Informacija

Dominančio geno išskyrimas iš didelės DNR grandinės

Dominančio geno išskyrimas iš didelės DNR grandinės


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Klasėje visada buvau sutrikęs dėl to ir niekada to neišmokau iki galo. Tarkime, kad turite 10 000 bp DNR ir tiesiog norite išskirti 100 bp specifinio regiono (dominančio geno) naudodami restrikcijos fermentą.

Kaip galite užtikrinti, kad abiejuose jūsų dominančio geno galuose būtų tinkamos sekos tam tikriems restrikcijos fermentams iškirpti.


Darant prielaidą, kad tiksliai žinote, kurioje visos DNR grandinės dalyje yra dominantis genas, atskirti geną yra gana lengva. Yra keletas restrikcijos fermentų, kuriuos galite naudoti, tik reikia nustatyti, kuris (-i) iš jų labiausiai tinka jūsų dominančiam genui.

Atminkite, kad paprastai yra gerai, jei bet kuriame geno gale yra papildomų nukleotidų; ribosomos pradės ir nustos pridėti peptidų pagal pradžios ir pabaigos kodonus, nepriklausomai nuo to, kiek ribosoma juda prieš pasiekdama pradžios kodoną. Išanalizuokite savo DNR grandinę ir pabandykite rasti restrikcijos fermentą, kuris perpjautų grandinę kažkur prieš prasidedant genui, o paprastai kitą, kuris ją perpjautų kažkur jai pasibaigus, nors kartais tas pats fermentas veiks abiem geno galams.

Redaguoti: Kaip minėjo @Untitpoi, jei restrikcijos fermento pjūvio seka randama dominančiame gene, jūsų genas bus perpjautas į dvi (ar daugiau). Labai svarbu užtikrinti, kad jūsų pasirinktas (-i) fermentas (-ai) nesupjaustytų dominančio geno, kitaip grandinė bus nenaudinga. Galima iš naujo sujungti sruogelius (kas, dėl lipnių galų, nėra per sunku), bet kam dėti papildomas pastangas, kai to nereikia?


Turite ką nors žinoti apie norimą seką ir šalia esančią seką, tada pasirenkate restrikcijos fermentą, kuris supjaustys maždaug ten, kur norite. Yra tiek daug skirtingų fermentų su skirtingomis pjovimo tikslinėmis sekomis, todėl paprastai įmanoma rasti tinkamą.


Įvadas į molekulinės biologijos metodus

Šio skyriaus tikslas – apibūdinti kai kuriuos šiandien naudojamus įprastus rekombinantinės DNR metodus. Šie metodai paprastai naudojami norint išskirti apibrėžtą genomo dalį, daugiausia geną, iš dominančio organizmo ar audinio, o vėliau apibūdinti šios genetinės medžiagos struktūrą ir funkciją. Norint išskirti geną, genominė DNR išgaunama iš pasirinkto audinio. Kad būtų geriau valdomos, santykinai didelės DNR molekulės restrikcijos endonukleazėmis supjaustomos į fragmentų mišinį. Tada fragmentai atskiriami vienas nuo kito pagal jų dydį gelio elektroforezės būdu. Norint patikrinti, ar viename iš DNR fragmentų, atskirtų agarozės gelyje, yra norimo geno buvimas, naudojama procedūra, vadinama Southern blotting. DNR fragmentai perkeliami iš gelio į filtrą, todėl išlaikomas pradinis fragmentų modelis. Tada vienos grandinės DNR arba RNR zondas, būdingas išskirtiniam genui, yra hibridizuojamas su tiksliniais fragmentais, pritvirtintais prie filtro. Prie zondo pritvirtinama radioaktyvi arba fluorescencinė žyma, skirta vėlesniam identifikavimui. Tais atvejais, kai reikia išskirti tik transkribuotas sekas, vietoj DNR paruošiama citoplazminė pasiuntinio RNR (mRNR). RNR analizė panašia į Southern blot metodiką vadinama Northern blotting. DNR sekų išsaugojimas paprastai pasiekiamas klonuojant DNR. DNR klonavimas apima DNR fragmento įterpimą į DNR vektorių ir stabilų rekombinantinės DNR įterpimą į tinkamą šeimininką. Šeimininko dauginimas palengvina rekombinantinės DNR amplifikaciją tolesnei analizei.


Branduolinės DNR ir ją reguliuojančių baltymų modifikacijos

DNR metilinimas yra įprastas epigenetinio reguliavimo mechanizmas eukariotų organizmuose, pradedant grybais ir baigiant žinduoliais. Genetiniai modelių organizmų tyrimai parodė, kad DNR metilinimas dalyvauja įvairiuose biologiniuose procesuose. Žinduolių DNR metilinimo modelius nustato ir palaiko trys DNR metiltransferazės: Dnmt3a, Dnmt3b ir Dnmt1. DNR metilinimo mechanizmų specifiškumo pagrindas ir tai, kaip reguliuojami DNR metilinimo modeliai, tebėra menkai suprantami. Tačiau besikaupiantys įrodymai rodo sudėtingą DNR metilinimo ir kitų epigenetinių mechanizmų sąveiką. Ypač įdomus yra histono lizino metilinimas, kuris, kaip įrodyta, yra glaudžiai susijęs su DNR metilinimu įvairiose sistemose. Šiame skyriuje pabrėžiami kelių naujausių tyrimų išvados, kurios suteikia įžvalgų apie mechaninę ir funkcinę histono metilinimo ir DNR metilinimo sąveiką.


Dominančio geno išskyrimas iš didelės DNR grandinės – Biologija

Persiųsti. Vienas iš galingesnių metodų, sukurtų per pastaruosius dvidešimt metų, yra galimybė gaminti, išskirti ir naudoti DNR, kuri papildo (cDNR) pasiuntinio RNR (mRNR), koduojančias dominančius baltymus. Puslapio pabaigoje trumpai apibendrinsime priežastį, kodėl cDNR gali būti itin vertingos eksperimentiniame projekte, nors daugelis jų jau turėtų būti akivaizdūs daugumai skaitytojų. Taip pat tiesa, kad yra daugybė skirtingų požiūrių į dominančių cDNR išskyrimą ir jie bus trumpai aprašyti antroje skyriaus dalyje. Pradėsime aprašydami, kaip žinomo baltymo cDNR gali būti išskirta naudojant aminorūgščių sekos informaciją, kuri istoriškai buvo pirmasis būdas, kuriuo buvo išskirta žinomą baltymą koduojanti cDNR. Šiame pirmajame skyriuje taip pat apsvarstysime, kaip gaminamos cDNR ir kaip kuriamos cDNR bibliotekos.

Kai kurie pagrindiniai terminai. Pradėkime nuo trijų apibrėžimų:

  • Klonuoti . Pirma, ką reiškia klonuoti? Klonavimas reiškia bet kurio organizmo genetiškai homogeniškos padermės išskyrimą. Klone visi organizmai genetiniu lygmeniu yra identiški visiems kitiems organizmams. Galima klonuoti bakterijas, fagus ar net aukštesnius augalus, išskiriant vieną ląstelę ir leidžiant tai vienai ląstelei sukurti koloniją, apnašas arba visą augalą. Kadangi dauguma augalų yra kilę iš vienos ląstelės, turinčios unikalų genotipą, lapų įsišaknijimas, kad susidarytų identiškų afrikietiškų žibuoklių kolekcija, yra klonavimas.
    • cDNR klonavimas išskiria ir amplifikuoja vieną savaime besidauginantį organizmą, kurio DNR yra eksperimentuotoją dominanti kDNR.
    • Kai kuriais atvejais cDNR klonavimas gali tiesiog reikšti bet kurios atskiros cDNR išskyrimą, nes tam tikromis aplinkybėmis eksperimentuotojas gali būti suinteresuotas bet kokia konkretaus audinio pagaminta cDNR. Dažniau cDNR klonavimo iššūkis yra ne kokios nors cDNR išskyrimas, o vienos kDNR, kuri yra įdomi eksperimentuotojui dėl tam tikros priežasties, atranka. Tokiu pat būdu galima išskirti klonus, kurie nėra cDNR klonai, o yra genominiai klonai.
    • Genominiai klonai yra tiesiog DNR, gauta tiesiogiai iš genomo. Genominė DNR apimtų kai kurias sekas, tokias kaip intronai arba reguliavimo sekos, kurių nebūtų galima rasti cDNR.
    • Taip pat monokloninio antikūno išskyrimas reiškia vienos ląstelės, ekspresuojančios unikalaus antikūno mRNR, išskyrimą. Taigi, monokloninių antikūnų kūrimas klonavimo pratimu.

    Klonavimo strategija. Pagrindinį eksperimentinį klonavimo metodą galima suskirstyti į keturias dalis.

    • Pirma, būtina sukurti arba gauti biblioteką su dominančia seka.
    • Antra, būtina išskirti klonus, kurie gali būti įdomūs.
    • Trečia, labai svarbu parengti oficialų testą, siekiant užtikrinti, kad išskirti klonai iš tiesų yra teisingi klonai.
    • Ketvirta, būtina išskirtą cDNR panaudoti įdomiam biologiniam naudojimui.

    cDNR bibliotekos. Panagrinėkime svarbius cDNR bibliotekos kūrimo aspektus. CDNR bibliotekoje tiesiog yra sekų, kurios yra komplementarios mRNR. Yra daug skirtingų kriterijų, pagal kuriuos galima spręsti apie cDNR bibliotekos kokybę. cDNR biblioteka paprastai yra geresnė, jei intarpų dydis (tai yra ištisinės cDNR kiekis kiekviename klone) yra didelis, idealiu atveju viso ilgio. Idealiu atveju jokiam bibliotekos nariui neturėtų būti cDNR, gautų iš skirtingų mRNR (tai gali būti paini). Biblioteka turi būti pakankamai didelė, kad joje būtų dominanti cDNR (arba, tiksliau, joje turėtų būti pakankamai nepriklausomai gautų klonų, kad joje būtų dominanti cDNR). Apskritai tai reiškia, kad jis turėtų reprezentuoti visas tam tikrame audinyje esančias mRNR. Žinoma, pasirinkti audinį, kuriame yra palyginti daug dominančios mRNR, yra svarbus eksperimentinis pasirinkimas. Apskritai, lengviau išskirti cDNR iš bibliotekos, kurioje ji pavaizduota daug kartų, nei iš bibliotekos, kurioje ji yra retai. Kai kurios bibliotekos charakteristikos priklauso nuo pasirinkto vektoriaus. Vektoriai dažnai pasirenkami, nes jie leidžia eksperimentiškai lengvai patikrinti daugybę nepriklausomų bibliotekos narių. Kai kurie vektoriai yra skirti ekspresuoti tik kDNR, o kiti buvo modifikuoti, kad ekspresuotų ne tik kDNR, bet ir išreikštų ją kontekste, kad iš cDNR būtų paverčiamas baltymu arba sulietu baltymu. (Sulieti baltymai bus aptarti toliau.) Prieš naudojant cDNR biblioteką, būtų protinga nustatyti, ar tai geros kokybės biblioteka. Ne vienas studentas sugaišo mėnesius laiko peržiūrėdamas biblioteką, kurioje nebuvo jokių intarpų arba intarpai buvo tokie trumpi, kad jie buvo mažai vertingi.

    cDNR gamyba. KDNR generavimas taip pat gali būti atliekamas įvairiais procesais, tačiau beveik visais atvejais cDNR generuoja fermentas atvirkštinė transkriptazė* (RT), galinti panaudoti RNR esančią informaciją, kad būtų sukurta papildoma DNR. Taigi atvirkštinė transkriptazė yra nuo RNR priklausoma DNR polimerazė. Kaip ir visos DNR polimerazės, ji negali inicijuoti de novo sintezės, bet priklauso nuo pradmenų buvimo. Kadangi daugelis mRNR turi poli-A uodegą 3' gale (žr. poliadenilinimą* ), oligo-dT dažnai naudojamas DNR sintezei pradėti (taip pat įmanoma ir dažnai būtina generuoti cDNR naudojant atsitiktinius pradmenis arba pradmenis. sukurtas specifinei mRNR amplifikuoti). Sukūrus pradinę cDNR, paprastai būtina pagaminti antrąją DNR grandinę. Vėlgi, yra daug strategijų, kaip tai padaryti, tačiau patogus mechanizmas apima DNR/RNR hibrido poveikį RNRazės-H ir DNR polimerazės deriniui. RNRazė-H gali sukelti vienos grandinės įtrūkimus RNR, o DNR polimerazė gali panaudoti šiuos vienos grandinės įtrūkimus, kad inicijuotų „antrosios grandinės“ DNR sintezę. Ši dviejų etapų procedūra buvo optimizuota siekiant maksimaliai padidinti cDNR tikslumą ir ilgį.

    cDNR įtraukimas į vektorių . Kitas iššūkis yra įtraukti šią cDNR kolekciją į vektorių*, kad ja būtų galima manipuliuoti. Vienas iš patogiausių būdų tai padaryti yra bandyti manipuliuoti cDNR taip, kad kiekviena iš jų turėtų unikalią restrikcijos vietą tuose galuose. Norėdami tai padaryti, cDNR dažnai metilinamos specifine metilo transferaze, kuri įtraukia metilo grupę į tam tikrą restrikcijos vietą, kad apsaugotų jas nuo restrikcijos fermento, kuris bus naudojamas vėliau. Tada bet kokie 3' arba 5' ilgiai turi būti pašalinti apdorojant nukleaze arba užpildyti polimeraze. Taip susidaro „bukais galais“ molekulė, kurioje 3’ ir 5’ bazės yra „registre“. Tada galima susieti sintetinį oligonukleotidą prie šios cDNR galų. Bukų galo surišimas paprastai yra mažai efektyvus procesas, tačiau naudojant didelę šių sintetinių oligonukleotidų koncentraciją, reakcija gali būti beveik baigta. Šie sintetiniai oligonukleotidai gali būti „jungikliai“ (kurie sintezuojami taip, kad jų vienas bukas galas ir vienas galas turi „iškyšą“ (ty vienos grandinės DNR sritį), kuri yra komplementari restrikcijos fermentų gaminamai daliai, arba jie gali būti adapteriai“ (kurie yra dvigrandė DNR molekulė, kurią galima apdoroti nukleaze, kad susidarytų atitinkama iškyša).

    Iškyšos susidarymo vertė yra ta, kad tai palengvins cDNR įvedimą į vektorių. Vektorius taip pat gali būti paruoštas apdorojant jį ta pačia nukleaze arba nukleaze, kuri gamina tą pačią restrikcijos vietą, kad susidarytų vienagrandė sritis, kuri yra komplementari su vienos grandinės sritimi cDNR. Sumaišius dominančią cDNR su vektoriumi, dalyvaujant ligazei, galima įtraukti cDNR į vektorių. Vienas iš eksperimentinių sunkumų tai darant yra tas, kad pats vektorius turės didelį polinkį pakartotinai susijungti, kad susidarytų vektorius be jokio cDNR intarpo. Tai dažnai sumažinama apdorojant vektorių fosfataze, kad būtų pašalinti galiniai fosfatai. Šie fosfatai reikalingi ligazei veikti, todėl ši strategija užkerta kelią šiai nepageidaujamai šalutiniai reakcijai.

    Naudojamo vektoriaus pasirinkimas taip pat turi didelę įtaką eksperimento rezultatams. Iš pradžių plazmidės buvo pasirinktos kaip vektoriai ir buvo modifikuotos, įtraukiant žymenis, kurie gali būti naudojami norint nustatyti, ar plazmidė buvo įvesta į bakterijų ląstelę, ar klonavimo vietoje yra cDNR intarpas. Visai neseniai buvo sukurti bakterijų fago lambda dariniai, kurie gali būti veiksmingi cDNR klonavimo vektoriai. Bakterijų fago lambda pranašumas yra tas, kad iš tam tikro mRNR/cDNR kiekio galima išskirti daugiau nepriklausomų klonų ir hibridizacijos metodais atrinkti didesnį klonų skaičių. Lambda ir lambda genetikos supratimo mastas leido išskirti lambda darinius, iš kurių buvo pašalinti kai kurie neesminiai genai, todėl galima nešti iki 11 kb cDNR intarpus, o tai yra patogus dydis ir pakankamas izoliacijai. daugumos cDNR. Lambda genomas yra linijinė molekulė, kai ji yra supakuota į bakteriofagą, o cDNR gali būti įtraukta į centrinę DNR sritį. Lambda „rankos“ (tolimesnės DNR dalys) koduoja visą esminę informaciją lambda replikacijai infekcinio ciklo metu. Klonavimo vieta lambda -gt10 buvo pasirinkta siekiant nutraukti genus, kurie yra būtini lambda lizogenijai *. Jei lambda rankos vėl susijungia, kai nėra įdėklo, ir pasirenkamas tinkamas šeimininkas (hfl, aukštam lizogenijos dažniui), šios dalelės nesudarys plokštelių. Taigi tik dalelės, turinčios įdėklą, sudarys apnašas. Nepaprasta bakteriofago lambda, kaip vektoriaus, galia yra ta, kad, kai cDNR yra surišta su lambda rankomis, DNR gali būti įtraukta į fago dalelę in vitro. Tada ekstraktai, paruošti iš ląstelių, turinčių visus lambda surinkimui būtinus baltymus, gali būti sumaišyti su bibliotekos DNR ir ATP, ir dalelės bus surinktos! Tada šios dalelės gali būti naudojamos užkrėsti E coli, o kiekviena atskira plokštelė yra nepriklausoma kloninė populiacija, atstovaujanti vienai cDNR rūšiai. Šis gebėjimas gali būti naudojamas tiek kDNR bibliotekai amplifikuoti (tai yra šiek tiek pavojinga, nes pakartotinis amplifikavimas gali lemti kai kurių kDNR sekų praradimą), ir kDNR bibliotekos atrankai, norint išskirti dominančią kDNR.

    Atranka . Lambda -gt10 biblioteka gali būti patogiai patikrinta, pasodinus ją santykinai didelėmis koncentracijomis ant E coli bakterijų vejos. Didelio tankio atranka leidžia eksperimentuotojui patikrinti nuo 100 000 iki 1 000 000 nepriklausomų plokštelių vienoje plokštelėje ir teoriškai leidžia patikrinti cDNR, kurios yra tik vienoje kopijoje vienoje ląstelėje tam tikrame audinyje. Atranka atliekama taikant „replica-plating“ procedūrą. Fagui užkrėtus E coli ir suformavus atskiras apnašas, uždėjus nitroceliuliozės gabalėlį ant E-coli vejos, galima sukurti puikų užkrėstos apnašos erdvinį vaizdą. Nitroceliuliozė labai aistringai jungiasi su DNR, todėl dalis kiekvienos plokštelės DNR gali būti perkelta į nitroceliuliozės popierių arba net kelis skirtingus nitroceliuliozės popierius. ant kiekvieno nitroceliuliozės lapo turi būti pavaizduotas originalus užkrėstų ląstelių modelis Petri lėkštelėje. Tada DNR iš bibliotekos gali būti kryžmiškai sujungta su filtru ir pašalintas baltymas gali būti nuplautas. Tada dominančios plokštelės gali būti patikrintos naudojant hibridizacijos testą.

    Tai veda prie klausimo, kaip galima patikrinti biblioteką, kad būtų galima išskirti kandidatus į dominančią cDNR. Vienas iš paprasčiausių būdų tai padaryti yra pasinaudoti DNR hibridizacija. Jei galima sukurti oligonukleotidą, kuris papildytų dominančią mRNR, jis gali būti naudojamas bibliotekai tikrinti. Toks oligonukleotidinis zondas gali būti sukurtas pagal sekos informaciją iš žinomo baltymo aminorūgščių sekos. 50–60-aisiais buvo sukurti biocheminiai metodai, skirti gauti žinomų išgrynintų baltymų sutampančių fragmentų aminorūgščių seką. Mūsų užduotis daug paprastesnė. Dabar reikia tik žinoti kelių baltymo regionų aminorūgščių seką. Norėdami tai padaryti, išgrynintas baltymas paprastai virškinamas proteazėmis arba biocheminiu metodu, kad būtų gauta peptidų serija. Skirtingai nuo baltymų, su kuriais reikia elgtis atsargiai, kad jie išlaikytų savo prigimtinę konformaciją, peptidai gali būti traktuojami kaip biologinės organinės molekulės. Juos galima frakcionuoti gana standartinėmis procedūromis, naudojant HPLC (aukšto slėgio skysčių chromatografiją), kuri gali išskirti atskirus peptidus. Jei atskirų peptidų serija gali būti išskirta, tų peptidų seka gali būti nustatyta arba bent iš dalies nustatyta Edmundo degradacijos būdu. Ši reakcijų serija atskiria atskiras aminorūgštis po vieną iš peptido ir galima identifikuoti gautus aminorūgščių darinius. Ši procedūra gali pateikti sekos informaciją apie peptidų seriją. Norint tai padaryti protingai, labai svarbu, kad kiekvienas peptidas būtų gautas iš vienos baltymo molekulės, o kriterijai, kuriais remiantis galima užtikrinti, kad taip būtų, buvo aptarti skyriuje apie baltymų valymą. Edmundo skaidymas veikia pašalinant atskiras aminorūgštis iš N-galo ir kai kuriais atvejais gali būti taikomas nepažeistam baltymui, tačiau paprastai N-galinė amino grupė yra chemiškai modifikuota, todėl šis metodas dažniausiai nepavyksta.

    Zondo projektavimas. Zondas yra oligonukleotidas, sukurtas taip, kad jis papildytų dominančią mRNR, kad būtų galima naudoti bibliotekai tikrinti. Žinoma, bet kuri mRNR gamina unikalų polipeptidą, kai ji yra išversta, tačiau atvirkščiai nėra tiesa. Kadangi tripleto kodas yra išsigimęs, yra daug mRNR sekų, kurios gali sudaryti tas pačias aminorūgščių sekas. Dėl šios priežasties oligonukleotidinio zondo projektavimas nėra paprastas, tačiau sumanus eksperimentatorius gali priimti gerus sprendimus kurdamas zondą. Iš esmės gali būti naudojamos dvi strategijos.Eksperimentuotojas gali pasirinkti sukurti santykinai trumpą oligonukleotidą, kuris, tikimasi, turės aukštą homologiją su dominančia mRNR, arba eksperimentuotojas gali pasirinkti sukurti ilgesnį zondą, kuriame yra didesnė tikimybė, kad kai kuriose srityse, kurios nėra papildančios mRNR. domina, bet tikimės, kad turės bent keletą sekų, kurios gali sudaryti stabilų dvipusį ryšį. Daugeliu atvejų prasminga sudaryti skirtingų zondų mišinį, kurie yra homologiški, tačiau turi skirtingas bazes tose vietose, kur neįmanoma tiksliai numatyti, kuris iš jų turėtų būti. Tai vadinama degeneracija. Zondas dažnai gali būti 64 arba 128 kartus išsigimęs, tačiau per didelis išsigimimas sumažina specifinį zondo aktyvumą ir padidina hibridizacijos su „neteisinga“ cDNR tikimybę. Strategijos pasirinkimas priklauso nuo turimų aminorūgščių sekų.

    Taip pat reikia atsižvelgti į daugybę kitų veiksnių. Daugelyje organizmų pirmenybė teikiama tam tikrų trynukų naudojimui, o ne kitų tripletų naudojimui (kodono panaudojimas). Paprastai nerekomenduojama kurti zondo, turinčio homologiją su žinoma mRNR, nes tai gali lemti netinkamos cDNR klonavimą. Todėl būtina patikrinti bet kurio zondo atitiktį žinomoms duomenų bazės sekoms. Labai svarbu naudoti aminorūgštis arba aminorūgščių derinius, turinčius mažiau potencialių tripletų koduojančių sekų arba mažesnį degeneracijos laipsnį (ty potencialias sekas). Jei galimi keli susiję zondai, dažnai tikslinga tikrinti su išsigimusiu oligonukleotidu. Suprojektavus zondą arba zondų seriją, juos galima susintetinti chemiškai ir paženklinti dideliu specifiniu aktyvumu 32 P. Tada oligonukleotidinius zondus galima inkubuoti su nitroceliuliozės filtrais, kad būtų galima hibridizuoti. Sąlygos pasirenkamos siekiant maksimaliai padidinti hibridizacijos specifiškumą, tačiau leidžiant tam tikrą galimą neatitikimą. Svarbiausia, kad sąlygos turėtų būti parinktos taip, kad hibridizacija, kuri yra nespecifinė arba vyksta tik esant dideliam neatitikimui, nebūtų leidžiama. Taigi, filtrai plaunami, kad būtų pašalinti nepažymėti arba nespecifiškai surišti oligonukleotidai. Tada filtrai gali būti autoradiografuojami, kad būtų galima identifikuoti filtro sritis, atitinkančias, tikiuosi, konkretų signalą. Kadangi filtras yra originalios plokštelės kopija, eksperimentatorius gali grįžti į šią plokštelę ir išskirti originalią plokštelę arba plokštelių grupę, atsakingą už signalą. Tada plokšteles galima pakartotinai uždėti ant šviežių E coli (atminkite, kad kiekvienoje plokštelėje yra fago, kuris gali užsikrėsti ir daugintis E coli), ir procesas kartojamas, kad galiausiai būtų išskirta viena plokštelė, atsakinga už signalą (ty apnašų valymas). * tai).

    Specifiškumo testas. Nors apnašos, duodančios stiprų signalą, izoliavimas yra akivaizdžiai jaudinantis žingsnis, tai tik pirmas žingsnis. Reikia užduoti kitą klausimą: ar izoliuota cDNR tikrai domina? Tai tikrai gali būti susijusio baltymo cDNR arba visiškai nesusijęs baltymas, kuris tiesiog turėjo seką, kuri hibridizuotųsi su pasirinktu zondu. Taigi labai svarbu sukurti tam tikrus kriterijus, pagal kuriuos būtų išskirta arba pašalinta tinkama cDNR. Yra keletas kriterijų, kurie atitiks šį poreikį. Paprasčiausias naudoja sekos informaciją, kurią galima gauti iš izoliuotos cDNR. Skirtingai nuo baltymų, kurių sekos informaciją gauti eksperimentiškai sunku, sekų informaciją gauti iš DNR yra gana paprasta. cDNR galima subklonuoti į patogų vektorių ir gauti sekos informaciją. Jei išskirtos cDNR seka taip pat koduoja kai kurių peptidų, kurie buvo sekvenuoti, bet nebuvo panaudoti zondui sukurti, seką, tai tikrai yra įtikinamas įrodymas, kad buvo išskirta teisinga cDNR. Būtų sunku ginčytis, kad buvo išskirta neteisinga cDNR, jei kelių nepriklausomų peptidų seką numatė cDNR.

    Dažnai taip pat yra numatomo baltymo struktūros elementų, kurie gali būti naudojami siekiant patvirtinti klonavimo procedūros teisingumą. Apibūdinant baltymą, dažnai žinoma, kad baltymas, pavyzdžiui, gali būti membraninis baltymas, tokiu atveju galima numatyti transmembraninių sekų egzistavimą. Yra žinoma, kad kai kurie baltymai yra fosfoproteinai, kurie tam tikrose situacijose rodo serinų arba treoninų buvimą, leidžiantį kinazei juos fosforilinti. Be to, kai kurie baltymai yra glikozilinti, o aminorūgščių sekos, susijusios su glikozilinimu, taip pat patvirtins klonavimo metodo teisingumą. Vėlgi, reikia pabrėžti, kad visa tai yra tik kriterijai, pagal kuriuos buvo išskirta tinkama cDNR. Eksperimentistas turi juos panaudoti, kad sukurtų įtikinamą atvejį, tačiau nė vienas nėra visiškai patikimas. Kai kuriais atvejais baltymo ekspresijos modelis (specifinis audiniams) arba mRNR pokytis organizmuose, kurie turi tam tikrą mutaciją, kuri, kaip žinoma, turi įtakos dominančio baltymo aktyvumui, gali būti svarbus kriterijus, leidžiantis. Eksperimentas įtikina, kad buvo išskirta teisinga cDNR. Vienas iš įtikinamiausių būdų yra nustatyti, ar izoliuotos DNR koduotas baltymas turi dominantį biologinį aktyvumą, tačiau kartais šiam eksperimentui atlikti prireikia laiko.

    Viso ilgio cDNR gavimas. Kai kuriais atvejais, iš tikrųjų daugeliu atvejų, išskirta cDNR nebus viso ilgio, ty ji atitiks tik mRNR dalis, bet ne visą seką. Tokiu atveju būtina iš naujo patikrinti biblioteką, paprastai naudojant jau išskirtą kDNR, kad būtų galima identifikuoti arba viso ilgio cDNR, arba dalinių cDNR, kurios apimtų visą dominančią cDNR, seriją. Tai iškelia įdomų klausimą, kaip eksperimentatorius žino, ar viso ilgio cDNR iš tikrųjų buvo izoliuota. Svarstymas apie pagrindinę molekulinę biologiją gali suteikti daug užuominų šiuo klausimu. MRNR molekulinė masė gali būti įvertinta Šiaurės analize* ir ją galima palyginti su išskirtos cDNR dydžiu. Gali būti, kad iš vieno geno gali būti sukurtos kelios mRNR alternatyvaus sujungimo būdu, ir tai reikia atsiminti. MRNR turėtų apimti ir koduojančią sritį, turinčią ilgą atvirą skaitymo rėmą, ir nekoduojančias sekas (dažnai vadinamas UTR*, u n t transliuotiems regionams) tiek 3', tiek 5' galuose. Atviras skaitymo rėmelis* yra tiesiog nenutrūkstama tripletų serija, kurioje nėra stop kodonų. Tokia kodavimo seka turėtų numatyti atitinkamos molekulinės masės baltymą, kuris dažnai gali būti lyginamas su žinomo baltymo molekuline mase. Prieš vertimo pradžios vietą dažnai, bet ne visada, randami stop kodonai. 3' pranešimo galas dažnai turi poli-A uodegą. Beveik visada yra ypatingas susidomėjimas aiškiai identifikuoti mRNR 5' galą. Šią seką dažnai sunkiausia gauti iš cDNR bibliotekos, nes jai reikia veiksmingos atvirkštinės transkriptazės iki kraštutinio mRNR galo. Dažnai reikia pakartotinai grįžti į cDNR biblioteką arba naudoti specializuotus metodus, norint išskirti autentišką 5' galą. Dažnai geriausias būdas identifikuoti sekas 5' kDNR gale yra naudoti RACE , kuri yra PGR pagrįsta technika, skirta DNR sekoms amplifikuoti netoli 5' arba 3' DNR galo. Konkretaus 5' galo autentiškumą galima patvirtinti atliekant 'pradiklio pratęsimo*' eksperimentus. Taikant šį metodą, atvirkštinė transkriptazė naudojama oligonukleotidiniam pradmeniui, kuris buvo sukurtas hibridizuotis šalia numatomo mRNR 5' galo, pratęsti. Pailginus tokį gruntą, turėtų susidaryti konkretaus ir numatomo dydžio polimeras.

    Kiti cDNR išskyrimo metodai.

    Pasirinkimas, kaip išskirti cDNR, priklauso nuo tyrėjo interesų ir turimų priemonių. Daugeliu atvejų buvo veiksmingai naudojamas oligonukleotidinio zondo dizainas, tačiau yra daug kitų papildomų metodų, kuriuos galima naudoti. Keletas iš jų bus išvardyti ir aprašyti šiame skyriuje.

    Klonavimas iš išraiškos bibliotekų. Daugeliu atvejų vektorius gali būti sukurtas taip, kad cDNR būtų ekspresuojama, dažnai kaip sulietas baltymas. Šiuo atveju cDNR buvo įtraukta į vektorių tokioje padėtyje, kurioje ji yra kito baltymo koduojančioje sekoje. Vektorius taip pat apima promotoriaus sekas, kurios leidžia ekspresuoti baltymą (tiek transkribuoti, tiek transliuoti). Kai toks vektorius naudojamas bibliotekai sukurti, jis vadinamas išraiškos biblioteka*. Ekspresijos bibliotekos turi pranašumą ir trūkumą, kad yra baltymo. Kai kuriais atvejais tai gali reikšti, kad gali būti selektyvus spaudimas prieš dominančios cDNR ekspresiją, tačiau daugeliu atvejų ši išraiška leidžia taikyti naujus atrankos būdus. Paprasčiausias iš jų yra antikūnų naudojimas bibliotekai patikrinti.

    Atranka naudojant antikūnus yra gana panaši į atranką su oligonukleotidiniu zondu, tačiau šiuo atveju antikūnas prieš baltymą yra prieinamas reagentas. Šis antikūnas gali būti sukurtas eksperimentiniu būdu, tačiau jis taip pat gali būti prieinamas dėl įdomaus autoimuninio atsako gyvūnų modeliuose arba žmonių populiacijoje. Pavyzdžiui, kai kuriems vėžiu sergantiems pacientams išsivysto autoimuninė liga, sukelianti neuronų degeneraciją. Tada šių pacientų antiserumai gali būti naudojami atskirti geną, gaminantį baltymą, kurį atpažįsta šis antikūnas. Antikūnas gali būti dedamas į nitroceliuliozės filtrus tokiomis sąlygomis, kai jis specifiškai jungiasi, ir tada antikūnas gali būti aptiktas antriniu antikūnu, kuris yra arba paženklintas izotopu, arba kovalentiškai prijungtas prie fermento, pavyzdžiui, krienų peroksidazės, kurį galima aptikti naudojant standartines fermentines reakcijas. . Čia yra gera svetainė, kurioje pateikiama daugiau informacijos apie tokio tipo požiūrį.

    Jei manoma, kad cDNR koduoja tirpų faktorių, turintį žinomą biologinį poveikį, ir jei tą poveikį galima nesunkiai ištirti, tai tyrimas gali būti būdas patikrinti biblioteką, nors gali būti sunku patikrinti daugybę nepriklausomų izoliuoja.

    Papildymas . Kai kuriuos genus galima išskirti naudojant klasikinį genetinės komplementacijos metodą. Jei yra tam tikro geno ekspresijos atrankos metodas, tada ši atranka gali būti naudojama norint išskirti tą geną koduojančią cDNR. Pavyzdžiui, gana paprasta pasirinkti už arba prieš fermento HGPRTazės* (hipoksantino guanino fosforibozolio transferazės) buvimą E. coli arba eukariotinėse ląstelėse. Jei HGPRTazės stokojančią E. coli galima išskirti ir transformuoti ekspresijos vektoriumi, atitinkamą aktyvumą ekspresuojančios ląstelės taptų HGPRTase+. Kadangi galima atrinkti tokias kolonijas, tai būtų paprastas būdas išskirti HGPRTazės cDNR iš bet kurio organizmo. Komplementacija buvo naudojama norint išskirti daugelio tipų cDNR, įskaitant kai kurias, reguliuojančias sudėtingus reiškinius, tokius kaip ląstelių ciklas arba prekyba membranomis. Šio metodo galia yra ta, kad jis pateikia tokius tvirtus specifinės in vivo funkcijos įrodymus. Žinoma, būtina nepriklausomai nustatyti, ar buvo išskirtas tinkamas klonas.

    Ekspresija ląstelės paviršiuje su antikūnų atranka. Ląstelių paviršiaus receptoriai yra ypač svarbūs biologijoje ir kartais juos galima išskirti naudojant ekspresijos strategiją. Pavyzdžiui, limfocituose esančios ląstelės paviršiaus molekulės buvo identifikuotos išskiriant specifinius monokloninius antikūnus. Taip pat daugelio receptorių ligandas buvo išskirtas prieš nustatant receptoriaus prigimtį. Abiem atvejais cDNR, skirta ląstelės paviršiaus molekulei, kai ekspresuojama, ląstelės paviršiuje atsiras surišimo vieta. Ši surišimo vieta gali būti naudojama bibliotekai tikrinti arba naudojant metodą, analogišką aukščiau minėtam antikūnų atrankai, arba naudojant ligandą arba antikūną kaip afiniteto reagentą, skirtą ląstelėms, ekspresuojančioms surišimo vietą, "panti".

    Funkcinis receptorių klonavimas . Viena iš įdomesnių ląstelių paviršiaus molekulių klasių yra molekulės, kurios koduoja jonų kanalus. Dėl didžiulės elektrofiziologijos galios ir jautrumo (elektrofiziologai gali išmatuoti net vienos molekulės funkciją!), vienos ar kelių mRNR molekulių buvimas vienoje ląstelėje gali sukurti pakankamai jonų kanalų, kuriuos būtų galima palyginti lengvai aptikti naudojant elektrofiziologinį tyrimą. metodas. Įšvirkštus mRNR į varlių oocitus, gali atsirasti tam tikrų jonų kanalų, kuriuos galima aptikti dėl jų reagavimo į elektrinius signalus arba dėl ekstraląstelinių ligandų buvimo. Šis metodas suteikė tiesioginį ląstelių paviršiaus glutamo rūgšties (glutamato) receptorių tyrimą, kuris yra labiausiai paplitęs neurotransmiterio receptorius centrinėje nervų sistemoje. Šis metodas gali būti pagrįstas ekspresijos vektoriais, galinčiais gaminti dominančią mRNR, arba neigiamu kriterijumi. Bendra cDNR injekcija gali užgniaužti signalą, hibridizuojant specifiškai su mRNR. Žinoma, bet kurio iš šių metodų sunkumas yra tas, kad tampa sunkiau patikrinti daug mRNR. Ši problema buvo sėkmingai išspręsta naudojant strategijas, apimančias „brolio (brolio ir sesers) atranką“. Pagal šią strategiją vienu metu tikrinami tūkstančiai nepriklausomų klonų, o kai signalas nustatomas bet kuriame telkinyje, pats telkinys gali būti suskirstytas į dalis, kol bus galima išskirti atskirą kloną.

    Homologinis patikrinimas. Vienas iš produktyviausių, nors galbūt ir mažiau kūrybingų požiūrių į cDNR išskyrimą yra homologijos atranka *. Kai įdomus genas buvo išskirtas iš vienos rūšies, yra gana paprasta naudoti žemo griežtumo hibridizacijos strategiją, kad būtų galima išskirti cDNR iš kitos rūšies. Taip pat dažnai galima nustatyti papildomų šeimos narių iš tos pačios rūšies. Nereikėtų nuvertinti šio požiūrio galios. Įdomūs mutantai dažnai gaunami Drosophila naudojant genetinius ekranus ir gali būti nepaprastai svarbu nustatyti atitinkamų genų egzistavimą žmonėms. Be to, dėl didelės žmonių populiacijos atidžiai stebint savo medicininę priežiūrą, žmogaus genetinės ligos yra gausus įdomių genų ir galiausiai įdomių cDNR šaltinis. Nustatyti tokių cDNR egzistavimą modelių sistemose gali būti labai vertinga. Geri to pavyzdžiai yra iš apoptozės srities. Kai kurie originalūs genai, tokie kaip ICE proteazė, iš pradžių buvo nustatyti atliekant C. elegans tyrimus, o vėliau buvo išskirti žmogaus šių genų homologai. Taip pat žmogaus onkogenas, bcl 2, iš pradžių buvo išskirtas atliekant genetinius tyrimus, dėl kurių buvo išskirta cDNR, o vėliau modelių sistemose buvo nustatyti homologai.

    PGR pagrįsti ekranai. PGR pagrįstas atranka taip pat yra būdas išskirti naujas cDNR. Išskyrus du ar daugiau šeimos narių, galima nustatyti homologinius regionus. Šios homologijos sritys yra išsaugotos šeimoje, PGR pradmenys gali būti sukurti ir naudojami mRNR atvirkštinės transkriptazės produktams amplifikuoti atitinkamame audinyje. Galima numatyti žinomų šeimos narių molekulinę masę, o naujos mRNR gali sukelti naujų amplifikacijos produktų. Gerą pavyzdį rasite skyriuje apie baltymus. Šie amplifikacijos produktai savo ruožtu gali būti naudojami cDNR bibliotekoms tikrinti. Kai kuriais atvejais gali pakakti net vieno konservuotos struktūros regiono, kad būtų galima išskirti naujus genus, naudojant šią strategiją. Atvirkštinė transkriptazė gali būti naudojama pradmeniui, kuris buvo pagamintas iki konservuotos sekos, išplėsti. Žinoma, tokie produktai gali būti nevienalyčiai, nes skirtingos atvirkštinės transkriptazės molekulės išsiplės skirtingai. Tačiau kai kurie restrikcijos fermentai gali suskaldyti viengrandę DNR ir tokį produktą apdorojant tokio tipo fermentu, susidarytų unikalaus dydžio fragmentas. Tada toks fragmentas gali būti surištas su homopolimeru (ty Cs seka gali būti pridėta prie molekulės galo), naudojant galinę transferazę. Tada ši Cs seka gali būti naudojama kaip vieta, skirta pritvirtinti oligonukleotidinį pradmenį, kuriame yra Gs ruožas. Jei šis pradmuo yra pratęstas, gautas produktas bus tinkamas PGR amplifikacijai tarp dviejų pradmenų, kurie buvo naudojami jį kuriant.

    Pliuso / minuso ekranas ir diferencialinis ekranas*. Kitas naudingas būdas išskirti dominančias cDNR remiasi ne žiniomis apie jų pirminę struktūrą, o prielaidomis apie jų ekspresiją. Tiek pliuso / minuso atranka, tiek diferencinis rodymas remiasi strategijomis, kuriomis siekiama išskirti cDNR, kurios yra išreikštos vienoje situacijoje, bet ne kitoje. Pavyzdžiui, žinoma, kad augimo faktoriai, tokie kaip NGF arba PDGF, ir hormonai, tokie kaip estrogenai, skatina naujų genų ekspresiją. Taigi, ląstelių populiacija, kuri yra kultivuojama arba auginama atliekant tokią eksperimentinę manipuliaciją (pvz., +/-NGF, +/-estrogenas, +/- retinoinė rūgštis), turėtų išreikšti kai kuriuos bendrus genus, bet turėti keletą bendrų genų. skirtingos mRNR. Taip pat skirtingų vystymosi stadijų audiniai gali turėti ypatingo susidomėjimo turinčius ekspresijos modelius. Giminingi, bet skirtingi audiniai taip pat gali išreikšti įdomų genų pogrupį. Manoma, kad yra įdomių genų, ekspresuojamų smegenėlėse, bet ne bazinėse ganglijose ar T ląstelėse, bet ne B ląstelėse. Šių genų išskyrimas gali padėti suprasti tų audinių funkciją arba genų ekspresijos reguliavimo būdą.

    • Atliekant pliuso/minuso atranką, mRNR išskiriama iš dviejų ląstelių populiacijų ir atvirkštinė transkribuojama, kad susidarytų cDNR populiacija. Tada šių cDNR alikvotinės dalys gali būti konvertuojamos į zondą atsitiktiniu heksameriniu pradiniu būdu ir naudojami pasikartojantiems bibliotekos pakėlimams tikrinti (ty du nitroceliuliozės filtrai, pagaminti iš tos pačios plokštelės ar ląstelių. Bet kokia plokštelė ar kolonija, hibridizuojanti pasikartojančius pakėlimus iš bibliotekos). vienas zondas, bet ne kitas, yra potencialus kandidatas į susidomėjimą, o diferencinė išraiška gali būti patikrinta šiaurės analize arba susijusiu metodu.
    • Diferencialinis ekranas yra paprastas PGR amplifikacijos modifikavimas. Taikant šį metodą, mRNR yra atvirkštinė transkribuojama naudojant pradmenų seriją. Dažnai parenkami pradmenys, turintys atsitiktinį oligonukleotidų rinkinį ir oligo-dT sekciją, kuri hibridizuotųsi su poli-A uodega. mRNR, kurios yra homologiškos atsitiktinai pasirinktai sekai, turėtų būti atvirkštinės transkribuotos, sukuriant vienos grandinės cDNR. Pridėjus kitą pradmenį, vėlgi, atsitiktinai parinktą, bus galima amplifikuoti atvirkštinės transkribuotos cDNR pogrupį. Priklausomai nuo atstumo tarp dviejų pradmenų, bus gauti skirtingos molekulinės masės fragmentai. Atlikus šią procedūrą su mRNR, kuri buvo išskirta iš dviejų skirtingų ląstelių populiacijų, galima nustatyti ekspresijos tarp dviejų ląstelių tipų arba ląstelių būsenų modelį. Vėlgi, amplifikuotas produktas, kuris, kaip manoma, yra unikalus tam tikram ląstelių tipui, gali būti naudojamas zondui, kad būtų galima patikrinti biblioteką arba išbandyti ekspresiją pagal šiaurinę analizę.Abu šie metodai buvo naudojami norint išskirti daug įdomių genų, naudojant tik jų ekspresijos modelį.

    Du hibridiniai atranka. Vienas iš aktyvesnių cDNR išskyrimo būdų yra dviejų hibridinių ekranų naudojimas*. Šie ekranai pavadinti todėl, kad jie naudojasi specifine baltymo ir baltymo sąveika, kuri vyksta tarp dviejų baltymų, kurių kiekvienas yra hibridinis baltymas. Visas tyrimas priklauso nuo kiekvieno hibridinio baltymo vienos dalies gebėjimo sudaryti specifinę sąveiką, kuri yra pakankamai stabili fiziologinėmis sąlygomis su kita. Buvo sukurta keletas šio metodo variantų, tačiau jie visi remiasi ta pačia savybe.

    • Paprasčiausioje versijoje gaminama bandomoji ląstelė, kuri ekspresuoja lengvai ištiriamą geną, pvz., beta-galaktozidazę, kontroliuojant gerai apibūdintam promotoriui. Promotorius parenkamas taip, kad jo bazinis aktyvumas būtų mažas, nesant stimuliacijos iš konkretaus reguliavimo elemento.
    • Tada ta pati ląstelė transfekuojama hibridinio baltymo ekspresijos vektoriumi. Viena hibridinio baltymo dalis yra gaunama iš transkripcijos faktoriaus, kuris yra skirtas atpažinti DNR reguliuojantį elementą. Tačiau prisijungimo prie vietos nepakanka genų ekspresijai sukelti, reikia specifinio mechanizmo transkripcijai aktyvuoti. Antroji šio hibridinio baltymo dalis apima seką, išskirtą iš konkretaus dominančio geno. Šis baltymas gali būti gautas iš kito transkripcijos faktoriaus, iš struktūrinio baltymo arba iš intraląstelinio signalinio baltymo. Vienintelis reikalavimas yra tas, kad paties hibrido nepakanka reporterio geno ekspresijai suaktyvinti.
    • Tada ši ląstelių sistema transfekuojama ekspresijos biblioteka, kuri taip pat išreiškia sulietų baltymų kolekciją. Šiuo atveju sulietas baltymas susideda iš dviejų dalių. Viena sulieto baltymo dalis yra koduojama cDNR bibliotekų rinkiniu, kuris, kaip eksperimentatorius tikisi, gali koduoti baltymą, kuris sąveikaus su taikiniu hibridiniame baltyme, jau ekspresuotame ląstelėje. Antroji šio sulieto baltymo dalis yra transkripcijos aktyvatorius, dažnai aktyvuojantis VP16 regionas, stiprus transkripcijos faktorius. Jei ląstelė yra transfekuota hibridiniu baltymu, kuris neatpažįsta ląstelėje jau esančio hibridinio baltymo (bate), nieko neturėtų atsitikti.
    • Tais retais atvejais, kai VP16 ekspresuojamas kaip hibridas su baltymu, kuris sąveikauja su ląstelėje jau esančiu hibridu, dėl to turėtų suaktyvėti beta-galaktozidazė. Taigi, ekranas yra pradinis baltymų ir baltymų sąveikos tyrimas ir yra sukonstruotas taip, kad būtų galima greitai patikrinti ir atrinkti daug cDNR bibliotekos narių specifinės sąveikos tyrimui. Žinoma, visada yra galimybė, kad aktyvinimas gali įvykti nespecifiniu mechanizmu, tačiau šią galimybę galima išbandyti be didelių sunkumų.

    Atranka pagal duomenų bazes. Greitas sekos informacijos ir genetinių duomenų kaupimas dažnai leidžia mokslininkams apeiti veiksmus, reikalingus kDNR izoliuoti. Pavyzdžiui, jei yra dalinė baltymo seka arba dalinė cDNR seka, ieškant duomenų bazių galima identifikuoti kandidatus į klonus, kuriuos galima užsisakyti ir išbandyti, siekiant nustatyti, ar jie yra „teisingas“ klonas. Duomenų bazėse yra visų genomų seka, taip pat trumpos sekos iš cDNR, kurios skirtos atskiriems klonams žymėti (EST* arba išreikštos sekos žymės).

    Santrauka. Kiekvienas iš šių cDNR bibliotekos atrankos metodų suteikia specifinį atranką arba tyrimą, skirtą cDNR, kurios gali būti įdomios. Tikėtina, kad gryninant baltymą bus gauta tai, kas tiriama, taip ir atliekant cDNR bibliotekos atranką, bus gauta tai, kas tikrinama. Norint nustatyti, ar išskirta cDNR iš tiesų labiausiai domina eksperimentuotoją, reikia atlikti papildomus tyrimus. Nesant supratimo, kokie tie testai turėtų būti, nebus prasmės atlikti pradinius patikrinimus. Taip pat atidžiai apsvarsčius, kurie ekranai yra geriausi konkrečiam tikslui, greičiausiai bus vaisingesnė paieška ir didesnė sėkmės procentas.

    Kodėl išskirti cDNR? Paskutinė tema, kurią reikia apsvarstyti šiame skyriuje, yra klausimas, kodėl cDNR išskyrimas yra toks galingas metodas. Greitai mintyse iškyla keletas atsakymų.

    1. KDNR išskyrimas leidžia eksperimentuotojui naudoti kDNR ekspresijos vektoriams sukurti, kad dominančių baltymų būtų galima gaminti dideliais kiekiais, o tai labai supaprastina baltymų gryninimo užduotį (pvz., žr. bakuloviruso ekspresiją*).

    2. Žinant aminorūgšties seką, iš karto gaunama prieiga prie baltymo sekos. Įvertinus baltymų struktūrą ir ištyrus įprastus žinomų baltymų motyvus, galima gauti daug informacijos apie galimą žinomos cDNR koduojamo baltymo struktūrą ir (arba) funkciją. Sekų buvimas gali lengvai reikšti, kad baltymo produktas gali būti fosforilintas arba gali surišti tam tikrą mažą biocheminę molekulę, pvz., GTP.

    3. Galimybė turėti mRNR leidžia greitai sukurti tyrimus, skirtus iRNR žymėjimo cDNR ekspresijai tirti, gali būti naudojama mRNR ekspresijai nustatyti naudojant tiek šiaurinę analizę, tiek RNazės apsaugą, o RNazės pasiskirstymas tarpląsteliniu būdu gali būti nustatytas in situ. hibridizacija. Kiekvienas iš šių metodų suteikia tam tikrą vertę.

    - Šiaurės analizė* gali greitai nustatyti, ar ekspresijos lygis keičiasi gydant vaistais, hormonais ar vystymosi stadija. Tai atskleidžia, ar yra išreikštos kelios skirtingos mRNR. Šiaurės analizė remiasi izoliuotų mRNR frakcionavimu agarozės (arba kartais akrilamido) gelyje, kuris vėliau perkeliamas į nitroceliuliozę. Tada perkeltos mRNR aptinkamos hibridizuojant su pažymėtu cDNR zondu.

    -- Rnazės apsauga* yra jautresnis mRNR gausos nustatymo metodas. Priešingai nei šiaurinėje analizėje, apsauga nuo RNazės priklauso nuo hibridinės molekulės atsparumo virškinimui. Nors mRNR paprastai yra labai jautri ribonukleazei, jei RNR yra išskiriama ir hibridizuojama su pažymėtu zondu (RNR arba DNR), tada hibridinė molekulė arba hibridinės molekulės dalis gali būti apsaugoti nuo ribonukleazės aktyvumo. Apsaugoto zondo kiekį ir jo dydį galima nesunkiai išmatuoti.

    - DNR matricos leidžia nustatyti didžiulio skaičiaus mRNR ekspresiją viename eksperimente. Jis pagrįstas hibridizacija su nukleino rūgštimis, kurios yra prijungtos prie kietosios fazės atramos.

    -- RT-PCR.* net ir nesant pažymėto cDNR zondo, žinant cDNR seką, galima kiekybiškai įvertinti ekspresiją. Žinant cDNR seką, PGR pradmenys gali būti sukurti ir naudojami atvirkštinės transkriptazės produktui amplifikuoti, nors tikrai kyla problemų atliekant tai kiekybiškai, tai taip pat gali būti naudinga ir galinga technika. Šis metodas taip pat gali būti pritaikytas in situ metodams.

    -- hibridizacija in situ*. cDNR taip pat gali būti naudojama norint nustatyti, kurios ląstelės, audiniai ar vystymosi stadijos gamina tam tikrą mRNR, naudojant in situ hibridizaciją. Pažymėta nukleorūgštis inkubuojama su fiksuotu audiniu arba ląstelėmis tokiomis sąlygomis, kai stabilus yra tik specifiškai surištas hibridas. Auto radiografija atskleidžia endogeninės RNR padėtį. Kontrolė su RNaze padeda įrodyti, kad hibridizacija yra su RNR, o ne su genetine medžiaga.

    3. Kaip jau minėjome aukščiau, žinios apie mRNR seką gali leisti klonuoti homologines sekas arba iš skirtingų rūšių, arba iš papildomų genų šeimų narių rūšies viduje.

    4. cDNR prieinamumas labai palengvina tiek polikloninių, tiek monokloninių antikūnų gamybą. Žinant baltymo seką, galima sukurti ir susintetinti peptidą, kuris gali būti naudojamas kaip antigenas (anti-peptidinis antigenas). Taigi, kai kuriais atvejais antikūnas, atpažįstantis konkretų baltymą, gali būti pagamintas niekada to baltymo neišvalius. Tai taip pat leidžia išreikšti ir išvalyti baltymą, kuris gali būti naudojamas kaip antigenas.

    5. Nors ekspresijos vektoriai yra nepaprastai naudingi gaminant didelius baltymo kiekius, jie galbūt dar naudingesni tuo, kad leidžia gaminti ne tik laukinio tipo baltymą, bet ir mutantinį baltymą. Kartu su į vietą nukreipta mutageneze baltymus galima modifikuoti iki beveik bet kokio eksperimentatoriaus pageidaujamo galo. Tai leidžia išbandyti konkrečius struktūros ir funkcijų ryšius. Pavyzdžiui, tam tikros fosforilinimo vietos svarba baltymo aktyvumui arba specifinė liekana surišant DNR gali būti tiriama ekspresuojant mutantinius baltymus. Žinoma, visi tokie tyrimai turėtų būti žinomi apie galimybę, kad mutantiniai baltymai gali būti prastai išreikšti arba nestabilūs. Įprastesnis ekspresuotų baltymų, turinčių specifinių mutacijų, naudojimas apima specifinių baltymų, kurie gali būti naudojami biocheminiams reagentams arba biocheminiams produktams, gamybą. Ar įvedus papildomus sulfhidralinius ryšius padidėtų konkretaus baltymo termostabilumas, todėl jis būtų geriau naudojamas PGR arba dar geriau kaip proteazės pagrindu pagamintas dėmių valiklis skalbinių ploviklyje?

    6. KDNR išskyrimas reiškia, kad baltymo funkcija in vivo gali būti išbandyta naudojant įvairius metodus. Baltymas gali būti pernelyg išreikštas arba jo ekspresija gali būti sumažinta arba baltymo funkcija gali būti modifikuota įvairiais būdais.

    • Galbūt paprasčiausias būdas yra sukurti priešprasminę tam tikros cDNR seką, naudojant normalią DNR arba fosfotionato bazes, kurios yra santykinai stabilesnės hidrolizei. Antisenso pridėjimas kai kuriais atvejais gali sumažinti baltymo ekspresiją, leidžiančią išbandyti baltymo funkciją konkrečioje sistemoje.
    • Kitas galingas metodas yra naudoti trumpas RNR sekas (RNRi arba siRNR), kad būtų skatinamas RNR, koduojančios dominantį baltymą, degradacija.
    • Taip pat cDNR gali suteikti galimybę modifikuoti geną, gaminantį mRNR. Homologinė rekombinacija suteikia kelią, kuriuo bet kuris dominantis genas gali būti sutrikdytas ar net sąlygiškai sutrikdytas (aptarta kitur). Tokio mutanto organizmo savybių tyrimas yra galingas būdas nustatyti konkretaus geno funkciją. Žr. nokautą ir nokautą .
    • Genas gali būti per daug išreikštas tiek ląstelių linijoje, tiek organizme. Geno įvedimas po konkrečiu promotoriumi į gemalo liniją leidžia daugintis organizmui, kuris klaidingai išreikš ar net sąlygiškai klaidingai išreikš tam tikrą geną. Tokie transgenai vėl yra itin galingas būdas nustatyti tikrąją biologinę funkciją.
    • Jei yra pakankamai žinių apie baltymo struktūros ir funkcijų ryšius, kartais galima sutrikdyti biologinę funkciją, netrukdant endogeninių genų ekspresijai. Dažnai įmanoma sukurti modifikuotą baltymą, kuris, ekspresuodamas, dominuojančiu būdu trukdo endogeninio geno funkcijai. Pavyzdžiui, nuo cAMP priklausomos baltymų kinazės reguliavimo subvieneto mutantinių formų ekspresija trukdo laukinio tipo reguliavimo subvienetų funkcijai ląstelėje. Šie trukdžiai atsiranda dėl to, kad kinazė paprastai susideda iš 2 reguliavimo ir 2 katalizinių subvienetų. Jei yra per didelė mutantinės reguliavimo formos, kuri nesuriša cAMP, ekspresija, tai to pakanka, kad būtų visiškai sutrikdytas bet kurios kinazės molekulės, apimančios net vieną reguliavimo subvienetą, aktyvumas. Panašiai, mutantinių signalinių molekulių, tokių kaip ras, ekspresija, kuri yra modifikuota taip, kad jos negalėtų perduoti signalo, bet išliktų pakankamai natūralios struktūros, kad galėtų gauti signalinę informaciją, gali padėti nustatyti ras arba susijusių molekulių vaidmenį signalizacijos kelyje. Tai dažnai vadinama dominuojančiu neigiamu požiūriu*.

    Taigi, cDNR klonų prieinamumas suteikia molekuliniam biologui daugybę klasikinės genetikos loginių metodų ir leidžia atlikti kritinius in vivo funkcijos tyrimus, kurie kitaip nebūtų įmanomi.

    cDNR ir eksperimentinis dizainas

    Pastangos, įdėtos į cDNR išskyrimą ir apibūdinimą, yra gerai atlyginamos dėl daugybės tokio reagento panaudojimo būdų.

    1. Akivaizdžiausias cDNR panaudojimas yra mRNR ekspresijos tyrimas. Tai galima padaryti naudojant šiaurinę analizę, RNazės apsaugos tyrimą, PGR pagrįstą aptikimą arba hibridizaciją in situ. Norint aptikti mRNR šiaurės analize*, mRNR turi būti paruošta ir frakcionuota gelio elektroforeze, kad būtų atskirtos skirtingos molekulinės masės mRNR. Tada ant gelio esanti RNR gali būti perkelta į nitroceliuliozę ir aptikta hibridizuojant su pažymėta cDNR. Žymė paprastai įtraukiama į cDNR pradmenų pratęsimu, naudojant atsitiktinę oligonukleotidų heksemerų atranką. Šis metodas turi galimybę atskirti skirtingos molekulinės masės mRNR ir taip gali atskleisti alternatyviai sujungtus produktus. RT-PCR* dažnai pasirenkamas, nes tai jautresnis mRNR identifikavimo metodas. Taikant šį metodą, zondas generuojamas naudojant vektorių, kuriame yra RNR polimerazės promotorius. Tada šis promotorius gali transkribuoti in vitro didelio specifinio aktyvumo RNR, kurios dalis gali būti sukurta taip, kad būtų homologiška bet kuriai kDNR. Žinoma, ši susintetinta RNR yra ypač jautri gydymui ribonukleaze, tačiau, jei ji hibridizuojama su mRNR preparatu, kuriame yra papildoma seka, susidarys hibridas ir dėl to RNR taps atspari Rnazės virškinimui. Kai kuriais atvejais saugomos RNR kiekį galima išmatuoti tiesiogiai, bet jį taip pat galima frakcionuoti gelyje, siekiant nustatyti saugomos rūšies molekulinę masę. Kitas naudingas būdas yra pasinaudoti sekos informacija ir naudoti RT-PCR* (atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininę reakciją). Taikant šį metodą, mRNR išskiriama, atvirkštinė transkribuojama, kad būtų sukurta papildoma DNR, o ši komplementari DNR amplifikuojama naudojant PGR pradmenis. Vėlgi, tai yra jautrus mRNR aptikimo metodas, tačiau reikia atsargiai pateikti kiekybinius teiginius apie mRNR kiekį įvairiuose mėginiuose. Galiausiai, hibridizacija gali būti atliekama fiksuotuose audiniuose, siekiant nustatyti, kokie ląstelių tipai ekspresuoja mRNR. Vėlgi, mRNR gali būti aptikta dėl jos hibridizacijos su pažymėtu zondu. Arba modifikuotas RT-PGR protokolas taip pat gali būti atliktas in situ. Taigi visi šie metodai turi galimybę aptikti mRNR gausą ir mRNR pokyčius tarp įvairių ląstelių tipų, reaguojant į vystymąsi ir reaguojant į hormonus ar kitas signalines molekules.

    2. iRNR seka yra greičiausias ir patikimiausias būdas nustatyti koduojamo baltymo seką. Klonuotos DNR seką galima palyginti greitai nustatyti naudojant Maxam-Gilbert Sequencing * arba Sanger Sequencing *. Dėl sparčiai besiplečiančios DNR duomenų bazės ir supratimo, kaip specifinės aminorūgščių sekos gali būti naudojamos tam tikriems baltymų domenams apibrėžti, sekų informacija gali būti naudojama itin pelningai. Pavyzdžiui, baltymo seka gali būti naudojama norint nustatyti tikimybę, kad tam tikri baltymo regionai įgis alfa-spiralės konfigūraciją. Taip pat tam tikros sekos yra susietos su tam tikromis funkcijomis arba tam tikromis struktūromis. Cinko piršto motyvas yra tam tikra baltymo struktūra, galinti surišti cinko atomus su dideliu afinitetu, ir ši struktūra dažnai randama DNR surišančiuose baltymuose. Taip pat spiralės-kilpos-spiralės struktūra, kurią sudaro dvi alfa-spiralės, sujungtos kilpa, dažnai randama transkripcijos faktoriuose. Katalizinė triada yra 3 aminorūgščių seka, randama daugelyje proteazių. Baltymų seka taip pat atskleis tam tikrų vietų buvimą po transliacijos modifikavimui. Angliavandenių, riebalų rūgščių ar fosfatų grupių pridėjimo sekos yra pakankamai gerai konservuotos, o šių sekų buvimas yra stiprus potransliacinio baltymo modifikacijos rodiklis. Jei prognozuojamos alfa spiralės ir jų paviršiuje yra didelė hidrofobinių grupių koncentracija, tai yra tvirtas požymis, kad baltymas gali turėti transmembraninį segmentą. Pasikartojantis tokio motyvo modelis randamas daugelyje signalinių molekulių. Pavyzdžiui, klasikinis septynių transmembranų modelis, kuris iš pradžių buvo rastas bakteriniame rodopsine, taip pat yra daugelyje ląstelių paviršiaus receptorių. Žinoma, bet kokios prognozės, padarytos remiantis aminorūgščių seka, turi būti patvirtintos, tačiau pirminė seka dažnai yra galingas nurodymas, kokius eksperimentus reikia atlikti.

    3. cDNR klono prieinamumas leidžia baltymą ekspresuoti įvairiuose kontekstuose. cDNR gali būti įterpta į įvairius ekspresijos vektorius skirtingiems tikslams. Bene akivaizdžiausias tokio požiūrio panaudojimas yra posakių perkėlimas į itin aukštą lygį. Taip gaunamas turtingas baltymų šaltinis, kuris žymiai palengvina baltymų valymo sunkumus. Tai gali suteikti daug baltymų fiziologiniams tyrimams arba naudoti kaip reagentą. Ryškesnis ekspresijos sistemos panaudojimas buvo gebėjimas ekspresuoti mutantinius baltymus. Kadangi DNR sekas galima mutuoti iš esmės savo nuožiūra, galima ekspresuoti ne tik laukinio tipo baltymus, bet ir giminingus baltymus, turinčius tam tikrų mutacijų. Šios mutacijos, jei gerai suplanuotos, gali būti naudojamos tam tikriems baltymo struktūros ir funkcijų santykiams patikrinti. Jie gali nustatyti, ar tam tikra liekana yra svarbi kataliziniam aktyvumui ar susiejimui su kitu baltymu. Susijusiu ir praktiškesniu būdu baltymai gali būti modifikuoti specifiniams tikslams. Galima įtraukti disulfidines jungtis, kad padidintų pramoninių ir komercinių baltymų terminį stabilumą. Molekulinėms reikmėms naudojami reagentai gali būti modifikuoti, kad būtų slopinama nepageidaujama veikla. Pavyzdžiui, nukleazės aktyvumas gali būti atskirtas nuo polimerazės aktyvumo DNR ploimerazėse. Vieną iš įdomiausių mutantinių baltymų ekspresijos pavyzdžių galima rasti dominuojančio neigiamo baltymo mutanto, kuris gali trukdyti endogeninio baltymo veiklai, projekte. Pavyzdžiui, jei įmanoma atskirti DNR surišantį domeną ir RNR polimerazę aktyvinantį domeną nuo transkripcijos faktoriaus, galima tikėtis, kad DNR surišančio domeno ekspresija, kai nėra aktyvuojančio domeno, trukdys endogeninio domeno aktyvumui. domenas. Daugelis baltymų veikia kaip multimeriai, todėl mutantinio baltymo ekspresija dažnai gali trikdyti endogeninio baltymo aktyvumą, trukdydama baltymų ir baltymų dimerizacijai. Ši strategija buvo labai naudinga tiriant konkrečius transkripcijos veiksnius. Be to, tarpląstelinis signalizavimas reikalauja nuoseklios baltymų serijos sąveikos. Mutantinio baltymo, kuris gali sąveikauti su vienu kaskados nariu, bet ne paskesniais nariais, ekspresija gali trukdyti endogeninio baltymo funkcijai.Ši strategija buvo panaudota labai pelningai, sukuriant sutrumpintus receptorių mutantus, kurie išreiškia tik ekstraląstelinį, bet ne tarpląstelinį baltymo domeną, arba ekspresuojant mutantinę ras versiją arba kitus GTP surišančius baltymus, kurie perduoda signalą ląstelėje.

    4. iRNR sekos prieinamumas taip pat atveria galimybę genetiškai suprasti baltymų funkciją. Daugeliu atvejų antisensinio oligonukleotido* ekspresija arba didelės koncentracijos sintetinių antisensinių oligonukleotidų buvimas gali slopinti endogeninės mRNR transliaciją, todėl ląstelėje trūksta dominančio baltymo. Tokios ląstelės ar audinio analizė gali padėti nustatyti baltymo funkciją in vivo. Taip pat informacija apie cDNR seką arba ją koduojantį geną gali būti naudojama kuriant strategiją, kaip sutrikdyti arba modifikuoti c-DNR koduojantį geną. Naudojant homologinę rekombinaciją galima arba sutrikdyti ir panaikinti geno ekspresiją, arba priversti ekspresuoti pakeistą geno produktą.

    6. Taip pat galima ištirti bet kurio geno produkto priverstinės ekspresijos poveikį bet kuriame dominančiame audinyje. Išnaudojant tam tikrų promotoriaus elementų supratimą (apie tai kitame puslapyje), kurie reikalingi baltymo ekspresijai tam tikrame audinyje tam tikru metu, galima sukurti geną arba hibridinį geną, ekspresuojantį bet kurį dominantį baltymą. . Taigi galima nustatyti, pavyzdžiui, neuropeptido geno perdėto ekspresijos poveikį nervų vystymuisi arba specifinio ryšio nervų sistemoje susidarymui. Galima nustatyti, ar laukinio tipo ar dominuojančios neigiamos baltymo formos ekspresija gali trukdyti bet kokiam vystymosi procesui arba sukelti žinomų ligų vystymąsi. Sukūrus reguliuojamus ekspresijos vektorius, galima kontroliuoti baltymų ekspresiją naudojant mažas molekules, tokias kaip tetraciklinas (žr. tTA* )

    7. Kaip minėjome aukščiau, homologiniams genams išskirti taip pat galima pasinaudoti cDNR sekomis. Naudojant mažo griežtumo hibridizaciją arba PGR metodą, pagrįstą žiniomis apie konservuotus genų regionus, dažnai galima nustatyti papildomus genus, kurie yra šeimos nariai ir galbūt biologiškai svarbūs, nesant jokių žinių apie jų funkciją.

    8. Žinodami baltymo cDNR seką, dažnai lengviau susidarys antikūnai ir monokloniniai antikūnai. Paprasčiausiai per daug išreikštas baltymas gali būti išgrynintas ir naudojamas kaip antigenas. Arba, kruopštus cDNR sekos ir tikėtinos koduojamo baltymo struktūros svarstymas gali būti naudojamas kuriant peptidus, kurie gali būti naudojami kaip antigenai polikloniniams arba monokloniniams antikūnams gaminti, ir tai bus aptarta puslapyje, skirtame antikūnams * .

    9. Galiausiai, kDNR seka gali būti naudojama kaip zondas genominėms bibliotekoms atrinkti ir atskirti geną, koduojantį tam tikrą kDNR. Tai itin vertingas metodas, nes jis suteikia tiltą tarp cDNR klonavimo ir klasikinės genetinės analizės. Nustačius cDNR geną, galima patikrinti jo ryšį su konkrečiu vystymosi ar ligos fenotipu. Galima naudoti klasikinius genetinius metodus, siekiant nustatyti, ar tam tikro geno mutacijos atsiskiria kartu su geno ar jo cDNR pokyčiais.

    Apibendrinant galima pasakyti, kad cDNR prieinamumas atveria tokį platų eksperimentinių metodų įvairovę, o cDNR klonavimas yra tokia galinga technologija, kad reikėtų apsvarstyti cDNR išskyrimą, nepaisant galutinio eksperimento tikslo.


    PRAKTIKOS KLAUSIMAI

    A) tikslioje jų nukleotidų sekoje turi būti informacija, skirta aminorūgščių sekai nustatyti, ir
    taigi visų ląstelės baltymų struktūra ir funkcija.

    B) yra svarbūs ląstelių makromolekulinių gamyklų funkciniai komponentai, kurie atrenka aminorūgštis ir sulygiuoja jas teisinga tvarka, nes sintezuojama polipeptidinė grandinė.

    C) katalizuoja daugybę pagrindinių cheminių reakcijų ląstelėse, įskaitant peptidinių jungčių susidarymą tarp aminorūgščių baltymų sintezės metu.

    D) reguliuoti genų ekspresiją.

    A) DNR grandinei būdingas poliškumas, kurį lemia laisvosios fosfato grupės ir laisvos dezoksiribozės hidroksilo grupės vieta.

    B) Gretimi nukleotidai yra sujungti fosfoesterio ryšiais, jungiančiais 3' ir 5' anglies atomus.

    C) DNR dviguba spiralė yra sukurta dėl vandenilio jungties komplementarumo tarp azoto bazių.

    RNR egzistuoja tik kaip vienos grandinės polimeras, o DNR yra dvigrandė spiralė.

    Papildoma hidroksilo grupė ant ribozės gali veikti kaip nukleofilas, kuris atakuoja fosfodiesterio ryšius ir todėl hidrolizuoja RNR polimerus.

    DNR grandinės lydymosi temperatūra priklauso nuo vandenilio jungčių tarp bazių skaičiaus.

    A) Pernešimo RNR turi sudėtingą antrinę struktūrą, kuri yra būtina jos adapterio funkcijai.

    B) Pasiuntinio RNR yra gausiausia RNR ląstelėje.

    C) Ribosominė RNR transliuoja kataliziškai.

    A) paveldimos genų mutacijos, reikalingos homologinei rekombinacijai, yra atsakingos už kai kuriuos šeimos vėžio atvejus.

    B) Homologinė rekombinacija gali būti naudojama sugriuvusioms rekombinacinėms šakėms ir dvigubų gijų pertraukoms taisyti.

    Homologinė rekombinacija yra labai klaidų taisymo būdas.

    SiRNR specifiškumas priklauso nuo cDNR zondo

    Ląstelių apdorojimas Virusų skaičius/ml
    Valdymas 1 X10^7
    siRNA-p24 3 X10^6
    siRNA-p25 2 X10^6
    siRNR-p24 + siRNR-p251X10^4
    siRNR į viruso baltymą 1X10^2

    siRNA-p24 efektyviausiai sumažina virusų skaičių

    siRNA-p25 efektyviausiai sumažina virusų skaičių

    siRNA-p24 + siRNA-p25 efektyviausiai mažina virusų skaičių

    kepenų audinyje, norint išvengti infekcijos, pakanka vien pašalinti p24 funkciją

    plaučių audinyje, norint išvengti infekcijos, pakanka pašalinti tik p25 funkciją.


    DNR sekos nustatymas

    DNR sekos nustatymas paprastai yra pirmasis žingsnis siekiant suprasti genetinę organizmo sandarą, o tai padeda:

    • Raskite reguliavimo ir genų sekas
    • Palyginkite skirtingų rūšių homologinius genus
    • Nustatyti mutacijas

    Atliekant seką, naudojami biocheminiai metodai, siekiant nustatyti nukleotidų bazių (adenino, guanino, citozino ir timino) tvarką DNR oligonukleotide. Tam tikro geno sekos žinojimas padės atlikti tolesnę analizę, siekiant suprasti geno funkciją. PGR naudojamas norint amplifikuoti dominantį geną, prieš nustatant seką. Daugelis biotechnologijų įmonių siūlo sekos nustatymo priemones, tačiau šios priemonės gali būti brangios. Dėl to daugelis tyrėjų paprastai atlieka PGR savo viduje ir siunčia mėginius į sekos nustatymo laboratorijas.


    Dominančio geno išskyrimas iš didelės DNR grandinės – Biologija

    Abstraktus

    Sąvoka liga plačiai reiškia bet kokią būklę, kuri pažeidžia normalią funkciją, todėl yra susijusi su normalios homeostazės disfunkcija. Kai neigiamai veikia vieno ar kelių organų ar organizmo sistemų veikla, pasireiškia įvairūs požymiai ir simptomai, sakome, kad nesame sveiki, t.y. sergame.

    Sveikata gali būti apibrėžta kaip visiškos fizinės, psichinės ir socialinės gerovės būsena. Kai žmonės sveiki, jie dirba efektyviau. Tai padidina našumą ir atneša ekonominę gerovę. Sveikata taip pat padidina žmonių ilgaamžiškumą ir sumažina kūdikių ir motinų mirtingumą.

    Atsižvelgiant į priežastis, ligas galima suskirstyti į:

    Infekcijos

    Tai ligos, kurias sukelia svetimo parazitinio organizmo invazija. Jie yra laikini, nes organizmų imuninė sistema gali tam tikru mastu kovoti su tokiais patogenais (ligą sukeliančiais organizmais), todėl padeda užkirsti kelią ligai. Imuninę sistemą taip pat galima sustiprinti vartojant kelis vaistus. Be lengvo gydymo, jų taip pat galima lengvai išvengti

    Gyvenimo būdo ligos

    Gyvenimo būdo ligos (taip pat kartais vadinamos ilgaamžiškumo ligomis arba civilizacijos ligomis) yra ligos, kurios dažnėja, kai šalys tampa labiau pramoninės ir žmonės gyvena ilgiau. Tai gali būti Alzheimerio liga, astma ir nutukimas. Manoma, kad mityba ir gyvenimo būdas yra pagrindiniai veiksniai, turintys įtakos polinkiui į daugelį ligų. Piktnaudžiavimas narkotikais, tabako rūkymas ir alkoholio vartojimas, taip pat mankštos trūkumas taip pat gali padidinti riziką susirgti tam tikromis ligomis, ypač vėlesniame amžiuje. Šių ligų galima visiškai išvengti laikantis sveikos gyvensenos.

    Genetiniai sutrikimai

    Genetinis sutrikimas yra liga, kurią sukelia vienas ar daugiau genomo anomalijų, ypač būklė, kuri yra nuo gimimo (įgimta). Tai medicininiai sutrikimai, susiję su genų mutacija. Genetiniai sutrikimai yra paveldimi ir perduodami iš tėvų genų. Kitus defektus gali sukelti naujos mutacijos arba DNR pokyčiai. Tokiais atvejais defektas bus paveldimas tik tuo atveju, jei jis atsiranda gemalo linijoje. Tą pačią ligą, pavyzdžiui, kai kurias vėžio formas, kai kuriems žmonėms gali sukelti paveldima genetinė būklė, kitiems žmonėms – naujos mutacijos, o dar kitiems – ne genetinės priežastys. Šios ligos yra visiškai atsitiktinės ir jų išvengti sunku, nes jas sukelia ne išoriniai veiksniai. Be to, kadangi jų pagrindinė priežastis slypi organizmo genome, buvo manoma, kad jų išgydyti neįmanoma iki pažangių tyrimų, atskleidžiančių DNR paslaptis, vedančius į biotechnologijų, taigi ir genų terapijos vystymąsi.

    Genų terapija

    Apie sveikatos būklę ar ligą galime galvoti kaip apie „išdaužtą langą“. Daugelis sveikatos sutrikimų atsiranda dėl vieno ar kelių žmogaus genų trūkumų arba mutacijų. Dėl mutacijų sutrinka to geno užkoduoto baltymo veikimas. Kai baltymas veikia netinkamai, ląstelės, kurios priklauso nuo šio baltymo funkcijos, negali normaliai elgtis, todėl gali atsirasti problemų visiems audiniams ar organams. Su genų mutacijomis susijusios sveikatos būklės vadinamos genetiniais sutrikimais.

    Taigi, jei sugedęs genas sukėlė mūsų „išdaužtą langą“, ar galime jį „pataisyti“? Kokios yra mūsų galimybės?

    1. Tylėkite: nekreipkite dėmesio į genetinį sutrikimą ir niekas nepasitaisys.

    2. Pabandykite gydyti sutrikimą vaistais ar kitais būdais: priklausomai nuo sutrikimo, gydymas gali būti geras ilgalaikis sprendimas arba ne.

    3. Įdėkite normalią, veikiančią geno kopiją: jei galite tai padaryti, tai gali išspręsti problemą!

    Jei tai sėkminga, genų terapija yra būdas išspręsti problemą jos šaltinyje. Pridėjus pataisytą geno kopiją, paveiktos ląstelės, audiniai ir organai gali tinkamai veikti. Genų terapija skiriasi nuo tradicinių vaistais pagrįstų metodų, kurie gali išspręsti problemą, bet nepataiso pagrindinės genetinės ydos.

    Genų terapijos tikslai

    Tačiau dabar kyla klausimas, į kokius sutrikimus ar ligas galime nukreipti taikydami genų terapiją? Daugelis sutrikimų ar sveikatos būklių gali būti gydomi naudojant genų terapiją, tačiau kiti gali būti netinkami šiam metodui. Kad liga būtų taikoma genų terapijai, ji turi atitikti šias sąlygas:

    1. Būklė turi atsirasti dėl vieno ar kelių genų mutacijų

    2. Norint gydyti genetinę ydą, būtina žinoti, kurio (-ių) geno (-ų) siekti. Taip pat laboratorijoje turima to geno DNR kopija. Geriausi kandidatai į genų terapiją yra vadinamieji „vieno geno“ sutrikimai, kuriuos sukelia tik vieno geno mutacijos.

    3. Norint sukurti geriausią įmanomą metodą, reikalingos žinios apie tai, kaip genų veiksniai sukelia sutrikimą. Pavyzdžiui:

     Kurie audiniai paveikti?

     Kokį vaidmenį šio audinio ląstelėse atlieka geno užkoduotas baltymas?

     Kaip geno mutacijos veikia baltymo funkciją?

    4. Pridėjus įprastą geno kopiją, problema pažeistame audinyje turėtų būti išspręsta. Tai gali atrodyti akivaizdu, bet taip nėra. Ką daryti, jei mutavęs genas koduoja baltymą, kuris neleidžia normaliam baltymui atlikti savo darbo? Taip funkcionuojantys mutuoti genai vadinami dominuojančiais neigiamais, o įprasto baltymo pridėjimas problemos neišspręs.

    5. Turi būti įmanomas genų pristatymas į paveikto audinio ląsteles. Tai priklauso nuo:

     Ar audinys pasiekiamas? Ar tai gana lengva (oda, kraujas ar plaučiai), ar sunkiau pasiekiama (vidaus organai)?

     Koks yra geriausias pristatymo būdas?

    Biotechnologijos metodai leido išskirti reikiamą geną laboratorijoje ir taip pat pristatyti geną.

    Dominančio geno išskyrimas

    Pirmas žingsnis – surasti ir išskirti geną, kuris bus įterptas į genetiškai modifikuotą organizmą. Norint rasti tinkamą įterpti geną, paprastai remiamasi ilgus metus trukusiais moksliniais tyrimais apie naudingų genų tapatybę ir funkciją. Kai tai žinoma, DNR reikia iškirpti tam tikrose vietose, kad būtų galima išskirti dominantį geną. Tai galima padaryti naudojant restrikcijos fermentus, dar vadinamus molekulinėmis žirklėmis, kurios pjauna DNR tam tikrose vietose, kuriose yra palindrominės DNR sekos. Tačiau norint iškirpti DNR restrikcijos fermentais, ji turi būti grynos formos, be kitų makromolekulių.

    DNR išskyrimas

    Kadangi DNR yra uždaryta membranose, turime sulaužyti ląstelę, kad išsiskirtų DNR kartu su kitomis makromolekulėmis, tokiomis kaip RNR, baltymai, polisacharidai ir lipidai. Tai galima pasiekti apdorojant bakterijų ląsteles/augalų ar gyvūnų audinius tokiais fermentais kaip lizocimas (bakterijos), celiulazė (augalų ląstelės), chitinazė (grybelis). Genai yra ant ilgų DNR molekulių, susipynusių su baltymais, tokiais kaip histonai. RNR gali būti pašalinta apdorojant ribonukleaze, o baltymus galima pašalinti apdorojant proteaze. Kitos molekulės gali būti pašalintos tinkamai apdorojant, o išgryninta DNR galiausiai nusėda po atšaldyto etanolio. Tai gali būti vertinama kaip smulkių siūlų rinkinys pakaboje.

    DNR pjovimas

    Restrikcijos fermentų virškinimas atliekamas inkubuojant išgrynintas DNR molekules su restrikcijos fermentu optimaliomis tam specifinio fermento sąlygomis. DNR pjaunant restrikcijos endonukleazėmis susidaro DNR fragmentai. Šiuos fragmentus galima atskirti gelio elektroforezės būdu. Kadangi DNR fragmentai yra neigiamo krūvio molekulės, jas galima atskirti priverčiant jas judėti link anodo elektriniu lauku per terpę / matricą. Atskirtose DNR juostose analizuojamas reikalingas genas, tada jis išpjaunamas iš agarozės gelio ir ekstrahuojamas iš gelio gabalėlio. Šis etapas žinomas kaip eliuavimas.

    Genų dauginimasis (PGR)

    Tada PGR arba polimerazės grandininė reakcija naudojama kelioms dominančio geno kopijoms sukurti. Šios reakcijos metu kelios dominančio geno (arba DNR) kopijos sintezuojamos in vitro naudojant du pradmenų rinkinius (mažus chemiškai susintetintus oligonukleotidus, kurie papildo DNR sritis) ir fermentą DNR polimerazę. Fermentas praplečia pradmenis, naudodamas reakcijoje pateiktus nukleotidus ir genominę DNR kaip šabloną. Jei DNR replikacijos procesas kartojasi daug kartų, DNR segmentas gali būti padidintas iki maždaug milijardo kartų, t.y., padaroma 1 milijardas kopijų.

    Taikymas pagal genus

    Genų pristatymas yra vienas didžiausių iššūkių genų terapijos srityje.

    1. TAIKYMAS į tinkamas ląsteles.

    2. Geno AKTYVAVIMAS. Geno kelionė nesibaigia, kai jis patenka į ląstelę. Jis turi patekti į ląstelės branduolį ir būti „įjungtas“, o tai reiškia, kad jos transkripcija ir transliacija suaktyvėja, kad susidarytų geno užkoduotas baltyminis produktas. Kad genų pristatymas būtų sėkmingas, gaminamas baltymas turi tinkamai veikti.

    3. Geno INTEGRAVIMAS ląstelėse. Genas turi likti vietoje ir toliau veikti tikslinėse ląstelėse. Jei taip, reikia užtikrinti, kad genas integruotųsi į ląstelės-šeimininkės genetinę medžiagą arba taptų jos dalimi, arba kad genas rastų kitą būdą išgyventi branduolyje be atmetimo.

    4. VENGIMAS žalingo šalutinio poveikio. Kaskart, kai į organizmą patenka nepažįstama biologinė medžiaga, kyla pavojus, kad ji bus toksiška arba kad organizmas sukels imuninį atsaką prieš ją. Jei organizmas sukurs imunitetą prieš konkrečią genų tiekimo priemonę, būsimi gydymo etapai bus neveiksmingi.

    Geriausio vektoriaus pasirinkimas

    Nėra „tobulo vektoriaus“, galinčio gydyti kiekvieną sutrikimą. Kaip ir bet koks medicininis gydymas, genų terapijos vektorius turi būti pritaikytas atsižvelgiant į unikalius sutrikimo požymius. Išmokome pamoką, kaip perkelti genus į augalus ir gyvūnus iš bakterijų ir virusų, kurie tai žinojo nuo amžių ir kaip pristatyti genus transformuoti eukariotų ląsteles ir priversti jas daryti tai, ko nori bakterijos ar virusai.

    Dalis genų terapijos iššūkių yra pasirinkti tinkamiausią vektorių sutrikimui gydyti. Kai kurie dažniausiai naudojami vektoriai yra šie:

    Virusai

    Paprastai kai galvojame apie virusus, galvojame apie tai, kad jie sukelia tokias ligas kaip peršalimas, gripas ir ŽIV/AIDS. Susidūrę su genų pristatymo problema, mokslininkai pažvelgė į virusus. Kam išradinėti dviratį iš naujo, jei yra visiškai geras? Jei galime modifikuoti virusus, kad jie pristatytų genus, nesukeldami žmonių susirgimų, galime turėti gerą genų terapijos priemonių rinkinį.

    Bendrieji virusinių vektorių pranašumai:

    -Jie labai gerai nusitaiko ir patenka į ląsteles.

     – Kai kurie virusiniai vektoriai gali būti sukurti taip, kad būtų nukreipti į konkrečius ląstelių tipus.

     – Juos galima modifikuoti, kad negalėtų daugintis ir sunaikinti ląstelės.

    Bendri virusinių pernešėjų trūkumai:

     Virusas negali "išplėsti", kad tilptų genetinės medžiagos gabalas, didesnis nei jis natūraliai sukurtas nešti. Todėl kai kurie genai gali būti per dideli, kad tilptų į tam tikro tipo virusą.
     Virusai gali sukelti pacientų imuninį atsaką, todėl galimi du padariniai:

     Paciento imunitetas virusui gali neleisti jam reaguoti į pakartotinį gydymą.

    Tačiau šiuolaikiniai virusiniai vektoriai buvo sukurti be daugumos baltymų, kurie sukeltų imuninį atsaką.

    Nevirusiniai vektoriai

    Nors virusai gali veiksmingai pristatyti genetinę medžiagą į paciento ląsteles, jie turi tam tikrų apribojimų. Kartais efektyviau pristatyti geną naudojant ne virusinį vektorių, kuris turi mažiau dydžio apribojimų ir nesukelia imuninio atsako.

    Nevirusiniai vektoriai paprastai yra žiedinės DNR molekulės, dar žinomos kaip plazmidės. Gamtoje bakterijos naudoja plazmides, kad perneštų genus iš ląstelės į ląstelę.

    Mokslininkai naudoja bakterijas ir plazmides, kad lengvai ir efektyviai saugotų ir atkartotų dominančius genus iš bet kurio organizmo.

    Šiuo metu naudojami vektoriai yra sukurti taip, kad padėtų lengvai susieti svetimą DNR ir atrinkti rekombinantus iš nerekombinantų.

    Tai nėra vienintelis būdas įvesti svetimą DNR į šeimininko ląsteles. Taikant metodą, žinomą kaip mikroinjekcija, rekombinantinė DNR tiesiogiai įšvirkščiama į gyvūno ląstelės branduolį. Kitu metodu, tinkamu augalams, ląstelės yra bombarduojamos didelio greičio aukso arba volframo mikrodalelėmis, padengtomis DNR, naudojant metodą, žinomą kaip biolistika arba genų ginklas.

    Cistinė fibrozė

    Cistinė fibrozė (CF), taip pat žinoma kaip mukoviscidozė, yra autosominis recesyvinis genetinis sutrikimas, kuris labiausiai paveikia plaučius, taip pat kasą, kepenis ir žarnas. Jai būdingas nenormalus chlorido ir natrio pernešimas per epitelį, dėl kurio susidaro tiršta, klampi sekrecija, neleidžianti blakstienoms išvalyti šiukšles, kurios sukelia tokius simptomus kaip kosulys, blogas virškinimas ir padidėjęs pažeidžiamumas infekcijoms.

    CF sukelia mutacija baltymo cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatoriaus (CFTR) geno 7 chromosomoje. Dažniausiai CFTR geno mutacija yra trijų bazių porų delecija. Šis baltymas reikalingas prakaito, virškinimo skysčių ir gleivių komponentams reguliuoti. CFTR reguliuoja chlorido ir natrio jonų judėjimą per epitelio membranas, tokias kaip alveolių epitelis, esantis plaučiuose. Kadangi visose CF sergančio paciento ląstelėse yra defektų baltymų, plaučiuose ir kituose organuose susikaupia daug tirštų, lipnių gleivių. Tai lemia CF sergančių pacientų simptomų sunkumą.

    Ar tai geras genų terapijos tikslas?

    Norėdami tai patikrinti, turite atsakyti į keletą klausimų:

     Ar ši būklė atsirado dėl mutacijos? Taip.

     Ar žinoma sutrikimo biologija? Taip.

     Ar pridėjus įprastą geno kopiją bus išspręsta pažeisto audinio problema? Taip. Nors mutavęs CFTR genas koduoja neveikiantį jonų kanalo baltymą, jis netrukdys normaliam CFTR kanalo baltymui tinkamai veikti. Todėl, pridėjus įprastą CFTR geno kopiją, problema turėtų būti išspręsta

     Ar įmanoma tiekti geną į paveikto audinio ląsteles? Taip, iš dalies. Gydyti CF sergančių pacientų plaučius gali būti įmanoma, nes plaučių paviršiai yra veikiami oro ir šiek tiek lengvai pasiekiami. Kadangi virškinimo sistema yra mažiau prieinama, ją gydyti gali būti sunkiau.
    Taigi galime daryti išvadą, kad tai yra tobula liga, kurią reikia gydyti genų terapija.

    Iššūkiai

    Kai kurie veiksniai, dėl kurių genų terapija tapo veiksmingu genetinių ligų gydymu, yra šie:

    &bull Trumpalaikis genų terapijos pobūdis -

    Kad genų terapija taptų nuolatiniu bet kokios būklės gydymu, terapinė DNR, įvesta į tikslines ląsteles, turi išlikti funkcionali, o ląstelės, kuriose yra gydomoji DNR, turi būti ilgaamžės ir stabilios. Problemos, susijusios su terapinės DNR integravimu į genomą ir greitai besidalijantis daugelio ląstelių pobūdis, neleidžia genų terapijai gauti ilgalaikės naudos. Pacientai turės atlikti kelis genų terapijos etapus.

    &bull Imuninis atsakas –

    Kiekvieną kartą, kai į žmogaus audinius patenka svetimkūnis, imuninė sistema yra skirta atakuoti įsibrovėlį. Rizika stimuliuoti imuninę sistemą tokiu būdu, kuris sumažina genų terapijos efektyvumą, visada yra potenciali rizika. Be to, dėl sustiprėjusio imuninės sistemos atsako į įsibrovėjus, kurie buvo pastebėti anksčiau, pacientams sunku pakartoti genų terapiją.

    &bull Problemos su virusiniais vektoriais -

    Virusai, nors daugelis genų terapijos tyrimų yra pasirenkami nešiotojai, pacientui kelia įvairių galimų problemų – toksiškumo, imuninės ir uždegiminės reakcijos, genų kontrolės ir taikymo problemų. Be to, visada yra baimė, kad viruso pernešėjas, patekęs į pacientą, gali atgauti savo gebėjimą sukelti ligą.

    &bull Multigeniniai sutrikimai -

    Būklės ar sutrikimai, atsirandantys dėl vieno geno mutacijų, yra geriausi kandidatai genų terapijai. Deja, kai kuriuos dažniausiai pasitaikančius sutrikimus, pavyzdžiui, širdies ligas, aukštą kraujospūdį, Alzheimerio ligą, artritą ir diabetą, sukelia daugelio genų kitimų bendras poveikis. Daugiageninius arba daugiafaktorinius sutrikimus, tokius kaip šie, būtų ypač sunku veiksmingai gydyti naudojant genų terapiją.

    Naujausias būsimas

    CRISPR

    CRISPR reiškia sugrupuotus reguliariai tarpais esančius trumpus palindrominius pasikartojimus. Šios RNR sekos atlieka imuninę funkciją archėjose ir bakterijose, tačiau maždaug per pastaruosius metus mokslininkai ėmėsi jų perrašyti genus. RNR seka tarnauja kaip vadovas nukreipti DNR seką, tarkime, zigotoje arba kamieninėje ląstelėje. Vadovaujanti seka veda fermentą Cas9 į dominančią DNR. Cas9 gali nupjauti dvigubą grandinę, ją įvardyti ar net numušti genų ekspresiją. Po to, kai Cas9 pažeidžia DNR, taisymo sistemos nustato seką arba gali būti įterptos naujos sekos.

    Tai nėra pirmasis ar vienintelis sukurtas genų atkūrimo terapijos metodas, tačiau CRISPR technologija, sako Ramesar, yra tokia ypatinga, nes, skirtingai nuo ankstesnių metodų, kurie buvo sudėtingesni ir galėjo nukreipti tik į vienos rūšies kūno ląsteles. Atrodo, kad tai yra „dydis tinka visiems pristatymui“, pritaikytas įvairiems audiniams. Procedūra taip pat atrodo gana paprasta atlikti.

    Kad ir kaip būtų įdomi plėtra, CRISPR dar nepateiks greito gydymo.

    Remdamasis savo pirminiais įspūdžiais literatūroje, Ramesar sako, kad atrodo, kad lokalizuotus, prieinamus nenormalius audinius (pvz., tinklainėje ar odoje) būtų lengviau nukreipti.

    Tačiau būklės, veikiančios kūną labiau sistemiškai, pavyzdžiui, tam tikri vystymosi sindromai ar centrinės nervų sistemos sutrikimai, gali būti problemiški, nes taisymo technologija patenka į pakankamai tikslinių tame audinyje esančių ląstelių, kad būtų galima veiksmingai pakeisti.

    „Tai taip pat gali priklausyti nuo pirmojo etapo, kuriuo bandoma atlikti terapiją, atsižvelgiant į paciento amžių ir ligos progresavimo lygį“, – sako Ramesar.

    IŠVADOS

    Nors ankstyvosios klinikinės nesėkmės paskatino daugelį atmesti genų terapiją kaip per daug reklamuojamą, klinikinė sėkmė nuo 2006 m. sustiprino naują optimizmą genų terapijos pažaduose. Tai apima sėkmingą pacientų, sergančių tinklainės liga, įgimta Leberio amauroze, su X susijusia SCID, ADA-SCID, adrenoleukodistrofija, lėtine limfocitine leukemija (LLL), ūmine limfocitine leukemija (ALL), išsėtine mieloma, hemofilija ir Parkinsono liga, gydymą. Šios naujausios klinikinės sėkmės paskatino iš naujo domėtis genų terapija, keliuose moksliniuose ir populiariuose leidiniuose paskelbtuose straipsniuose raginama toliau investuoti į šią sritį.


    Genų inžinerijos procesas

    Genetinė inžinerija plačiai naudojama biologiniuose tyrimuose. Pelių modeliai sukurti biomedicininiams tyrimams, bakterijos sukurtos gaminti vaistus, tokius kaip insulinas, o pasėliai – žemės ūkiui. Visi šie genų inžinerijos produktai buvo sukurti taikant tuos pačius pagrindinius veiksmus: identifikuojant dominantį bruožą, išskiriant tą genetinį požymį, įterpiant tą bruožą į norimo organizmo genomą ir vėliau išauginant inžinerinį organizmą (1 pav.). Šie veiksmai išsamiai paaiškinti toliau, naudojant Monsanto pavyzdžius, nes jų technologijų informacija yra viešai prieinama. Kitos didžiosios įmonės, tokios kaip Syngenta, BASF, Dow, Bayer ir Du Pont, naudoja panašius metodus, kaip trumpai aprašyta atitinkamose jų svetainėse [3, 4, 5, 6, 7].

    1 veiksmas: nustatykite dominantį bruožą
    Norėdami nustatyti norimą naują bruožą, mokslininkai dažniausiai žvelgia į gamtą. Sėkmingas naujos dominančios genetinės savybės atradimas dažnai yra kritinio mąstymo ir sėkmės derinys. Pavyzdžiui, jei mokslininkai ieško bruožo, kuris leistų pasėliui išgyventi konkrečioje aplinkoje, jie ieškotų organizmų, kurie natūraliai gali išgyventi toje konkrečioje aplinkoje. Arba, jei mokslininkai siekia pagerinti pasėlių maistinę vertę, jie peržiūrės augalų, kurie, jų manymu, gamina dominančią maistinę medžiagą, sąrašą.

    Šiuo metu GMO bruožo, kuris buvo nustatytas per šį sėkmės ir kritinio mąstymo derinį, pavyzdys yra tolerancija herbicidui Roundup (žr. šį straipsnį). „Monsanto“ sukūrė „Roundup Ready“ augalus po to, kai rado šalia „Roundup“ gamyklos augančias bakterijas, kuriose buvo genas, leidžiantis joms išgyventi esant herbicidui [8]. Nors jo nėra JAV rinkoje, Syngenta sukūrė auksinius ryžius su padidintu provitamino A kiekiu, kurį žmogaus organizmas gali paversti vitaminu A (žr. šį straipsnį). „Syngenta“ mokslininkai nustatė genų seką, gaminančią provitaminą A, ir sudarė augalų, kuriuos reikia patikrinti pagal šią seką, sąrašą [9]. Jei pasisekė, gamtoje buvo augalas, kukurūzai, kuriame buvo genas, dėl kurio auksiniai ryžiai gamina provitaminą A tokiu kiekiu, kuris galėtų patenkinti vitamino A stokojančių bendruomenių mitybos poreikius.

    2 veiksmas: išskirkite dominantį genetinį požymį
    Lyginamoji analizė naudojama norint iššifruoti, kurioje organizmo genetinės sandaros dalyje yra dominantis bruožas. Požymį turinčių augalų genomai lyginami su tos pačios rūšies genomais, neturinčiais požymio, siekiant nustatyti genus, esančius tik pirmajame [8]. Skirtingų rūšių, turinčių tą patį požymį, genomai taip pat gali būti lyginami, siekiant nustatyti geną, kaip buvo vystant Golden Rice [9]. Jei nėra palyginimui skirtos genetinės informacijos duomenų bazės, mokslininkai tikslingai ištrina arba „išmuša“ dominančio genomo dalis, kol prarandamas norimas bruožas, taip nustatydami genus, kurie lemia tą požymį.

    Siekdama paspartinti šį procesą, Monsanto sukūrė ir užpatentavo metodą, žinomą kaip sėklų smulkinimas [8]. Taikant šį metodą, „Monsanto“ nuskuta dalis sėklų, kad būtų galima nustatyti didelio našumo genetinę seką, o likusios sėklos lieka gyvybingos sodinti. Taip sukuriama augalų genetinė duomenų bazė dar prieš juos išauginant, kur naudojama brūkšninių kodų sistema, skirta augalams suderinti su jų genotipais. Tada mokslininkai gali naudoti šią duomenų bazę, kad nustatytų naujus dominančius bruožus, taip pat optimizuotų pageidaujamus pasėlių požymius, atrinkdami geriausius genotipus pagal augalų fenotipus.

    3 veiksmas: įdėkite norimą genetinį požymį į naują genomą
    Keisti augalų sėklų genomą sunku dėl jų standžios struktūros. Daugelis biotechnologijų įmonių naudoja „genų ginklus“, kurie 22 kalibro užtaisu į augalo audinį šaudo DNR padengtas metalo daleles [8]. Monsanto nebenaudoja genų ginklų, o naudojasi bakterijomis, vadinamomis Agrobacterium tumefaciens, kurios natūraliai įsiveržia į sėklas ir keičia augalus, įterpdamos savo DNR dalis į augalo genomą.

    Biotechnologijų tyrimuose įprasta genetiškai modifikuoti bakterijas, kad pagamintų norimą baltymą. Tai atliekama naudojant fermentus dominančią DNR grandinę perpjaunant ir įklijuojant į plazmidę, kuri yra maža, apskrita DNR molekulė [10]. Tada bakterijos sukrečiamos naudojant šilumą arba elektrą, kad ląstelės priimtų sukurtą plazmidę. Modifikuojant A. tumefaciens, kurią lengviau modifikuoti nei pačias augalų sėklas, mokslininkai gali panaudoti natūraliai invazinį bakterijų elgesį kaip Trojos arklį, norėdami įterpti norimus bruožus į pasėlių genomą.

    4 žingsnis: GMO auginimas
    Po to, kai genetinis požymis buvo sėkmingai įterptas į organizmo genomą, modifikuotas organizmas turi sugebėti augti ir daugintis su naujai sukurtu genomu. Pirma, reikia patikrinti organizmų genotipą, kad mokslininkai daugintų tik tuos organizmus, kurių genomas buvo modifikuotas teisingai.

    Biotechnologijų įmonės investuoja dideles sumas, kad šios sėkmingai sukurtos gamyklos išliktų gyvos ir daugintųsi. Įmonės naudoja specialias klimato kontroliuojamas augimo kameras, o biologai dažnai tikrina augalus rankomis, kad įsitikintų, jog jie auga taip, kaip tikėtasi [8].

    Šio proceso metu biotechnologijų įmonės naudos automatizuotas mašinas, tokias kaip Monsanto GenV sėjamoji, kad galėtų sekti augalus ir apskaičiuoti optimalias sėjos ir augimo sąlygas, kad gautų geriausią įmanomą derlių. GMO sėklos dažnai pateikiamos su instrukcijomis dėl tarpų ir mitybos, gautos atlikus šiuos tyrimus.


    Susijęs

    Wyss institutas
    Gyvybės mokslų centras.
    3 Blackfan Circle
    Bostonas, MA 02115
    Žemėlapis ir nuorodos


    Turinys

    Daugybė įvairių atradimų ir pažangos paskatino genų inžinerijos vystymąsi. Žmogaus nukreiptos genetinės manipuliacijos prasidėjo nuo augalų ir gyvūnų prijaukinimo dirbtinės atrankos būdu maždaug 12 000 m. [1] : 1 Buvo sukurti įvairūs metodai, padedantys veisti ir atrinkti. Hibridizacija buvo vienas iš būdų greitai pakeisti organizmo genetinę sandarą. Labiausiai tikėtina, kad pasėlių hibridizacija pirmą kartą įvyko, kai žmonės pradėjo auginti genetiškai skirtingus giminingų rūšių individus arti. [2] : 32 Kai kuriuos augalus pavyko padauginti vegetatyviniu klonavimu. [2] : 31

    Genetinį paveldėjimą pirmą kartą atrado Gregoras Mendelis 1865 m., atlikęs eksperimentus su žirniais. [3] 1928 m. Frederickas Griffithas įrodė, kad egzistuoja „transformuojantis principas“, susijęs su paveldėjimu, kurį 1944 m. Oswald Avery, Colin MacLeod ir Maclyn McCarty nustatė kaip DNR. Frederickas Sangeris 1977 metais sukūrė DNR sekos nustatymo metodą, labai padidindamas mokslininkams prieinamą genetinę informaciją.

    Išsiaiškinus DNR egzistavimą ir savybes, reikėjo sukurti priemones, kurios leistų ja manipuliuoti. 1970 m. Hamilton Smiths laboratorija atrado restrikcijos fermentus, leidžiančius mokslininkams išskirti genus iš organizmo genomo. [4] DNR ligazės, kurios sujungia suskaidytą DNR, buvo atrastos anksčiau 1967 m. [5] Sujungus du fermentus tapo įmanoma „iškirpti ir įklijuoti“ DNR sekas, kad būtų sukurta rekombinantinė DNR. Plazmidės, atrastos 1952 m., [6] tapo svarbiomis priemonėmis perduodant informaciją tarp ląstelių ir replikuojant DNR sekas. Polimerazės grandininė reakcija (PGR), kurią 1983 m. sukūrė Kary Mullis, leido amplifikuoti (atkartoti) mažas DNR dalis ir padėjo identifikuoti bei išskirti genetinę medžiagą.

    Be manipuliavimo DNR, reikėjo sukurti metodus, kaip ją įterpti į organizmo genomą. Griffitho eksperimentas jau parodė, kad kai kurios bakterijos turėjo galimybę natūraliai įsisavinti ir išreikšti svetimą DNR. Buvo sukelta dirbtinė kompetencija Escherichia coli 1970 m. apdorojant juos kalcio chlorido tirpalu (CaCl2). [7] Transformacija naudojant elektroporaciją buvo sukurta devintojo dešimtmečio pabaigoje, padidindama efektyvumą ir bakterijų diapazoną. [8] 1907 m. bakterija, sukėlusi augalų auglius, Agrobacterium tumefaciens, buvo atrastas. Aštuntojo dešimtmečio pradžioje buvo nustatyta, kad ši bakterija įterpė savo DNR į augalus naudodama Ti plazmidę. [9] Pašalinus genus iš plazmidės, sukėlusios naviką, ir pridėjus naujų genų, mokslininkai galėjo užkrėsti augalus A. tumefaciens ir leisti bakterijoms įterpti pasirinktą DNR į augalų genomus. [10]

    Pirmasis žingsnis yra nustatyti tikslinį geną ar genus, kuriuos reikia įterpti į šeimininką. Tai lemia gaunamo organizmo tikslas. Kai kuriais atvejais paveikiamas tik vienas ar du genai. Sudėtingesniems tikslams gali būti įtraukti visi biosintezės keliai, apimantys kelis genus. Radus genus ir kitą genetinę informaciją iš daugybės organizmų galima įterpti į bakterijas saugoti ir modifikuoti, taip sukuriant genetiškai modifikuotas bakterijas. Bakterijos yra pigios, lengvai auga, kloninės, greitai dauginasi, gana lengvai transformuojasi ir gali būti laikomos -80 °C temperatūroje beveik neribotą laiką. Kai genas yra izoliuotas, jis gali būti laikomas bakterijų viduje ir suteikia neribotą tiekimą tyrimams. [11]

    Gali būti atliekami genetiniai tyrimai, siekiant nustatyti galimus genus, o po to kiti testai nustato geriausius kandidatus. Paprastas ekranas apima atsitiktinai DNR mutaciją naudojant chemines medžiagas ar spinduliuotę, o tada pasirenkant tuos, kurie rodo norimą požymį. Dėl organizmų, kurių mutacija nėra praktiška, mokslininkai ieško individų tarp populiacijos, kuriems būdinga natūrali mutacija. Procesai, kurių metu žiūrima į fenotipą ir bandoma nustatyti atsakingą geną, vadinami tiesiogine genetika. Tada geną reikia susieti, lyginant fenotipo paveldėjimą su žinomais genetiniais žymenimis. Greičiausiai kartu esantys genai bus paveldimi kartu. [12]

    Kitas variantas yra atvirkštinė genetika. Šis metodas apima konkretų geną, turintį mutaciją, ir tada stebėti, koks fenotipas vystosi. [12] Mutacija gali būti sukurta taip, kad inaktyvuotų geną arba tik tam tikromis sąlygomis leistų jam suaktyvėti. Sąlyginės mutacijos yra naudingos nustatant genus, kurie paprastai yra mirtini, jei neveikia. [13] Kadangi panašias funkcijas atliekančių genų sekos yra panašios (homologinės), galima numatyti tikėtiną geno funkciją, lyginant jo seką su gerai ištirtų genų seka iš modelių organizmų. [12] Dėl mikromasyvų, transkriptų ir genomo sekos sukūrimo tapo daug lengviau rasti pageidaujamus genus. [14]

    Bakterijos Bacillus thuringiensis pirmą kartą buvo atrastas 1901 m. kaip šilkaverpių mirties sukėlėjas. Dėl šių insekticidinių savybių bakterijos buvo naudojamos kaip biologinis insekticidas, komerciškai sukurtas 1938 m. 1956 m. buvo atrasti verksmo baltymai, užtikrinantys insekticidinį aktyvumą, o iki devintojo dešimtmečio mokslininkai sėkmingai klonavo šį baltymą koduojantį geną ir jį išreiškė. tai augaluose. [15] Genas, užtikrinantis atsparumą herbicidui glifosatui, buvo rastas po septynerius metus trukusių paieškų bakterijose, gyvenančiose Monsanto RoundUp gamyklos ištekėjimo vamzdyje. [16] Gyvūnams dauguma naudojamų genų yra augimo hormono genai. [17]

    Visi genų inžinerijos procesai yra susiję su DNR modifikavimu. Tradiciškai DNR buvo išskirta iš organizmų ląstelių. Vėliau, sukūrus DNR biblioteką, genai buvo klonuoti iš DNR segmento arba dirbtinai susintetinti. Išskyrus, į geną pridedami papildomi genetiniai elementai, leidžiantys jį ekspresuoti šeimininko organizme ir palengvinti atranką.

    Ištraukimas iš langelių Redaguoti

    Pirmiausia ląstelė turi būti švelniai atidaryta, atskleidžiant DNR, nepadarant jai per daug žalos. Naudojami metodai skiriasi priklausomai nuo ląstelės tipo. Atidarius, DNR turi būti atskirta nuo kitų ląstelių komponentų. Plyšusioje ląstelėje yra baltymų ir kitų ląstelių liekanų. Sumaišius su fenoliu ir (arba) chloroformu, o po to centrifuguojant, nukleorūgštys gali būti atskirtos nuo šių šiukšlių į viršutinę vandeninę fazę. Šią vandeninę fazę galima pašalinti ir, jei reikia, toliau išgryninti kartojant fenolio-chloroformo etapus. Nukleino rūgštys gali būti nusodinamos iš vandeninio tirpalo naudojant etanolį arba izopropanolį. Bet kurią RNR galima pašalinti pridedant ribonukleazę, kuri ją suardys. Daugelis įmonių dabar parduoda rinkinius, kurie supaprastina procesą. [18]

    Genų izoliacija Redaguoti

    Dominantis genas turi būti atskirtas nuo išskirtos DNR. Jei seka nežinoma, įprastas būdas yra suskaidyti DNR atsitiktinio virškinimo metodu. Paprastai tai atliekama naudojant restrikcijos fermentus (fermentus, kurie pjauna DNR). Dalinis restrikcijos suskaidymas nupjauna tik kai kurias restrikcijos vietas, todėl DNR fragmentų segmentai persidengia.DNR fragmentai dedami į atskirus plazmidinius vektorius ir auginami bakterijų viduje. Patekusi į bakteriją, plazmidė nukopijuojama, kai bakterijos dalijasi. Norint nustatyti, ar tam tikrame fragmente yra naudingas genas, DNR biblioteka patikrinama dėl pageidaujamo fenotipo. Jei aptinkamas fenotipas, gali būti, kad bakterijose yra tikslinis genas.

    Jei genas neturi aptinkamo fenotipo arba DNR bibliotekoje nėra tinkamo geno, jį reikia išskirti kitais būdais. Jei geno padėtį galima nustatyti naudojant molekulinius žymenis, chromosomų vaikščiojimas yra vienas iš būdų išskirti tinkamą DNR fragmentą. Jei genas išreiškia artimą homologiją su žinomu kitos rūšies genu, jį galima išskirti bibliotekoje ieškant genų, kurie labai atitinka žinomą geną. [19]

    Žinomoms DNR sekoms gali būti naudojami restrikcijos fermentai, kurie supjausto DNR abiejose geno pusėse. Tada gelio elektroforezė surūšiuoja fragmentus pagal ilgį. [20] Kai kurie geliai gali atskirti sekas, kurios skiriasi viena bazine pora. DNR galima vizualizuoti, nudažant ją etidžio bromidu ir fotografuojant UV šviesoje. Šalia DNR galima pastatyti žymeklį su žinomo ilgio fragmentais, kad būtų galima įvertinti kiekvienos juostos dydį. Tinkamo dydžio DNR juostoje turi būti genas, iš kurio jis gali būti pašalintas iš gelio. [18]: 40–41 Kitas žinomų sekų genų išskyrimo būdas apima polimerazės grandininę reakciją (PGR). [21] PGR yra galingas įrankis, galintis sustiprinti tam tikrą seką, kurią vėliau galima išskirti gelio elektroforezės būdu. Jo efektyvumas mažėja esant didesniems genams ir gali sukelti klaidų sekoje.

    Galima dirbtinai susintetinti genus. [22] Kai kurios sintetinės sekos yra parduodamos, atsisakant daugelio šių ankstyvųjų etapų. [23]

    Modifikacija Redaguoti

    Įterpiamas genas turi būti derinamas su kitais genetiniais elementais, kad jis tinkamai veiktų. Šiame etape genas gali būti modifikuotas, kad būtų geresnė ekspresija ar efektyvumas. Daugumoje konstrukcijų yra ne tik įterpiamas genas, bet ir promotoriaus ir terminatoriaus sritis, taip pat pasirenkamas žymeklio genas. Promotorių sritis inicijuoja geno transkripciją ir gali būti naudojama kontroliuoti genų ekspresijos vietą ir lygį, o terminatoriaus sritis baigia transkripciją. Atrenkamas žymeklis, kuris daugeliu atvejų suteikia organizmui, kuriame jis ekspresuojamas, atsparumą antibiotikams, naudojamas nustatyti, kurios ląstelės yra transformuotos nauju genu. Konstrukcijos gaminamos naudojant rekombinantinės DNR metodus, tokius kaip restrikcijos skaidymas, ligavimas ir molekulinis klonavimas. [24]

    Sukūrus geną, jis turi būti stabiliai integruotas į tikslinių organizmų genomą arba egzistuoti kaip ekstrachromosominė DNR. Yra daug būdų, kaip geną įterpti į šeimininko genomą, ir jie skiriasi priklausomai nuo organizmo, į kurį taikoma, tipo. Daugialąsčiuose eukariotuose, jei transgenas yra įtrauktas į šeimininko lytinių ląstelių ląsteles, susidariusi ląstelė šeimininkė gali perduoti transgeną savo palikuonims. Jei transgenas yra įtrauktas į somatines ląsteles, transgenas negali būti paveldimas. [25]

    Transformacija Redaguoti

    Transformacija yra tiesioginis ląstelės genetinių komponentų pakeitimas perduodant genetinę medžiagą per ląstelės membraną. Maždaug 1% bakterijų natūraliai gali perimti svetimą DNR, tačiau šį gebėjimą gali sukelti kitos bakterijos. [26] Bakterijų įtempimas šilumos šoku arba elektroporacija gali padaryti ląstelės membraną pralaidžią DNR, kuri vėliau gali būti įtraukta į genomą arba egzistuoti kaip ekstrachromosominė DNR. Paprastai ląstelės yra inkubuojamos tirpale, kuriame yra dvivalenčių katijonų (dažnai kalcio chlorido), šaltomis sąlygomis, prieš jas veikiant šilumos impulsui (šilumos šokui). Kalcio chloridas iš dalies ardo ląstelės membraną, todėl rekombinantinė DNR patenka į šeimininko ląstelę. Manoma, kad esant šaltai ląstelėms veikiant dvivalenčiais katijonais, ląstelės paviršiaus struktūra gali pasikeisti arba susilpnėti, todėl ji taps pralaidesnė DNR. Manoma, kad šilumos impulsas sukelia šilumos disbalansą ląstelės membranoje, dėl kurios DNR patenka į ląsteles per ląstelės poras arba pažeistą ląstelės sienelę. Elektroporacija yra dar vienas kompetencijos skatinimo būdas. Šiuo metodu ląstelės trumpam sukrečiamos 10-20 kV/cm elektriniu lauku, kuris, manoma, sukuria skylutes ląstelės membranoje, pro kurias gali patekti plazmidinė DNR. Po elektros šoko skylės greitai uždaromos ląstelės membranos taisymo mechanizmais. Paimta DNR gali integruotis su bakterijų genomu arba, dažniau, egzistuoti kaip ekstrachromosominė DNR.

    Augaluose DNR dažnai įterpiama naudojant Agrobakterija-tarpininkaujanti rekombinacija, [27] pasinaudojant Agrobakterijas T-DNR seka, leidžianti natūraliai įterpti genetinę medžiagą į augalų ląsteles. [28] Augalų audiniai supjaustomi nedideliais gabalėliais ir mirkomi skystyje, kuriame yra suspenduotų medžiagų Agrobakterija. Bakterijos prisitvirtins prie daugelio augalų ląstelių, kurias atidengė pjūviai. Bakterijos naudoja konjugaciją, kad perkeltų DNR segmentą, vadinamą T-DNR, iš savo plazmidės į augalą. Perkelta DNR yra bandoma į augalo ląstelės branduolį ir integruojama į augalo šeimininko genominę DNR. Plazmidė T-DNR integruojama pusiau atsitiktinai į ląstelės šeimininkės genomą. [29]

    Modifikuodami plazmidę, kad išreikštų dominantį geną, mokslininkai gali stabiliai įterpti savo pasirinktą geną į augalų genomą. Vienintelės esminės T-DNR dalys yra jos du maži (25 bazinių porų) pasikartojimai, iš kurių bent vienas reikalingas augalų transformacijai. [30] [31] Genai, kuriuos reikia įvesti į augalą, klonuojami į augalo transformacijos vektorių, kuriame yra plazmidės T-DNR sritis. Alternatyvus būdas yra agroinfiltracija. [32] [33]

    Kitas augalų ląstelių transformavimo metodas yra biolistika, kai aukso ar volframo dalelės padengiamos DNR ir tada įšaunamos į jaunas augalų ląsteles arba augalų embrionus. [34] Tam tikra genetinė medžiaga patenka į ląsteles ir jas transformuoja. Šis metodas gali būti naudojamas augalams, kurie nėra jautrūs Agrobakterija infekcija ir taip pat leidžia transformuotis augalų plastidams. Augalų ląstelės taip pat gali būti transformuojamos naudojant elektroporaciją, kuri naudoja elektros šoką, kad ląstelės membrana taptų pralaidi plazmidinei DNR. Dėl ląstelėms ir DNR padarytos žalos biolistikos ir elektroporacijos transformacijos efektyvumas yra mažesnis nei agrobakterinės transformacijos. [ reikalinga citata ]

    Transfekcijos redagavimas

    Transformacija gyvūnų atžvilgiu turi skirtingą reikšmę, nurodant progresavimą į vėžinę būseną, todėl svetimos DNR įterpimo į gyvūnų ląsteles procesas paprastai vadinamas transfekcija. [35] Yra daug būdų tiesiogiai įvesti DNR į gyvūnų ląsteles in vitro. Dažnai šios ląstelės yra kamieninės ląstelės, naudojamos genų terapijai. Cheminiais metodais naudojami natūralūs arba sintetiniai junginiai, kad susidarytų dalelės, kurios palengvina genų perdavimą į ląsteles. [36] Šie sintetiniai vektoriai turi galimybę surišti DNR ir pritaikyti didelius genetinius pernešimus. [37] Vienas iš paprasčiausių metodų apima kalcio fosfato naudojimą DNR surišimui, o po to eksponavimą kultivuotoms ląstelėms. Tirpalas kartu su DNR yra kapsuliuojamas ląstelių. [38] Liposomos ir polimerai gali būti naudojami kaip vektoriai DNR pristatyti į auginamas gyvūnų ląsteles. Teigiamai įkrautos liposomos jungiasi su DNR, o polimerai gali sąveikauti su DNR. [36] Jie sudaro atitinkamai lipopleksus ir polipleksus, kuriuos vėliau pasiima ląstelės. Kiti metodai apima elektroporacijos ir biolistikos naudojimą. [39] Kai kuriais atvejais transfekuotos ląstelės gali stabiliai integruoti išorinę DNR į savo genomą, šis procesas žinomas kaip stabili transfekcija. [40]

    Norint sukurti transgeninius gyvūnus, DNR turi būti įterpta į gyvybingus embrionus arba kiaušinius. Paprastai tai atliekama naudojant mikroinjekciją, kai DNR įšvirkščiama per ląstelės branduolio apvalkalą tiesiai į branduolį. [26] Superovuliuoti apvaisinti kiaušinėliai surenkami vienos ląstelės stadijoje ir auginami in vitro. Kai pro protoplazmą matomi spermatozoidų galvutės ir kiaušinėlio probranduoliai, į vieną iš jų suleidžiama genetinė medžiaga. Tada oocitas implantuojamas į pseudonėščio gyvūno kiaušintakį. [41] Kitas metodas yra genų perkėlimas tarp embrioninių kamieninių ląstelių. Genas transfekuojamas į embrionines kamienines ląsteles, o po to įterpiamas į pelių blastocistas, kurios vėliau implantuojamos globėjams. Gauti palikuonys yra chimeriniai, o tolesnis poravimasis gali sukelti peles, visiškai transgeniškas dominančiu genu. [42]

    Transdukcijos redagavimas

    Transdukcija yra procesas, kurio metu svetima DNR į ląstelę patenka viruso ar viruso vektoriaus. [43] Genetiškai modifikuoti virusai gali būti naudojami kaip virusiniai vektoriai, siekiant perkelti tikslinius genus į kitą organizmą genų terapijoje. [44] Pirmiausia iš viruso pašalinami virulentiški genai, o vietoj jų įterpiami tiksliniai genai. Sekos, leidžiančios virusui įterpti genus į šeimininko organizmą, turi būti paliktos nepažeistos. Populiarūs virusų vektoriai yra sukurti iš retrovirusų arba adenovirusų. Kiti virusai, naudojami kaip vektoriai, yra lentivirusai, raupų virusai ir herpeso virusai. Naudojamo viruso tipas priklausys nuo tikslinių ląstelių ir nuo to, ar DNR bus pakeista visam laikui, ar laikinai.

    Regeneravimas Redaguoti

    Kadangi dažnai genetine medžiaga transformuojama tik viena ląstelė, organizmas turi būti atkurtas iš tos vienos ląstelės. Augaluose tai pasiekiama naudojant audinių kultūrą. [45] [46] Kiekviena augalų rūšis turi skirtingus sėkmingo regeneravimo reikalavimus. Jei tai pavyksta, taikant metodą gaunamas suaugęs augalas, kurio transgenas yra kiekvienoje ląstelėje. [47] Gyvūnams būtina užtikrinti, kad įterptos DNR būtų embrioninėse kamieninėse ląstelėse. [27] Palikuonis gali būti patikrintas dėl geno. Visi pirmosios kartos palikuonys yra heterozigotiniai įterpto geno atžvilgiu ir turi būti inbreduoti, kad gautų homozigotinį pavyzdį. [ reikalinga citata ] Bakterijos susideda iš vienos ląstelės ir dauginasi kloniškai, todėl regeneracija nėra būtina. Atrenkami žymenys naudojami lengvai atskirti transformuotas ląsteles nuo netransformuotų ląstelių.

    Ląstelės, kurios buvo sėkmingai transformuotos DNR, turi žymeklio geną, o ne transformuotose. Auginant ląsteles esant antibiotikams ar cheminėms medžiagoms, kurios atrenka arba pažymi tą geną ekspresuojančias ląsteles, galima atskirti modifikuotas ląsteles nuo nemodifikuotų. Kitas atrankos metodas apima DNR zondą, kuris prilimpa tik prie įterpto geno. Šių žymenų paprastai yra transgeniniame organizme, nors buvo sukurta nemažai strategijų, kurios gali pašalinti atrenkamą žymenį iš subrendusio transgeninio augalo. [48]

    Patvirtinimas Redaguoti

    Nustačius, kad rekombinantiniame organizme yra įterptų genų, paprastai nepakanka, kad būtų užtikrinta, jog jie bus tinkamai išreikšti numatytuose audiniuose. Tolesni tyrimai, naudojant PGR, Southern hibridizaciją ir DNR sekos nustatymą, atliekami siekiant patvirtinti, kad organizme yra naujas genas. [49] Šie tyrimai taip pat gali patvirtinti įterpto geno chromosomų vietą ir kopijos numerį. Patvirtinus genų produktų (RNR ir baltymų) paieškos ir matavimo metodai taip pat naudojami genų ekspresijai, transkripcijai, RNR apdorojimo modeliams ir baltyminio produkto (-ų) ekspresijai bei lokalizacijai įvertinti. Tai apima šiaurinę hibridizaciją, kiekybinę RT-PGR, Western blot, imunofluorescenciją, ELISA ir fenotipinę analizę. [50] Jei reikia, organizmo palikuonys tiriami siekiant patvirtinti, kad transgenas ir susijęs fenotipas yra stabiliai paveldimi.

    Tradiciniai genų inžinerijos metodai paprastai įterpia naują genetinę medžiagą atsitiktinai į šeimininko genomą. Tai gali pakenkti ar pakeisti kitus organizmo genus. Buvo sukurti metodai, kurie įterpdavo naują genetinę medžiagą į konkrečias organizmo genomo vietas. Ankstyvieji metodai, nukreipti į genus tam tikrose genomo vietose, rėmėsi homologine rekombinacija. [51] Sukūrus DNR konstrukcijas, kuriose yra šablonas, atitinkantis tikslinę genomo seką, gali būti, kad HR procesai ląstelėje įterps konstrukciją į norimą vietą. Naudojant šį metodą embrioninėms kamieninėms ląstelėms, buvo sukurtos transgeninės pelės, kurių tikslinės išmuštos. Taip pat buvo įmanoma įtraukti genus arba pakeisti genų ekspresijos modelius. [52]

    Jei gyvybiškai svarbus genas yra išmuštas, jis gali būti mirtinas organizmui. Norint ištirti šių genų funkciją, buvo naudojamos specifinės vietos rekombinazės (SSR). Du dažniausiai pasitaikantys tipai yra Cre-LoxP ir Flp-FRT sistemos. Cre rekombinazė yra fermentas, kuris pašalina DNR homologinės rekombinacijos būdu tarp surišimo sekų, žinomų kaip Lox-P vietos. Flip-FRT sistema veikia panašiai, o Flip rekombinazė atpažįsta FRT sekas. Kryžminus organizmą, turintį rekombinazės vietas, besiribojančias su dominančiu genu, su organizmu, kuris ekspresuoja SSR kontroliuojant specifiniams audiniams promotoriams, galima išmušti arba įjungti genus tik tam tikrose ląstelėse. Tai taip pat buvo naudojama žymenų genams pašalinti iš transgeninių gyvūnų. Tolesnės šių sistemų modifikacijos leido tyrėjams sukelti rekombinaciją tik tam tikromis sąlygomis, o tai leido genus išmušti arba išreikšti norimu vystymosi laiku ar etapais. [52]

    Genomo redagavimui naudojamos dirbtinai sukurtos nukleazės, kurios sukuria specifines dvigrandės pertraukas norimose genomo vietose. Pertraukos priklauso nuo ląstelių DNR atstatymo procesų, kuriuos galima panaudoti tiksliniam genų išmušimui, koregavimui arba įterpimui dideliais dažniais. Jei yra donoro DNR, kurioje yra atitinkama seka (homologijos), nauja genetinė medžiaga, turinti transgeną, bus integruota į tikslinę vietą labai efektyviai homologinės rekombinacijos būdu. [53] Yra keturios sukurtų nukleazių šeimos: meganukleazės, [54] [55] ZFN, [56] [57] transkripcijos aktyvatoriaus tipo efektorinės nukleazės (TALEN), [58] [59] CRISPR/Cas (reguliariai sugrupuotos). tarpusavy esantis trumpas palindrominis pasikartojimas / su CRISPR susijęs baltymas (pvz., CRISPR/Cas9). [60] [61] Iš keturių tipų dažniausiai naudojami du TALEN ir CRISPR/Cas [62] Naujausi pažanga buvo skirta kelių sistemų derinimui, siekiant išnaudoti geriausios abiejų savybių savybės (pvz., megaTAL, kuris yra TALE DNR surišimo domeno ir meganukleazės suliejimas). ). [62]

    Meganukleazės ir cinko pirštų nukleazės Redaguoti

    Pirmą kartą meganukleazės žinduolių ląstelėse buvo panaudotos 1988 m. [64] Meganukleazės yra endodezoksiribonukleazės, kurios veikia kaip restrikcijos fermentai su ilgomis atpažinimo vietomis, todėl jos yra specifiškesnės tikslinei vietai nei kiti restrikcijos fermentai. Tai padidina jų specifiškumą ir sumažina toksiškumą, nes jie nenutaikys tiek daug genomo vietų. Labiausiai ištirtos meganukleazės yra LAGLIDADG šeima. Nors meganukleazės vis dar yra gana jautrios netaikiniam surišimui, todėl jos yra mažiau patrauklios nei kitos genų redagavimo priemonės, dėl mažesnio dydžio jos vis tiek yra patrauklios virusinės vektorizacijos perspektyvoms. [65] [53]

    Cinko piršto nukleazės (ZFN), pirmą kartą panaudotos 1996 m., paprastai sukuriamos suliejus cinko piršto domenus ir FokI nukleazės domenas. Taigi ZFN turi galimybę suskaidyti DNR tikslinėse vietose. [53] Sukūrus cinko piršto domeną, kad jis būtų nukreiptas į konkrečią genomo vietą, galima redaguoti genominę seką norimoje vietoje. [65] [66] [53] ZFN pasižymi didesniu specifiškumu, bet vis tiek gali prisijungti prie nespecifinių sekų. Nors tam tikras netaikinio skilimas yra priimtinas kuriant transgeninius modelio organizmus, jie gali būti ne optimalus visiems žmogaus genų terapijos gydymo būdams. [65]

    TALEN ir CRISPR Redaguoti

    Prieiga prie kodo, reguliuojančio DNR atpažinimą naudojant į transkripcijos aktyvatorių panašius efektorius (TALE), 2009 m. atvėrė kelią naujos klasės efektyvių TAL pagrįstų genų redagavimo įrankių kūrimui. TALE, Xanthomonas augalų patogeno išskiriami baltymai, labai specifiškai jungiasi su augalo šeimininko genais ir inicijuoja genų, padedančių užsikrėsti, transkripciją. Sukurti TALE sujungiant DNR surišimo šerdį su FokI nukleazės katalizinis domenas leido sukurti naują dizainerių nukleazių įrankį – TALE nukleazę (TALEN). [67] Jie turi vieną didžiausių specifiškumo iš visų dabartinių inžinerinių nukleazių. Dėl pasikartojančių sekų jas sunku sukurti naudojant standartinę molekulinės biologijos procedūrą ir pasikliauti sudėtingesniu metodu, pvz., Auksinių vartų klonavimu. [62]

    2011 m. buvo sukurta dar viena didelė proveržio technologija, pagrįsta CRISPR/Cas (sugrupuotos reguliariai tarpuose trumpais palindrominiais pasikartojimais / CRISPR susijusiais baltymais) sistemomis, kurios veikia kaip adaptyvi imuninė sistema bakterijose ir archėjose. CRISPR/Cas sistema leidžia bakterijoms ir archėjoms kovoti su invaziniais virusais, skaidant viruso DNR ir įterpiant šios DNR dalis į savo genomą. Tada organizmas transkribuoja šią DNR į RNR ir sujungia šią RNR su Cas9 baltymais, kad įsiveržiančioje viruso DNR būtų sudarytos dvigrandos. RNR tarnauja kaip orientacinė RNR, nukreipianti Cas9 fermentą į reikiamą vietą viruso DNR. Suporavus Cas baltymus su suprojektuota vadovo RNR, CRISPR/Cas9 gali būti naudojama dvigrandėms pertraukoms sukelti tam tikruose DNR sekų taškuose. Pertrauką atstato ląstelių DNR atkūrimo fermentai, daugeliu atvejų sukuriant nedidelę įterpimo / ištrynimo tipo mutaciją. Tikslinis DNR taisymas yra įmanomas pateikiant donoro DNR šabloną, kuris atspindi norimą pokytį ir kuris (kartais) naudojamas dvigubos grandinės pertraukos taisymui homologinės rekombinacijos būdu. Vėliau buvo įrodyta, kad CRISPR/Cas9 gali redaguoti žmogaus ląsteles lėkštelėje. Nors ankstyvajai kartai trūksta TALEN specifikos, pagrindinis šios technologijos pranašumas yra dizaino paprastumas. Tai taip pat leidžia vienu metu taikyti kelias svetaines, todėl vienu metu galima redaguoti kelis genus. CRISPR/Cpf1 yra visai neseniai atrasta sistema, kuriai, palyginti su CRISPR/Cas9, reikia skirtingos kreipiančiosios RNR, kad būtų sukurtos tam tikros dvigrandės pertraukos (palieka iškyšas skaidant DNR). [62]

    CRISPR / Cas9 yra veiksmingas genų sutrikdymui. Kinų mokslininko He Jiankui sukurtas ŽIV atsparių kūdikių kūrimas yra bene garsiausias genų sutrikdymo, naudojant šį metodą, pavyzdys. [68] Jis yra daug mažiau veiksmingas koreguojant genus. Kuriami bazių redagavimo metodai, kuriuose „nukleazės negyva“ Cas 9 endonukleazė arba susijęs fermentas yra naudojami genų taikymui, o susietas deaminazės fermentas atlieka tikslinį bazės pasikeitimą DNR. [69] Naujausias CRISPR-Cas9 patobulinimas vadinamas pagrindiniu redagavimu. Šis metodas susieja atvirkštinę transkriptazę su RNR valdoma inžinerine nukleaze, kuri atlieka tik vienos grandinės pjūvius, bet nepertraukiamų dviejų grandžių.Jis pakeičia DNR dalį, esančią šalia pjūvio, nuosekliai veikiant nukleazei ir atvirkštinei transkriptazei, įvedant norimus pokyčius iš RNR šablono. [70]