Informacija

Kiek platus yra CD47?

Kiek platus yra CD47?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Neseniai buvo teigiama, kad CD47, dar žinomas kaip „nevalgyk manęs“, yra išreikštas visose naviko ląstelėse. Atrodo, kad tai nepatvirtina kitų ląstelių biologijos eksperimentų. Kokiose kitose ląstelėse ekspresuojamas CD47?


Nežinau, kiek plačiai. Vykdykime paprastą duomenų užklausą ir išsiaiškinkime: eikite į GEO NCBI. Lange „Genų profiliai“ įveskite CD47 ir paspauskite Enter, kad paleistumėte užklausą. Atsidariusio puslapio viršuje naudokite nuorodą, pažymėtą „Ribos“, kad apribotumėte 7000+ rezultatų tik žmonėms, lange „DataSet organizmas“ įvesdami terminą „žmogus“. Taigi, yra daugiau nei 3700 rezultatų. Peržiūrėkite juos, kad suprastumėte, kokių tipų ląstelės ir kokiomis sąlygomis CD47 yra išreikštas.

Pabandykime antrą būdą. Eikite į BioGPS portalą. Atitinkamame lange įveskite CD47 ir paleiskite užklausą. Iš rezultatų pasirinkite eilutę su ID # 961, nes tai reiškia žmogaus geną CD47. Gauta Hs (žmogaus) genų ekspresijos / aktyvumo diagrama parodys jums bendriau, kur CD47 yra išreikštas.


Negaliu pateikti išsamaus atsakymo į tai, bet CD baltymai randami įvairių tipų baltuosiuose kraujo kūneliuose. Jei pagalvoji apie tai, neįmanoma, kad paviršiaus baltymas galėtų būti tik pastebėta ant vėžio ląstelių, nes vėžys yra ląstelių linija, kuri yra aklavietė reprodukcijai. Galite pamatyti geneatlas langelyje apatinėje dešinėje puslapio pusėje – jo genas yra išreikštas, bent jau nedideliu kiekiu, beveik visuose pagrindiniuose audinių tipuose.


Abstraktus

Makrofagai atpažįsta CD47 kaip “self” ir fagocitozės CD47 nulinių kraujodaros ląstelių žymeklį. Naudodami CD47 chimeros modelius, parodome, kad makrofagų fagocitinis aktyvumas prieš CD47 nulines kraujodaros ląsteles yra suteikiamas CD47 ekspresijos nehematopoetinėse ląstelėse, o šis procesas yra nepriklausomas nuo kraujodaros ląstelių. Chimerų makrofagai, kuriuose nehematopoetinės ląstelės ekspresuoja CD47 fagocitozės CD47 nulines ląsteles, tuo tarpu chimerose, kuriose nėra CD47 ant nehematopoetinių ląstelių, yra tolerantiškos CD47 nulinėms ląstelėms. Tačiau pastarųjų chimerų makrofagai išlaiko fagocitinį aktyvumą prieš CD47 nulinius RBC, parodydami suskaidytą makrofagų toleranciją CD47 nulinėms hematopoetinėms ląstelėms. Rezultatai pabrėžia galimą nehematopoetinių ląstelių svarbą reguliuojant makrofagų funkciją ir rodo anksčiau neapibūdintą makrofagų tolerancijos mechanizmą.

Makrofagai yra būtini tiek įgimtam, tiek adaptyviam imuniniam atsakui. Jie inicijuoja įgimtą imuninį atsaką, atpažindami patogenus pagal daugybę receptorių, pasižyminčių specifiškumu modelio atpažinimo molekulėms (1, 2). Makrofagai taip pat išreiškia slopinančius receptorius, kurie kontroliuoja makrofagų aktyvumą audiniuose (3). Vienas iš šių receptorių, vadinamas signalizacijos reguliuojančiu baltymu (SIRP)α (taip pat žinomas kaip CD172a, SHPS-1), yra ekspresuojamas makrofaguose ir dendritinėse ląstelėse (DC), kurios atpažįsta CD47 – pentaspano membranos glikoproteiną, kuris yra visur ekspresuojamas visuose audiniuose (4). 𠄶). Ankstesni tyrimai parodė, kad CD47 yra esminis “self” žymuo, o jo signalizacija per SIRPα apsaugo nuo netinkamos savaiminės fagocitozės (7). Hematopoetinės ląstelės, neišreiškiančios CD47, greitai pašalinamos iš kraujotakos makrofagų ir DC (7, 8) [pagalbinė informacija (SI) 6 pav.]. Kadangi WT pelėse, gaunančiose CD47 KO ir WT ląstelių mišinį, pašalinamos tik CD47 KO ląstelės, fagocitozės slopinimui reikalinga CD47 ekspresija atskiroje ląstelėje, bet ne makrofaguose ar kitose aplinkinėse ląstelėse, ir tokia apsauga greičiausiai yra tarpininkaujama. tiesiogine sąveika tarp CD47 ant tikslinės ląstelės ir SIRPα ant makrofagų (SI 7 pav.).

Įdomu tai, kad CD47 KO pelių makrofagai ir DC nefagocituoja CD47 KO ląstelių. Kadangi SIRPα ekspresijos lygis CD47 KO makrofaguose yra beveik toks pat kaip WT makrofagų, mažai tikėtina, kad ši tolerancija CD47 KO ląstelėms būtų sukelta SIRPα ekspresijos lygiu (7). Gali būti, kad CD47 ekspresijos trūkumas makrofaguose arba aplinkoje gali reguliuoti makrofagų funkciją. Arba tokia tolerancija gali būti įgyta ankstyvoje prenatalinio vystymosi stadijoje kaip kompensacija už sutrikdytą geną ir gali nepasireikšti normaliuose makrofaguose. Be to, lieka nežinoma, kodėl makrofagai naudoja CD47, bet ne kitų slopinančių receptorių ligandus, norėdami identifikuoti save WT pelėse. Norėdami išspręsti šiuos klausimus ir suprasti makrofagų tolerancijos mechanizmus, čia įvertinome įvairių tipų CD47 chimerų makrofagų, kuriuose CD47 ekspresuojamas hematopoetinėse ląstelėse, nehematopoetinėse ląstelėse arba ląstelėse, fagocitinį aktyvumą prieš CD47 KO ląsteles. abu skyriai.


ĮVADAS

Nervų sistemos vystymosi metu aksonų išplėtimas iš neuronų į tikslines ląsteles yra pagrįstas įvairiais aplinkos ženklais, įskaitant difuzinius chemoattraktantus ir chemorepelentus, ekstraląstelinės matricos baltymus ir ląstelių adhezijos molekules (Tessier-Lavigne ir Goodman, 1996 Dickson, 2002). Reaguodamas į šiuos nurodymus, aksono augimo kūgis sukuria ir atitraukia filopodijas ir lamellipodijas – procesus, kuriems reikalingas laikinasis ir erdvinis aktino citoskeleto reguliavimas. Mažų G baltymų Rho šeimos nariai, įskaitant Rho, Rac ir Cdc42, yra pagrindiniai tarpininkai, susiejantys orientacinius signalus su aktino citoskeleto pertvarkymu (Ridley). ir kt., 1992 Nobes and Hall, 1995 Kozma ir kt., 1997 Luo ir kt., 1997 Hirose ir kt., 1998 Takai ir kt., 2001 Arakawa ir kt., 2003). Nors Rac ir Cdc42 skatina neurito išplitimą, Rho jį slopina arba sukelia augimo kūgio žlugimą. Šie baltymai taip pat yra susiję su dendritų vystymusi (Threadgill ir kt., 1997). Nors buvo įrodyta, kad tam tikri orientaciniai veiksniai, įskaitant plyšį, semaforiną ir efriną, reguliuoja Rho šeimos baltymus (Wahl). ir kt., 2000 Whitford and Ghosh, 2001 Wong ir kt., 2001), lieka neaišku, kaip kiti tarpląsteliniai ženklai kontroliuoja neurito išplėtimą per šiuos mažus G baltymus.

CD47, dar žinomas kaip su integrinu susijęs baltymas (IAP), iš pradžių buvo identifikuotas kartu su integrinu αvβ3 (Brown ir kt., 1990). Tai yra imunoglobulino (Ig) superšeimos narys, turintis į Ig-V panašų ekstraląstelinį regioną, penkis numanomus transmembraninius domenus ir trumpą citoplazminę uodegą (Brown ir Frazier, 2001). CD47 yra susijęs su daugelio ląstelių procesų, įskaitant neutrofilų migraciją, reguliavimu (Cooper ir kt., 1995 Parkos ir kt., 1996), T-ląstelių aktyvacija (Reinhold ir kt., 1997 Waclavicekas ir kt., 1997), T ir B ląstelių apoptozė (Mateo ir kt., 1999 Pettersen ir kt., 1999) ir trombocitų aktyvacija (Chung ir kt.,1997, 1999). CD47 ekstraląstelinė sritis yra atsakinga už jo ryšį su integrino β3 subvienetu (Lindberg ir kt., 1996b). Nors dauguma CD47 tarpininkaujamų ląstelių atsakų greičiausiai apima integrinų, ypač αvβ3 arba αIIbβ3, aktyvavimą (Brown ir Frazier, 2001), tokio aktyvavimo molekulinis mechanizmas nėra visiškai suprantamas. CD47 ekstraląstelinė sritis taip pat jungiasi su spėjamais ligandais trombospondin-1 (TSP1 Gao ir kt., 1996 Chung ir kt., 1997 Brown and Frazier, 2001) ir SHP substratas-1 (SHPS-1 Jiang ir kt., 1999 Seiffert ir kt., 1999).

SHPS-1, taip pat žinomas kaip BIT arba SIRPα, yra į receptorių panašus transmembraninis baltymas, kurio ekstraląsteliniame regione yra trys į Ig panašūs domenai, taip pat galimos tirozino fosforilinimo vietos ir baltymo tirozino fosfatazės SHP SH2 domenų prisijungimo vietos. -2 ir SHP-1, jo citoplazminėje srityje (Fujioka ir kt., 1996 m. Ohnishi ir kt., 1996 Charitonenkovas ir kt., 1997). Sudarydamas kompleksą su SHP-2, SHPS-1 skatina ląstelių migraciją reguliuodamas aktino citoskeleto (Inagaki) reorganizaciją ir kt., 2000). Mes ir kiti neseniai parodėme, kad CD47 ir SHPS-1 sudaro ląstelių ir ląstelių ryšio sistemą (CD47 – SHPS-1 sistemą), kuri atlieka svarbų vaidmenį atliekant įvairias ląstelių funkcijas. SHPS-1 įsijungimas CD47 slopina SHPS-1 – SHP-2 komplekso susidarymą ir taip prisideda prie ląstelių migracijos slopinimo dėl kontakto tarp ląstelių (Motegi) ir kt., 2003). CD47 prisijungimas prie raudonųjų kraujo kūnelių prie SHPS-1 makrofaguose taip pat slopina makrofagų vykdomą raudonųjų kraujo kūnelių fagocitozę – procesą, kuriam reikalinga SHP-1 sąveika su SHPS-1 (Oldenborg). ir kt.,2000, 2001). Monokloniniai antikūnai prieš CD47 slopina neutrofilų transmigraciją (Liu ir kt., 2001), o tai rodo, kad CD47-SHPS-1 sistema gali tarpininkauti dvikrypčiai slopinančiam ląstelių migracijos reguliavimui. Tačiau signalizacijos kelias, suaktyvintas SHPS-1 prisijungus prie CD47, iš esmės nežinomas. Atrodo, kad tam tikrus ląstelių atsakus, kuriuos sukelia TSP1 prisijungimas prie CD47, sukelia kokliušo toksinui (PTX) jautrus heterotrimerinis G baltymas G.i (Frazier ir kt., 1999 Brown ir Frazier, 2001).

CNS tiek CD47, tiek SHPS-1 yra lokalizuoti sinapsių turtinguose regionuose, tokiuose kaip hipokampas ir smegenėlės (Jiang ir kt., 1999 H. Ohnishi ir T. Matozaki, nepublikuotas pastebėjimas). Tinklainėje abi molekulės yra lokalizuotos presinapsinėse arba postsinapsinėse vietose (arba abiejose), tačiau SHPS-1 nesusieja su CD47 išmuštų pelių sinapsinėmis vietomis, o tai rodo, kad SHPS-1 sąveika su CD47 yra būtina jo sinaptinei lokalizacijai ( Mi ir kt., 2000). Be to, CD47 gausa hipokampe buvo susijusi su žiurkių atminties išsaugojimu (Huang ir kt., 1998), o ilgalaikis potencavimas (LTP) yra sutrikęs pelėms su CD47 išmušimu (Chang). ir kt., 1999), nurodant CD47 vaidmenį sinaptiniame plastiškumą ir atminties formavimąsi hipokampe. Kartu šie stebėjimai rodo, kad dėl sąveikos su SHPS-1 CD47 gali tarpininkauti neuronų ląstelių ir ląstelių ryšiui dvikrypčiu būdu ir taip moduliuoti sinapsinį perdavimą. Buvo nustatytos keturios alternatyviai sujungtos pelės CD47 mRNR izoformos, iš kurių viena, pažymėta 4 forma, yra gausiausia smegenyse (Reinhold). ir kt., 1995).

Nepaisant šių įvairių stebėjimų, fiziologinės CD47 funkcijos neuronų ląstelėse ir šio baltymo veikimo būdas dažniausiai lieka nežinomi. Dabar mes ištyrėme CD47 vaidmenį reguliuojant neuritų remodeliavimą N1E-115 neuroblastomos ląstelėse.


CD47 / SIRPα, IMUNINĖS KONTROLĖS TAŠKAS PAGRINDINĖ IMUNINĖ SISTEMA

Tarp mieloidinės linijos ląstelių makrofagai turi didelį potencialą kaip priešvėžinių vaistų tarpininkas, remiantis savo tvirtu fagocitozės gebėjimu [8, 9]. CD47, žinomas kaip su integrinu susijęs baltymas, pirmą kartą buvo nustatytas kaip transmembraninis baltymas iš raudonųjų kraujo kūnelių (RBC) [10]. Signalą reguliuojantis baltymas alfa (SIRPα), transmembraninis makrofagų baltymas, yra pagrindinis CD47 receptorius [11]. CD47 prisijungimas prie SIRPα sukelia SIRPα susiejimą su šiomis fosfatazėmis, tokiu būdu perduodant „nevalgyk manęs“ signalus makrofagams ir užkertant kelią jų aktyvacijai [8, 12, 13]. CD47 ekspresija yra laikoma normalių ląstelių, įskaitant perpiltus eritrocitus, limfocitus ir trombocitus, savisaugos mechanizmu, siekiant atsispirti makrofagų fagocitozės pašalinimui [14]. Gerai įrodyta, kad kinetinės hematopoetinės kamieninės ląstelės (HSC) apsisaugo nuo makrofagų fagocitozės padidindamos CD47 ekspresiją, kai jos praeina per sinusoidus, tada sumažina CD47 ekspresiją, kai persikėlė į čiulpus [15]. Be to, CD47 ekspresijos lygis numato tikimybę, ar HSC gali būti fagocituojamas makrofagų cirkuliuojant [16]. Nors CD47 ir SIRPα sąveikos nebuvimas gali suaktyvinti fagocitinius receptorius ir sukelti raudonųjų kraujo kūnelių makrofagų fagocitozę [17].

Nukreipimas į CD47 / SIRPα ašį vėžio gydymui. Anti-CD47 mAb, Anti-SIRPα mAb ir SIRPα-Fc sulietas baltymas sustiprina naviko fagocitozę makrofagais, todėl naviko antigenai gali būti pateikti T ląstelėms. TCR, T ląstelių receptorius. MHC, pagrindinis histo suderinamumo kompleksas.

Nukreipimas į CD47 / SIRPα ašį vėžio gydymui. Anti-CD47 mAb, Anti-SIRPα mAb ir SIRPα-Fc sulietas baltymas sustiprina naviko fagocitozę makrofagais, todėl naviko antigenai gali būti pateikti T ląstelėms. TCR, T ląstelių receptorius. MHC, pagrindinis histo suderinamumo kompleksas.

Kancerogenezės procese nustatyta, kad daugumoje navikų yra per didelė CD47 ekspresija (1 pav.). Sergant hematologiniu vėžiu, CD47 ekspresija ūminėje mieloidinėje / limfoblastinėje leukemijoje, ne Hodžkino limfomos ląstelėse ir daugybinės mielomos mėginių kaulų čiulpuose buvo aptikta, nes kelis kartus padidėjo, palyginti su normaliais audiniais, o CD47 lygis numatė bendrą išgyvenamumą iki pirminio gydymo [16, 18]. Be to, tyrimais taip pat nustatyta, kad kietieji navikai, įskaitant krūties, kiaušidžių, šlapimo pūslės, storosios žarnos, glioblastomą, prostatos naviką ir kepenų ląstelių karcinomą, išreiškė maždaug tris ar penkis kartus daugiau CD47 nei atitinkami normalūs audiniai [19]. Kai pacientai buvo suskirstyti į „žemo CD47“ ir „didelio CD47“ grupes, remiantis vienmatine analize, buvo įrodyta, kad aukštas CD47 mRNR ekspresijos lygis buvo susijęs su sumažėjusiu išgyvenimu be progresavimo ir bendru išgyvenamumu [19]. Todėl šie įrodymai parodė, kad piktybinės ląstelės išnaudojo CD47 / SIRPα ašį, kad perduotų „nevalgyk manęs“ signalą, kad būtų išvengta makrofagų stebėjimo ir fagocitozės, o tai pabrėžė, kad CD47 / SIRPα ašies blokavimas gali būti naudojamas siekiant skatinti makrofagų gebėjimą fagocituoti ir pašalinti naviko ląsteles.


3. B-ląstelių limfomos atsparumo imuninės kontrolės taško blokadai mechanizmai

Bellone M ir Elia A [295] išsamiai apžvelgė atsparumą imuninės kontrolės taško blokados terapijai sergant žmogaus vėžiu, tačiau mechanizmai, kuriais grindžiamas B ląstelių limfomos atsparumas imuninės kontrolės taško blokadai, vis dar menkai suprantami.

Nors per pastaruosius 20 metų buvo padaryta didelė pažanga siekiant įveikti B-NHL pacientų atsparumą standartinei terapijai, klinikinėje aplinkoje įvedant imuninės kontrolės punktų blokadas, kaip atskirus vaistus arba kombinuotą gydymą (1 lentelė ir 2 paveikslas). , kai kurie parametrai gali pakenkti šių naujų metodų veiksmingumui. Pacientui būdingi veiksniai, tokie kaip amžius, lytis, ŽLA heterozigotiškumas arba 㬢-mikroglobulino (B2M) praradimas, onkogeninių signalų perdavimo takų amplifikacija, imunosupresinės ląstelės ir molekulės, esančios TME, gali pabloginti antigeno atpažinimą ir prisidėti prie imuninės kontrolės taško nesėkmės. blokados [296 297] (3 pav.).

Atsparumo imuninės kontrolės punktų blokadai mechanizmai. MHC I klasės komponentų reguliavimo panaikinimas, pvz., 㬢 mikroglobulino (B2M) praradimas ir žmogaus leukocitų antigeno (HLA) heterozigotiškumo praradimas, taip pat IFN signalizacijos takų defektai gali sutrikdyti antigeno atpažinimą priešnavikinėse CD8+ T ląstelėse. Onkogeninių signalizacijos takų, tokių kaip PI3K/AKT/mTOR, Wnt/β-kateninas ir MAPK, amplifikacija padidina imunosupresinių citokinų gamybą, sukelia T-ląstelių pašalinimą iš TME ir taip pat gali sukelti atsparumą imuninės kontrolės taško blokadai. Epigenetiniai (histono acetilinimas arba DNR metilinimas) ir genetiniai (kenksmingos mutacijos) pokyčiai yra esminiai genų ekspresijos sutrikimų, susijusių su ilgalaikiu T-ląstelių išsekimu, sukėlėjai, kurie galiausiai gali sukelti imuninės kontrolės taško terapijos nesėkmę. Be to, mieloidinės kilmės slopinančios ląstelės (MDSC), Tregai, su navikais susiję makrofagai (TAM) ir su vėžiu susiję fibroblastai (CAF) yra pagrindiniai imunosupresiniai ląstelių tipai TME, galintys prisidėti prie atsparumo imuninės kontrolės taško blokadai. Imunosupresinės molekulės, tokios kaip TGF-β ir IFN-γ, kurias išskiria naviko ląstelės, mieloidinės ląstelės ir makrofagai TME, taip pat gali slopinti efektorinių T ląstelių funkcijas, todėl imuninės kontrolės taško blokada tampa neveiksminga.

Dėl dažnos PD-L1 nenormalios ekspresijos, kuri randama tarp limfoma sergančių pacientų, vėžio tipas labiausiai reaguoja į anti-PD1 gydymą. Tačiau PD-1/PD-L1 blokadą gali stipriai paveikti specifiniai ligai būdingi veiksniai, o jos nuspėjamoji reikšmė klinikiniuose tyrimuose vis dar yra prieštaringa. Nenuoseklūs duomenys daugiausia gali būti siejami su kintamaisiais PD-L1 ištekliais (navikinėmis ląstelėmis, naviko mikroaplinkos ląstelėmis, periferiniu krauju), dažymo (įskaitant antikūnų aptikimą) procedūrų skirtumais ir teigiamomis / neigiamomis PD-L1 ribomis. Be to, buvo įrodyta, kad PD-L1 gali sąveikauti cis su CD80 ant APC ir tada sutrikdyti PD-1 ir PD-L1 surišimą [298]. Alternatyvių surišimo partnerių funkcinis poveikis taip pat pabrėžia PD-1/PD-L1 imunoterapijos veiksmingumo skirtumus skirtingose ​​biologinėse sąlygose.

Yra keli mechanizmai, nustatantys, ar pacientas reaguos į PD-1/PD-L1 blokadą, ar ne. Silpnai imunogeniški navikai gali turėti nepakankamai aktyvią T-ląstelių populiaciją, kad papildomai reaguotų į PD-1/PD-L1 blokadą, potencialiai imunogeniniai navikai taip pat bus atsparūs PD-1/PD-L1 blokadai, jei jie sukurs mechanizmus, slopinančius aktyvaciją ir T-ląstelių infiltracija po gydymo. Be to, pacientai gali tapti atsparūs PD-1/PD-L1 terapijai, jei jie nepakankamai atgaivina išsekusias navikui specifines CD8+ T-ląsteles arba prarado tikslinius antigenus ar gebėjimą juos pateikti. Galiausiai, kai kurie pacientai iš pradžių gali reaguoti į PD-1/PD-L1 blokadą, bet tapti atsparūs, jei priešnavikinės T ląstelės yra trumpalaikės [299].

Taip pat yra epigenetinių B limfomos ląstelių mechanizmų, skatinančių atsparumą imuninės kontrolės taškų blokadoms. Zheng ir kt. in vitro ir in vivo duomenys. [300] parodė, kad per didelis miR-155 ekspresija sustiprina PD-L1 ekspresiją, sumažina periferinio kraujo imunines ląsteles, sukelia CD8+ T ląstelių apoptozę ir disfunkciją per AKT/ERK defosforilinimą ir sumažina DLBCL pacientų išgyvenamumą. Taip pat buvo įrodyta, kad histono deacetilazė 3 (HDAC3) yra dar vienas svarbus epigenetinis PD-L1 reguliatorius sergant B ląstelių limfoma, nes jos slopinimas padidina PD-L1 transkripciją, todėl klinikinis atsakas į PD-L1 blokadą yra geresnis [301].

Imuninės aplinkos molekuliniai mechanizmai, reguliuojantys imuninės kontrolės taškų blokadų veiksmingumą sergant B ląstelių limfoma, yra menkai suprantami. Buvo įrodyta, kad T-ląstelių uždegiminiai navikai yra praturtinti jautrumu PD-1 blokados terapijai [302].Ir atvirkščiai, T-ląstelių neuždegiminiai navikai turi mažai infiltruojančių imuninių ląstelių ir paprastai yra atsparūs imuninės kontrolės taško blokados terapijai [303]. Uždegimoms limfomoms būdinga ryški T-ląstelių infiltracija [304], genetiniai pakitimai, palengvinantys pabėgimą nuo imuninės priežiūros [78,82,305,306] ir dažnos mutacijos, dėl kurių NF-kB signalizacijos kelias yra hiperaktyvus [78,307].

Hiperprogresuojanti liga nustatyta 9% pacientų, kuriems buvo skirtas gydymas anti-PD-1/PD-L1 [308,309]. Hiperprogresija yra susijusi su vyresniu pacientų amžiumi, bet ne su naviko našta ar vėžio tipu [308]. MDM2/MDM4 amplifikacija ir EGFR aberacija koreliuoja su didesne hiperprogresijos rizika sergant kietuoju vėžiu [309], nors tai buvo mažai žinoma sergant limfoma. Naujausi duomenys parodė, kad pacientams, kuriems pasireiškia hiperprogresija, dažniau serga PD-L1 − [308]. Manoma, kad taip yra todėl, kad PD-1 sąveika su anti-PD-1 mAb slopina, bet nepadidina T ląstelių aktyvacijos. Todėl anti-PD-1 mAb gali būti PD-1 agonistai, o ne antagonistai, esant PD-L1 − būsenai. Liga taip pat gali greitai progresuoti dėl sąveikos tarp PD-L1 ir CD80, o ne PD-1, kol blokuoja anti-PD-1 mAb, esant PD-L1+ būsenai [310]. Kai kurie PD-1 polimorfizmai taip pat gali turėti įtakos anti-PD-1 mAb veikimui, todėl po PD-1 blokados gali atsirasti hiperprogresija [311].


Rezultatai

SIRPα ir CD47 tirpių domenų projektavimas ir paruošimas

Norėdami apibendrinti CD47 ir SIRPα biologinę sąveiką, sukūrėme ekspresijos konstrukcijas, kad sukurtume jų rekombinantinius, tirpius, ekstraląstelinės sąveikos domenus. CD47-CD4-6His buvo gaminamas žinduolių ekspresijos sistemoje ir anksčiau buvo įrodyta, kad jis jungiasi su rekombinantiniu SIRPα [77]. Kaip ir tikėtasi, rekombinantinis CD47-CD4-6His buvo labai glikozilintas ir migravo kaip difuzinė juosta

60 kDa, palyginti su 40 kDa molekuline svoriu, numatytu pagal baltymų seką (S1 pav). CD47 glikozilinimo heterogeniškumas neturi įtakos jo gebėjimui surišti SIRPα [78].

Neglikozilintas SIRPα jungiasi su CD47 dideliu nM afinitetu [78]. Tačiau rekombinantinis SIRPα, turintis neįprastai aukštą ir nevienalytį glikozilinimą, parodė sutrikusį CD47 surišimą [79]. Norėdami sumažinti biologinio tyrimo kintamumą, pasirinkome gaminti SIRPα sistemoje, kurioje trūksta glikozilinimo. SIRPα-Avi (1 izoformos alelis 1) yra išreikštas E. coli kaip sulieta konstrukcija, apimanti N-galo gryninimo žymę, po kurios seka ekstraląstelinis CD47 surišantis SIRPα fragmentas, prijungtas prie C-galo Avi-Tag. Po afiniteto užfiksavimo ir žymės skilimo SIRPα-Avi buvo biotinilintas in vitro (SIRPα-biotinas), naudojant išgrynintą rekombinantą E. coli biotino ligazė (BirA) iki >98 % įtraukimo, matuojant masės spektrometrija (S2 pav). Išgrynintas baltymas yra monomerinis, kaip įvertino SEC. Mažo kampo rentgeno sklaidos (SAXS) tyrimai (žr S1 failas) patvirtino, kad SIRPα yra monomerinis tirpale (mažiausiai iki 1,8 mM), o C-galo Avi-žymas yra atokiau nuo CD47 surišimo srities, o tai rodo jo tinkamumą mūsų tyrimui (S3 pav.).

Norėdami patvirtinti biologiškai svarbią mūsų PPI reagentų sąveiką, naudojome SPR spektroskopiją, kad išmatuotume jų pastovios būsenos surišimo afinitetą (2 pav). SIRPα-biotinas buvo imobilizuotas ant SAV lusto su CD47-CD4-6His, įšvirkštu keliomis koncentracijomis, kad gautų K.d maždaug 200 nM. Tai galima palyginti su ankstesne ataskaita apie 300 nM ir 279 nM, naudojant panašias konstrukcijas ir matuojant per SPR [66, 80], ir 470 nM tirpiam CD47 prisijungimui prie SIRPα ekspresuojančių CHO ląstelių, išmatuotų pagal fluorescencijos intensyvumą [81].

SIRPα-biotinas buvo imobilizuotas ant SAV lusto, po to suleidžiamas CD47-CD4-6His skirtingomis koncentracijomis. (A) Asociacijos ir disociacijos atsakai rodomi kaip kiekvienos išbandytos koncentracijos perdanga. (B) Didžiausias asociacijos fazės atsakas buvo nubraižytas atsižvelgiant į koncentraciją ir pritaikytas prie pastovios būsenos surišimo kreivės, kad būtų apytiksliai K.d sąveikos poros.

Tyrimo kūrimas

Sukūrėme TR-FRET tyrimą, skirtą kiekybiškai įvertinti CD47 ir SIRPα sąveiką [82]. Pradėjome nuo TR-FRET reagentų iš CisBio galimybių ir optimizavimo tyrimams. Donoro reagentas susideda iš anti-6His monokloninio antikūno, pažymėto terbio kriptatu (61HI2TLA), kad būtų užtikrintas ilgalaikis fluorescencinis signalas, sujungtas su CD47 6His žyme (3A pav). Akceptorius susideda iš streptavidino, pažymėto XL665 fluorochromu (SAV-XL665 610SAXLA), kad susietų su biotino žyme SIRPα. Galimybių bandymas buvo atliktas 384 šulinėlių formatu, siekiant įvertinti signalo foną ir tyrimo specifiškumą. Naudojant eksperimentiškai nustatytą Kd kaip atskaitos taškas (žr 2 pav), CD47 ir SIRPα koncentracijos 100 nM lėmė 5 S/B, palyginti su tuo pačiu mišiniu, kuriame trūko CD47 (4A pav). Norint rasti optimalią baltymų reagentų koncentraciją kiekvienam tyrimui, kiekvienas komponentas buvo titruojamas iki prisotinimo (4B ir 4C pav). Tada sumažinome tyrimo tūrius, kad būtų galima naudoti 1536 šulinėlių formatu, ir pradėjome tikrinti pagrįstumą bei toliau optimizuoti tyrimą (4D pav). Galiausiai, naudodami pakoreguotas ligando baltymų koncentracijas, optimizavome tyrimo buferį, donoro ir akceptoriaus lygius, plokštelės tipą, reagento pridėjimo tvarką ir inkubacijos laiką (1 lentelė ir S4 pav). Trumpai tariant, mes nustatėme, kad nM CD47 (12,5 nM) ir SIRPα (100 nM) koncentracijos PBS buferyje su minimaliu plovikliu (0,005% IGEPAL CA-630) ir BSA (0,1%) sukūrė tvirtą tyrimą.

TR-FRET pagrįsti tyrimai (viršutinis skydelis) ir ALPHAScreen tyrimas (apatinis skydelis). CD47 ir SIRPα buvo pateikti kaip jų rentgeno kristalų struktūros iš PBP 2JJS, grandinės D ir grandinės B, atitinkamai.

(A) Pradinis tyrimas, atliktas 384 šulinėlių plokštelės formatu, naudojant CisBio TR-FRET reagentus. CD47 ir SIRPα buvo tiriami esant 2 koncentracijoms (20 nM ir 100 nM), o visos reakcijos FRET santykis buvo lyginamas su kontrolėmis, kuriose nebuvo nei CD47, nei SIRPα, kad būtų galima apskaičiuoti S/B (n = 16). (B) CD47 arba (C) SIRPα koncentracijos buvo titruojamos, o kitos buvo fiksuotos, kaip nurodyta (A) 384 šulinėlių plokštelėse, kad būtų nustatyta jų optimali tyrimo koncentracija, įvertinta pagal S/B (n = 4). (D) 384 šulinėlių arba 1536 šulinėlių formatų tyrimo našumas lyginamas naudojant optimizuotas koncentracijas, gautas iš B ir C skydelių. Tyrimas Z’ nurodytas kiekvienam plokštelės tipui (n = 32).

Antra, sukūrėme LANCE (LANthanide Chelate Excite) TR-FRET tyrimą, kurį sudaro anti-6His monokloninis antikūnas, susietas su Eu-chelatu (Anti-6His-Eu AD0110), skirtas donorui, susijusiam su CD47 reagentu ir streptavidinu. į alofikocianiną (SAV-APC AD0201) kaip akceptorių, susijusį su SIRPα. Naudojant optimizuotas CD47 ir SIRPα koncentracijas iš CisBio tyrimo optimizavimo kaip pradinį tašką, LANCE tyrimo reagentai buvo titruojami 1536 šulinėlių formatu, kad S/B būtų 12 (4 lentelė ir S5 pav) naudojant optimalias sąlygas, nurodytas 1 lentelė. Kaip ir atliekant CisBio tyrimą (S4 pav), galutinis taškas yra stabilus (≥ 80 % pradinio signalo) mažiausiai 48 valandas (S6 pav).

Trečia, mes sukūrėme AlphaScreen testą kaip kryžminio patvirtinimo stačiakampį tyrimą. Jame naudojama granulių liuminescencinio deguonies nukreipimo [83] technologija, pagrįsta energijos perdavimu iš lazeriu sužadinto (680 nm) donoro granulės į akceptoriaus granules vienetinio deguonies pavidalu, kad būtų gautas liuminescencinis signalas (520–620 nm). [84,85]. Singleto deguonies gyvavimo laikas yra ribotas (4 μs pusinės eliminacijos laikas), kol jis atsipalaiduoja į pradinę būseną, per kurį jis tirpale gali pasklisti maždaug 200 nm. Jei akceptoriaus rutuliukas yra per tą atstumą, energija iš pavienio deguonies perduodama į tiokseno darinius akceptoriaus granulėje, o vėliau baigiasi šviesos gamyba 520–620 nm. Nesant akceptoriaus granulės, pavienis deguonis atsipalaiduoja iki pagrindinės būsenos ir signalas nesukeliamas. Šis nuo artumo priklausomas cheminės energijos perdavimas yra ALPHAScreen homogeninio formato pagrindas (3 pav).

ALPHAScreen tyrimas buvo optimizuotas kaip atskaitos taškas naudojant CD47 ir SIRPα koncentracijas iš CisBio tyrimo kūrimo. Nors optimali CD47 koncentracija išliko nepakitusi per visus tris tyrimus, optimali SIRPα koncentracija ALPHAScreen tyrime yra 4 kartus mažesnė, galbūt dėl ​​to, kad SAV granulių surišimo geba skiriasi nuo streptavidino tirpale. Optimizavimas taip pat leido pasiekti 2 kartus mažesnę granulių koncentraciją, nei pasiūlė gamintojas, todėl sumažėjo duomenų taško kaina [86]. Gautas ALPHAScreen tyrimas davė tvirtus HTS parametrus (Z' 0,79, S/B = 75 4 lentelė), šiek tiek greitesnis nuskaitymo laikas nei atliekant TR-FRET tyrimus (9 min./lėkštelė, palyginti su 14 min./lėkštele) ir įprastas tyrimo buferis bei plokštelės tipas su CisBio ir LANCE tyrimais (1 lentelė).

Tyrimo patvirtinimas

Mes įvertinome visų trijų tyrimų našumą qHTS formatu, naudodami SIRPα šaltą (nebiotiniluotą) kaip specifinį SIRPα-CD47 sąveikos inhibitorių. IC50 vertės gerai sutapo su gautomis atliekant TR-FRET tyrimą (atitinkamai 2,8 μM ir 1,1 μM CisBio ir LANCE) ir ALPHAScreen testą (0,55 μM). 5A pav). Kalnų šlaitai rodo beveik idealią bimolekulinę sąveiką (1,2–1,5, 5A pav). Mes taip pat įvertinome mažos molekulės gebėjimą veikti kaip inhibitorius tyrime, nes galutinis HTS tyrimo tikslas bus patikrinti dideles chemines bibliotekas, kad būtų galima rasti mažų molekulių baltymų ir baltymų sąveikos tarp SIRPα-CD47 antagonistų. Kadangi nėra žinomų šios sąveikos mažų molekulių inhibitorių, nusprendėme naudoti laisvą biotiną, kad slopintume SIRPα ir streptavidino konjuguotų tyrimo reagentų sąveiką. Laisvas biotinas buvo iš anksto pridėtas prie SIRPα-CD47 komplekso prieš pridedant su streptavidinu konjuguotą reagentą, kad būtų išvengta nepaprastai lėto susidariusio komplekso išjungimo greičio [87]. Biotino aktyvumas buvo panašus visuose tyrimuose ir pasižymėjo tokia pačia galia tarp tyrimų kaip didelės molekulės SIRPα-šaltas (AlphaScreen>LANCE>CisBio). 5B pav). IC50 260, 170, 115 nM vertės buvo panašios į rezultatus, gautus Perkin Elmer atliekant panašius tyrimus, įvertinančius biotino trukdžius tyrimo terpėje [88]. Bendradarbiavimas, kurį rodo kalno nuolydis nuo 2 iki 3, greičiausiai atsiranda dėl streptavidino daugiavalentiškumo ir atspindi poreikį blokuoti kelias vietas prieš pašalinant artumo signalą. Tai prieštarauja SIRPα-šalčio sąveikai su dvivalenčiu CD47-CD4-6His/anti-His antikūnu, parodytu aukščiau. Tyrimo patikimumas, nurodytas Z faktoriumi, buvo „puikus“ [74] (žr 4 lentelė) ir leido pereiti prie bandomojo patikrinimo naudojant 1280 sudėtinę LOPAC biblioteką (Sigma).

(A) Tyrimo specifiškumas buvo patvirtintas naudojant SIRPα šaltai titruotą, kad būtų slopinamas SIRPα-biotino CD47 surišimo aktyvumas atrankos tyrimuose. Kalno šlaitas ir IC50 yra nurodyti (n = 4). (B) Tyrimo atlikimas naudojant teigiamą kontrolinę mažą molekulę (biotiną) buvo įvertintas visuose trijuose tyrimuose (n = 1). Normalizuotas aktyvumas, apskaičiuotas esant neutraliai kontrolei (+CD47, +SIRPα, be inhibitorių), yra 0%, o maža kontrolė (-CD47 +SIRPα, nėra inhibitorių) – kaip -100%. Tada tyrimo aktyvumas su tiriamomis medžiagomis buvo lyginamas ir normalizuotas su šiomis kontrolėmis.

Bandomojo atrankos tyrimo palyginimas

LOPAC biblioteka buvo išbandyta qHTS formatu, naudojant 7 taškų titravimą tarp plokštelių, apimantį nuo 38 μM iki 2,4 nM (galutinė koncentracija) 1536 šulinėlių formatu. Visi tyrimai parodė tvirtą našumą, įvertintą pagal Z faktorių, statistinį teigiamo ir neigiamo kontrolinio pasiskirstymo atskyrimo matą. Z' buvo nustatytas naudojant kiekvienos plokštelės 1 ir 2 stulpelius atitinkamai kaip teigiamą ir neigiamą kontrolę (6 ir 7 pav).

Rodomi (A) CisBio, (B) LANCE ir (C) AlphaScreen tyrimų rezultatai. Individualūs neutralios kontrolės (+CD47, +SIRPα, be inhibitorių) ir žemos kontrolės (+CD47 –SIRPα, be inhibitoriaus) signalo duomenų taškai, pažymėti kiekvienos lėkštelės duobutėje 10 plokštelių bandomojo tikrinimo metu (n = 32 taškai vienoje plokštelėje ). Taškinės linijos reiškia + ir – 20 % vidutinio signalo kiekvienam aukštam ir žemam valdymui. Z faktorius buvo apskaičiuotas pagal kiekvienos plokštelės aukštą ir žemą kontrolinį elementą ir apskaičiuotas visų plokštelių vidurkis.

Rodomi (A) CisBio, (B) LANCE ir (C) AlphaScreen tyrimų rezultatai. Kiekviename tyrime SIRPα-šaltas buvo titruotas kaip kontrolinis inhibitorius (n = 2). Klaidų juostos rodo dviejų pakartojimų standartinį nuokrypį. Vidutinis IC50 ir minimalus reikšmingas santykis (MSR) buvo apskaičiuotas per 10 plokštelių bandymą kiekvienam atrankos tyrimui. MSR apibrėžiamas kaip mažiausias dviejų junginių stiprumų santykis, kuris yra statistiškai reikšmingas ir apskaičiuojamas kaip MSR = 10 2√2s, kur s yra vieno junginio logaritminio stiprumo standartinio nuokrypio įvertis.

Bibliotekos junginių aktyvumas buvo analizuojamas pagal kreivės klasifikaciją (cc), kaip aprašyta anksčiau [89, 90]. Trumpai tariant, junginiai buvo laikomi aktyviais, kai pasireiškė arba nuo koncentracijos priklausomas slopinimas su dviem asimptotais ir nepilnu aktyvumu (-50–90% cc -1,2), visišką aktyvumą esant didžiausioms tirtoms koncentracijoms (<-90% cc -2,1) arba visišką. slopinimas dviem asimptotais, rodančiais įsotinimo efektą (<-90 % cc -1,1), kaip parodyta 5 lentelė. Didžiausias bendras aktyvumas buvo parodytas AlphaScreen (17 iš 1280 1,3 proc. 8 pav), po to buvo atliktas CisBio TR-FRET tyrimas (15 iš 1280 1,2 %) ir LANCE TR-FRET tyrimas (3 iš 1280 0,2 %).

Rezultatai rodomi naudojant (A) CisBio, (B) LANCE ir (C) AlphaScreen tyrimus. Koncentracijos atsako kreivės, atitinkančios aktyviųjų junginių duomenis, naudojant 4 parametrų logistinę lygtį, įtrauktos ištisinėmis linijomis. Juodos linijos rodo aktyvumą tik nurodytame tyrime. Mėlynos linijos rodo aktyvumą tiek CisBio, tiek AlphaScreen tyrimuose. Raudonos linijos rodo aktyvumą visuose trijuose tyrimuose.

Toliau apibūdinome šių junginių aktyvumą papildomais tyrimo rodmenimis, priešpriešinio patikrinimo tyrimais, duomenų charakteristikomis ir pranešta apie junginių nebuvimą. Atliekant biocheminius HTS tyrimus [91, 92], cheminių medžiagų sukeliami tyrimo trukdžiai gali būti įvairių formų ir gali būti tarpininkaujama junginio fluorescencija arba agregacija, signalo susilpnėjimu dėl absorbcijos arba pavienio deguonies gesinimo ir afiniteto žymos sutrikimo AlphaScreen atveju.

TR-FRET tyrimuose fluorescenciniai junginiai arba slopintuvai buvo nustatyti naudojant papildomą donoro kanalo fluorescencijos duomenų nuskaitymą. Donoro fluorescencijos pokyčiai, kurie atspindi arba prisideda prie bendro aktyvumo (FRET/donoro santykis), rodo tyrimo trukdžius, todėl šie junginiai buvo pašalinti iš tolesnio svarstymo [93]. Donoro kanalų artefaktai buvo pastebėti 14 iš 15 CisBio tyrimo aktyvių molekulių (9 pav), ir 2 iš 3 aktyviųjų LANCE (10 pav), todėl 6-hidroksi-DL-DOPA yra vienintelis likęs kandidatas abiejuose TR-FRET tyrimuose, kuris, kaip žinoma, turi aktyvumą daugelyje nesusijusių tyrimų ir yra laikomas nepatogiąja molekule. AlphaScreen aktyviems junginiams naudojome papildomą priešpriešinio ekrano tyrimą (TruHits, Perkin Elmer), kai pažymėta SIRPα ir CD47 sąveikos pora buvo pakeista vienu dvigubu pažymėtu peptidu (Biotin-peptide-6XHis). Junginiai, rodantys aktyvumą šiame priešpriešiniame ekrane, specifiškai nesuardo SIRPα-CD47 sąveikos, bet yra afiniteto žymenų ardikliai, vienetiniai deguonies arba fluorescencijos gesikliai arba galbūt baltymų agregatoriai. Atitinkamai, 3 iš 17 aktyvių molekulių parodė priešingą ekrano aktyvumą ir buvo pašalintos iš tolesnio svarstymo (11 pav).

Normalizuotas donoro ir akceptoriaus kanalų aktyvumo signalas ir apskaičiuotas santykio signalas kiekvienam aktyviam junginiui, praneštam apie 7 taškų koncentracijos atsaką, sugeneruotą naudojant qHTS. Normalizuotas aktyvumas buvo apskaičiuotas, kai neutrali kontrolė (+CD47 +SIRPα, be inhibitoriaus) yra 0%, o maža kontrolė (+CD47 -SIRPα, nėra inhibitorių) – kaip -100%. Tada buvo lyginamas tyrimo aktyvumas su tiriamais junginiais ir normalizuotas šiame diapazone. (A) Junginiai, trukdantys donoro fluorescencijai, kurį rodo aktyvumas donoro kanale. (B) Reaktyvus junginys, aktyvus atliekant įvairius kitus nesusijusius atrankos tyrimus.

Normalizuotas donoro ir akceptoriaus kanalų aktyvumo signalas ir apskaičiuotas santykio signalas kiekvienam aktyviam junginiui, praneštam apie 7 taškų koncentracijos atsaką, sugeneruotą naudojant qHTS. Normalizuotas aktyvumas buvo apskaičiuotas, kai neutrali kontrolė (+CD47 +SIRPα, be inhibitoriaus) yra 0%, o maža kontrolė (+CD47 -SIRPα, nėra inhibitorių) – kaip -100%. Tada buvo lyginamas tyrimo aktyvumas su tiriamais junginiais ir normalizuotas šiame diapazone. (A) Junginiai, trukdantys donoro fluorescencijai, kurį rodo aktyvumas donoro kanale. (B) Reaktyvus junginys, aktyvus atliekant įvairius kitus nesusijusius atrankos tyrimus (Pubchem).

Normalizuotas aktyvumo signalas, skirtas specifiniam AlphaScreen tyrimui (Alfa) ir nespecifiniam skaitiklio ekrano tyrimui (skaitiklis) kiekvienam aktyviam junginiui, praneštam 7 taškų koncentracijos atsakui, sugeneruotam naudojant qHTS. Normalizuotas aktyvumas AlphaScreen tyrime buvo apskaičiuotas, kai neutrali kontrolė (CD47 + SIRPα, be inhibitoriaus) yra 0%, o neigiama kontrolė (CD47–SIRPα, nėra inhibitorių) – kaip -100%. Normalizuotas aktyvumas skaitiklio ekrano tyrime buvo apskaičiuotas, kai neutrali kontrolė (+TruHits reagentas, be inhibitoriaus) yra 0%, o neigiama kontrolė (-TruHits reagentas, be inhibitoriaus) kaip -100% aktyvumas. Tada tyrimo aktyvumas su tiriamais junginiais buvo lyginamas ir normalizuotas šiame diapazone. (A) Junginiai, kurie trukdė tyrimui, kaip rodo reikšmingas aktyvumas skaitiklio ekrano tyrime. (B) Reaktyvūs junginiai, nustatyti kaip aktyvūs atliekant įvairius kitus nesusijusius atrankos tyrimus.

Likusios aktyvios molekulės buvo toliau tikrinamos, ar nėra idealaus elgesio, kuris rodytų kitokį nei CD47-SIRPα antagonizmą mechanizmą. Dabar gerai atpažįstamas tyrimo trukdžių mechanizmas apima molekules, kurios linkusios agreguotis vandeniniuose tyrimo buferiuose ir adsorbuoti tyrimo reagentus, sukeldamos akivaizdų slopinamąjį aktyvumą [94–96]. Kadangi šis reiškinys atsiranda ties slenksčiu, kai bandomoji molekulė pasiekia savo tirpumo ribą, koncentracijos atsako kreivės parodys stačią Hill nuolydį netoli tirpumo ribos [94]. Tada kalvų šlaitai yra nespecifinio aktyvumo rodiklis, o junginiai buvo pažymėti kaip neidealūs inhibitoriai, kai jų kalno šlaitai buvo už -0,5–1,5 diapazono ribų, suprantant, kad tai neabejotinai identifikuoja problemines molekules kaip agregatorius [ 97]. Siekiant išvengti junginių agregacijos ir susijusių tyrimų trukdžių, visi pirminiai tyrimai ir tolesni testai buvo atlikti naudojant ploviklį [97, 98].

Vienos aktyvios molekulės atveju TR-FRET tyrimuose (6-hidroksi-DL-DOPA), jos Hill nuolydis patenka į CisBio ir LANCE tyrimų toleranciją.Iš AlphaScreen aktyviųjų medžiagų aurintrikarboksirūgštis, cefalosporinas C, apresolinas, indirubino-3'-oksimas, 2,2'-bipiridilas, CGS-15943, L-histidino hidrochloridas ir rutenio raudonasis visi rodė Hill šlaitus, neatitinkančius mūsų priimtinumo kriterijų ir buvo atmesta. Likusios veikliosios medžiagos (morinas, roterlinas, 1,10-fenantrolino monohidratas, chinolino rūgštis, fuzario rūgštis ir 6-hidroksi-DL-DOPA) turi PAINS charakteristikas ([91,99,100] ir ChEMBL duomenų bazė), todėl jos gali būti klaidingos. teigiamas ir netinkamas tolesniam darbui. Taip pat įtariama, kad 6-hidroksi-DL-DOPA trukdo tyrimui dėl jo agregatoriaus aktyvumo (žr. aukščiau), o kituose tyrimuose [101], PAINS charakteristikų (kaip apibrėžta ChEMBL duomenų bazėje), žinomo redokso reaktyvumo ir tyrimo laisvumo (aktyvus). 119 iš 386 Pubchem tyrimų [102] rankraščio rengimo metu). Nepaisant gerai atpažįstamo tyrimui trukdančio aktyvumo, 6-hidroksi-DL-DOPA aktyvumas mūsų tyrimuose atitiko gerai veikiantį junginį, be to, tai buvo vienintelė nuosekliai aktyvi molekulė visuose qHTS tyrimuose. Taigi jis buvo pasirinktas tolesniam tyrimui.

Naujas 6-hidroksi-DL-DOPA miltelių mėginys buvo gautas iš tiekėjo ir patvirtintas naudojant HPLC-MS iš 10 mM DMSO atsargų. Tolesni tyrimai qHTS tyrime parodė panašų, o gal ir šiek tiek stipresnį aktyvumą (12 pav CisBio ir AlphaScreen). Tada junginys buvo įvertintas dėl SIRPα-CD47 ardančio aktyvumo anksčiau aprašytame SPR tyrime (vide infra), tačiau nepavyko slopinti baltymų ir baltymų sąveikos sąlygomis, panašiomis į qHTS tyrimus.

Rodomi (A) CisBio, (B) LANCE ir (C) AlphaScreen tyrimų rezultatai. Tolesnis bandymas buvo atliktas naudojant šviežiai padengtą junginį iš miltelių atsargų su 11 taškų koncentracijos atsaku (n = 1).

Kaip minėta aukščiau, 6-hidroksi-DL-DOPA yra žinomas agregatorius. Šio tipo trukdžiai turėtų sukelti aktyvumą AlphaScreen skaitiklio ekrano tyrime. Tačiau savo tyrime, vadovaudamiesi gamintojo protokolu, nieko neradome. Šiame eksperimente kontrolinis peptidas iš anksto sumaišomas ir su akceptoriaus, ir su donoro granulėmis, kad susidarytų kompleksas, o vėliau įpilama į tyrimo šulinėlius, po to sumaišomi junginiai. Esant tokioms sąlygoms, iš anksto suformuotas granulių ir peptidų kompleksas gali būti kinetiškai ir fiziškai nejautrus agreguotam junginiui. Palyginimui, pirminiame tyrime reagento baltymai veikiami agreguotu junginiu prieš pridedant granulių. Norėdami vienareikšmiškai nustatyti, ar 6-Hidroksi-DL-DOPA parodė trukdantį aktyvumą skaitiklio ekrane, pakeitėme protokolą, kad jis labiau atitiktų pirminį tyrimą. Esant šioms peržiūrėtoms sąlygoms (2 v. priešpriešinis ekranas), į duobutes pirmiausia pridedamas peptidas, po to junginys, tada granulės (13 pav). Patikslintos sąlygos atskleidė priešpriešinio atrankos testo v.2 aktyvumą, kuris buvo panašus į pirminį atrankos tyrimą, ir nustatė, kad 6-hidroksi-DL-DOPA yra trukdanti molekulė. Todėl jis buvo pašalintas iš tolesnio svarstymo. Apibendrinant galima pasakyti, kad bandomojo atrankos tyrimo metu jokie junginiai nebuvo nustatyti kaip specifiniai CD47-SIRPα sąveikos inhibitoriai. Tačiau mes sukūrėme tyrimus ir priešpriešinius tyrimus, kurie pašalino daugelį trukdančių junginių ir kuriuos galima pritaikyti didesnėms chemiškai įvairioms kolekcijoms ir atrankos kampanijoms.

Aktyvumas, parodytas naudojant CD47-SIRPα PPI tyrimą (kairysis skydelis) ir skaitiklio ekrano tyrimą, vykdomas pagal skirtingas reagento pridėjimo sekas (dešinysis skydelis).

Tyrimo atlikimas visiškai automatizuotoje didelėje bibliotekoje qHTS

Išbandėme pirmiau minėtų tyrimų, išdėstytų kaip didelės bibliotekos, visiškai automatizuotos qHTS kampanijos, našumą. Mes naudojome pirminį ekraną su pasroviui skirtu skaitikliu ir stačiakampiais atrankos tyrimais, galinčiais identifikuoti tyrimo artefaktus iš junginių, aktyvių pirminėje atrankoje. Pirminiam ekranui pasirinkome LANCE TR-FRET tyrimą, nes jis turėjo geriausią Z faktorių ir mažiausią junginio trukdžių profilį bandomojo patikrinimo metu (14 pav). Kaip skaitiklio ekraną, vietoj SIRPα-CD47 sąveikos panaudojome LANCE TR-FRET tyrimą su 6XHis-biotino peptidu (kaip ir aukščiau aprašytame AlphaScreen skaitiklio ekrano tyrime). Tai leido įvertinti tyrimui trukdančius junginius su tais pačiais TR-FRET reagentais kaip ir pirminis ekranas. Aktyviems junginiams patvirtinti buvo naudojamas stačiakampis atranka ir atlikta naudojant AlphaScreen SIRPα-CD47 sąveikos tyrimą, kaip aprašyta aukščiau. Norėdami išbandyti šią tyrimo konfigūraciją, mes patikrinome didelį (94 965 junginių), įvairių (1 000 pastolių, kurių reprezentacija skiriasi nuo 20 iki 100 junginių kiekvienam chemotipui), labai kuruojamą (PAINS, Lipinsky), į šviną (prisodrintą sp3, spirociklinį, naujų chemotipų) cheminė biblioteka (Genesis, NCATS), suformatuota kaip 6 ir 7 taškų koncentracijos reakcija tarp plokštelių 1536 šulinėlių šaltinio plokštelėse. Atranka buvo atlikta su NCATS automatizavimo grupe, naudojant visiškai automatizuotą Kalypsis Robotic platformą, kurioje naudojama ta pati skysčio dozavimo, junginių tvirtinimo ir galutinio taško matavimo įranga, kuri buvo naudojama neprisijungus atliekant bandomąjį patikrinimą. Šiuo formatu pirminis patikrinimas buvo atliktas 409 plokštelėse per 4 atrankos dienas. 2 atrankos dieną buvo 200 plokštelių, kurių didžiausias pralaidumas buvo daugiau nei 40 000 junginių per dieną pagal 6 ir 7 taškų koncentracijos atsakus. Pirminis tyrimas buvo tvirtas (S/B = 17,6 ± 2,2, CV = 2,0 % ± 0,6 ir Z′ 0,93 ± 0,3 14A pav), kaip apskaičiuota iš kiekvienos serijos plokštelės kontrolinių šulinėlių.

(A) Z' koeficientas, apskaičiuotas iš lėkštelės viduje esančių kontrolinių mėginių. (B) Normalizuotas visų junginių aktyvumas, tirtas pagal 6 taškų koncentracijos atsaką. Pateiktos kreivės reiškia visus junginius, kurių aktyvumas yra neigiamas kreivės klase. Raudonai pavaizduotų kreivių maksimalus aktyvumas yra ≤-25%.

Dėl mažo aktyvumo ekrane junginiai buvo atrinkti tolesniems tyrimams, jei jų kreivės klasifikacija buvo neigiama (visos kreivės 14B pav) ir didžiausia normalizuota reakcija yra <-25 % (raudonos kreivės į 14B pav). Dėl to buvo atrinkta 12 junginių tolesniam tyrimui. Šie junginiai, atrinkti iš cheminių atsargų, buvo naudojami bibliotekos plokštelėms gaminti, padengti 11 taškų koncentracijos atsako formatu nuo 38 μM iki 37 nM ir patvirtinti neprisijungus naudojant TR-FRET pirminį ekrano tyrimą (15 pav). Testavimas neprisijungus patvirtino 8 iš 12 aktyvių elementų, nustatytų pirminiame ekrane. 4 junginiai, kurie nebuvo patvirtinti, rodė -4 kreivės klasę ir buvo aktyvūs tik esant didžiausiai koncentracijai pirminiame ekrane. Šie rezultatai suteikė dar vieną qHTS formato atrankos vertės ir gebėjimo naudoti koncentracijos reagavimą kaip ankstyvą veiklos filtrą pavyzdį. Likę aktyvūs junginiai buvo papildomai tiriami naudojant TR-FRET pagrįstą skaitiklio atrankos tyrimą, siekiant pašalinti tyrimui trukdančius klaidingai teigiamus junginius. Trys junginiai parodė nepriimtiną aktyvumą skaitiklio ekrano tyrime (ta pati kreivės klasifikacija arba didžiausias aktyvumas kaip ir pirminiame ekrane) ir buvo pašalinti iš tolesnio tyrimo. Likusiems junginiams buvo atliktas ortogoninis tyrimas, naudojant AlphaScreen SIRPα-CD47 sąveikos tyrimą, ir patvirtinta, kad 5 junginiai turi panašų aktyvumą kaip ir pirminiame ekrane. Patvirtintų veikliųjų junginių cheminės tapatybės bus pateikiamos tolesnėje ataskaitoje, kuri bus gauta dėl jų nuolatinio charakterizavimo ir optimizavimo.

Kairysis skydelis: atrankos proceso schema, rodanti įvesties bibliotekos dydį, tyrimo panaudojimą, pažangius junginius (žalia rodyklė) ir nepažangius junginius (raudona rodyklė). Dešinysis skydelis: junginių, pasirinktų tolesniam tyrimui iš pirminio ekrano, aktyvumo profiliai. Parodyta kiekvieno atlikto tyrimo veikla, o junginių profiliai yra atskirti pagal tyrimo pažangos lygį. (A) Nevykdoma TR-FRET stebėjimas. (B) Nepriimtina skaitiklio ekrano veikla. (C) Patvirtinta, kad aktyvus naudojant AlphaScreen.


Senstančios ląstelės ir makrofagai: pagrindiniai regeneracijos dalyviai?

Per pastarąjį dešimtmetį mūsų supratimas apie senstančių ląstelių fiziologinį vaidmenį drastiškai pasikeitė – nuo ​​tik ląstelių streso ir senėjimo rodiklių iki pagrindinio vaidmens regeneruojant ir atstatant. Vis dažniau tyrimais nustatyta, kad senstančios ląstelės ir su senėjimu susijęs sekrecinis fenotipas (SASP) yra labai svarbūs regeneraciniame procese po sužalojimo, tačiau senėjimo programos suaktyvinimo laikas ir kontekstas gali lemti skirtingus rezultatus. Pavyzdžiui, laikina senstančių ląstelių indukcija, po kurios seka greitas klirensas ankstyvosiose stadijose po sužalojimo, skatina atstatymą, o ilgalaikis senstančių ląstelių kaupimasis pablogina audinių funkciją ir gali sukelti organų nepakankamumą. Pagrindinis SASP vaidmuo yra imuninių ląstelių pritraukimas į sužalojimo vietą ir vėlesnis senstančių ląstelių pašalinimas. Tarp šių ląstelių tipų yra makrofagų, kurie turi gerai dokumentuotą reguliavimo vaidmenį visuose regeneracijos ir atstatymo etapuose. Tačiau, nors pradedamas tirti senstančių ląstelių ir makrofagų vaidmuo šiame procese, specifinė šių ląstelių tipų sąveika ir tai, kaip jos yra svarbios įvairiuose sužalojimo / reparacinio atsako etapuose, vis dar reikalauja tolesnio tyrimo. Šioje apžvalgoje nagrinėjame dabartinę literatūrą, susijusią su šių ląstelių tipų sąveika, kaip jų bendradarbiavimas yra svarbus regeneracijai ir taisymui, ir į kokius klausimus reikia atsakyti siekiant pažangos.

1. Įvadas

Audinių atstatymas ir regeneracija yra svarbūs biologiniai procesai, vykstantys po sužalojimo ir būtini išgyvenimui. Sužalojimas gali atsirasti dėl infekcijos, toksinio ar mechaninio išpuolio, o tai lemia ryškų imuninės sistemos suaktyvėjimą ir daugybės ląstelių, kurios prasiskverbia į pažeistą vietą, įdarbinimas. Jas sudaro natūralios žudančios ląstelės, makrofagai, neutrofilai, B ląstelės, T ląstelės, fibroblastai, epitelio ląstelės ir endotelio ląstelės. Sveikoje aplinkoje tokios ląstelės dirba kartu, siekdamos atstatyti audinių funkciją ir apriboti žalą, o šis procesas turi būti griežtai reguliuojamas. Daugelyje patologinių aplinkų šie mechanizmai tampa nereguliuojami, o imuninių ląstelių įdarbinimas gali inicijuoti, sustiprinti ir net palaikyti audinių pažeidimus. Šis pažeistų audinių gijimo procesas yra žinomas kaip „atstatymas“ ir apima du atskirus regeneracijos ir pakeitimo procesus, kur regeneracija reiškia procesą, kurio metu naujas audinių augimas atkuria pažeistų audinių plotus į pradinę būseną, o pakeitimas vyksta labai pažeistuose audiniuose. , dažnai randų pavidalu.

Nors uždegiminė kaskada padeda pašalinti kenksmingą dirgiklį ir išvalyti pažeistą vietą nuo negyvų ląstelių ir matricos šiukšlių, sužalotų audinių gijimas priklauso nuo savalaikio uždegimo slopinimo, o tai sudaro sąlygas reparacinių ląstelių aktyvacijai [1]. Tačiau reparacinio atsako veiksmingumas priklauso nuo sužalojimo sunkumo ir tipo, paveikto organo ir rūšiai būdingų savybių. Nors varliagyviai gali regeneruoti galūnes [2], o žuvys – miokardą [3], suaugę žinduoliai nesugeba atkurti nė vieno iš jų. Be to, suaugusių žinduolių organai, tokie kaip kepenys, išlaiko tam tikrą regeneracinį pajėgumą [4], o smegenų ir nugaros smegenų regeneracija yra labai ribota [5]. Be to, kai audiniai yra veikiami ilgalaikio sužalojimo, taisymo procesas gali tapti lėtinis arba sutrikęs, o tai gali sukelti patologinius procesus, įskaitant fibrozę arba lėtinį uždegimą, kurie galiausiai paveikia organo funkciją ir gali sukelti organo ar organizmo mirtį.

1.1. Ląstelių senėjimas

Dažnas sužalojimo proceso rezultatas yra ląstelių senėjimas, negrįžtama, bet stabili ląstelių ciklo sustabdymo forma, apibrėžiama pakitusiu transkriptu, kuris atsiranda besidauginančiose ląstelėse, kai jos pasiekia savo replikacinio gyvenimo trukmės pabaigą arba patiria stresą. Senstančios ląstelės dažnai pasižymi padidinta ir suplokšta forma [6] ir pasižymi senėjimo požymiais, įskaitant DNR ir chromatino pakitimus bei genų ekspresijos pokyčius [7–11] mitochondrijų disfunkciją ir vėlesnį reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) išsiskyrimą [12]. ,13] baltymų modifikacijos [14] ir lipofuscino granulių kaupimasis [15] SA-β-galaktozidazės ekspresija [16] ir SASP faktorių išsiskyrimas [14,17] (1 pav.a). Be to, nors dažnai randama pažeistuose audiniuose [27, 28], senstančios ląstelės taip pat gali būti nepažeistuose organuose, ypač organuose, kurie anksčiau buvo pažeisti arba patyrę ligas [29], ypač vyresnio amžiaus žmonėms. Ląstelių senėjimas pirmą kartą buvo aptiktas pirminėje ląstelių kultūroje, kur ilgą laiką augintos ląstelės, panašios į senėjimą, pasiekė būseną, kai nebegalėjo daugintis [30, 31]. Vėliau su senėjimu susijusios (SA)-β-galaktozidazės teigiamos ląstelės buvo pastebėtos senuose audiniuose [16]. Daugelį metų po to senėjimas buvo vertinamas tik kaip organizmo senėjimo rezultatas, tačiau per pastarąjį dešimtmetį mūsų supratimas labai pasikeitė, o tai rodo, kad ląstelių senėjimas gali įvykti reaguojant į įvairius dirgiklius, įskaitant ląstelių pažeidimus [18], oksidacinis stresas [32], onkogeninis signalizavimas [19], telomerų dilimas [20], jonizuojanti spinduliuotė [21] ir kai kurie vaistai nuo vėžio [22] (1 pav.b), ir netgi pastebimas kūrimo metu [23,24] (1 pavc). Buvo pranešta apie daugelio tipų ląstelių senėjimą natūralaus senėjimo metu ir po traumų ar ligų, įskaitant epitelį [33], endotelį [34], imunines ląsteles [35], mezenchimines ląsteles [36], kaulus [37], raumenis [38] ir riebalinis audinys [39]. Todėl svarbus senėjimo vaidmuo yra užkirsti kelią pažeidimo plitimui visame audinyje ir, sergant vėžiu, veikia kaip stiprus barjeras prieš navikogenezę (apžvelgta [40]) (1 pav.c). Apskritai, laikinas senėjimo indukcija, po kurios seka senstančių ląstelių pašalinimas, skatina audinių remodeliavimąsi ir regeneraciją [25, 26] (1 pav.c), tačiau dėl lėtinių sužalojimų gali ilgai kauptis senstančios ląstelės, sukeldamos nuolatinį uždegimą, kuris galiausiai pablogina audinių funkciją ir gali prisidėti prie organų nepakankamumo (1 pav.c). Dėl šios priežasties senstančių ląstelių pusiausvyra ir jų buvimas / išvalymas greičiausiai vaidins pagrindinį vaidmenį audinių atstatyme. Šioje apžvalgoje mes sutelkėme dėmesį į literatūrą, aprašančią epitelio audinių senėjimo ir imuninių ląstelių, ypač makrofagų, sąveiką.

1 pav. Ląstelių senėjimo požymiai, priežastys ir pasekmės. (a) Pagrindinės senstančios ląstelės ypatybės, įskaitant padidintą ir netaisyklingą / išlygintą formą [6], DNR segmentus su chromatino pokyčiais, sustiprinančius senėjimą (DNR-SCARS) [9] ir židinius [10], pakitusią genų ekspresiją [8] ir ląstelių ciklo sustabdymas [7], mitochondrijų disfunkcija ir reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) išsiskyrimas [12,13], baltymų modifikacijos [14], lipofuscino granulės, SA-β-galaktozidazės ekspresija [16] ir SASP faktorių išsiskyrimas [14]. ,17]. (b) Ląstelių senėjimas gali atsirasti dėl ląstelių ar DNR pažeidimo [18], onkogenų, mitogenų ir citokinų signalizacijos [19], telomerų dilimo / sutrumpėjimo [20], jonizuojančiosios spinduliuotės [21] ir vaistų nuo vėžio [22]. (c) Ląstelių senėjimas vaidina dvejopą vaidmenį vystymosi metu [23, 24] ir audinių atstatymo bei regeneracijos metu [25, 26], kur jis gali skatinti ląstelių likučių pašalinimą, sumažinti fibrozę, sukelti epigenetinius pokyčius ir veikti kaip stiprus barjeras prieš naviko atsiradimą. , o tai taip pat sukelia senėjimo plitimą, DNR pažeidimus, tolesnį audinių pažeidimą ir galiausiai sukelia su amžiumi susijusį audinių pablogėjimą ir patologijas. Sukurta naudojant Biorender.com.

1.2. Su senėjimu susijęs sekrecijos fenotipas

Senstančios ląstelės dažnai pasižymi gebėjimu sukurti su senėjimu susijusį sekrecinį fenotipą (SASP), priešuždegiminį atsaką, kuris suaktyvina ir sustiprina senėjimo fenotipą aplinkinėse ląstelėse, moduliuoja fibrozę ir skatina regeneraciją [41] (1 pav.c). SASP sudaro sudėtingas ekstraląstelinės matricos proteazių, augimo faktorių, chemokinų ir citokinų mišinys, turintis didelį poveikį audinių mikroaplinkai [42]. Tokie SASP komponentai gali sukelti senėjimą gretimose ląstelėse tiek autokrininiu [43,44], tiek parakrininiu [41,45] būdu, o tai rodo, kad senėjimas sukuria uždegiminę mikroaplinką, dėl kurios gali išnykti senstančios ląstelės. Priešuždegiminių citokinų, tokių kaip interleukinas-6 (IL-6) ir interleukinas-8 (IL-8) [46], chemokinų, tokių kaip monocitų chemoattraktantiniai baltymai (MCP) ir makrofagų uždegiminiai baltymai (MIP) sekrecija [42] ] ir augimo faktorius, tokius kaip transformuojantis augimo faktorius-β (TGFβ) [47], sukelia uždegimą ir įdarbina imunines ląsteles, kad išvalytų senstančias ląsteles.

1.3. Makrofagai audinių atstatyme

Įrodyta, kad tarp įvairių ląstelių tipų, kurie organizuoja taisymą, makrofagai pasižymi svarbiu reguliavimo aktyvumu visuose atstatymo ir fibrozės etapuose. Makrofagai į sužalojimo vietą įdarbinami chemokinų gradientais ir įvairiomis adhezijos molekulėmis, kur jie atlieka savo vaidmenį kaip ląstelės, kurios fagocituoja ląstelių šiukšles ir įsiveržiančias ląsteles kartu su kitomis apoptozinėmis ląstelėmis, reaguodamos į audinių pažeidimą. Svarbu tai, kad makrofagai yra labai svarbūs senstančių ląstelių pašalinimui po sužalojimo [48, 49], taip pat svarbus chemokinų, matricos metaloproteinazių (MMP) ir kitų uždegiminių mediatorių, skatinančių pradinį ląstelių atsaką, šaltinis [50]. Dabartiniai modeliai rodo, kad senėjimas inicijuoja audinių modeliavimą / remodeliavimą, įdarbindamas imunines ląsteles per SASP, kur makrofagai išvalo senstančias ląsteles, o tai leidžia atkurti progenitorines ląsteles ir regeneruoti pažeistą audinį [25, 26, 51]. Tačiau nuolatinio pažeidimo arba senų audinių atveju klirensas ir regeneracija gali būti pažeisti dėl prasto makrofagų prisitraukimo, padidėjusio senstančių ląstelių ar net pačių makrofagų pažeidimo. Iš tiesų, jei makrofagai išeikvojami ankstyvose daugelio organų atstatymo stadijose, uždegiminis atsakas sumažėja [52] ir dėl to ne toks efektyvus atstatymas ir regeneracija [53, 54].

Šioje apžvalgoje pagrindinis dėmesys skiriamas naujausioms išvadoms, kurios pagerino mūsų supratimą apie senstančias ląsteles ir makrofagus audinių pažeidimo atveju, ir šių ląstelių, kaip pagrindinių veikėjų, palengvinančių audinių regeneraciją ir taisymą, bendradarbiavimo svarbą.

2. Senstančių ląstelių vaidmens audinių pažeidime įrodymai

Senėjimas yra negrįžtamo proliferacijos sustojimo būsena, kurią ląstelės patiria reaguodamos į įvairius žalingus dirgiklius, ir yra susijusi su morfologijos pokyčiais, lizosomų aktyvumu, chromatino struktūros pokyčiais (H2Ax ekspresija) ir SASP aktyvacija [55] (pav. 1a). Didžioji dalis mūsų dabartinio supratimo apie senėjimą atsirado dėl ligos ar senėjimo tyrimų, tačiau neseniai atsirado naujas senėjimo vaidmuo sprendžiant audinių pažeidimus. Iš tiesų, senstančios ląstelės buvo nustatytos įvairiuose pažeistuose organuose, įskaitant kepenis [28, 47], inkstus [56, 57], širdį [58], skeleto raumenis [27] ir seilių liaukas [59]. buvo susijęs su audinių funkcijos praradimu. Nepaisant to, buvo pranešta, kad senstančių ląstelių buvimas turi teigiamą ir neigiamą poveikį jų nuolatiniam organui, priklausomai nuo jų gausos ir trukmės (1 pav.c) ir suteikia mums svarbių įžvalgų apie jų fiziologinę funkciją. Iš tiesų, jei senėjimo funkcija yra ląstelių pašalinimas, kodėl ląstelės nepatiria greitesnio ir tiesioginio apoptozės kelio ir kodėl evoliucijos metu buvo atrinktos senstančios ląstelės? Dėl šio klausimo atsirado nauja koncepcija, kad senstančios ląstelės vaidina svarbų vaidmenį audinių atstatyme ir remodeliavime, atlikdamos galutinę funkciją, kol galiausiai pačios pašalinamos [26].

2.1. Senstančių ląstelių vaidmuo audinių atstatyme

Iki šiol buvo naudojami du pagrindiniai metodai, skirti ištirti senstančių ląstelių vaidmenį atkuriant: genetinės išeikvojimo strategijos, kai senstančios ląstelės pašalinamos iš audinio, ir senolitikų naudojimas, kai junginiai naudojami senstančių ląstelių žūčiai sukelti.

2.2. Genetinio išeikvojimo strategijos

Norėdami atskirti senstančių ir apoptotinių ląstelių vaidmenį audinių pažeidime, Baker ir kt. [66] naudojo indukuojamą „senėjimo iki apoptozės“ progerinį pelės modelį, kai transgeninės pelės ekspresuoja proapoptotinius baltymus, ekspresuodamos p16 INK4a promotorių. Suleidus pelėms su „cheminiu jungikliu“, ląstelės, ekspresuojančios su senėjimu susijusį žymenį p16 INK4a, buvo paverstos apoptotinėmis ląstelėmis. in vivo. Įdomu tai, kad Beikeris pastebėjo senstančių ląstelių skaičiaus mažėjimą ir kt. [66] pastebėjo daugelio su amžiumi susijusių patologijų atsinaujinimą (2 pav.), o tai rodo senstančių ląstelių vaidmenį sutrikdant audinių homeostazę. Tačiau naudojant panašų, bet mechaniškai skirtingą pelės modelį odos žaizdų gijimo tyrimuose, tai parodė Demaria ir kt. [60], kad pelių skatinimas pereiti nuo senėjimo prie apoptozės žymiai sulėtino žaizdų gijimą ir dėl to žaizdose susikaupė didesnis fibrozinio audinio kiekis (2 pav.). Įdomu tai, kad jaunoms pelėms buvo nustatytas trumpalaikis P16 INK4a + senstančių ląstelių pliūpsnis normaliai žaizdai gyjant ir išnyko po žaizdos uždarymo, o tai rodo ankstyvą senstančių ląstelių vaidmenį žaizdos atsistatyme ir neigiamą jų pašalinimo poveikį [60]. Panašiai ląstelių senėjimas vyksta miofibroblastuose odos žaizdose gijimo proceso metu, o tai, manoma, sumažina fibrozės mastą [61].

2 pav. Makrofagų ar senstančių ląstelių išeikvojimas turi įvairių ir priešingų poveikių organų regeneracijai. Senstančių ląstelių išsekimo poveikis (a) arba makrofagų išeikvojimas arba kaupimosi prevencija (b) yra pavaizduoti. Daugelyje organų ląstelių išeikvojimo laikas turi lemiamą reikšmę regeneraciniam rezultatui. Nors senstančių ląstelių išeikvojimas lėtina odos žaizdų gijimą ir sustiprina fibrozę [60, 61], makrofagų ištrynimo poveikis žaizdų gijimo metu priklauso nuo laiko [54], o senstančių ląstelių išeikvojimas sukelia kepenų fibrozę [28, 62], išsekimą. Makrofagai, priklausomai nuo laiko, gali sumažinti kepenų randus ir fibrozę [52]. Be to, senstančių ląstelių pašalinimas neturi arba iš esmės teigiamo poveikio raumenims ir širdžiai [63], tačiau makrofagų išeikvojimas daro žalingą poveikį širdžiai ir raumenų regeneracijai [63–65]. Sukurta naudojant Biorender.com.

Remiantis šiais stebėjimais, kituose audinių pažeidimo modeliuose taip pat buvo įrodytas kontrastingas senstančių ląstelių funkcijos poveikis. Kai pažeidžiamos kepenys, kepenų žvaigždžių ląstelės sensta ir susidaro stabilus fibrozinis randas [28] (2 pav.). In vivo, šios senstančios ląstelės yra identifikuojamos fibrozinių pažeidimų viduje, tačiau pelėms trūksta 53 p ir p16 INK4A rodo padidėjusią kepenų ir inkstų fibrozę [28, 62]. Ir atvirkščiai, onkogeninio NRAS G12 V pelių modelyje, kur senstančias ląsteles paprastai išvalo monocitai ir makrofagai, pelių, kurių imunodeficitas, klirensas sumažėja, todėl atsiranda brandūs kepenų navikai [67]. Be to, p16-3MR transgeninė pelė, modelis, turintis p16 INK4a promotorių, leidžiantį atsekti ir pašalinti senstančias ląsteles, buvo panaudotas siekiant parodyti, kad senstančių ląstelių delecija sumažina skausmą eksperimentiniame osteoartrito modelyje [68]. Svarbiausia, kad pelės modelis, kuriame yra transgenas, INK-ATTAC, sukeliantis apoptozę p16 INK4a ekspresuojančiose ląstelėse, nustatė, kad gydymas senstančiomis ląstelėmis pailgino pelių patinų ir patelių gyvenimo trukmę, uždelsė navikogenezę ir susilpnino su amžiumi susijusį kelių organų pablogėjimą. , įskaitant inkstus, širdį ir riebalus, be akivaizdaus šalutinio poveikio [69].

2.3. Senolitikai

Senolitinių junginių naudojimas taip pat suteikia mechanizmą, leidžiantį išsiaiškinti senstančių ląstelių vaidmenį ir ypač specifinį išeikvojimo laiką. Įrodymai rodo, kad senolitikai gali paskatinti SA-β-gal ekspresiją ląstelių kultūroje [70]. Be to, senolitinių junginių ABT-737 arba dasatinibo ir kvercetino (DQ) skyrimas in vivo sukelia apoptozę senstančiose ląstelėse ir pašalina pelės odą, plaučius ir hematopoetinę sistemą, o vėliau pagerina audinių atstatymą [70–73]. Be to, DQ vartojimas skatina senų pelių transplantacijų išgyvenimą [74].

Apibendrinant, šie tyrimai išryškina priešingą senstančių ląstelių vaidmenį sužalojimui ir taisymui bei jų funkcijų skirtumus dėl sužalojimo laiko, laipsnio ir tipo. Iš tiesų, vis daugiau įrodymų rodo, kad ląstelių senėjimas yra daugiapakopis, dinamiškas procesas, progresuojantis nuo laikinos iki stabilios ląstelių ciklo sustabdymo būsenos, o tai lemia rezultatą [75].

2.4. Su senėjimu susijusio sekrecinio fenotipo vaidmuo audinių atstatyme

Be to, be tiesioginio poveikio ląstelių dalijimuisi ir klirensui, pagrindinis mechanizmas, kuriame senstančios ląstelės daro įtaką sužalojimui, yra SASP. SASP sekrecija apima daugybę tirpių signalų, galinčių turėti įtakos audinių uždegimui, atstatymui ir fibrozei, įskaitant IL-1, IL-8, IL-6 ir transformuojantį augimo faktorių beta (TGF).β). SASP yra priešuždegiminis atsakas, kuris suaktyvina ir sustiprina senėjimo fenotipą aplinkinėse ląstelėse, todėl tarpininkauja senėjimo plitimui visame audinyje, žinomas kaip „pašalinio senėjimas“. Per kintamą citokinų ir chemokinų rinkinį parakrininis senėjimas sukeliamas ir palaikomas mechanizmais, kurie sukuria reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) ir atsaką į DNR pažeidimą (DDR) [76]. Pavyzdžiui, buvo įrodyta, kad parakrininis senėjimas sustiprina tulžies pažeidimą ir sutrikdo kepenų regeneraciją [47]. Iš dalies pašalinus SASP, per TGFβ slopinimas, padidėja hepatocitų proliferacija, sumažėja fibrozė ir pagerėja bendra kepenų funkcija. Priešingai, Demaria naudojamo odos pažeidimo pelės modelyje ir kt., autoriai nustatė teigiamą SASP poveikį [60]. Įdomu tai, kad išskiriant SASP faktorių PDGF-AA, buvo nustatyta, kad odos žaizdų uždarymas paspartėjo, skatinant miofibroblastų diferenciaciją ir granuliacinio audinio susidarymą.

Iš tiesų, kai pirmą kartą buvo tiriamas SASP, jo vaidmuo sužalojimams ir gydymui nebuvo gerai suprantamas, nes komponentai atrodė daugiausia priešuždegiminiai. Nuo tada buvo pasiūlyta, kad senėjimas gali pabloginti regeneraciją per parakrininį signalizavimą, todėl kaimyninės ląstelės negali kompensuoti žalos, todėl sustiprėja fibrozė ir sumažėja regeneracinio atsako pajėgumas [47]. Tačiau atrodo, kad ryškūs uždegiminiai komponentai ir žalingos pasekmės dažniausiai atsiranda, kai SASP yra ilgalaikis ir gali būti naudingas, kai yra trumpalaikis, todėl vaidina svarbų vaidmenį audinių rekonstrukcijoje ankstyvosiose traumos stadijose. Tiesą sakant, 2017 m ir kt. [29] parodė, kad esant ūminiam ir lėtiniam sužalojimui, SASP faktoriaus IL-6 išsiskyrimas iš senstančių ląstelių leido perprogramuoti raumenų palydovines ląsteles, o tai rodo SASP vaidmenį palengvinant ląstelių plastiškumą ir atstatymą. Svarbu tai, kad tai rodo naudingą SASP vaidmenį skatinant kamieninių ląstelių populiacijų ląstelių plastiškumą ūminio raumenų pažeidimo metu, taip pat patologinėje raumenų pablogėjimo aplinkoje [29].

2.5. Ląstelių senėjimas esant pluripotencijai

Be minėtų išvadų, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad perprogramavimo veiksniai OCT4, SOX2, KLF4 ir cMYC gali sukelti ląstelių senėjimą ir IL-6 gamybą. in vivo, o tai lemia efektyvesnį perprogramavimą [77]. Be to, SASP gali skatinti regeneracinį atsaką, sukeldamas somatinių kamieninių / progenitorinių ląstelių plastiškumą ir kamieniškumą [78]. Rička ir kt. [78] parodė, kad laikinas SASP poveikis pirminiuose pelių keratinocituose padidino kamieninių ląstelių žymenų ekspresiją ir regeneracinį pajėgumą. in vivo. Tačiau ilgalaikis SASP poveikis sukėlė senėjimo sustojimą, kuris atstojo regeneracinius stimulus [78]. Taigi buvo pasiūlyta, kad sužalojimo atveju senstanti ląstelė naudoja SASP, kad sukeltų gretimų ląstelių plastiškumą ir kamieniškumą, kad būtų galima pakeisti senstančią ląstelę, kai ji išvalyta, ir paskatinti audinių regeneraciją [25]. Tačiau svarbu pažymėti, kad kai šis procesas yra nekontroliuojamas, su senėjimu susijęs perprogramavimas gali sukelti naviko formavimąsi, skatindamas vėžio kamieną [79]. Priešingai, SASP faktoriai, kuriuos išskiria senstančios širdies progenitorinės ląstelės (CPC) per parakrininę signalizaciją, sukelia kitaip sveikų CPC senėjimą. Šiame kontekste senstančių ląstelių pašalinimas iš senų pelių arba pelių, gydytų senolitikais, panaikino SASP ir sukėlė nuolatinių CPC aktyvavimą ir proliferuojančių Ki-67 EdU+ kardiomiocitų skaičiaus padidėjimą, o tai rodo, kad senstančių pašalinimas. ląstelės gali palengvinti blogėjimą po širdies pažeidimo ir prisidėti prie širdies gebėjimo atsinaujinti [58]. Be to, senėjimo efektorių p53 ir p16 INK4a ištrynimas pagerina žmogaus fibroblastų perprogramavimo į iPSC efektyvumą, o tai rodo, kad šioje aplinkoje senėjimas neigiamai veikia plastiškumą [80]. Svarbu tai, kad šie skirtumai, ar senstančios ląstelės yra naudingos / kenkia regeneracijai, pabrėžia senėjimo programos aktyvavimo laiko svarbą ir jos kintantį vaidmenį įvairiais atsako į žalą etapais.

Iki šiol žinoma, kad SASP vaidina svarbų vaidmenį embriono vystymesi, žaizdų gijimui ir naviko augimui, o tai rodo, kad SASP atlieka sudėtingesnius fiziologinius vaidmenis, nei mes šiuo metu suprantame (apžvelgta [81, 82]). Kartu šie tyrimai rodo, kad senstančios ląstelės vaidina svarbų vaidmenį audinių pažeidime ir regeneracijoje ir gali skatinti ir slopinti audinių atstatymą. Tiesiog teigiamą senstančių ląstelių pašalinimo poveikį įrodo aplinkybės, kai senstančios ląstelės kaupiasi ir sukelia neigiamų pasekmių. Ir atvirkščiai, trumpalaikė senstančių ląstelių banga vaidina svarbų vaidmenį skatinant taisymą ankstyvosiose sužalojimo stadijose. Apskritai šios išvados patvirtina supratimą, kad senėjimo programa gali būti naudingas regeneracinis procesas, tačiau, kai ji yra sutrikdyta, ji gali atlikti žalingą vaidmenį. Pavyzdžiui, nors ūmus senėjimas neabejotinai atlieka svarbų vaidmenį užkertant kelią piktybiniams navikams ir skatinant sėkmingą audinių atstatymą, chroniškai senstančių ląstelių kaupimasis dar labiau prisideda prie sužalojimų, ligų ir senėjimo.

3. Makrofagų vaidmuo audinių pažeidime

Nors buvo įrodyta, kad daug įvairių ląstelių tipų vaidina svarbų vaidmenį sužalojimui ir atstatymui, pastaraisiais metais ypatingas susidomėjimas makrofagais atsirado dėl skirtingų makrofagų populiacijų indėlio ir jų plastiškumo sužalojimo kontekste. Taigi pastaraisiais metais ypatingas dėmesys buvo skiriamas įvairių makrofagų būsenų ir pogrupių identifikavimui daugelyje skirtingų organų sistemų ir skirtingam jų vaidmeniui sužalojimui ir taisymui. Makrofagai yra labai svarbūs salamandros [83] galūnių regeneracijai ir zebražuvių [84] uodegos pelekų regeneracijai (3 pav.). Be to, makrofagai glaudžiai sąveikauja su aplinka, integruodami invazinių patogenų, komensalinių bakterijų signalus, taip pat specifines audinių funkcijas, todėl makrofagai itin gerai prisitaiko prie vietinės aplinkos ir taip įgyja specifinių organų funkcijų [85, 86]. Makrofagų populiacijos, esančios įvairiuose kūno audiniuose, vadinamos „audinuose gyvenančiais“ makrofagais ir daugiausia gaunamos iš trynio maišelio embriogenezės metu (apžvelgta [87]). Kaip ilgaamžės ląstelės, audiniuose gyvenantys makrofagai yra ypač svarbūs, nes jie stebi ir „įsimena“ praeities ir dabarties įvykius audinyje, o tai atlieka svarbų vaidmenį jų plastiškumui. Be to, buvo įrodyta, kad šie makrofagai gali iš naujo reguliuoti savo elgesį, tikriausiai dėl epigenetinių modifikacijų [88, 89]. Todėl audiniuose gyvenantys makrofagai yra labai svarbūs palaikant audinių homeostazę.

3 pav. Regeneracijos gyvūnų modeliai parodė makrofagų ir senstančių ląstelių sąveiką audinių regeneracijos metu. Ląstelių senėjimo indukcija sukelia su senėjimu susijusį sekrecinį fenotipą (SASP) per salamandros galūnių regeneraciją, zebrafinio pelekų regeneraciją ir gimdos regeneraciją po gimdymo. Nesant makrofagų, atsinaujinančios salamandros galūnės senstančios ląstelės nėra išvalytos, o tai yra galima sutrikusios regeneracijos priežastis (pilka brūkšninė rodyklė) [48]. Senstančių ląstelių arba makrofagų pašalinimas zebrafinių žuvų regeneracijos metu turi žalingą poveikį regeneracijai, spėjama, kad pakeičiama griežtai reguliuojama ląstelių senėjimo pusiausvyra (brūkšninės pilkos rodyklės) [125]. Žinduolių gimda po gimdymo iš esmės pertvarkoma, kai senstančias ląsteles paprastai išvalo makrofagai. Trūkstant makrofagų, senstančios ląstelės kaupiasi gimdoje [126], o tai greičiausiai sukelia nereguliuojamą regeneraciją ir funkciją (brūkšninė pilka rodyklė). Sukurta naudojant Biorender.com.

Reaguojant į audinių pažeidimą, uždegimas sukelia pradinį neutrofilų antplūdį, kurį lydi monocitų kilmės makrofagai, kurie išvalo ląstelių šiukšles ir koordinuoja ląstelių procesus, kad inicijuotų audinių atstatymą. Svarbu tai, kad šis procesas sukelia bendrą makrofagų telkinio audiniuose esančių makrofagų praskiedimą, o tai dar labiau pablogina infiltruojančių makrofagų, kurie pritaiko savo funkciją prie aplinkinių vietinės mikroaplinkos ženklų, dauginimasis. Taigi daugybė tyrimų nustatė, kad specializuoti monocitų ir makrofagų vaidmenys ir jų aktyvavimo laikas yra labai svarbūs įvairiuose audinių atstatymo, regeneracijos ir remodeliavimo etapuose [52,54].

3.1. Makrofagų fenotipai

Anksčiau makrofagai buvo plačiai suskirstyti į dvi kategorijas: M1 (klasikiškai aktyvuotas) ir M2 (alternatyviai aktyvuotas), atsižvelgiant į jų uždegimines ir priešuždegimines / reparacines funkcijas. Šiais laikais dvejetainė M1/M2 klasifikacija paprastai laikoma per daug supaprastinta daugybės esamų makrofagų populiacijų įvairovė. in vivo, ir iki šiol buvo toliau suskirstyti pagal jų genų ekspresijos profilius [90, 91]. Nepaisant to, priešuždegiminiai makrofagai paprastai siejami su aukšto lygio priešuždegiminių citokinų ekspresija, gebėjimu tarpininkauti atsparumui patogenams, gaminti reaktyvius azoto ir deguonies tarpinius produktus ir skatinti. Th1 atsakymai [92]. Kita vertus, reparaciniai makrofagai pasižymi savo vaidmeniu audinių remodeliavime ir taisyme, imuninės sistemos reguliavime, skalbimo ir fagocitiniais gebėjimais [93], taigi, daugiausiai atlieka priešnavikines ir imunoreguliacines funkcijas (apžvelgta [94]).

Nenuostabu, kad buvo įrodyta, kad priešuždegiminiai makrofagai palaiko audinius žalojančius uždegiminius atsakus, o šių ląstelių buvimas buvo susijęs su įvairiomis uždegiminėmis ir fibrozinėmis ligomis. Priešuždegiminių makrofagų vaidmuo buvo ypač gerai ištirtas nugaros smegenų pažeidimo modeliuose, kai buvo įrodyta, kad makrofagai lengvai kaupiasi pažeidimo vietoje. Šiuose modeliuose makrofagų aktyvacija ir poliarizacija, priklausomai nuo mikroaplinkos pokyčių, parodė, kad ilgalaikis priešuždegiminių makrofagų įdarbinimas palengvina aksonų nykimą ir gali iš esmės atitolinti regeneracinį atsaką [95] ir jų mirtį. savo vietoje dar labiau prisideda prie audinių pažeidimo [96]. Be to, aksonų augimo inhibitorių buvimas yra žymiai didesnis priešuždegiminiuose makrofaguose, o tai rodo, kad šios ląstelės gali aktyviai prisidėti prie regeneracijos slopinimo po nugaros smegenų pažeidimo [97]. Be to, kepenų tyrimai taip pat parodė, kad uždegiminiai makrofagai pablogina pažeidimą, kai kepenų nekrozės vietose stebimas uždegiminių makrofagų padidėjimas [98, 99]. Tai taip pat pastebėta ūminio inkstų pažeidimo metu, kai ankstyvų, priešuždegiminių makrofagų slopinimas pagerina inkstų funkciją [100] (2 pav.). Tačiau svarbu pažymėti, kad priešuždegiminiai makrofagai taip pat gali prisidėti prie procesų, dėl kurių atsigauna. Tai buvo pastebėta skeleto raumenų pažeidimo modeliuose, kai monocitų / makrofagų kaupimosi slopinimas pablogina raumenų regeneraciją [63, 64] ir širdies regeneraciją, kai dėl makrofagų išeikvojimo keičiasi miofibroblastų infiltracija ir neovaskuliarizacija, o vėliau – skilvelių išsiplėtimas ir mirtingumas. 65] (2 pav.). Taigi, norint optimaliai ištaisyti po sužalojimo, tikriausiai reikalinga tinkama priešuždegiminių ir priešuždegiminių makrofagų pusiausvyra.

3.2. Makrofagų išeikvojimo ir atstatymo tyrimai

Galbūt nenuostabu, kad visiškas makrofagų išeikvojimas taip pat kenkia audinių atstatymui. Kepenų audinių pažeidimo modelių išeikvojimo tyrimai parodė, kad pelėms, kurių makrofagų išeikvota, nepavyksta visiškai reaguoti į citokinus, o tai vėliau sutrikdė kepenų regeneraciją [52]. Tikėtina, kad taip yra dėl priešuždegiminių, regeneruojančių makrofagų, kurie atlieka svarbų vaidmenį skatinant audinių atstatymą, praradimo. Šias makrofagų populiacijas iš dalies apibrėžė jose gaminamas priešuždegiminis citokinas IL-10, kuris veikia kaip svarbus priešuždegiminis mediatorius, būtinas priešuždegiminiam aktyvumui palaikyti [101]. Įdomu tai, kad ankstyvos uždegiminės žarnyno ligos modelyje IL-10 receptorių (IL-10R) praradimas sukėlė spontanišką kolito išsivystymą [102], o tai rodo, kad IL-10R signalizacija žarnyno makrofaguose yra svarbus veiksnys. žarnyno uždegimui kontroliuoti. Be to, nors pelėms, kurioms trūksta IL-10, odos žaizdų gijimas pagreitėja, dėl pagreitėjusio epitelizacijos ir žaizdos susitraukimo makrofagų infiltracija buvo žymiai padidėjusi [103], o tai dar labiau padidino IL-10 signalų perdavimą uždegimui.

Be to, naujausias Podaru straipsnis ir kt. [104] parodė, kad funkcinių „reparatyvinių makrofagų“, gautų iš kaulų čiulpų mononuklearinių ląstelių, transplantacija pelių miokardo infarkto modelyje žymiai pagerino funkcinį atsigavimą. Čia autoriai nustatė, kad reparacinių makrofagų transplantacija sustiprino miokardo audinių atstatymą, skatindama kraujagyslių susidarymą ir sumažindama kardiomiocitų hipertrofiją bei intersticinę fibrozę. Įdomu tai, kad tokių reparacinių makrofagų transplantacija taip pat padidino jų iš šeimininko kilusių kolegų skaičių, o tai iš dalies tarpininkavo TGF.β sekrecija [104]. Be to, po hepatocitų mirties kepenų pažeidimo metu, makrofagams pasisavinus šiukšles, atsiranda Wnt3a, kuris vėliau sukelia kanoninį WNT signalizavimą netoliese esančiose kepenų progenitorinėse ląstelėse, palengvindamas jų diferenciaciją į hepatocitus ir taip prisidedant prie regeneracinio atsako [105]. Taigi, uždegiminių ląstelių sukeltas citokinų signalizavimas vaidina neatsiejamą vaidmenį regeneruojant ir skaidant audinius.

Neseniai buvo įrodyta, kad mažos tarpląstelinės pūslelės (sEV), gautos iš M2 kaulų čiulpų kilmės monocitų (BMDM), gali susilpninti nugaros smegenų pažeidimą (SCI). SEV tarpininkauja parakrininei signalizacijai ir yra svarbūs reguliuojant ląstelių funkciją [106]. Čia buvo nustatyta, kad SEV iš M2 BMDM apsaugo SCI pelių neuronus, slopindami mTOR kelią ir sustiprindami neuronų autofaginį gebėjimą, todėl sumažina apoptozę. in vitro ir in vivo. Nustatyta, kad tai įvyko dėl mikroRNR miR-421-3p, kuris reguliuoja mTOR kelią M2 BMDM-sEV viduje, pernešimo [107]. Šis tyrimas pirmą kartą parodė, kad iš M2 gauti BMDM yra svarbūs saugant neuronus ir palengvinant atsigavimą po SCI, taip pat pabrėžiant, kad tai vyksta perkeliant SEV. Be to, šis tyrimas dar labiau išaiškina naudingus M2 makrofagų vaidmenis traumos metu ir nurodo mechanizmą, kuriuo jie atlieka apsauginę / atkuriamąją funkciją.

Įdomu tai, kad buvo įrodyta, kad tokie priešuždegiminiai makrofagai ne tik skatina audinių atstatymą, bet ir antagonizuoja priešuždegiminių makrofagų funkciją bei kovoja su jų profibrotinėmis galimybėmis [108, 109]. Taigi makrofagų sąveika / bendradarbiavimas su įvairių tipų ląstelėmis, įskaitant tas, kurios dalyvauja pradinėje uždegimo fazėje, yra gyvybiškai svarbios. Neseniai buvo įrodyta, kad neutrofilai taip pat atlieka esminę kepenų atkūrimo funkciją, skatindami priešuždegiminių Ly6C hi CX3CR1 lo monocitų / makrofagų fenotipinį pavertimą pro-reparatyviniais Lyc6 lo CX3CR1 hi makrofagais. Be to, nustatyta, kad ši konversija priklauso nuo reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) ekspresijos iš neutrofilų [110, 111]. Įdomu tai, kad šis tyrimas parodė neutrofilų ir makrofagų bendradarbiavimą ir jų sąveikos svarbą uždegimui ir audinių atstatymui [111]. Tai patvirtina besikaupiančius įrodymus, kad monocitų kilmės makrofagai gali patirti tiek fenotipinį, tiek funkcinį perėjimą, kad paskatintų audinių regeneraciją ir gijimą [112, 113].

Galiausiai makrofagų aktyvumas skirtingose ​​audinių pažeidimo fazėse yra svarbus audinių atstatymui. Selektyviai mažinant makrofagų populiacijas Duffieldas ir kt. [52] parodė, kad sužalojimo ir taisymo metu makrofagai atlieka skirtingus, priešingus vaidmenis. Tiksliau, Ccl4 sukelto grįžtamojo kepenų pažeidimo pelės modelyje makrofagų išeikvojimas pažengusios fibrozės metu sumažino randus. Tačiau jei makrofagai buvo išeikvoti remonto laikotarpiu, tai lėmė matricos skilimą ir nuolatinį fibrozinio atsako aktyvavimą. Svarbu tai, kad tai parodė, kad makrofagai atlieka ir sužalojimus sukeliančias, ir taisymą skatinančias užduotis (2 pav.) ir kad tame pačiame audinyje egzistuoja funkciškai skirtingos makrofagų subpopuliacijos, kurios atlieka svarbų vaidmenį įvairiose sužalojimo / atsigavimo fazėse [52]. Be to, makrofagų išeikvojimas ankstyvosiose odos žaizdų atstatymo stadijose atitolino pakartotinį epitelizaciją, todėl sumažėjo randų susidarymas, o išeikvojimas vidurinėje naujų audinių formavimo fazėje sutrikdė žaizdos uždarymą. Svarbiausia, kad išeikvojimas vėlyvose atkūrimo stadijose neturėjo įtakos bendram atstatymo atsakui, o tai rodo, kad makrofagai atlieka skirtingas ir skirtingas funkcijas odos atstatymo fazėse [54,114] (2 pav.). Galiausiai, tokie tyrimai kaip šie rodo, kad makrofagai atlieka skirtingas ir skirtingas funkcijas skirtinguose atkūrimo ar regeneracijos procesų etapuose, o tai yra labai svarbus atradimas, jei ateityje norime terapiškai manipuliuoti makrofagų funkcija, kad pagerintume organų regeneraciją.

4. Senstančių ląstelių ir makrofagų sąveika regeneruojant ir taisant audinius

Dabar žinoma, kad senėjimas vaidina svarbų vaidmenį daugelyje skirtingų audinių pelių embriono vystymosi metu [23, 24]. Tai apima mezonefrinius kanalėlius mezonefros involiucijos metu (inkstų ir sėklidžių vystymasis), vidinės ausies endolimfinį maišelį, galūnių viršūninį ektoderminį keterą, regresuojančius rankų ir pėdų tarpupirščius ir nervinio nervo uždarymą. vamzdis [23]. Iš tiesų, yra įrodymų, kad senstančias pelių vystymosi ląsteles E13.5–14.5 dienomis supa makrofagai ir kad makrofagų infiltracija lemia senstančių ląstelių klirensą ir audinių remodeliavimąsi [23, 97]. Svarbu tai, kad vystymosi metu stebimi procesai suteikia mums unikalią įžvalgą apie mechanizmus, skatinančius regeneraciją ir atstatymą po traumos suaugus, ir yra pradinis taškas manipuliuojant tokiais procesais. in vivo.

4.1. Senstančių ląstelių stebėjimas makrofagais

Makrofagų vaidmuo valant senstančias ląsteles buvo žinomas daugiau nei dešimtmetį [115]. Kadangi senstančios ląstelės per SASP išskiria daug citokinų ir chemokinų, nenuostabu, kad vis daugiau tyrimų palaiko nuo makrofagų priklausomą priežiūros mechanizmą, kuris veikia tiek normaliuose, tiek atsinaujinančiuose audiniuose. Iš tiesų, atrodo logiška, kad senstančių ląstelių skaičius turi būti atidžiai stebimas, siekiant išlaikyti audinių homeostazę ir sušvelninti ir (arba) užkirsti kelią neigiamam senstančių ląstelių kaupimosi poveikiui. Pirmieji įrodymai, kad imuninė sistema dalyvauja stebint senstančias ląsteles, buvo gauti 2007 m. iš Xue. ir kt. [116], kurie atskleidė, kad p53 reaktyvacija p53 trūkumo augliuose lėmė visišką naviko regresiją. Nustatyta, kad tai nulėmė uždegiminių citokinų reguliavimas ir įgimto imuninio atsako aktyvavimas [116]. Po to buvo įrodyta, kad imuninių ląstelių, įskaitant makrofagus, vaidmuo yra svarbus pašalinant senstančias ląsteles kepenų pažeidimo modeliuose, taip pat siekiant išvengti pernelyg didelės žalingos fibrozės ir sprendžiant kepenų fibrozę [117]. Be to, buvo įrodyta, kad senstančios kepenų žvaigždžių ląstelės išskiria SASP, kuris pritraukia makrofagus [118]. 2013 metais Lujambio ir kt. parodė, kad p53 ekspresuojančios žvaigždžių ląstelės išskiria IFN-γ ir IL-6, kurie skatina Kupfferio makrofagus, o infiltruoti makrofagai poliarizuojasi link naviko slopinimo M1 būsenos, galinčios nukreipti senstančias ląsteles kultūroje. Tačiau senstančiose žvaigždžių ląstelėse, kuriose trūksta p53, buvo gaminamas IL-4, dėl kurio makrofagai poliarizavosi link išgyvenimą skatinančio M2 fenotipo [119]. Taigi, šie įrodymai rodo, kad senstančios ląstelės gali sukelti fenotipinius makrofagų pokyčius, kurie gali turėti įtakos jų funkcionalumui. Įdomu tai, kad mezenchiminės kamieninės ląstelės (MSC) taip pat atlieka reguliuojantį vaidmenį perkeldamos vietinius makrofagus nuo uždegimą skatinančio fenotipo prie audinių reparacinio fenotipo [120,121], o jei makrofagų nėra, naujagimiai praranda gebėjimą regeneruoti miokardą po miokardo. infarktas [122].

Be to, senstančios ląstelės taip pat gali sukelti adaptyvų imuninį atsaką, kai jas pašalina CD4+ T ląstelės ir monocitai/makrofagai. Tai buvo įrodyta kepenyse, kur prieš piktybinius senstančius hepatocitus pašalina CD4+ T ląstelės, kurioms reikia monocitų/makrofagų, pabrėžiant imuninių ląstelių kryžminio pokalbio svarbą senstančių ląstelių klirensui [123]. Be to, kepenų vėžio modelyje buvo įrodyta, kad senstančių ląstelių stebėjimas reikalauja CCR2+ mieloidinių ląstelių įdarbinimo ir brandinimo, o CCR2 abliacija sukėlė kepenų ląstelių karcinomų augimą [124].

4.2. Senstančios ląstelės ir makrofagų sąveika regeneracijos metu

Norėdami toliau tirti šias sąveikas, 2015 m. Yun ir kt. [48] ​​parodė, kad makrofagai buvo labai svarbūs senstančių ląstelių klirensui, suteikdami pirmuosius įrodymus, kad senėjimo stebėjimo mechanizmai veikia normalios regeneracijos metu. Čia autoriai įrodė, kad salamandros galūnių regeneracijos metu buvo reikšminga ląstelių senėjimo indukcija, nurodant jo, kaip normalių regeneruojančių audinių regeneracijos mechanizmo, svarbą. Be to, Yun ir kt. taip pat pranešė, kad stiprus SASP parašas blastemose sutapo su stipriu senstančių ląstelių indukcijos piku (3 pav.), o tai rodo, kad tai gali turėti parakrininį poveikį regeneracijai ir makrofagų cheminei traukai [48]. Svarbiausia, kad atsinaujinančiose galūnėse makrofagai ir senstančios ląstelės randamos arti viena kitos. Priešingai, klodronato sukeltas makrofagų ištrynimas lemia senstančių ląstelių išlikimą galūnių regeneracijos metu [48]. Tai patvirtina, ataskaitos apie kitus modeliinius organizmus, tokius kaip zebrafish, parodė neigiamą makrofagų abliacijos poveikį zebrafijos pelekų regeneracijos metu [84]. Tai buvo toliau tiriama 2020 m. Da Silva-Álvarez atliktame tyrime ir kt., kurie parodė, kad po zebrafish sužalojimo pažeidimo vietoje buvo senstančių ląstelių ir kad jų pašalinimas sutrikdė regeneraciją [125] (3 pav.). Be to, senstančias ląsteles, kurios kaupiasi žinduolių gimdoje po gimdymo, efektyviai išvalo makrofagai po gimimo, o makrofagų išeikvojimas sukelia nenormalų senstančių ląstelių kaupimąsi [126] (2 pav.).

Todėl yra įtikinamų įrodymų apie senstančių ląstelių vaidmenį ir jų sąveiką su makrofagais audinių pažeidimo ir taisymo metu. SASP skatina makrofagų proliferaciją [127], o P16INK4a+ makrofagai kaupiasi senstant ir pablogina SASP [128]. Transkripcijos faktorius GATA4 stabilizuojamas ląstelių senėjimo metu, o tai savo ruožtu aktyvuoja NFκB, kad palengvintų SASP [129] (4 pav.). Tačiau iki šiol išlieka klausimų dėl mechanizmų, kuriais senstančios ląstelės sąveikauja su imunine sistema, įskaitant makrofagus, ir kaip tai sukelia arba užkerta kelią reparacinei reakcijai. Anksčiau buvo įrodyta, kad senstančios ląstelės savo ląstelės paviršiuje ekspresuoja NKG2D ligandus MICA ir ULBP2, todėl natūralios žudikų (NK) ląstelės leidžia jas atpažinti ir pašalinti. Be to, nustatyta, kad šių ligandų ekspresiją reguliuoja DNR pažeidimo atsakas ir ERK signalizacijos kelias dėl sužalojimo [131] (4 pav.).

4 pav. Senstančios ląstelės ir makrofagai bendrauja sudėtingais dvikrypčiais signalais audinių remodeliavimosi, taisymo, regeneracijos ir naviko atsiradimo metu. Senstančias ląsteles aptinka natūralių žudikų (NK) ląstelių imuninė priežiūra, kurią skatina ląstelių kontaktas, baltymų pernešimas, aktino polimerizacija ir citoplazminiai tilteliai, o tai galiausiai padeda atpažinti NK ląsteles ir T ląsteles [130]. Senstančios ląstelės savo ląstelės paviršiuje ekspresuoja ligandus MICA ir ULBP2, reaguodamos į DNR pažeidimus ir ERK signalus, kurie padeda NK ląstelėms juos pašalinti [131]. Be to, senstančios ląstelės dažnai ekspresuoja MHCII ir vimentiną, o tai leidžia atpažinti T ląsteles ir makrofagus [123, 132, 133]. Ir atvirkščiai, senstančios ląstelės gali išvengti aptikimo išreikšdamos signalą „nevalgyk manęs“ CD47, kuris, prisijungdamas prie slopinančio receptoriaus SIRP, slopina makrofagų fagocitozę.α [111] ir GATA4 stabilizuojasi ląstelių senėjimo metu, o tai savo ruožtu aktyvuoja NFκB, kad palengvintų SASP [129]. Makrofagai egzistuoja kaip audiniuose gyvenančios ląstelės arba yra kilę iš kraujo pernešamų monocitų ir gali būti poliarizuoti į priešuždegiminę arba proreparatyvią būseną. P16 Ink4a ir Sa ekspresijaβGal makrofaguose buvo susijęs su poliarizacija, o ne kaip parakrininio senėjimo pasekmė [128, 134, 135]. Makrofagų ekspresuojamas CCR2 yra labai svarbus senstančių ląstelių stebėjimui ir T ląstelių bei infiltruojančių makrofagų pašalinimui [124]. Normaliomis fiziologinėmis sąlygomis p53+ žvaigždžių ląstelės išskiria priešuždegiminius citokinus IFN-γ ir IL-6, kurie skatina Kupfferio ląstelių ir infiltruojančių makrofagų poliarizaciją link priešuždegiminės būsenos, kuri gali nukreipti į senstančias ląsteles. Ir atvirkščiai, senstančiose žvaigždžių ląstelėse, kuriose trūksta p53, gaminasi IL-4, todėl makrofagai poliarizuojami link išgyvenimą skatinančio fenotipo [119]. Su senėjimu susijęs sekrecijos fenotipas (SASP) padidina uždegiminių citokinų kiekį, suaktyvina imuninį atsaką ir senstančių ląstelių klirensą. Be šio klasikinio vaidmens, SASP taip pat sukelia ekstraląstelinį remodeliavimą (ECM), kuris prisideda prie pakitusio ląstelių pritraukimo ir pablogėjusios imuninių ląstelių prieigos prie senstančių ląstelių [136]. MHC molekulė HLA-E, kurią ekspresuoja senstančios ląstelės ir sukelia IL-6, sąveikauja su slopinančiu receptoriumi NKG2A, kurį ekspresuoja NK ląstelės ir T ląstelės, kad išvengtų stebėjimo, o šios sąveikos blokavimas pagerina imuninį atsaką prieš senstančias ląsteles. [137], tokiu būdu, kai ilgalaikis uždegimas taip pat prisideda prie senstančių ląstelių išlikimo. Sukurta naudojant Biorender.com.

4.3. Senstančios ląstelės ir makrofagai sąveikauja su senėjimu

Kitas neišspręstas klausimas yra tai, kas leidžia senstančioms ląstelėms kauptis senėjimo / sužalojimo metu ir kaip senstančioms ląstelėms pavyksta išvengti imuninės sistemos išvalymo. Pažanga atsakant į šį klausimą parodė, kad senstantys odos fibroblastai gali išvengti imuninės sistemos klirenso, ekspresuodami neklasikinę MHC molekulę HLA-E. HLA-E veikia sąveikaudama su slopinančiais NKG2 receptoriais, kuriuos ekspresuoja NK ląstelės ir CD8+ T ląstelės, kad slopintų imuninį atsaką prieš senstančias ląsteles (4 pav.). Autoriai nustatė, kad HLA-E ir NKG2A receptoriaus sąveikos blokavimas padidino imuninį atsaką prieš senstančias ląsteles. in vitro. Įdomu tai, kad jie nustatė, kad su SASP susijęs citokinas IL-6 sukėlė HLA-E ekspresiją nesenstančiose ląstelėse parakrininiu būdu [137]. Taigi IL-6 padidintas HLA-E ekspresijos reguliavimas rodo, kad ilgalaikis uždegimas taip pat gali prisidėti prie senstančių ląstelių išlikimo audiniuose, dar labiau prisidedant prie sužalojimo ar su amžiumi susijusių ligų patogenezės. Tai patvirtina faktas, kad IL-6 buvo gerai apibūdintas senėjimo metu [138] ir randamas vyresnio amžiaus pacientų serume, taip pat įvairiuose sužalojimų modeliuose [139, 140]. Be to, kaip pažymi autoriai, CD8+ T ląstelių, kurios yra NKG2C+, kitos slopinančių NKG2 receptorių izoformos, išsiplėtimas su amžiumi gali paaiškinti, kodėl imuninė sistema yra mažiau efektyvi valant senstančias ląsteles vyresnio amžiaus žmonėms. Todėl būtų įdomu nustatyti, ar CD8 + NKG2C + T ląstelių gausa / vaidmuo ūminio ir (arba) lėtinio pažeidimo metu pasikeitė.

Kitas svarbus audinių regeneracijos komponentas yra tarpląstelinė matrica (ECM) ir jos kryžminis pokalbis su aplinkinės mikroaplinkos ląstelėmis. Įdomu tai, kad žinoma, kad tirpus SASP sukelia ECM remodeliavimą ir standėjimą, o tai anksčiau buvo įrodyta, kad senėjimo metu keičia imuninių ląstelių įdarbinimą [136]. Tiesą sakant, ECM pokyčiai, atsirandantys dėl matricos standumo pokyčių, pablogina imuninių ląstelių prieigą prie senėjimo praturtintų audinių [136]. Be to, stromos ląstelės, tokios kaip fibroblastai, yra atsakingos už audinių struktūros reguliavimą per ECM nusėdimą, taip pat palaiko homeostazę išskiriant citokinus, chemokinus, augimo faktorius ir kitus pagrindinius signalinius baltymus [136] (4 pav.). Anksčiau aptarėme SASP svarbą išskiriant tirpius veiksnius, kurie daro įtaką aplinkinių audinių mikroaplinkai ir palaiko audinių homeostazę. Buvo pranešta, kad egzistuoja platus kryžminis pokalbis tarp su senėjimu susijusių stromos populiacijų, kurios, kaip žinoma, kaupiasi senėjimo metu, ir imunosupresinio fenotipo.

4.4. Makrofagų ir senstančių ląstelių paralelės

Be gerai dokumentuoto makrofagų fagocitinio vaidmens, neseniai pirmą kartą buvo įrodyta, kad chemoterapijos sukeltos senstančios ląstelės (CISC) gali įsisavinti tiek kaimynines senstančias ląsteles, tiek nesenstančias naviko ląsteles panašiame į makrofagus. mada. Svarbu pažymėti, kad toks elgesys buvo pastebėtas po chemoterapinio gydymo. Tačiau šį elgesį taip pat sukelia nutlin vartojimas, kuris aktyvuoja p53 nesukeldamas genotoksinio streso [141].Šis įspūdingas atradimas, kad senstančios ląstelės tinkamoje aplinkoje gali įgyti fagocitinį fenotipą, rodo galimą išgyvenimo pranašumą.

Šis naujai nustatytas senstančių ląstelių gebėjimas išryškina paraleles su makrofagais, kai tiek makrofagai, tiek senstančios ląstelės išskiria veiksnius, skatinančius matricos remodeliaciją ir imunomoduliaciją [142,143], ir išreiškiančius metabolinius žymenis, tokius kaip CD38 [144]. Iš tiesų buvo manoma, kad krūties vėžio ląstelių kanibalizmas vaidina svarbų vaidmenį skatinant senėjimą [141], todėl bus svarbu ištirti senstančių ląstelių kanibalizmo vaidmenį įvairiuose kontekstuose, įskaitant vystymąsi, senėjimą ir regeneraciją. /remontas. Visų pirma, bus įdomu nustatyti tokių ląstelių vaidmenį senėjančių ląstelių kaupime ir ar kanibalizmas gali turėti įtakos ląstelių klirensui po sužalojimo. Be to, bus labai svarbu nustatyti, kokių tipų ląsteles šios kanibalistinės ląstelės pirmenybę teikia ir ar yra tam tikrų savybių, lemiančių jų įsisavinimą, siekiant nustatyti, ar, jei tokios ląstelės egzistuoja už vėžio konteksto ribų, jos yra naudingos ar žalingos. regeneravimo ir taisymo procesui.

4.5. Senstanti imuninė sistema ir imunosenescencija

Kūnui senstant įgimta imuninė sistema pamažu silpsta – reiškinys dabar vadinamas imunosencencija [145], dėl kurio susilpnėja efektorinių imuninių ląstelių funkcija, o sveikų audinių atsinaujinimo greitis smarkiai sumažėja [146]. Dėl to senų audinių mikroaplinka kaupia senstančias ląsteles, tokias kaip su SASP susiję fibroblastai, ir įgyja imuninių infiltratų, tokių kaip imunosupresinės mieloidinės kilmės slopinančios ląstelės (MDSC) ir T reguliuojančios ląstelės, infiltraciją. MDSC yra nevienalytė mieloidinės kilmės ląstelių populiacija, kuri slopina T ląsteles išskirdama arginazę 1, TGF.β ir reaktyviosios deguonies rūšys (ROS), o T reguliuojančios ląstelės atlieka vaidmenį reguliuojant arba slopinant kitas imuninės sistemos ląsteles (apžvelgta [147]). Buvo pasiūlyta, kad šis audinių mikroaplinkos pokytis gali paskatinti patologinių būklių, tokių kaip vėžys, vystymąsi ir leisti plėstis vėžinėms ląstelėms, kurių nesulaiko imuninė sistema. Iš tiesų, lėtinio sužalojimo atveju tikrai gali būti, kad šis imuninės sistemos švelnumas arba sutrikusi imuninė priežiūra taip pat gali turėti panašų poveikį, pavyzdžiui, leidžiant kauptis senstančioms ląstelėms. Be to, žinoma, kad efektorinių T ląstelių, NK ląstelių, makrofagų ir dendritinių ląstelių imunosenescencija smarkiai sumažina jų citotoksinį aktyvumą ir infiltraciją į seną naviką skatinančią mikroaplinką [148]. Tai patvirtino pastebėjimas, kad vyresnio amžiaus žmonėms sistemiškai daugėja imunosupresinių M2 makrofagų ir N2 neutrofilų (apžvelgta [149]), o tai gali prisidėti prie imunosupresinio fenotipo atsiradimo. Tai buvo parodyta senėjimo indukcijos modelyje, naudojant fibroblastus, kurie pagreitina stromos palaikomą navikogenezę (FASST) pelę, kur autoriai pastebėjo senstančių ląstelių kaupimąsi, taip pat padidėjusį MDSC ir reguliuojančių T ląstelių skaičių, o tai nebuvo stebimas jaunesnio audinio mikroaplinkoje. Be to, šis MDSC ir T reg ląstelių skaičiaus padidėjimas sveikose pelėse buvo nustatytas greta senstančių ląstelių populiacijų ir buvo nustatytas pirmiausia dėl IL-6 sekrecijos [148]. Be to, perforino (Prf1), esminis senstančių ląstelių imuninės priežiūros komponentas, sukelia senstančių ląstelių kaupimąsi kepenyse [150] ir bendrai didėjant jų kaupimuisi su amžiumi, dėl ko atsiranda lėtinis uždegimas, fibrozė ir audinių pažeidimai [117]. Taigi šis trumpalaikio SASP ir senstančių ląstelių klirenso procesas jaunoms ir senoms pelėms natūralaus senėjimo proceso metu rodo labai aiškius panašumus su senėjimo programos atsiradimu ir senstančių ląstelių klirenso / kaupimosi ciklu atitinkamai ūminio ir lėtinio pažeidimo atveju. .

Gerai apibūdintas mechanizmas, kuriuo senstančias ir apoptotines ląsteles reguliuoja makrofagai, yra jų „valgyk mane“ signalai. Tačiau senstančios ląstelės dažnai išreiškia „nevalgyk manęs“ signalą CD47, ląstelės paviršiaus baltymą, kurį sukelia NF reguliavimas.κB, kuris sutrikdo makrofagų fagocitozę, prisijungdamas prie slopinančio receptorių signalą reguliuojančio baltymo alfa (SIRP).α) randamas makrofagų ląstelės paviršiuje. Ir atvirkščiai, senstančios ląstelės taip pat padidina MHC II klasės molekulių ekspresiją savo ląstelės paviršiuje, o tai padeda CD4+ T ląstelėms jas atpažinti [123,132]. Be to, neseniai buvo nustatyta, kad senstančios ląstelės savo ląstelių paviršiuje taip pat išreiškia oksiduotą vimentino formą, kuri galiausiai patenka į kraują, o tai rodo, kad oksiduotus baltymus gali atpažinti humoralinė įgimta imuninė sistema. Tai rodo, kad tokie baltymai yra senėjimo stebėjimo mechanizmo dalis, veikdami kaip „suvalgyk mane“ signalai, ir šis procesas gali susilpnėti su amžiumi [133]. Jau žinoma, kad modifikuotas vimentinas yra ekspresuojamas imuninių ląstelių, įskaitant apoptozinius neutrofilus [151–153] ir T ląsteles [154], paviršiuje, o tai galiausiai lemia makrofagų pašalinimą [155].. Be to, buvo nustatyta, kad apoptozinių ląstelių paviršiuje esantys radiacijos sukelti baltymai gali sąveikauti su vimentinu, esančiu gretimų fagocitų paviršiuje, todėl juos pašalina makrofagai [155]. Mechanizmų, reguliuojančių makrofagų fagocitinį gebėjimą ir vėlesnį senstančių ląstelių klirensą, supratimas bus gyvybiškai svarbus kuriant būsimus terapinius metodus, padedančius regeneruoti ir pagerinti sveikatos trukmę.

Senstančios ląstelės taip pat gali bendrauti su kaimyninėmis ląstelėmis per tiesioginį baltymų perdavimą. 2015 metais jį parodė Biranas ir kt. [130] kad baltymai buvo perkelti į NK ir T ląsteles ir kad šį procesą palengvino NK ląstelių imuninė senstančių ląstelių priežiūra, todėl jos suaktyvėjo ir padidino citotoksiškumą. Baltymų perdavimas griežtai priklausė nuo ląstelių ir ląstelių kontakto ir CDC42 reguliuojamos aktino polimerizacijos, o iš dalies tarpininkavo citoplazminiai tilteliai. Tai padidina galimybę, kad senstančios ląstelės gali naudoti tarpląstelinį baltymų pernešimą, kad paskatintų kaimyninių ląstelių senėjimą arba galbūt netgi skatintų išgyvenimą. Be to, gali būti, kad šis procesas gali būti svarbus regeneracijai, nes leidžia molekuliniams tarpininkams pernešti ląsteles tarp senstančių ir regeneruojančių ar palaikančių ląstelių. Iš tiesų, autoriai nustatė, kad, palyginti su įprastomis ląstelėmis, senstančios ląstelės pirmiausia naudoja tarpląstelinį baltymų pernešimą (IPT), kad reguliuotų savo pačių pasišalinimą imuninėmis ląstelėmis ir bendrautų su epitelio ląstelėmis. Siekiant tai patvirtinti, įvairūs kiti tyrimai parodė, kad IPT naudojamas imuniniams atsakams inicijuoti ir moduliuoti, kurie galiausiai palaiko ląstelių išgyvenimą [156–158]. Norint visapusiškai nustatyti medžiagos perkėlimą tarp makrofagų ir kitų imuninių ląstelių senėjimo ir regeneracijos / taisymo metu, reikia atlikti tolesnį tyrimą. Neseniai paskelbta tirpių baltymų ir egzosominių krovinių SASP faktorių proteominė duomenų bazė neabejotinai padės geriau suprasti ląstelių ryšį ir senėjimą [14].

Nors vis daugiau žinoma apie senstančių ląstelių ir makrofagų arba imuninės sistemos vaidmenį regeneruojant ir atkuriant, lieka daug atvirų klausimų. Pavyzdžiui, vis dar neaišku, ar patys makrofagai sensta dėl sužalojimo ir ar tai gali prisidėti prie senstančių ląstelių kaupimosi. Iš tiesų, nors dėl imuninės sistemos pažeidimo nepavyksta išvalyti senstančių ląstelių, o tai prisideda prie jų išlikimo audiniuose, tokį imuniteto nepakankamumą iš dalies gali lemti imuninės sistemos senėjimas, dėl kurio sutrinka imuninių ląstelių funkcija.. Salė ir kt. [128] anksčiau pranešė apie p16 INK4a ir Sa-β-Gal ekspresijos stebėjimą makrofaguose, o tai rodo, kad senstančios ląstelės gali paskleisti senėjimą imuninėms ląstelėms. Tačiau vėliau autoriai pranešė, kad šių žymenų ekspresija atsirado ne dėl senėjimo plitimo, o įgyjama kaip fiziologinio atsako į imuninius dirgiklius dalis [134]. Tai atitinka pranešimus, kad p16 INK4a dalyvauja makrofagų poliarizacijoje [135]. Taigi, ar imuninės ląstelės sensta traumos ar ligos metu, reikia toliau tirti, tačiau buvo pranešta, kad imuninių ląstelių funkcija laipsniškai mažėja, žinoma kaip imunosenescencija, kuri, kaip pranešta, prisideda prie senstančių ląstelių kaupimosi [159, 160]. Be to, jei makrofagai sensta, ar jie vis tiek išlaiko savo gebėjimą išvalyti tikslines ląsteles, įskaitant kitas senstančias ląsteles? Jei taip yra, tikėtina, kad makrofagai prisideda prie „uždegimo“ proceso, įskaitant imuninės sistemos senėjimą, ypač jei nustatyta, kad senstantys makrofagai skatina uždegimą skatinančią aplinką. Be to, svarstant terapinius metodus taip pat bus svarbu suprasti kitus mechanizmus, kuriais pažeidžiami makrofagai, dėl kurių pakinta jų funkcija ir (arba) fenotipas traumos metu.

4.6. Senstančių ląstelių kaupimasis ir patologija

Kiti neišspręsti klausimai yra tai, ar yra „lūžio taškas“, kuriame senstančios ląstelės turi kauptis, kol audinys tampa disfunkcinis, ir ar panašus procesas vyksta toje vietoje, kur makrofagai nepajėgia išvalyti senstančių ląstelių. Kaip minėta anksčiau, specifiniai mechanizmai, kuriais makrofagai sąveikauja su senstančiomis ląstelėmis, dar turi būti išaiškinti. Molekulinių mechanizmų, reguliuojančių šią sąveiką ir reguliuojančių makrofagų funkciją, supratimas bus labai svarbus gydymo progresui ir lėtinių ligų supratimui. Atsižvelgiant į senstančių ląstelių sąveiką su CD4+ T ląstelėmis, siekiant išvengti imuninės priežiūros, būtų naudinga toliau apibūdinti, ar egzistuoja panašūs mechanizmai tarp makrofagų ir senstančių ląstelių. Galiausiai, nors įvairūs tyrimai atskirai parodė skirtingų senėjimo programos komponentų vaidmenį regeneraciniame atsake, vis dar reikia atlikti išsamų tyrimą, susiejantį šiuos procesus. Nors trumpalaikis SASP yra naudingas regeneracijai, o ilgalaikis SASP signalizavimas skatina senstančių ląstelių kaupimąsi, atliktas išsamus SASP „bangų“ remonto / regeneravimo metu tyrimas, taškas, kuriame šis procesas tampa žalingas, ir tikslūs mechanizmai, reguliuojantys šį atsaką. ir kaip jie bendrauja tarpusavyje, vis dar trūksta.

5. Terapinė manipuliacija makrofagais audinių regeneracijai/atstatymui

Kaip aprašyta ankstesniuose skyriuose, makrofagų vaidmuo palaikant audinių homeostazę, išvalant senstančias ląsteles ir skatinant regeneraciją pradedamas geriau suprasti. Dėl įgimto makrofagų vaidmens šiuose procesuose, atsirandanti idėja gydyti ligas / su amžiumi susijusias patologijas, susijusias su senėjančių ląstelių kaupimu, patenka į manipuliavimo makrofagų funkcija sferą. Tokios idėjos apima Alzheimerio ligos [161], miokardo infarkto [162], vėžio [163] ir uždegiminių ligų [164], tokių kaip reumatoidinis artritas, gydymą makrofagų terapija.

5.1. Makrofagų inžinerijos metodai

Vienas iš būdų, kaip pasiekti terapinį metodą, yra sukurti makrofagus, kad būtų ignoruojami senstančių ląstelių paviršiuje esantys signalai „nevalgyk manęs“. Kaip minėta anksčiau, CD47-SIRPα ašis leidžia senstančioms ląstelėms išvengti imuninės sistemos pašalinimo, todėl šios ašies blokavimas gali būti veiksmingas gydymas nuo senstančių ląstelių kaupimosi senstant ir sužalojus. Molekulės, nukreipiančios į šią ašį, jau buvo sukurtos ir apima tas, kurios nukreiptos į CD47, taip pat konkrečiai į SIRPα, kartu su bispecifiniais nukreipimo agentais. Šių agentų naudojimas buvo gerai apibūdintas sergant vėžiu, kai šiuo metu anti-CD47 antikūnai yra klinikiniuose tyrimuose [111]. Atsižvelgiant į makrofagų vaidmenį blokuojant CD47 – SIRPα ašį, makrofagų, nukreiptų į CD47, projektavimas gali būti veiksmingas. Pavyzdžiui, panašiai kaip CAR-T ląstelės, chimeriniai antigeno receptoriai fagocitozei (CAR-Ps) yra sukurti taip, kad fagocituotų specifinius taikinius, ir buvo pasiūlyta, kad makrofagų, nukreiptų į CD47, inžinerija gali būti veiksminga priešnavikinė terapija [111]. Iš tiesų, šių makrofagų naudojimas gali būti veiksmingas pašalinant lėtinį senstančių ląstelių kaupimąsi po sužalojimo. Tačiau išlieka susirūpinimas dėl manipuliavimo CD47 – SIRPα ašimi terapiniam naudojimui, įskaitant, bet tuo neapsiribojant, sutarimą, kad CD47 – SIRPα sąveika, parodyta atliekant tyrimus su pelėmis, gali ne visiškai arba ne taip veiksmingai perteikti žmogui [165]. kad CD47 grupavimas taip pat gali turėti įtakos CD47 ir SIRPα sąveikai ir kad anti-CD47 neblokuojantis antikūnas 2D3 padidina CD47 klasterizavimą [166,167] ir reikšmingas CD47 funkcijas, kurios nepriklauso nuo SIRPα, kurios veikia SIRPγ. arba trombospondinas 1 (TSP1), galintis sukelti nepageidaujamą poveikį T ląstelėms [168, 169]. Kita galimybė yra padidinti makrofagų fagocitinį gebėjimą, didinant „suvalgyk mane“ signalus. Netinkama signalo „valgyk mane“ kalretikulino, ligando, reikalingo fagocitinių ląstelių įsisavinimo receptoriams aktyvuoti, ekspresija sukelia ląstelių atsparumą eferocitozei, o apoptozinių ląstelių nepavyksta išvalyti kaimyniniams makrofagams [170]. Dalis senų ir vėžinių ląstelių gali būti „paženklintos“ makrofagų išskiriamu kalretikulinu ir vėliau pašalinamos iš audinių [171]. Taigi, pernelyg didelė kalretikulino ekspresija senstančiose ląstelėse gali padėti padidinti fagocitozę ir makrofagų klirensą iš audinio. Trečias variantas yra alogeninių makrofagų naudojimas arba indukuotų pluripotentinių kamieninių (IPS) ląstelių makrofagų iš jaunų donorų skyrimas [172], tačiau nėra aišku, ar jauni makrofagai turi geresnį fagocitozės gebėjimą, o kai kuriuose tyrimuose teigiama, kad su amžiumi sumažėja gebėjimas [172]. 173], o kiti nenurodo skirtumo [174]. Be to, atrodo, kad skirtumai yra susiję su audiniu, iš kurio jie yra gauti, ir su tuo, ar jie yra audinyje, ar infiltruojantys [175]. Taigi, taikymas į makrofagus gali būti terapinė galimybė pašalinti senstančias ląsteles in vivo.

5.2. Senolitikai

Alternatyvus būdas išvalyti senstančias ląsteles yra naudoti vaistus, kurie naikina senstančias ląsteles, žinomus kaip senolitikai. Buvo įrodyta, kad senstančių ląstelių pašalinimas naudojant senolitinius vaistus, tokius kaip ABT-263, kurie veikia nukreipdami į apoptozės kelyje dalyvaujančius baltymus (pvz., BCL-xL ir BCL-2), sėkmingai pašalino senstančias ląsteles. in vitro ir in vivo [73 176]. Visų pirma, ABT-263, kuris signalizuoja per antiapoptotinius baltymus BCL-xL ir BCL-2, pasirodė esąs veiksmingas pašalinant senstančias ląsteles pelių modeliuose [73 177] ir šiuo metu atliekami 1 fazės klinikiniai tyrimai su vėžiu sergančiais pacientais [178]. . Be to, dasatinibas ir kvercetinas (DQ), kuris nukreiptas ne tik į BCL-2 šeimos narius, bet ir į HIF-1α, PI3-kinazę ir su p21 susijusius antiapoptotinius kelius [179], pasirodė esąs veiksmingas gerinant fizinę disfunkciją sergant idiopatinėmis plaučių ligomis. sergančių fibroze (IPF) [180]. Tačiau senolitikų naudojimas išlieka ribotas, daugiausia dėl specifiškumo, biologinio prieinamumo ir jų vartojimo būdo trūkumo. Iš tiesų, jei nustatoma, kad patys makrofagai sensta dėl sužalojimo, gali prireikti derinti darbą su senolitikais, įtraukiant tuos, kurie gali nukreipti makrofagus ir kitas ląsteles. Arba gydymas, aktyvuojantis genų tinklus, skatinantis „jaunesnį“ fenotipą makrofaguose, galėtų būti realus pasirinkimas. Tai ypač svarbu dėl lemiamo makrofagų vaidmens kuriant regeneracijai palankią aplinką, reikalingą audinių taisymui.

Kaip minėta anksčiau, nors senolitikai pasirodė esą veiksmingi žudant senstančias ląsteles, jie išlaiko plataus spektro aktyvumą, ypač atsižvelgiant į nevienalytį senėjimo programos pobūdį. 2020 metais Cai ir kt. [181] sukūrė naują provaistą, pavadintą SSK1, kuris yra specifiškai aktyvuojamas β-galaktozidazės (β-Gal) aktyvumo, kuris, kaip manoma, yra gerai dokumentuotas senstančių ląstelių žymeklis. Nustatyta, kad provaistas pašalina senstančias ląsteles, taip pat atkuria žemo laipsnio uždegimą ir atkuria kai kurias funkcijas. Todėl šis naujas vaistas yra selektyvesnis būdas ištrinti senstančias ląsteles iš įvairių ląstelių tipų ir audinių [181]. Nustatyta, kad provaistas ne tik sumažino senstančių ląstelių skaičių, bet ir sumažino SA-β-Gal teigiamų makrofagų skaičių pažeistuose plaučiuose ir senose kepenyse, o kartu sumažėjo su uždegimu susijusių citokinų. Tai rodo, kad pačių makrofagų pašalinimas gali būti naudingas. Čia svarbu atkreipti dėmesį į anksčiau minėtą Hallo tyrimą ir kt. kuriame autoriai pranešė, kad senstantys makrofagai buvo akivaizdūs jaunoms pelėms, visiškai dėl jų žymenų p16 INK4a ir β-galaktozidazės [128]. Tačiau vėliau buvo aprašyta, kad šių žymenų ekspresija yra makrofagų poliarizacijos ir atsako žymenys [134]. Svarbu tai, kad tai pabrėžia, kad reikia geresnių metodų imuninių ląstelių senėjimui nustatyti. Be to, kadangi senstančios ląstelės neturi vieno konkretaus universalaus žymens ir dėl savo dinamiško pobūdžio, kad jų žymenys laikui bėgant gali keistis, bet kokio vaisto, skirto vien tik senstančioms ląstelėms, specifiškumas yra problemiškas.

5.3. Genų inžinerijos metodai

Kadangi pačių makrofagų pašalinimas sukelia rimtų pasekmių, alternatyvus būdas yra pakeisti jų genų ekspresiją, kad būtų sukelti tam tikri fenotipai. Tai apima tam tikrų transkripcijos faktorių, pvz., IRF5, ekspresiją, kuri dalyvauja makrofagų poliarizacijoje link uždegiminio fenotipo, o tai savo ruožtu neleidžia gijimui ir skatina uždegimą. Taigi, manipuliavimas makrofagais, siekiant išreikšti žemesnį IRF5 lygį, gali būti daug žadanti strategija [182].Be to, mikroRNR ar kitų molekulių pristatymas naudojant tiekimo būdus, tokius kaip liposomos, gali būti perspektyvus genetinės manipuliacijos metodas, vertas tolesnio tyrimo [183, 184].

Kalbant apie genetinę manipuliaciją, įdomus senėjimo aspektas, kuris dar turi būti nuodugniai ištirtas, yra genų ekspresijos reguliavimas epigenetiniu lygiu. Įdomi regeneracinės medicinos idėja yra ta, kad pluripotencijos faktoriai gali būti išreikšti senstančiose ląstelėse, skatinant grįžimą į ląstelių ciklą ir modifikuojant genų ekspresijos profilius. Be to, buvo domimasi epigenetinių veiksnių naudojimu skatinant perprogramavimą, nes senstančios ląstelės turi represinę chromatino konfigūraciją, kuri, kaip manoma, stabiliai nutildo proliferaciją skatinančius genus, kartu suaktyvindama SASP. Visų pirma, histono modifikacijos, tokios kaip H3K27me3, buvo susijusios su SASP reguliavimu senstančiose ląstelėse [185]. Įdomu tai, kad neseniai atliktame tyrime taip pat buvo įrodyta, kad senėjimo programos aktyvinimas veda prie epigenetinio kraštovaizdžio pertvarkymo, įdarbinant BRD4, transkripcijos ir epigenetinį reguliatorių, kuris aktyvuoja naujai aktyvuotus super-stiprintuvus, esančius šalia SASP genų [186]. ]. Be to, buvo nustatyta, kad BRD4 yra labai svarbus SASP ir parakrininiam signalizavimui bei senėjimo imuninei priežiūrai. Svarbu tai, kad šis tyrimas atskleidė, kaip ląstelės gali suaktyvinti imuninę sistemą moduliuojančius genus, reikalingus parakrininei imuninei aktyvacijai ir naviko slopinimo imuninės priežiūros programai. Tai gali parodyti, kaip senstančios ląstelės reguliuojamos homeostazės metu, ir gali būti regeneracijos tikslai. Iš tiesų, BRD4 slopinimas sutrikdo imuninių ląstelių gebėjimą nukreipti ir pašalinti iki piktybines senstančias ląsteles. in vitro ir in vivo [186], rodantis šio metodo veiksmingumą.

5.4. Epigenetinis taikymas

Siekiant papildyti makrofagų genų inžineriją, nukreipimas į epigenetinius fermentus, veikiančius chromatiną senstančiose ląstelėse, taip pat gali būti veiksmingas būdas įjungti genų reguliavimo tinklus, susijusius su „jaunesne morfologija“, ir gali padėti reguliuoti SASP. Šis metodas yra daug žadantis, nes identifikuojant „pagrindinius reguliatorius“, jis leidžia reguliuoti daugybę sudėtingai tarpusavyje susijusių genų ir genų tinklų, o ne manipuliuoti mažais pogrupiais. Iš tiesų, žinoma, kad senstančios ląstelės pertvarko epigenetinį kraštovaizdį, kad paskatintų genų, susijusių su ląstelių gynyba ir uždegiminiu atsaku, ekspresiją, daugelis iš kurių apibūdinami kaip SASP dalis [17]. Be to, epigenetinio reguliavimo pokyčiai buvo susiję su imunosenescencija, nes Meninas skatina histono acetilinimą Bachas2 lokusą, taip slopindamas T ląstelių senėjimą, o vėliau ir imunosenescenciją [187]. Iš tiesų, šis metodas taip pat susijęs su makrofagais ir gali būti sėkmingas keičiant makrofagų poliarizaciją.

5.5. Makrofagų elgesio keitimas

Fagocitozė makrofaguose reguliuojama aktyvinant ir slopinant receptorių signalus. Aktyvuojantys makrofagų receptoriai siunčia fagocitinį signalą, kuris skatina „valgyti“ procesą. Svarbu tai, kad taikant senstančias ląsteles/makrofagus regeneracijos/remonto tikslais, svarbu pažymėti, kad optimalus rezultatas tikriausiai bus pasiektas kruopščiai, laiku ir subalansuotai manipuliuojant šiuo procesu. Iš tiesų, literatūroje atkreipiamas dėmesys į svarbų senstančių ląstelių vaidmenį inicijuojant ankstyvąsias atkūrimo stadijas ir makrofagų vaidmenį išvalant šias ląsteles per pirmąją trumpalaikę taisymo „bangą“. Tik neseniai buvo nustatyta, kad tirpus SASP turi dvi skirtingas funkcines stadijas, pirmoji stadija buvo labai priešuždegiminė stadija, praturtinta TGFβ. Taigi, šio proceso slopinimas, kaip parodyta ankstesniuose tyrimuose [188], greičiausiai turės neigiamą poveikį remontui. Tačiau makrofagų aktyvinimas vėlesniuose taškuose, kur kaupiasi senstančios ląstelės, greičiausiai bus naudingas. Iš tiesų, nustatyti laiko momentus, kada intervencija yra reikalinga / veiksmingiausia įvairiose organų sistemose, bus vienas iš sudėtingiausių aspektų kuriant veiksmingą terapiją.

6. Išvada, atviri klausimai ir perspektyvos

Nuo pirmųjų minčių, kad senėjimas buvo tik natūralus senėjimo rezultatas, mūsų supratimas apie senėjimo vaidmenį senėjimui ir žmonių ligoms labai pasikeitė. Dabar žinome, kad senėjimo programa atlieka sudėtingesnius vaidmenis, ypač audinių regeneravimo ir taisymo srityje, nei mūsų dabartinės žinios. Be to, per pastarąjį dešimtmetį taip pat buvo pradėtas rodyti esminis makrofagų vaidmuo remontuojant ir regeneruojant dėl ​​gerai pranešamo jų vaidmens traumos metu. Tačiau iki šiol lieka daug klausimų, susijusių su jų specifiniu vaidmeniu reguliuojant senstančias ląsteles po sužalojimo įvairiose organų sistemose, o tai apsunkina labai nevienalytis senėjimo programos pobūdis, kuris tiesiogiai veikia makrofagų funkciją. Taigi, kad būtų galima nukreipti senėjimą terapinėmis priemonėmis, reikia išspręsti keletą atvirų klausimų, pavyzdžiui, toliau pateiktų. (i) Kaip senstančios ląstelės sąveikauja su makrofagais ir kaip tai keičiasi skirtingose ​​regeneracinės reakcijos fazėse ar „bangose“? (ii) Kaip mikroaplinkos pokyčiai sukelia epigenetinius / genominius / fenotipinius makrofagų pokyčius? (iii) Kada senstančios ląstelės turi kauptis, kol makrofagai negali jų išvalyti, arba kada senstančios ląstelės pradeda vengti imuninės sistemos pašalinimo? Svarbu tai, kad atsakymai į šiuos klausimus geriau išsiaiškins, kaip senstančios ląstelės ir makrofagai veikia kartu sužalojimo ir taisymo kontekste, ir padės kurti gydymo priemones, skirtas senstančioms ląstelėms gydyti.


SIRP struktūros paaiškina suporuotų receptorių specifiškumą

Sudėtinga stuburinių gyvūnų imuninė sistema turi būti griežtai kontroliuojama, kad būtų galima reaguoti į patogeninį iššūkį nesukeliant nereikalingo šalutinio poveikio. Nors tirpūs žymenys, pvz., citokinai, leidžia imuninėms ląstelėms lokalizuotis infekcijos vietoje, specifinė baltymų: baltymų sąveika, susidariusi tarp ląstelių, tiksliai suderina imunologinį atsaką.

Signalą reguliuojantys baltymai (SIRP) yra ląstelių paviršiaus baltymų, daugiausia ekspresuojamų mieloidinėse ląstelėse, šeima, kurią sudaro trys nariai: SIRP, SIRPß ir SIRP [1]. Nors visų trijų tarpląstelinės sritys yra labai panašios, šių baltymų viduląsteliniai regionai nėra vienodi ir ląstelėms perduoda labai skirtingus signalus. SIRP&alpha atpažįsta CD47, daugumos ląstelių paviršiuje išreikštą baltymą, kuris veikia kaip molekulinis savęs&rsquo žymeklis, ir formuoja šią CD47/SIRP sąveiką. slopina ląstelių įsisavinimas makrofagais. Kita vertus, SIRPß nepripažįsta CD47, o SIRPß sąveika su jo (nežinoma) ekstraląsteliniu ligandu skatina makrofagų įsisavinimą. Nors SIRP atpažįsta CD47 su mažesniu afinitetu nei SIRP, jis išreiškiamas T-ląstelių paviršiuje, o ne makrofaguose, ir manoma, kad jis neturi tiesioginės signalizacijos funkcijos. Taigi SIRP apibūdina membraninių baltymų šeimų, vadinamų &bdquopored receptors&rdquo, klasę, kurią sudaro keli baltymai, turintys panašius tarpląstelinius regionus, bet radikaliai skirtingus transmembraninius / citoplazminius regionus, turinčius skirtingus (aktyvuojančius, slopinančius arba neutralius) signalizacijos potencialus.

Tarpląsteliniai SIRP regionai apima tris imunoglobulino (Ig) domenus linijinėje matricoje. Anksčiau buvome nustatę pirmojo (aminogalinio) SIRP Ig domeno struktūrą [2]. Naudodami vietinę mutagenezę parodėme, kad sąveiką su CD47 tarpininkavo SIRP N-galinės (apikos) kilpos, labiau panašios į tai, kaip antikūnai atpažįsta antigenus, o ne į bendruosius Ig domeno sąlygojamus ląstelė: ląstelės kontaktus.

Norėdami nustatyti tikslų mechanizmą, pagal kurį SIRP atpažįsta savo ligandą, mes išsprendėme N-galinio SIRP domeno struktūrą komplekse su vieninteliu CD47 ekstraląsteliniu Ig domenu dviem kristalų formomis, atlikdami molekulinį pakeitimą, naudodami duomenis, surinktus BM14 ir ID23-2. 74 paveiksle parodyta CD47/SIRP sąsaja, kuri skiriasi nuo kitų vidutinio afiniteto Ig domeno tarpininkaujamų ląstelių paviršiaus sąveikų, nes ji yra labai vingiuota, gerai priglundanti ir plati, abipusiai dalyvaujant kilpoms iš aminogalinių galų. tiek SIRP, tiek CD47.

74 pav.: Žmogaus SIRP struktūra komplekse su CD47. Rodomas penkių CD47 transmembraninių spiralių schematiškas vaizdas.

Priešingai nei SIRP, SIRPß ir SIRP suriša CD47 silpnai arba visai nesusieja, nepaisant to, kad jie dalijasi > 90% sekos tapatybe su SIRP. Mes išsprendėme SIRP N-galinių domenų ir dviejų SIRPß izoformų struktūras molekuliniu pakeitimu, naudodami duomenis, surinktus BM14. Šios struktūros demonstruoja išskirtinį SIRP sąveikos sąsajos selektyvumą. Apskritai SIRP , ß ir struktūros yra labai panašios (75 pav.). Tačiau abiem SIRPß izoformoms galima nustatyti specifinius aminorūgščių skirtumus SIRP atžvilgiu, dėl kurių SIRPß nesugeba surišti CD47. Be to, įvedę vieną aminorūgšties mutaciją į vienos SIRP&beta izoformos seką, galėjome suteikti galimybę surišti CD47 afinitetu, artėjančiu prie SIRP.

75 pav.: a) SIRPß ir SIRP superpozicija CD47 / SIRP kompleksas rodo, kad SIRP yra labai panašios struktūros. Tačiau tik SIRP suriša CD47 dideliu afinitetu. b) SIRP aminorūgščių polimorfizmo vietos (raudonos sferos) atsiskiria nuo CD47 / SIRP sąveikos sąsajos.

SIRP N-galo ligandą surišantis domenas turi daug didesnį sekos kintamumą nei dauguma kitų ląstelės paviršiaus receptorių. Šio sekos kintamumo susiejimas su CD47/SIRP komplekso struktūra rodo, kad dauguma SIRP&betaa polimorfizmų yra atokiau nuo sąveikos sąsajos (75 pav.), o tai reiškia, kad sekos kintamumas nemoduliuoja CD47 sąveikos stiprumo. Siūlome, kad šio sekos kintamumo varomoji jėga galėtų būti išvengti SIRP atpažinimo patogenų, o tai išnaudotų SIRP gebėjimą sumažinti makrofagų aktyvumą. Idėja, kad SIRP gali būti patogenų taikinys, yra ta, kad SIRPß galėjo evoliucionuoti taip, kad imituotų ekstraląstelinius SIRP regionus, jo struktūra panaši, tačiau priešinga (aktyvinanti) signalizacijos veikla, kuri sužlugdo patogenų bandymus išnaudoti SIRP slopinamąjį potencialą. .

SIRP struktūra komplekse su CD47, kartu su SIRPß ir SIRP struktūromis atskirai, molekuliškai išsamiai parodė, kaip šis suporuotas receptorius suriša savo ligandą ir kaip subtilūs aminorūgščių kitimai ligandą surišančiose srityse lemia išskirtinį ligandą. SIRP šeimos selektyvumas. SIRP polimorfizmų atskyrimas nuo CD47 sąveikos sąsajos rodo, kad patogeninis iššūkis gali paskatinti SIRP polimorfizmą. Patogeno spaudimas slopinančiam receptoriui suteikia patikimą raison d&rsquoêtre suporuotų receptorių, turinčių panašias ekstraląstelines struktūras, bet priešingus signalizacijos potencialus, egzistavimui.


Dėkojame dr. Kun Dong už pagalbą BK surišant gCD47 į CAS9GFP vektorių.

1. Soto-Pantoja DR, Kaur S, Roberts DD. CD47 signalizacijos keliai, kontroliuojantys ląstelių diferenciaciją ir atsaką į stresą. Crit Rev Biochem Mol Biol. (2015) 50:212�. doi: 10.3109 / 10409238.2015.1014024

2. Roberts DD, Frazier WA. Trombospondinai ir jų receptoriai: besivystančios funkcijos. In: Keeley FW, Mecham RP, redaktoriai. Ekstraląstelinės matricos evoliucija. Berlynas Heidelbergas: Springeris (2013). p. 221�. doi: 10.1007/978-3-642-36002-2_8

3. Matlung HL, Szilagyi K, Barclay NA, van den Berg TK. CD47-SIRPalpha signalizacijos ašis kaip įgimtas imuninės sistemos kontrolės taškas sergant vėžiu. Immunol Rev. (2017) 276:145�. doi: 10.1111/imr.12527

4. Hughesas AL. Virusinio interleukino-10 ir kitų DNR viruso genų, turinčių stuburinių homologų, kilmė ir evoliucija. J Mol Evol. (2002) 54:90�. doi: 10.1007/s00239-001-0021-1

5. Cameron CM, Barrett JW, Mann M, Lucas A, McFadden G. Myxoma virus M128L yra išreikštas kaip ląstelės paviršiaus CD47 tipo virulentiškumo faktorius, kuris prisideda prie makrofagų aktyvacijos sumažėjimo in vivo. Virusologija. (2005) 337:55�. doi: 10.1016/j.virol.2005.03.037

6. Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, Sahoo D, Dalerba P, Mitra SS ir kt. CD47 signalą reguliuojančio baltymo alfa (SIRPa) sąveika yra terapinis taikinys žmogaus kietiesiems navikams. Proc Natl Acad Sci USA. (2012) 109:6662𠄷. doi: 10.1073/pnas.1121623109

7. Murata Y, Saito Y, Kotani T, Matozaki T. CD47 signalą reguliuojančio baltymo alfa signalizacijos sistema ir jos taikymas vėžio imunoterapijai. Cancer Sci. (2018) 109:2349�. doi: 10.1111 / cas.13663

8. Advani R, Flinn I, Popplewell L, Forero A, Bartlett NL, Ghosh N ir kt. Hu5F9-G4 ir rituksimabo CD47 blokada sergant ne Hodžkino limfoma. N Engl J Med. (2018) 379:1711�. doi: 10.1056 / NEJMoa1807315

9. Lin GHY, Chai V, Lee V, Dodge K, Truong T, Wong M ir kt. TTI-621 (SIRPalphaFc), CD47 blokuojantis vėžio imunoterapinis preparatas, sukelia limfomos ląstelių fagocitozę keliais poliarizuotais makrofagų pogrupiais. PLoS ONE. (2017) 12:e0187262. doi: 10.1371/journal.pone.0187262

10. Kauder SE, Kuo TC, Harrabi O, Chen A, Sangalang E, Doyle L ir kt. ALX148 blokuoja CD47 ir stiprina įgimtą bei adaptyvų priešnavikinį imunitetą su palankiu saugumo profiliu. PLoS ONE. (2018) 13:e0201832. doi: 10.1371/journal.pone.0201832

11. Kaur S, Elkahloun AG, Singh SP, Chen QR, Meerzaman DM, Song T ir kt. Funkciją blokuojantis CD47 antikūnas slopina kamienines ląsteles ir EGF signalus esant trigubai neigiamam krūties vėžiui. Oncotarget. (2016) 7:10133�. doi: 10.18632/oncotarget.7100

12. Lee TK, Cheung VC, Lu P, Lau EY, Ma S, Tang KH ir kt. CD47 tarpininkaujamo katepsino S / proteazės aktyvuoto receptoriaus 2 signalizacijos blokada yra terapinis taikinys kepenų ląstelių karcinomai. Hepatologija. (2014) 60:179�. doi: 10.1002 / hep.27070

13. Roberts DD, Kaur S, Isenberg JS. Ląstelių redokso signalizacijos reguliavimas matricląsteliniais baltymais kraujagyslių biologijoje, imunologijoje ir vėžyje. Antioksidacinis redokso signalas. (2017) 27:874�. doi: 10.1089/ars.2017.7140

14. Nath PR, Pal-Nath D, Mandal A, Cam M, Schwartz AL, Roberts DD. Natūralių žudikų ląstelių įdarbinimą ir aktyvavimą reguliuoja CD47 ekspresija naviko mikroaplinkoje. Cancer Immunol Res. (2019) 7:1547�. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0367

15. Kaur S, Kuznetsova SA, Pendrak ML, Sipes JM, Romeo MJ, Li Z ir kt. Transmembraninio receptoriaus CD47 modifikavimas heparano sulfatu yra būtinas norint slopinti trombospondin-1 perduodamą T ląstelių receptorių signalą. J Biol Chem. (2011) 286:14991�. doi: 10.1074/jbc.M110.179663

16. Milleris TW, Kaur S, Ivins-O'Keefe K, Roberts DD. Trombospondinas-1 yra nuo CD47 priklausomas endogeninis vandenilio sulfido signalizacijos inhibitorius aktyvuojant T ląsteles. Matrix Biol. (2013) 32:316�. doi: 10.1016/j.matbio.2013.02.009

17. Soto-Pantoja DR, Terabe M, Ghosh A, Ridnour LA, DeGraff WG, Wink DA ir kt. CD47 naviko mikroaplinkoje riboja priešnavikinio T-ląstelių imuniteto ir radioterapijos bendradarbiavimą. Cancer Res. (2014) 74:6771�. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0037-T

18. Feliz-Mosquea YR, Christensen AA, Wilson AS, Westwood B, Varagic J, Melendez GC ir kt. Antraciklinų ir anti-CD47 terapijos derinys slopina invazinį krūties vėžio augimą ir užkerta kelią toksiniam poveikiui širdžiai reguliuojant autofagiją. Krūties vėžio gydymas. (2018) 172:69�. doi: 10.1007/s10549-018-4884-x

19. Soto-Pantoja DR, Miller TW, Pendrak ML, Degraff WG, Sullivan C, Ridnour LA ir kt. CD47 trūkumas suteikia ląstelėms ir audiniams radioaktyvią apsaugą aktyvuojant autofagiją. Autofagija. (2012) 8:1628�. doi: 10.4161/auto.21562

20. Kaur S, Soto-Pantoja DR, Stein EV, Liu C, Elkahloun AG, Pendrak ML ir kt. Trombospondin-1 signalizacija per CD47 slopina savaiminį atsinaujinimą reguliuodamas c-Myc ir kitus kamieninių ląstelių transkripcijos faktorius. Sci Rep. (2013) 3:1673. doi: 10.1038/srep01673

21. Miller TW, Soto-Pantoja DR, Schwartz AL, Sipes JM, DeGraff WG, Ridnour LA ir kt. CD47 visame pasaulyje reguliuoja medžiagų apykaitos kelius, kurie kontroliuoja atsparumą jonizuojančiai spinduliuotei. J Biol Chem. (2015) 290:24858�. doi: 10.1074/jbc.M115.665752

22. Zoppoli G, Regairaz M, Leo E, Reinhold WC, Varma S, Ballestrero A ir kt. Tariama DNR/RNR helikazė Schlafen-11 (SLFN11) jautrina vėžines ląsteles DNR žalojantiems agentams. Proc Natl Acad Sci USA. (2012) 109:15030𠄵. doi: 10.1073/pnas.1205943109

23. Rees MG, Seashore-Ludlow B, Cheah JH, Adams DJ, Price EV, Gill S ir kt. Cheminio jautrumo ir bazinio geno ekspresijos koreliacija atskleidžia veikimo mechanizmą. Nat Chem Biol. (2016) 12:109�. doi: 10.1038/nchembio.1986

24. Gardner EE, Lok BH, Schneeberger VE, Desmeules P, Miles LA, Arnold PK ir kt. Cheminiam jautrumui recidyvas sergant smulkialąsteliniu plaučių vėžiu vyksta per EZH2-SLFN11 ašį. Vėžio ląstelė. (2017) 31:286�. doi: 10.1016/j.ccell.2017.01.006

25. Lok BH, Gardner EE, Schneeberger VE, Ni A, Desmeules P, Rekhtman N ir kt. PARP inhibitoriaus aktyvumas koreliuoja su SLFN11 ekspresija ir rodo sinergiją su temozolomidu sergant smulkialąsteliniu plaučių vėžiu. Clin Cancer Res. (2017) 23:523�. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1040

26. Tang SW, Bilke S, Cao L, Murai J, Sousa FG, Yamade M ir kt. SLFN11 yra EWS-FLI1 transkripcijos taikinys ir lemiamas atsakas į vaistą sergant Ewingo sarkoma. Clin Cancer Res. (2015) 21:4184�. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-2112

27. Sousa FG, Matuo R, Tang SW, Rajapakse VN, Luna A, Sander C ir kt. DNR atkūrimo genų pokyčiai NCI-60 ląstelių linijose ir jų nuspėjamoji vertė priešvėžinių vaistų aktyvumui. DNR taisymas. (2015) 28:107�. doi: 10.1016/j.dnarep.2015.01.011

28. Deng Y, Cai Y, Huang Y, Yang Z, Bai Y, Liu Y ir kt. Didelė SLFN11 ekspresija prognozuoja geresnį pacientų, sergančių KRAS 2 egzono laukinio tipo gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu, išgyvenamumą po gydymo adjuvantine oksaliplatina. BMC vėžys. (2015) 15:833. doi: 10.1186/s12885-015-1840-6

29. Tang SW, Thomas A, Murai J, Trepel JB, Bates SE, Rajapakse VN ir kt. Atsparumo į DNR nukreiptiems agentams įveikimas epigenetiškai aktyvuojant Schlafen 11 (SLFN11) ekspresiją I klasės histono deacetilazės inhibitoriais. Clin Cancer Res. (2018) 24:1944�. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-17-0443

30. Nogales V, Reinhold WC, Varma S, Martinez-Cardus A, Moutinho C, Moran S ir kt. Epigenetinis tariamos DNR / RNR helikazės SLFN11 inaktyvavimas žmogaus vėžyje suteikia atsparumą platinos vaistams. Oncotarget. (2016) 7:3084�. doi: 10.18632/oncotarget.6413

31. Li M, Kao E, Malone D, Gao X, Wang JYJ, David M. DNR pažeidimo sukelta ląstelių mirtis priklauso nuo SLFN11 priklausomo skirtingų II tipo tRNR skilimo. Nat Struct Mol Biol. (2018) 25:1047�. doi: 10.1038/s41594-018-0142-5

32. Murai J, Tang SW, Leo E, Baechler SA, Redon CE, Zhang H ir kt. SLFN11 blokuoja įtemptas replikacijos šakes nepriklausomai nuo ATR. Mol Cell. (2018) 69:371� e376. doi: 10.1016/j.molcel.2018.01.012

33. Reinhold MI, Green JM, Lindberg FP, Ticchioni M, Brown EJ. Ląstelių plitimas išskiria T ląstelių aktyvacijos padidinimo mechanizmą su integrinu susijusiu baltymu / CD47 ir CD28. Int Immunol. (1999) 11:707�. doi: 10.1093/intimm/11.5.707

34. Kaur S, Singh SP, Elkahloun AG, Wu W, Abu-Asab MS, Roberts DD. Nuo CD47 priklausomas tarpląstelinių pūslelių, kurias gamina T ląstelės, imunomoduliacinė ir angiogeninė veikla. Matrix Biol. (2014 m.) 37:49�. doi: 10.1016/j.matbio.2014.05.007

35. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. Paprastas metodas, leidžiantis kiekybiškai įvertinti mažą DNR pažeidimo lygį atskirose ląstelėse. Exp Cell Res. (1988) 175:184�. doi: 10.1016/0014-4827(88)90265-0

36. Kaur S, Elkahloun AG, Singh SP, Arakelyan A, Roberts DD. Funkciją blokuojantis CD47 antikūnas moduliuoja tarpląstelinį pūslelių sukeltą tarpląstelinį signalą tarp krūties karcinomos ląstelių ir endotelio ląstelių. J mobiliojo ryšio signalas. (2018) 12:157�. doi: 10.1007/s12079-017-0428-0

37. Ma D, Liu S, Lal B, Wei S, Wang S, Zhan D ir kt. Ekstraląstelinis matricos baltymas tenascinas C padidina fagocitozę, kurią sukelia CD47 funkcijos praradimas glioblastomoje. Cancer Res. (2019) 79:2697�. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3125

38. Cerami E, Gao J, Dogrusoz U, Gross BE, Sumer SO, Aksoy BA ir kt. cBio vėžio genomikos portalas: atvira platforma, skirta tyrinėti daugiamačius vėžio genomikos duomenis. Vėžio atradimas. (2012) 2:401𠄴. doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0095

39. Gao J, Aksoy BA, Dogrusoz U, Dresdner G, Gross B, Sumer SO ir kt. Integruota sudėtingos vėžio genomikos ir klinikinių profilių analizė naudojant cBioPortal. Mokslinis signalas. (2013) 6:pl1. doi: 10.1126/scisignal.2004088

40. Maxhimer JB, Soto-Pantoja DR, Ridnour LA, Shih HB, DeGraff WG, Tsokos M ir kt. Radioaktyvioji apsauga normaliame audinyje ir uždelstas naviko augimas blokuojant CD47 signalizaciją. Sci Transl Med. (2009) 1:3ra7. doi: 10.1126/scitranslmed.3000139

41. Gewirtz DA. Kritinis antraciklinų grupės antibiotikų adriamicino ir daunorubicino priešnavikinio poveikio veikimo mechanizmų įvertinimas. Biochem Pharmacol. (1999) 57:727�. doi: 10.1016/S0006-2952(98)00307-4

42. de la Casa-Esperon E. Nuo žinduolių iki virusų: Schlafen genai vystymosi, proliferacijos ir imuniniuose procesuose. Biomol sąvokos. (2011) 2:159�. doi: 10.1515/bmc.2011.018

43. Nath PR, Gangaplara A, Pal-Nath D, Mandal A, Maric D, Sipes JM ir kt. CD47 ekspresija natūraliose žudikų ląstelėse reguliuoja homeostazę ir moduliuoja imuninį atsaką į limfocitinį choriomeningito virusą. Priekinis imunolis. (2018) 9:2985. doi: 10.3389/fimmu.2018.02985

44. Li Z, Calzada MJ, Sipes JM, Cashel JA, Krutzsch HC, Annis D ir kt. Trombospondinų sąveika su a4b1 integrinu ir CD47 skirtingai moduliuoja T ląstelių elgesį. J Cell Biol. (2002) 157:509�. doi: 10.1083/jcb.200109098

45. Li SS, Liu Z, Uzunel M, Sundqvist KG. Endogeninis trombospondinas-1 yra ląstelės paviršiaus ligandas, skirtas reguliuoti nuo integrino priklausomą T limfocitų adheziją. Kraujas. (2006) 108:3112�. doi: 10.1182/blood-2006-04-016832

46. ​​Barretina J, Caponigro G, Stransky N, Venkatesan K, Margolin AA, Kim S ir kt. Vėžio ląstelių linijos enciklopedija leidžia numatyti priešvėžinių vaistų jautrumo modeliavimą. Gamta. (2012) 483:603𠄷. doi: 10.1038/nature11003

47. Soto-Pantoja DR, Ridnour LA, Wink DA, Roberts DD. CD47 blokada padidina pelių, paveiktų mirtina viso kūno švitinimo, išgyvenamumą. Sci Rep. (2013) 3:1038. doi: 10.1038/srep01038

48. Kaur S, Roberts DD. Skirtingas normalių ir neoplastinių kamieninių ląstelių moduliavimas trombospondin-1 ir CD47 signalizacija. Int J Biochem Cell Biol. (2016) 81:184�. doi: 10.1016/j.biocel.2016.05.005

Raktiniai žodžiai: radiorezistencija, epigenetika, CD47, trombospondinas-1, atsakas į DNR pažeidimą, šlafenas-11, prostatos vėžys

Citata: Kaur S, Schwartz AL, Jordan DG, Soto-Pantoja DR, Kuo B, Elkahloun AG, Mathews Griner L, Thomas CJ, Ferrer M, Thomas A, Tang SW, Rajapakse VN, Pommier Y ir Roberts DD (2019) Schlafen-11 kaip CD47 signalizacijos, reguliuojančios jautrumą jonizuojančiai spinduliuotei ir topoizomerazės inhibitoriams, taikinį. Priekyje. Oncol. 9:994. doi: 10.3389/fonc.2019.00994

Gauta: 2019 m. rugpjūčio 15 d. Priimta: 2019 m. rugsėjo 16 d
Paskelbta: 2019 m. spalio 01 d.

Ira Ida Skvortsova, Insbruko medicinos universitetas, Austrija

Jih-Hwa Guh, Nacionalinis Taivano universitetas, Taivanas
Katerina Smesny Trtkova, Palacký universitetas, Čekija

Autorių teisės ©, 2019 m. Kaur, Schwartz, Jordan, Soto-Pantoja, Kuo, Elkahloun, Mathews Griner, Thomas, Ferrer, Thomas, Tang, Rajapakse, Pommier ir Roberts. Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License (CC BY) sąlygas. Naudojimas, platinimas ar atgaminimas kituose forumuose yra leidžiamas, su sąlyga, kad pirminis (-i) autorius (-ai) ir autorių teisių savininkas (-iai) yra nurodyti ir cituojamas originalus leidinys šiame žurnale, laikantis priimtos akademinės praktikos. Neleidžiama naudoti, platinti ar dauginti, jei nesilaikoma šių sąlygų.

† Šie autoriai vienodai prisidėjo prie šio darbo

‡ Dabartinis adresas: Anthony L. Schwartz, Morphiex Biotherapeutics, Boston, MA, Jungtinės Valstijos
David R. Soto-Pantoja, Wake Forest medicinos mokykla, Vinston-Seilemas, NC, Jungtinės Amerikos Valstijos


Santrauka 5218: Anti-CD47 terapijos sukūrimas vaikų smegenų augliams gydyti.

Įvadas: Pastaraisiais metais atliktas platus smegenų auglių molekulinis apibūdinimas pasirodė esąs naudingas navikų klasifikavimui, rizikos stratifikavimui ir dabartinių gydymo būdų rezultatų prognozavimui. Tačiau dabartinis priežiūros standartas nepagerino prognozės ir padidina kognityvinių sutrikimų riziką vaikams, sergantiems smegenų augliais. Būdingas naviko progresavimo ir pasikartojimo bruožas yra jo gebėjimas išvengti imuninės sistemos. Mūsų hipotezė yra ta, kad moduliuodami įgimtą imuninę sistemą galime sustiprinti makrofagų gebėjimą „valgyti ir nužudyti“ smegenų vėžio ląsteles. Naujausi duomenys rodo, kad sąveika tarp ląstelės paviršiaus antigeno CD47 ir jo surišimo partnerio SIRPα yra mechanizmas, kuriuo kietieji ir kietieji navikai gali išvengti įgimtos imuninės sistemos. Norėdami sužinoti, ar anti-CD47 terapija yra galimas piktybinių vaikų smegenų auglių gydymas, pirmiausia ištyrėme CD47 ekspresiją šviežiai izoliuotuose pacientų ir pomirtiniuose mėginiuose iš 4 skirtingų navikų tipų difuzinės vidinės pontino gliomos, medulloblastomos, ependimomos ir ATRT. Mes išbandėme hipotezę, kad CD47-SIRPα sąveikos blokavimas sukėlė fagocitozę in vitro fagocitozės tyrime. Toliau sukūrėme ortotopinių ksenografų modelius pelėms, kurių imunitetas susilpnėjęs, ir gydėme jas anti-CD47 humanizuotu antikūnu, kuris šiuo metu kuriamas klinikiniams kraujodaros ir ne CNS piktybinių navikų tyrimams.

Rezultatas: CD47 ekspresija buvo sureguliuota visuose navikų tipuose ir buvo >90% aukšto laipsnio navikų ląstelių. Padidėjusi CD47 ekspresija buvo pastebėta CD15+ ir CD133+ numanomų vėžio kamieninių ląstelių populiacijoje. CD47-SIRPα sąveikos blokavimas padidina naviko fagocitozę makrofagais in vitro. Sisteminis gydymas anti-CD47 antikūnais žymiai sumažino naviko naštą ortotopinio ksenografo aplinkoje.

Išvada: Anti-CD47 terapija yra perspektyvus ir veiksmingas vaikų didelio laipsnio smegenų auglių gydymo būdas.

Citatos formatas: Sharareh Gholamin, Siddhartha S. Mitra, Chase'as Elliottas Richardas, Achal Achrol, Doosik Kong, Jun Jae Shin, Michelle Monje-Deisseroth, Yoon-Jae Cho, Irving Weissman, Samuel H. Cheshier. Vaikų smegenų auglių anti-CD47 terapijos kūrimas. [abstraktus]. In: 104-ojo metinio Amerikos vėžio tyrimų asociacijos susirinkimo medžiaga 2013 m. balandžio 6–10 d. Vašingtonas, Kolumbija. Filadelfija (PA): AACR Cancer Res 201373 (8 Suppl): Abstract Nr. 5218. doi: 10.1158/1538-7445.AM2013-5218


Žiūrėti video įrašą: How do Immune Cells Macrophages Engulf Bacteria Phagocytosis Process (Spalio Mėn 2022).