We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Įsiveržusias bakterijas fagocituoja fagocitai. Fagocitai yra specializuotos baltosios ląstelės. Bet jei ne fagocitinės ląstelės yra užkrėstos bakterijomis, kaip šios ląstelės elgiasi šioje situacijoje? Ar jie pasiduoda bakterijoms?
Kad ląstelės užsikrėstų bakterijomis, kai kurios bakterijos vis tiek bus kraujyje. Fagocitai juos vis dar praryja tokiu pačiu būdu. Tačiau, kai bakterijų paviršiuje esantys antigenai patenka į fagocitų paviršių, tai vadinama antigeną pateikiančia ląstele (APC). Specializuoti limfocitai, žinomi kaip Th ląstelės, prisijungia prie šių antigenų ir tada dalijasi. Tada jie stimuliuoja citotoksines T ląsteles, kurios išskiria cheminę medžiagą, vadinamą perforinu. Perforinas daro skylutes ant „ne fagocitais“ užkrėstų ląstelių membranos, leidžiančios patekti vandeniui. Tai iš esmės sukelia ląstelės ir bakterijų sprogimą, vadinamą ląstelių lize.
Taigi iš esmės užkrėsta ląstelė tiesiog sunaikinama, nebent hidroliziniai fermentai suardytų bakterijas.
Fagocitozės ir eukariogenezės ištakos
Fagocitozė, ty didelių dalelių įsisavinimas eukariotų ląstelėmis, randama įvairiuose organizmuose ir dažnai manoma, kad tai yra pagrindinė eukariotinės ląstelės kilmė, ypač siekiant įgyti bakterijų endosimbiontus, įskaitant mitochondrijos protėvį.
Rezultatai
Baltymų, susijusių su fagocitoze skirtinguose eukariotuose, rinkinių palyginimas atskleidžia didžiulę įvairovę su labai mažais labai konservuotų komponentų, kurie paprastai neturi lengvai atpažįstamų prokariotų homologų. Nepaisant to, tų baltymų, kurių tokie homologai egzistuoja, filogenetinė analizė duoda užuominų apie galimą fagocitozės kilmę. Pagrindinė išvada yra ta, kad archėjų pogrupis koduoja aktinus, kurie yra ne tik monofiliniai su eukariotų aktinais, bet ir turi unikalių struktūrinių savybių su aktinu susijusiais baltymais (Arp) 2 ir 3. Visi fagocitiniai procesai yra griežtai priklausomi nuo aktino citoskeleto remodeliavimosi ir šakotų gijų, už kurias atsakingas Arp2/3, susidarymas. Bendrų Arp2/3 ir archealinių aktinų struktūrinių bruožų buvimas rodo, kad bendri archealinių ir eukariotinių aktinų protėviai galėjo suformuoti šakotas gijas, kaip ir šiuolaikinis Arp2/3. Atrodo, kad Rho šeimos GTPazės, kurios yra visur eukariotų fagocitozės reguliatoriai, yra bakterinės kilmės, todėl darant prielaidą, kad mitochondrijų endosimbionto šeimininkas buvo archeonas, šių GTPazių genai atsiranda horizontalaus genų perdavimo būdu iš endosimbionto arba ankstesnio įvykio metu. .
Išvada
Šios išvados rodo hipotetinį eukariogenezės scenarijų, pagal kurį eukariotų archeologinis protėvis neturėjo ląstelės sienelės (kaip šiuolaikiniai Termoplazma), bet turėjo aktino pagrindu sukurtą citoskeletą, įskaitant šakotas aktino gijas, leidžiančias šiam organizmui gaminti aktino palaikomus membranos išsikišimus. Šios iškyšos palengvintų atsitiktinį, atsitiktinį bakterijų įsisavinimą, iš kurių viena ilgainiui tapo mitochondrija. Endosimbionto įsigijimas sukėlė eukariogenezę, ypač endomembraninės sistemos atsiradimą, kuri galiausiai paskatino šiuolaikinio tipo fagocitozės evoliuciją, nepriklausomai keliose eukariotų linijose.
Recenzentai
Šį straipsnį peržiūrėjo Simonetta Gribaldo, Gaspar Jekely ir Pierre Pontarotti. Norėdami gauti visas apžvalgas, eikite į apžvalgininkų ataskaitų skyrių.
Deksametazonas skatina fagocitozę ir bakterijų naikinimą žmogaus monocitais / makrofagais in vitro
Susirašinėti: Annette van der Goes, Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Van der Boechorststraat 7, 1081 BT, Amsterdamas, Nyderlandai. El. paštas: [email protected] Ieškokite daugiau šio autoriaus darbų
Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Amsterdamas, Nyderlandai
Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Amsterdamas, Nyderlandai
Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Amsterdamas, Nyderlandai
Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Amsterdamas, Nyderlandai
Susirašinėti: Annette van der Goes, Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Van der Boechorststraat 7, 1081 BT, Amsterdamas, Nyderlandai. El. paštas: [email protected] Ieškokite daugiau šio autoriaus darbų
Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Amsterdamas, Nyderlandai
Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Amsterdamas, Nyderlandai
Ląstelių biologijos ir imunologijos katedra, Medicinos fakultetas, Vrije Universiteit, Amsterdamas, Nyderlandai
Abstraktus
Vienas iš gliukokortikoidų (GC) veiksmų sergant išsėtine skleroze (IS) yra slopinamasis poveikis demielinizacijai. Tai gali sukelti sumažėjęs infiltruojančių makrofagų skaičius ir (arba) dėl poveikio mielino fagocitozei. Čia tiriame GC poveikį mielino fagocitozei. Priešingai nei tikėtasi, mes nustatėme, kad žmogaus monocitų inkubavimas su deksametazonu (DEX) 48 valandas padidino (maždaug tris kartus) mielino fagocitozę. Šis žmogaus monocitų fagocitozės sustiprinimas neapsiribojo mielinu. DEX padidino įvairių dalelių fagocitozę, kurią sukelia skirtingi makrofagų receptoriai. Mes nustatėme, kad ne tik fagocitozė Staphylococcus aureus bakterijų pagausėjo, bet ir šių bakterijų naikinimas buvo bent du kartus veiksmingesnis po kultivavimo su DEX. Auglio nekrozės faktoriaus α gamyba iš žmogaus monocitų gautų makrofagų, kuriuos sukelia lipopolisacharidas ir S. aureus buvo slopinamas DEX. Kartu mūsų rezultatai rodo, kad DEX skatina žmogaus monocitų dalelių fagocitozę ir taip gali prisidėti prie audinių atstatymo po imuninės sistemos sukelto audinių pažeidimo ar infekcijos. Šie duomenys atskleidžia naują GC klinikinio taikymo šviesą. J. Leukoc. Biol. 67: 801–807 2000.
Fagocitozės sujungimas su uždegimu
Uždegimas yra dviašmenis kardas ir turi būti griežtai reguliuojamas. Jau seniai žinoma, kad makrofagai pritaiko patogenui tinkamus atsakus, nors mechanizmas, kuriuo grindžiamas šis išskirtinis reguliavimas, nebuvo žinomas. Pastaruoju metu daug dėmesio buvo skirta TLR šeimai, PRR, kuri aptinka daugybę PAMP [19–22]. Šios molekulės gali nustatyti specifinį patogeno pobūdį, ir kadangi jos yra įtrauktos į fagosomas, jos yra idealios fagocitozės ir uždegimo jungtys. Kadangi TLR yra išsamiai aprašyti kitur šiame numeryje, aš juos paliesiu tik trumpai. Be to, dėl didžiulio pastarojo meto publikacijų skaičiaus nenurodysiu atskirų indėlių, o skaitysiu keletą apžvalgų.
TLR. TLR šeima neseniai pasirodė kaip pagrindiniai PAMP aptikimo tarpininkai ir tapo archetipiniu PRR. TLR pavadinimas kilęs iš Drosophila baltymas Toll, kuris dalyvauja nugaros ir pilvo formavimuose vystymosi metu ir šeimininko gynyboje musėje [23]. TLR taip pat yra labai homologiški interleukino (IL)-1 receptorių (IL-1R) šeimos nariams. Tiek TLR, tiek IL-1R turi tarpląstelines uodegas su labai homologiniu regionu, sudarė Toll / IL-1R (TIR) domeną, tačiau turi skirtingus tarpląstelinius domenus. IL-1R šeimos nariai turi IgG pakartojimų tarpląsteliniame domene, būdingame daugeliui citokinų receptorių, o TLR tarpląsteliniai domenai turi daug leucino pasikartojimo struktūrą, primenančią CD14, molekulę, gerai žinomą dėl savo vaidmens nustatant bakterijų LPS.
Vienas tyrimas fagocitozės ir bakterijų žudymo neutrofilais greičiui matuoti
Mes sukūrėme metodą, leidžiantį išmatuoti fagocitozės ir bakterijų žudymo neutrofilais greitį vienu tyrimu. Neutrofilai buvo inkubuojami su bakterijomis ir tam tikrais intervalais buvo atskirti nuo nesuvartotų bakterijų mažu greičiu centrifuguojant. Fagocitozės ir žudymo greitis buvo apskaičiuotas pagal ekstraląstelinių bakterijų skaičiaus sumažėjimą ir tarpląstelinių bakterijų skaičiaus pokyčius. Buvo įrodyta, kad tiek fagocitozė, tiek žudymas atitinka pirmos eilės kinetiką, o greičio konstantos buvo apskaičiuotos neatskirdami tyrimo į dvi fazes. Priešingai nei dviejų pakopų metodai, mūsų metodas matuoja žudymą nuo to momento, kai neutrofilai pradeda nuryti bakterijas, taip pat pašalina poreikį laikinai sustabdyti neutrofilų aktyvumą ir iš naujo pradėti tyrimą pašalinus tarpląstelines bakterijas. Gavome atkuriamus fagocitozės ir žudymo rezultatus Staphylococcus aureus (t1/2 = atitinkamai 9 min ir 6 min) ir Escherichia coli (t1/2 = 10 min ir 2 min.). Mes taip pat galėjome aptikti 56% žudymo greičio sumažėjimą S. aureus neutrofilai iš asmens, turinčio mažą mieloperoksidazės lygį. J. Lcukoc. Biol. 55: 147–152 1994.
Pagrindinės sąvokos ir santrauka
- Fagocitai yra ląstelės, kurios atpažįsta patogenus ir sunaikina juos fagocitozės būdu.
- Atpažinimas dažnai vyksta naudojant fagocitų receptorius, kurie jungiasi su molekulėmis, paprastai esančiomis ant patogenų, vadinamų su patogenais susiję molekuliniai modeliai (PAMP).
- Receptoriai, kurie jungiasi su PAMP, vadinami modelio atpažinimo receptoriai, arba PRR. Į rinkliavą panašūs receptoriai (TLR) yra vienas iš PRR tipų, randamų fagocituose.
- Ekstravazacija Baltųjų kraujo kūnelių patekimas iš kraujotakos į užkrėstą audinį vyksta per procesą transendotelinė migracija.
- Fagocitai skaido patogenus per fagocitozė, kuris apima patogeno įsisavinimą, jo nužudymą ir virškinimą per a fagolizosoma, o paskui išskiria nesuvirškintas medžiagas.
Fagocitozė: mechanizmas ir žingsniai
Fagocitozė yra tarpląstelinės dalelės, tokių kaip patogenai ar negyvos / mirštančios ląstelės, įsisavinimas fagocitinėmis ląstelėmis ir yra vienas iš svarbių įgimtų gynybos mechanizmų. Jį daugiausia vykdo specializuotos ląstelės, tokios kaip makrofagai, neutrofilai ir dendritinės ląstelės.
Fagocitozė yra vienos rūšies endocitozė, kitos yra receptorių sukelta endocitozė ir pinocitozė.
1 žingsnis: Fagocitinių ląstelių aktyvinimas ir chemotaksis
Viduje konors Pirmasis fagocitozės etapas, fagocitus traukia įvairios medžiagos, susidarančios imuniniame atsake, ir juda link jų. Šis procesas vadinamas chemotaksė.
Ramybės fagocitus aktyvuoja uždegimo mediatoriai (bakterijų produktai, citokinai, prostaglandinai ir komplemento baltymai). Aktyvinimas padidina jų metabolinį ir mikrobicidinį aktyvumą. Aktyvuotos ląstelės taip pat išreiškia daugiau glikoproteinų receptorių, kurie padeda joms pasiekti infekcijų vietą ir tvirtai susijungti su mikroorganizmais. Pirmieji atsiranda neutrofilai, o vėliau juos pakeičia makrofagai.
2 žingsnis: Invazinių mikrobų atpažinimas
The Kitas žingsnis fagocitoze yra antigeno prilipimas prie fagocitinių ląstelių membranos. Prilipimas sukelia membranos išsikišimus, vadinamus pseudopodia, išsiplėsti aplink pritvirtintą medžiagą ir jas nuryti.
(Vaizdo šaltinis: Gary E. Kaiser)
- Modelio atpažinimo receptoriai (PRR): Rašto atpažinimo receptoriai atpažįsta su patogenais susiję molekuliniai modeliai (PAMP). Tai apima bakterijų molekules, tokias kaip peptidoglikanas, techoinės rūgštys, lipopolisacharidas, mananai, flagelinas, pilinas ir bakterijų DNR. Pvz., Scavenger receptoriai ir į rinkliavą panašūs receptoriai suriša ir internalizuoja gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas po prisijungimo su PAMP.
Fc receptorių sukelta opsonizacijaOpsoninas yra molekulė, kuri jungiasi tiek su antigenu, tiek su makrofagais ir sustiprina fagocitozę.
(Vaizdo šaltinis: philpoteducation)
- Fc receptoriai: Fc receptoriai (FcR), esantys ant makrofagų ir neutrofilų paviršių, jungiasi su antikūnų, tokių kaip IgG ir IgM, Fc dalimi, susidariusia su antigenais (bakterine ląstele arba virusu). Šis procesas, vadinamas opsonizacija, stiprina fagocitozę.
- Komplemento receptoriai (CR1):Komplemento receptoriai, esantys fagocitinėse ląstelėse, jungiasi su komplemento baltymais, sudarytais kompleksais su antigeno-antikūnų kompleksais. Pavyzdžiui, makrofagai turi C3b receptorius ir taip suriša ląsteles arba kompleksus, prie kurių prilipo C3b, sukeldami fagocitozę. Manozę surišantys lektinai (MBL) taip pat padeda sustiprinti fagocitozę.
3 veiksmas: Prarijus ir fagosomų susidarymas
Fagosomų susidarymas(Vaizdo šaltinis: Gary E. Kaiser)
Po pritvirtinimo, aktino gijų polimerizacijos ir depolimerizacijos išsiunčiami pseudopodai, kurie praryja mikrobą. Pseudopodijos susiliejimas apgaubia medžiagą endocitinėje pūslėje, vadinamoje a fagosoma, kuris vėliau patenka į endocitinio apdorojimo kelią.
4 veiksmas: Fagolizomų susidarymas
Šiuo keliu fagosoma juda link ląstelės vidaus, kur susilieja su lizosoma ir sudaro fagolizosoma.
5 veiksmas: Mikrobų naikinimas ir liekamųjų kūnų susidarymas
- Žudymas nuo deguonies: Aktyvuoti fagocitai gamina daugybę reaktyvieji deguonies tarpiniai produktai (ROI) ir reaktyvūs azoto tarpiniai produktai kurie turi stiprų antimikrobinį poveikį. Metabolizmo procesas, žinomas kaip kvėpavimo sprogimas atsiranda fagocitinėse ląstelėse, kurios aktyvuoja su membrana susietą oksidazę, sudarant superoksido anijoną, hidroksilo radikalus ir vandenilio peroksidą. Fagolizosomos viduje taip pat susidaro kitos stiprios antimikrobinės medžiagos, tokios kaip hipochloritas, azoto oksidas ir kt. Visos šios medžiagos pasižymėjo ryškiu antimikrobiniu aktyvumu prieš bakterijas, grybelius, parazitinius kirminus ir pirmuonis.
- Nuo deguonies nepriklausomas žudymas: Aktyvintos fagocitinės ląstelės taip pat sintetina lizocimą ir įvairius hidrolizinius fermentus (pavyzdžiui, katepsiną G, elastazę, kolagenazę, katelicidinus ir baktericidinį pralaidumą skatinantį baltymą), kurių skilimo veiklai nereikia deguonies. Be to, aktyvuoti makrofagai gamina grupę antimikrobinių ir citotoksinių peptidų, paprastai žinomų kaip defensinai. Defenzinai gali sunaikinti įvairias bakterijas, įskaitant Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, ir Haemophilus influenzae. Suaktyvinti makrofagai taip pat išskiria naviko nekrozės faktorių α (TNF-α) – citokiną, kuris turi įvairų poveikį ir yra citotoksiškas kai kurioms naviko ląstelėms.
6 veiksmas: Eliminacija arba egzocitozė
Tada suvirškintas fagolizosomos turinys pašalinamas procese, vadinamame egzocitozė.
Gyvų ir nužudytų arba fluorescenciniu būdu pažymėtų bakterijų fagocitozė makrofagais skiriasi tiek dydžiu, tiek receptorių specifiškumu
Dr S Józefowski, Jogailos universiteto medicinos koledžo Imunologijos skyrius, Czysta g. 18, Krokuva 31-121, Lenkija. El. paštas: [email protected] Ieškokite daugiau šio autoriaus darbų
Jogailos universiteto medicinos koledžo Imunologijos katedra, Krokuva, Lenkija
Jogailos universiteto medicinos koledžo Imunologijos katedra, Krokuva, Lenkija
Gamtos apsaugos institutas, Lenkijos mokslų akademija, Krokuva, Lenkija
Mikrobiologinių tyrimų ir autovakcinų centras, Krokuva, Lenkija
Jogailos universiteto medicinos koledžo Imunologijos katedra, Krokuva, Lenkija
Jogailos universiteto medicinos koledžo Imunologijos katedra, Krokuva, Lenkija
Dr S Józefowski, Jogailos universiteto medicinos koledžo Imunologijos skyrius, Czysta g. 18, Krokuva 31-121, Lenkija. El. paštas: [email protected] Ieškokite daugiau šio autoriaus darbų
Abstraktus
Manoma, kad nuo opsonino sukelta bakterijų fagocitozė, kurią sukelia makrofagai, yra svarbus ankstyvas antibakterinės šeimininko gynybos mechanizmas. Tačiau, nors buvo įrodyta, kad gebėjimas surišti bakterijas yra bendras visų tipų SR bruožas, daugeliu atvejų įrodymai apsiriboja padidėjusiu nužudytų, fluorescenciniu būdu pažymėtų bakterijų prisijungimo prie nefagocitinių ląstelių, transfekuotų šiais receptoriais. . Mes siekėme patikrinti SR gebėjimą tarpininkauti neopsoninei gyvų gyvūnų fagocitozei. Escherichia coli (Ec) ir Staphylococcus aureus (Sa), pavyzdinės gramneigiamų ir teigiamų bakterijų rūšys, atitinkamai, ir įvertinti santykinį skirtingų SR, išreikštų pelių makrofaguose, indėlį šiame procese. Mes nustatėme, kad A klasės SR SR-A/CD204 buvo pagrindinis receptorius, tarpininkaujantis fluorescenciniu būdu pažymėtos Sa fagocitozei, tuo tarpu skirtingi SR turėjo labai nereikalingą vaidmenį gyvo Sa fagocitozėje. Ir atvirkščiai, skirtingi SR prisidėjo prie fluorescenciniu būdu pažymėto Ec fagocitozės. Palyginimui, gyvo Ec fagocitozė buvo daug mažesnio masto ir buvo selektyviai tarpininkaujama SR-A. Šie rezultatai kelia abejonių dėl fluorescenciniu būdu pažymėtų bakterijų kaip tinkamų gyvų bakterijų pakaitalų. Mažas nuo opsonino nepriklausomos Ec fagocitozės mastas ir nesutrikusi Sa fagocitozė makrofaguose, kuriuose trūksta SR-A arba CD36, rodo, kad šio proceso defektas gali nebūti atsakingas už sumažėjusį bakterijų klirensą pelėms, kurioms trūksta šių receptorių. Manome, kad šis sutrikimas gali atsirasti dėl intracelulinių bakterijų žudymo slopinimo, kurį sukelia priešuždegiminiai citokinai, kuriuos per didelius kiekius gamina SR trūkumo ląstelės, reaguodamos į bakterinius produktus.
Papildomas paveikslas S1 | Aktino citoskeleto morfologija WT ir lrrkA KO ląstelės. WT ir lrrkA KO buvo leista prilipti prie stiklinio dangtelio, tada fiksuoti, pralaidinti ir nudažyti fluorescenciniu faloidinu, kad būtų atskleista aktino citoskeleto struktūra. Trys WT ir WT nuotraukos lrrkA KO ląstelės. Aktino citoskeleto morfologija pasirodė labai panaši WT ir lrrkA KO ląstelės. Strypas: 10 μm.
Papildomas paveikslas S2 | Kvorumo jutimo faktorių sekrecija pagal lrrkA KO ląstelės. WT ląstelės buvo inkubuojamos 4 valandas su ląstelių supernatantais iš WT arba lrrkA KO ląstelės, praskiestos, kaip nurodyta šviežiu HL5. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su polistireno granulėmis ir išmatuota fagocitozė, kaip aprašyta 1 paveikslo legendoje. Fagocitozė buvo išreikšta kaip WT ląstelių internalizacijos procentas šviežioje terpėje tame pačiame eksperimente (vidutinis ± SEM, N = 3 nepriklausomi eksperimentai). Ląstelės, inkubuotos šviežioje terpėje (0 % ląstelių supernatantas), fagocitavo granules maždaug keturis kartus efektyviau nei ląstelės, inkubuotos grynuose ląstelių supernatantuose (100 % ląstelių supernatantas), turinčiose koncentruotų kvorumo jutimo faktorių. Taip pat buvo įvertinti ląstelių supernatantai, praskiesti šviežia terpe, siekiant tiksliau įvertinti kvorumo jutimo aktyvumą. Supernatantas iš lrrkA KO ląstelės turėjo lygiai tokį patį slopinamąjį poveikį fagocitozei, kaip ir WT ląstelių supernatantas.
Papildomas paveikslas S3 | GFP-LrrkA yra lokalizuota branduolyje ir citozolyje. LrrkA KO ląstelės, ekspresuojančios GFP-LrrkA, buvo fiksuotos 2% formaldehidu ir vizualizuotos konfokaline mikroskopija. GFP fluorescencija buvo matoma branduolyje (rodyklių galvutėse) ir citozolyje. Netransfekuotas lrrkA KO ląstelės buvo naudojamos lygiagrečiai kaip neigiamos kontrolės ir neparodė jokios GFP fluorescencijos. Strypas: 5 μm.
Papildomas paveikslas S4 | SibA, PDI ir Talin A lygiai ląstelėse yra panašūs WT ir lrrkA KO ląstelės. (A) Ląstelių baltymai buvo atskirti ant SDS-poliakrilamido gelio, perkelti į nitroceliuliozę, o nurodyti baltymai buvo aptikti specifiniais antikūnais. (B) Signalo intensyvumas buvo nustatytas keliais nepriklausomais eksperimentais ir nurodomas kaip signalo santykis lrrkA KO ir WT ląstelės. Eksperimento kiekybinis įvertinimas parodytas A žymimas raudonai. SibA, Talino ir PDI (naudojamų kaip kontrolė) kiekis buvo neatskiriamas lrrkA KO ir WT ląstelės.
Papildomas paveikslas S5 | Genų ekspresijos reguliavimas folio rūgštimi. D. discoideum WT ląstelės, išaugintos HL5, 4 valandas buvo veikiamos 1 mM folio rūgšties arba ne. RNR-seq analizė leido nustatyti 10 genų, kurių transkripcija buvo žymiai pakeista folio rūgšties poveikiu. (A) Kiekvienam nagrinėjamam genui (fol1 į fol10), nurodoma geno tapatybė ir pavadinimas, taip pat RT-PGR naudotų pradmenų pora ir amplikono dydis. (B) 10 analizuotų genų RT-PGR analizė patvirtino rezultatus, gautus naudojant RNR-seq.
Fagocitų persekiojimo elgesys: amebų diskriminacija tarp gramneigiamų ir gramteigiamų bakterijų
Fagocitai yra ląstelės, kurios persekioja, sugeria ir naikina bakterijas. Tai yra žinduolių imuninės sistemos makrofagai ir neutrofilai, taip pat laisvai gyvenančios amebos, kurios medžioja ir praryja bakterijas maistui. Fagocitozė gali sukelti įvairių pasekmių, pradedant nuo išlaikymo iki infekcijos ir patogenų arba naudingų simbiontų kolonizavimo, todėl gali prireikti diskriminacijos ieškant gerųjų bakterijų, vengiant blogųjų. Čia mes išbandėme, ar dirvožemio ameba Dictyostelium discoideum gali atskirti skirtingus bakterijų tipus, naudojant elgesio tyrimus, kai ameboms buvo pateiktos suporuotos skirtingos bakterijos. Pastebėjome skirtumus, kiek amebos persekiojo skirtingų tipų bakterijas, taip pat pirmenybinę migraciją link gramneigiamų, palyginti su gramteigiamomis bakterijomis. Amebų, kilusių iš skirtingų geografinių vietovių, atsako profiliai buvo panašūs, o tai rodo, kad persekiojimas yra išsaugotas daugelyje rūšių asortimento. Nors ankstesnis darbas parodė, kad bakterijos naudoja chemotaksę, kad surastų amebų, kurias jos kolonizuoja, mūsų darbas rodo, kad atsitinka ir priešingai – amebos gali pirmiausia nukreipti save į tam tikras bakterijas aplinkoje. Pirmenybinis jutimas ir atsakas gali padėti paaiškinti, kodėl kai kurios amebų ir bakterijų asociacijos gamtoje yra dažnesnės nei kitos.
1. Įvadas
Fagocitai yra judrios žinduolių imuninės sistemos ląstelės, tokios kaip neutrofilai ar makrofagai, kurios aptinka ir sugeria bakterijų įsibrovėlių vietą, taip pat amebos, kurios medžioja ir praryja bakterijas maistui [1,2]. Siekdami surasti bakterijas, fagocitai atlieka chemotaksinį arba „persekiojimo“ elgesį, parodydami, kad gali aptikti bakterijas ir reaguoti į jas per atstumą (pvz., neutrofilų persekiojimą [3]). Tačiau lieka neaišku, ar fagocitai gali atskirti skirtingų tipų bakterijas, leisdami joms selektyviai persekioti tam tikras bakterijas, nepaisant diskriminacijos svarbos tokiems rezultatams kaip klirensas, infekcija ar kolonizacija.
Ameba Dicytostelium discoideum yra pavyzdinė fagocitozės, chemotaksės ir šeimininko bei patogeno sąveikos sistema [2]. Šios ląstelės fagocituoja bakterijas maistui, tačiau kai kurios bakterijos jas taip pat užkrečia ir žudo, o kitos kolonizuoja [2,4]. Ankstyvas darbas parodė, kad diktiostelidus dirvožemyje riboja bakterijų prieinamumas ir jie rodo vidinį ir tarprūšinį augimą kartu esančiose bakterijose [5–7]. Kituose darbuose buvo nustatyti skirtingi genų rinkiniai, reguliuojantys gramneigiamų ir gramteigiamų bakterijų augimą, taip pat fiziologiniai pokyčiai, atsirandantys dėl šių dviejų bakterijų tipų fagocitozės [8, 9].
Siekėme nustatyti, ar D. discoideum galėjo atskirti bakterijas per atstumą, naudojant suporuoto pasirinkimo testą, kai amebos buvo nusodintos vienodu atstumu tarp skirtingų bakterijų rūšių ir jų pirmenybės laipsnis (ty ląstelių, migruojančių link bakterijų, skaičius) buvo kiekybiškai įvertintas. Išbandėme tris skirtingus D. discoideum genotipai iš skirtingų geografinių regionų, apimančių didelę rūšies natūralaus arealo dalį. Mes taip pat iškėlėme hipotezę, kad jei jos gali atskirti bakterijas, jos gali būti jautresnės ar net teikti pirmenybę bakterijų rūšims, kurios dažnai jas kolonizuoja, pvz. Burkholderia spp. arba Pseudomonas fluorescens [4,10]. Galiausiai, ciklinį adenozino monofosfatą (cAMP) naudoja D. discoideum dėl chemotaksės ir agregacijos perėjimo į daugialąstę gyvavimo ciklo stadiją. Tačiau neseniai buvo pranešta, kad cAMP taip pat naudoja D. discoideum bakterijoms nustatyti [11]. Tolesniuose eksperimentuose išbandėme, ar bakterijų išskiriamas cAMP turi įtakos D. discoideum migracija, lyginant amebos atsaką su Escherichia coli mutantai, kurių cAMP gamyba skiriasi. Apibendrinant, šie eksperimentai sprendžia visapusį klausimą: ar fagocitai gali diskriminuoti aplinkoje esančias bakterijas, ieškodami naudingų bakterijų, vengdami kenksmingų? Gebėjimas diskriminuoti gali turėti įtakos susidūrimo su bakterijomis gamtoje dažniui ir gali būti svarbus skatinant pasikartojančią sąveiką, skatinančią šeimininko ir mikrobo prisitaikymą ir koevoliuciją.
2. Medžiaga ir metodai
Naudoti metodai išsamiau aprašyti elektroninėje papildomoje medžiagoje. Trumpai, trys D. discoideum padermės QS32 (Teksasas), QS39 (Tenesis) ir QS40 (Massachusetts) buvo pasėti į HL5 terpę su 10% galvijų vaisiaus serumo ir 2% PSV (10 mg ml -1 penicilino, 50 mg ml -1 streptomicino sulfato, 20 μg ml - 20 μg). 1 folio rūgštis ir 60 μg ml –1 vitamino B12) ir maždaug vieną savaitę palaikomos kaip bakterijų neturinčios prilipusios kultūros (elektroninė papildoma medžiaga, S1 lentelė). Keturi gramneigiami (Klebsiella pneumoniae, E. coli, P. fluorescens ir Burkholderia spp.) ir keturi gramteigiami (Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus ir Enterococcus faecalis) bakterijos buvo auginamos per naktį lizogeniniame sultinyje ir koncentruojamos iki OD600 iš 5. Dvidešimt tūkstančių D. discoideum ląstelės buvo dedamos dėmėmis ant Nunc Omni dėklo, kuriame yra 10 ml KK2 buferio (14,0 mM K).2HPO4 ir 3,4 mM K2HPO4, pH = 6,4) su 2 % Noble agaru. Po džiovinimo tarp jų buvo dedama 2 µl bakterijų dėmių D. discoideum dėmė, maždaug 0,65 cm atstumu. Skaičius D. discoideum ląstelės, kurios judėjo link kiekvienos bakterijų rūšies, buvo kiekybiškai įvertintos ImageJ naudojant vaizdus, paimtus praėjus 4 valandoms po eksperimento pradžios (1 pav.a). Eksperimentai buvo pakartoti trimis laikinai nepriklausomais tyrimais. Daugiau informacijos apie cAMP tyrimą rasite elektroninėje papildomoje medžiagoje.
Figūra 1. (a) Kiekvienos iš trijų amebos D. discoideum genotipai (QS32, QS39 arba QS40) buvo nusodinti tarp gramneigiamų ir gramteigiamų bakterijų porų. Kiekvienos amebos dėmės kairysis ir dešinysis kraštai buvo pavaizduoti po 4 valandų. (b) Kiekvienoje suporuotoje juostoje rodomas dviejų nurodytų bakterijų rūšių pasirinkimas, kai gramneigiamos rūšys yra kairėje, o gramteigiamos rūšys – dešinėje. Klaidų juostos žymi 1 s.e. per tris laikinai nepriklausomus pakartojimus. 21 iš 24 tyrimų daugiau ląstelių migravo link gramneigiamų, palyginti su gramteigiamomis bakterijomis. (c) ANOVA rezultatai rodo, kad amebos labai mėgsta gramneigiamas bakterijas (p = 0,02 daugiau informacijos rasite tekste.). Santrumpos: Kp, K. pneumoniae Ec, E. coli Pf, P. fluorescens Bu, Burkholderia spp. Bs, B. subtilis ml, M. luteus Sa, S. aureus Ef, Enterococcus faecalis. (Internetinė versija spalvota.)
3. Rezultatai
21 iš 24 porų pasirinkimų tarp gramteigiamos ir gramneigiamos bakterijos, D. discoideum pirmiausia migravo link gramneigiamų bakterijų rūšių (1 pavb ženklas-testas: dvišakis p < 0,0003). Šiam modeliui buvo trys išimtys: QS39 rodė silpną pirmenybę gramteigiamam B. subtilis virš gramneigiamų K. pneumonaie ir E. coli, ir QS40 silpnai palankios B. subtilis porinėse varžybose prieš K. pneumonaie.
Modeliavome ląstelių, migruojančių link bakterinės dėmės, skaičių, priklausomai nuo židinio bakterijos, alternatyvaus bakterijos pasirinkimo, Gramo būsenos ir D. discoideum genotipas. Visi trys sąveikos terminai buvo labai nereikšmingi ir buvo pašalinti iš modelio (1 lentelė). Alternatyvios bakterijos tapatybė kiekviename poriniame pasirinkime taip pat buvo labai nereikšminga ir taip pat buvo pašalinta iš modelio, o tai rodo, kad alternatyvios bakterijos tapatybė neturi įtakos tam, kiek ląstelės migruoja link židinio bakterijos. Apskritai atsakas į skirtingas bakterijas (židininė bakterija) labai skyrėsi χ 2 = 29, d.f. = 1, p < 0,0001 elektroninė papildoma medžiaga, S1 pav.). Stipriausias atsakas buvo į P. fluorescens, bakterijų rūšis, kuri buvo ne kartą išskirta D. discoideum vaisiakūniai [4,10]. Silpniausias atsakas buvo į gramteigiamas bakterijas: M. luteus, S. aureus ir E. facaelis. Remiantis poriniais rezultatais, rodančiais gramneigiamą pirmenybę, modelis parodė reikšmingą gramo būsenos poveikį chemotaksei (1 pav.c F1,5.87 = 9.23, p = 0,02). Bendras atsako profilis buvo stebėtinai panašus visoje geografiškai plačiai paplitusioje vietoje D. discoideum deformacijos (1 pavb), užfiksuotas nereikšmingo poveikio D. discoideum genotipas dėl chemotaksės. Galiausiai palyginome amebų migraciją į laukinį tipą E. coli padermė su dviejų mutantų paderme, iš kurių viena turi vienintelio adenilato ciklazės geno deleciją cyaA o kitas per daug ekspresuoja tą patį geną (cyaA OE ). Iš tiesų, chemotaksė buvo stipriausia cyaA OE o silpniausias iki ΔcyaA, ir modelis buvo nuoseklus visuose trijuose D. discoideum genotipai (2 pav.), o tai rodo, kad cAMP aptikimas gali turėti įtakos šios amebos (židininės bakterijos) elgesiui. χ 2 = 61,5, d.f. = 1, p < 0,0001 elektroninė papildoma medžiaga, lentelė S2).
2 pav. Migracija link E. coli padermių, kurios skiriasi cAMP gamyba. Amebos atsakas į laukinį tipą (WT) E. coli ir du E. coli mutantai ΔcyaA ir cyaA OE , kur cAMP gamybai reikalingas adenilato ciklazės genas yra atitinkamai ištrintas arba per daug išreikštas. (a) Atsakymų pavyzdžiai D. discoideum QS39 į E. coli padermės, kurioms trūksta cAMP arba jos per daug gamina, ir atitinkama kontrolė, kuriai trūksta bakterijų. (b) Visuose poriniuose deriniuose pastebėjome stipresnę migraciją į E. coli padermė, gaminanti daugiau cAMP. (Internetinė versija spalvota.)
1 lentelė. Atsitiktinių veiksnių poveikio mišraus modelio dispersinės analizės rezultatai. Kiekvienas atsitiktinis veiksnys buvo išbandytas imant skirtumą tarp įdėtųjų modelių su ir be dominančių veiksnių –2 liekamųjų log tikimybių (-2RLL), kurių laisvės laipsniai lygūs parametrų skaičiaus skirtumui. Fiksuoto poveikio faktorius, Gramo būsena, buvo išbandytas naudojant standartą F- testas (F1,5.87 = 9.23, p = 0,02), kaip rekomenduojama [12].