiausia atsakingi už osmoliškumo palaikymą. Yra keletas kitų svarbių tam tikrų jonų funkcijų, kurias atlieka druskos.
i. Ca 2+ jonai reikalingi ląstelių adhezijai, signalų perdavimui, be jų dalyvavimo ląstelių proliferacijoje ir diferenciacijoje.
ii. Na +, K + ir CI – jonai reguliuoja membranos potencialą.
iii. PO 3- 4, SO 2- 4 ir HCO – 3 jonai dalyvauja palaikant tarpląstelinį krūvį, be to, jie yra pirmtakai gaminant tam tikrus svarbius junginius, pvz. PO 3- 4 reikalingas ATP sintezei.
Daugumoje auginimo terpių yra gliukozės, kuri yra svarbus energijos šaltinis. Glikolizės metu gliukozė skaidoma ir susidaro piruvatas/laktatas. Šie junginiai toliau metabolizuodami patenka į citrinos rūgšties ciklą ir oksiduojasi iki CO2. Tačiau eksperimentiniai įrodymai rodo, kad gliukozės indėlis į citrinos rūgšties ciklą yra labai mažas in vitro (kultūrinėse ląstelėse), palyginti su situacija in vivo. Glutaminas, o ne gliukozė, tiekia anglį citrinos rūgšties ciklui. Dėl šios priežasties auginamoms ląstelėms reikalingas labai didelis glutamino kiekis.
Hormonai ir augimo faktoriai:
Jei terpėje yra serumo, hormonų ir augimo faktorių dėti paprastai nereikia. Jie dažnai dedami į terpę be serumo.
Kiti ekologiški papildai:
Į terpę paprastai dedama keletas papildomų organinių junginių kultūroms palaikyti. Tai apima tam tikrus baltymus, peptidus, lipidus, nukleozidus ir citrinos rūgšties ciklo tarpinius produktus. Jei terpėje nėra serumo, labai naudinga papildyti šiuos junginius.
Pirmaisiais metais auginimo terpėje visada buvo antibiotikų. Dažniausiai naudojami antibiotikai buvo ampicilinas, penicilinas, gentamicinas, eritromicinas, kanamicinas, neomicinas ir tetraciklinas. Siekiant sumažinti užteršimą, buvo pridėta antibiotikų. Tačiau pagerėjus aseptinėms sąlygoms šiuolaikinėse audinių kultūros laboratorijose, antibiotikų pridėti nereikia. Tiesą sakant, antibiotikų vartojimas yra susijęs su keliais trūkumais.
i. Galimybė sukurti antibiotikams atsparias ląsteles kultūroje.
ii. Gali sukelti antimetabolinį poveikį ir trukdyti proliferacijai.
iii. Galimybė laikinai paslėpti keletą infekcijų.
iv. Gali paskatinti blogas aseptines sąlygas.
Dabartinė rekomendacija yra ta, kad įprastinei ląstelių kultūrai nereikėtų dėti antibiotikų. Tačiau jie gali būti naudojami pirminėms kultūroms vystyti.
Serumas:
Serumas yra natūralus biologinis skystis, kuriame gausu įvairių komponentų, skatinančių ląstelių dauginimąsi. Pagrindinės sudedamosios dalys, esančios skirtingų tipų serumuose, išvardytos 34.3 lentelėje. Dažniausiai naudojami serumai yra veršelių serumas (CS), galvijų vaisiaus serumas (FBS), arklio serumas ir žmogaus serumas. Naudojant žmogaus serumą, jis turi būti patikrintas dėl virusinių ligų (hepatito B, ŽIV).
Maždaug 5-20 % (v/v) serumo dažniausiai naudojama kelių terpių papildymui. Trumpai aprašomos kai kurios svarbios serumo sudedamųjų dalių savybės.
Serumo baltymų funkcijos in vitro nėra labai aiškios. Kai kurie iš jų dalyvauja skatinant ląstelių prisirišimą ir augimą pvz. fetuinas, fibronektinas. Baltymai padidina auginimo terpės klampumą, be to, prisideda prie buferinio poveikio.
Maistinės medžiagos ir metabolitai:
Serumo sudėtyje yra keletas aminorūgščių, gliukozės, fosfolipidų, riebalų rūgščių, nukleozidų ir tarpinių medžiagų apykaitos produktų (piruvinės rūgšties, pieno rūgšties ir kt.). Šios sudedamosios dalys tam tikru mastu prisideda prie ląstelių mitybos poreikių. Tačiau tai gali būti nereikšminga sudėtingose terpėse su gerai papildytomis maistinėmis medžiagomis.
Serume yra tam tikrų augimo faktorių, kurie skatina ląstelių dauginimąsi kultūroje:
i. Trombocitų kilmės augimo faktorius (PDGF).
ii. Fibroblastų augimo faktorius (FGF).
iii. Epidermio augimo faktorius (EGF).
iv. Kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF).
v. Į insuliną panašūs augimo faktoriai (IGF-1, IGF-2).
Tiesą sakant, beveik visi šie augimo faktoriai yra komerciškai prieinami naudoti audinių kultūroje.
Hidrokortizonas skatina ląstelių prisirišimą, o insulinas palengvina ląstelių gliukozės pasisavinimą. Augimo hormonas kartu su somatomedinais (IGF) skatina ląstelių dauginimąsi.
Serumas taip pat gali turėti ląstelių augimą slopinančių faktorių. Dauguma jų yra artefaktai, pvz. bakterijų toksinai, antikūnai. Natūraliame serume taip pat yra fiziologinio augimo inhibitoriaus, būtent transformuojančio augimo faktoriaus β (TGF-β). Daugumą šių augimą slopinančių faktorių galima pašalinti inaktyvuojant šiluma (56 °C temperatūroje 30 minučių).
Terpės ir serumo pasirinkimas:
Kaip jau minėta, yra apie keliolika terpių ląstelių kultūroms. Tam tikros terpės pasirinkimas grindžiamas ląstelių linija ir auginimo tikslu. Pavyzdžiui, viščiukų embriono fibroblastams ir HeLa ląstelėms naudojamas EMEM.
DMEM terpė gali būti naudojama neuronams auginti. Pasirinktas ląstelių ir ląstelių linijų sąrašas kartu su naudojamomis terpėmis ir serumais pateiktas 34.4 lentelėje. Tiesą sakant, informacijos apie tinkamos terpės parinkimą konkrečiai ląstelių linijai galima rasti literatūroje.
Serumo pasirinkimas taip pat priklauso nuo auginamų ląstelių tipo.
Renkantis serumą atsižvelgiama į šiuos kriterijus:
i. Partijos variantai.
iii. Veiksmingumas skatinant ląstelių augimą ir išsaugojimą.
Pastaraisiais metais pastebima tendencija nutraukti serumo naudojimą ir pereiti prie aiškesnės terpės.
Terpės papildymas audinių ekstraktais:
Be serumo, auginimo terpę taip pat galima papildyti tam tikrais audinių ekstraktais ir mikrobų kultūros ekstraktais. Pavyzdžiai yra viščiukų embriono ekstraktas, jautienos širdies proteolitinis virškinimas, baktopeptonas, laktalbumino hidrolizatas, triptozė. Nustatyta, kad viščiuko embriono ekstrakte yra ir didelės molekulinės masės, ir mažos molekulinės masės junginių, kurie palaiko ląstelių augimą ir dauginimąsi.
Programos
Žmonių ir gyvūnų chimeros yra naudinga gyvoji bandymų aplinka, padedanti mokslininkams geriau suprasti žmogaus biologijos pagrindus ir žmonių ligų mechanizmus. Kaip savo straipsnyje pabrėžė Behringer, laboratorinių gyvūnų naudojimas kaip žmogaus biologijos ar ligų modeliai nevisiškai atkartoja žmogaus fiziologiją. „Taigi, pagrindinis žmogaus ir gyvūnų chimeros tyrimų tikslas yra sukurti gyvūnams žmogaus ląstelių charakterius“, – rašė jis.
Tokie tyrimai atliekami jau kelis dešimtmečius. Pavyzdžiui, 1974 m. grupė mokslininkų iš Danijos pranešė apie pirmą sėkmingą daugelio skirtingų žmogaus vaisiaus organų persodinimą į laboratorinės pelės modelį, vadinamą nuoga pele. Jų eksperimentai, paskelbti 1974 m. žurnale Nature, parodė, kad žmogaus vaisiaus plaučiai, inkstai, kasa, užkrūčio liauka, antinksčiai, sėklidės ir kiaušidės galėjo įsitvirtinti ir vystytis nuogos pelės viduje.
Pastaraisiais metais atlikti eksperimentai buvo skirti išplėsti žmogaus ir gyvūno chimerinio modelio panaudojimo galimybes. 2004 metais žurnale Blood publikuotame straipsnyje autoriai aprašė eksperimentus, kurių metu žmogaus kraujodaros kamieninės ląstelės arba kraują formuojančios kamieninės ląstelės buvo persodintos į 55–60 dienų amžiaus avies vaisius. Šios kamieninės ląstelės ne tik sudaro kraujo ir imuninės sistemos komponentus, bet ir gali sudaryti ląsteles, tokias kaip kaulai ir raumenys. Autoriai nustatė, kad hematopoetinės kamieninės ląstelės taip pat gali formuoti funkcines žmogaus kepenų ląsteles. Tyrėjai pasiūlė, kad toks chimerinis modelis galėtų būti priemonė sukurti daug žmogaus kepenų ląstelių, skirtų vaisiaus ar naujagimio genetinėms ligoms gydyti, kai kepenų ląstelių trūksta.
Kita tyrimų grupė žmogaus embrionines kamienines ląsteles įvedė į 14 dienų embrioninių pelių smegenis. Šie eksperimentai, aprašyti 2005 m. žurnale PNAS paskelbtame straipsnyje, parodė, kad žmogaus embrioninės kamieninės ląstelės sudarė daug skirtingų funkcinių nervinių ląstelių tipų. Šios ląstelės toliau vystėsi į brandžius ir aktyvius žmogaus neuronus pelės priekinėje smegenyse. Autoriai pabrėžė gyvos aplinkos, kurioje būtų galima tirti žmogaus nervų vystymąsi, svarbą. Be to, jie pasiūlė, kad tokios chimeros galėtų padėti kurti naujus neurodegeneracinių ir psichikos ligų modelius, taip pat suteikti galimą priemonę paspartinti terapinių vaistų patikrą.
Ląstelių kultūros mėginių fiksavimo metodai
Kiekvienam IHC eksperimentui reikia atidžiai apsvarstyti tinkamą naudoti fiksatorių, nes netinkamai fiksuoti antigenai gali būti neaptikti.
Formalinas
Fiksuojant formaline ilgiau nei 10–15 min., baltymai susieis iki taško, kur gali prireikti paimti antigeną, siekiant užtikrinti, kad antikūnas galėtų laisvai prisijungti prie baltymo ir jį aptikti.
Etanolis
- Į stiklelį įpilkite 100–200 μL 95 % etanolio ir 5 % ledinės acto rūgšties.
- Padėkite -20°C temperatūroje 5–10 min., pageidautina, į Coplins stiklainį.
- Nuplaukite 3 kartus su PBS.
Metanolis
- Į stiklelį įpilkite 100–200 μL ledo šalto metanolio, 5% acto rūgšties.
- Padėkite -20°C temperatūroje 10 min., pageidautina, į Coplins stiklainį
- Nuplaukite 3 kartus su PBS.
Etanolis ir metanolis taip pat bus pralaidūs. Kai kurie epitopai yra labai jautrūs metanoliui, nes jis gali sutrikdyti epitopo struktūrą. Jei taip nutinka, vietoj to pabandykite acetoną, jei reikalingas pralaidumas.
Acetonas
- Į stiklelį įpilkite 100–200 μl ledo šalto acetono.
- Place at -20°C for 5-10 min.
- Wash 3x with PBS.
Acetone will also permeabilize. No further permeabilization step is required.
Worthington Tissue Dissociation Guide
Tissue dissociation/primary cell isolation and cell harvesting are principal applications for enzymes in tissue culture research and cell biology studies. Despite the widespread use of enzymes for these applications over the years, their mechanisms of action in dissociation and harvesting are not well understood. As a result, the choice of one technique over another is often arbitrary and based more on past experience than on an understanding of why the method works and what modifications could lead to even better results.
The goal of a cell isolation procedure is to maximize the yield of functionally viable, dissociated cells. There are many parameters which may affect the outcome of any particular procedure including but not limited to:
4. Genetic modification(s) (knockouts, etc.)
5. Dissociation medium used
7. Impurities in any crude enzyme preparation used
8. Concentration(s) of enzyme(s) used
The first four items generally are not a matter of choice. To achieve suitable results the other variable conditions are best defined empirically.
Researchers searching the scientific literature for information on the ideal enzymes and optimal conditions for tissue dissociation are often confronted with conflicting data. Much of the variation stems from the complex and dynamic nature of the extracellular matrix and from the historical use of relatively crude, undefined enzyme preparations for cell isolation applications. Also, the extracellular matrix is composed of a wide variety of proteins, glycoproteins, lipids and glycolipids, all of which can differ in abundance from species to species, tissue to tissue and with developmental age. Commonly used crude enzyme preparations such as Pronase, NF 1:250 and collagenase contain several proteases in variable concentrations, as well as a variety of polysaccharidases, nucleases and lipases.
This guide summarizes our knowledge of how these enzymes accomplish the "routine" operations of tissue dissociation and cell harvesting, describes standard lab procedures, offers a logical experimental approach for establishing a cell isolation protocol, and lists many tissue specific references.
Matthew E. Merritt, Ph.D.
Matthew Merritt received his PhD in physical chemistry in the lab of Dr. Jacob Schaefer at Washington University in St. Louis, MO (1996). His dissertation focused on determining 3D structures in condensed solids, including polymers and biopolymers, using solid state NMR distance measurements. He then joined the lab of Dr. Gary Drobny at the University of Washington in Seattle. For his post-doctoral research at UW, he determined structural constraints in DNA using 31 P- 19 F REDOR solid state NMR. In the year 2000, he joined the staff of the Radiological Sciences Department at the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas. In 2004 he was promoted to research faculty, and in 2008 to tenure track faculty as an assistant professor. In 2015 he was promoted to Associate Professor of Radiology at UTSW. In September of 2015 he joined the UF faculty as an associate professor of Biochemistry and Molecular Biology.
RESEARCH DESCRIPTION
My research is focused on understanding intermediary metabolism in mammalian systems. Towards this goal, I apply two similar methodologies for measuring metabolic flux. 1) Steady state 13 C and 2 H isotopomer analysis. This method uses models of steady state metabolism and isotopomer distributions measured by NMR to infer relative flux through competing metabolic pathways. 2) Real time analysis of metabolic flux using hyperpolarized metabolic contrast agents. Hyperpolarization is a method for dramatically increasing the sensitivity of NMR. With the enhancements achieved, enzyme kinetics can be directly observed in functioning tissues.