Informacija

Ką paliečiamas jaučia C. Elegansas?

Ką paliečiamas jaučia C. Elegansas?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Skaitau C. Elegans liečiamus atsakymus. Palietus, ką konkrečiai jaučia neuronai? Manoma, kad prisilietimas deformuoja kūno ląsteles ir tą deformaciją jaučia jutimo neuronai. Tai teisinga? Arba patys neuronai yra tiesiogiai stimuliuojami dėl mažo organizmo dydžio? (O gal aš toli?)


Trumpai tariant, tu teisus. Jūs paliečiate odą, o tai suspaudžia mechanoreceptorius, kurie generuoja kaskadinį neuronų atsaką.

Kalbant apie tikrus neuronus, tai tikrai priklauso nuo tipo prisilietimo. Pavyzdžiui, gerai apibūdintas tipas yra švelnūs mechaniniai dirgikliai, kurie gali apimti ALM, AVM, PLM ir PVM, priklausomai nuo atsako (Will Schafer apžvalga doi: 10.1007/s00424-014-1574-3).

Šie švelnaus prisilietimo receptoriai (TRN) yra hipodermyje, o jų neurituose yra specializuoti mechaninės transdukcijos (MeT) kanalai. Būtent tų kanalų pasikeitimas sukelia receptorių aktyvavimą ir visą tolesnį elgsenos atsaką (apibendrinta iš toliau pateikto mokslinių ataskaitų dokumento).

Taigi, apibendrinant: aktyvuojami mechanoreceptorių neuronai, kurie sukelia atsaką. Sakydamas „atsakymas“ turiu galvoje, kad tie mechanoreceptorių neuronai aktyvuoja kai kuriuos interneuronų kelius, o tai savo ruožtu suaktyvina motorinius neuronus, dėl kurių kirminas daro ką nors.

Yra daug kitų mechaninio jutimo mechanizmų, o „WormBook“ yra vieta, kur galite pamatyti išsamią jų apžvalgą.


Tikrasis mechaninis MeT kanalų aktyvavimo mechanizmas / būdas yra pakankamai didelis klausimas, dėl kurio neseniai buvo paskelbtas mokslinės ataskaitos straipsnis. Tas dokumentas yra DOI:10.1038/s41598-017-12190-0 (Elmi et al. Determining the biomechanics of touch sensation in C elegans).

Jie pristato dokumentą, pakartodami tai, ką apibendrinau aukščiau.

[… ] lietimo pojūtis gali būti laikomas įvykių grandine, kurią inicijuoja odai taikomų mechaninių apkrovų pasiskirstymas erdvėje ir laiko atžvilgiu, dėl kurių atsiranda įtempių, deformuojančių odos paviršių, posluoksnius ir apatinius mechanoreceptorius. Reaguodami į perduodamą mechaninę energiją, mechanoreceptoriai aktyvuoja neuronų signalizacijos tinklą, kuris užkoduoja fizinį kontaktą kaip informaciją, kurią mes suvokiame kaip „prisilietimą“.


Elmi ir kt. nustatyti protingą tyrimą, kad pamatytumėte, kaip keičiasi kirmino kūnas. Kūnas yra gana elastingas (iki 16 mikrometrų), o oda šiek tiek pasislinkusi, nes korpusas nėra tobulai cilindro formos.

Jie naudojo šiuos duomenis kurdami preliminarų skirtingų kirmino kūno sluoksnių modelį, o tada patvirtino ir suderino modelį. Tai puikus dokumentas (su šiek tiek matematikos / fizikos, kuri iš jūsų profilio atrodo, kad jums tai patiks).


Caenorhabditis elegans genomo stabilumas

M. Rieckheris, . B. Schumacheris, knygoje „Genomo stabilumas“, 2016 m

Abstraktus

Caenorhabditis elegantiškas per pastaruosius dešimtmečius buvo svarbus pavyzdinis organizmas. Apibrėžta vystymosi linija ir dinaminė gemalo linija, kurioje yra erdviškai išspręstas mitozinis ir mejotinis ląstelių dalijimasis, daro nematodą nuostabia eksperimentine sistema genomo stabilumui ir DNR atkūrimo mechanizmams tirti. Atsekama genetika palengvino naujų genomo priežiūros mechanizmų atradimą ir jų tyrimą besivystančio ir senstančio gyvūno kontekste. Pateikiame DNR taisymo ir atsako į DNR pažeidimus mechanizmų apžvalgą C. elegans ir įvairios metodikos, kurios buvo naudojamos siekiant suprasti metazoanų genomo stabilumą.


Mechaninių sistemų biologija C. elegans prisilietimo pojūtis

Lytėjimo pojūtis informuoja mus apie fizines mūsų aplinkos savybes ir yra esminis bendravimo aspektas. Prieš pajuntant prisilietimus, mechaniniai signalai greitai ir patikimai perduodami nuo odos paviršiaus į mechaninius-elektrinius perdavimo kanalus, įterptus į specializuotus jutimo neuronus. Mes tik pradedame suprasti, kaip minkštieji audiniai dalyvauja perduodant jėgą ir kaip jie deformuojasi. Čia apžvelgiame empirinius ir teorinius atskirų molekulių ir molekulinių ansamblių, kurie, kaip manoma, dalyvauja mechaninėje transmisijoje, tyrimus ir pritaikome šiame darbe atsiradusias sąvokas lytėjimo pojūčiui. Mes sutelkiame dėmesį į nematodą Caenorhabditis elegantiškas kaip gerai ištirtas lietimo pojūčio modelis, kuriame mechanika gali būti tiriama molekuliniu, ląstelių ir sistemų lygiu. Galiausiai darome išvadą, kad jėgos perdavimas yra atsirandanti makromolekulinių ląstelių struktūrų savybė, kurios viena kitą stabilizuoja.


Kaip mokslininkai naudoja C. elegans šiandien atlikti tyrimus?

Praėjus beveik 60 metų po to, kai Brenneris pradėjo dirbti C. elegans, dabar tai yra nusistovėjęs pavyzdinis organizmas ir visame pasaulyje yra daugiau nei 500 laboratorijų, tiriančių šiuos kirminus! Daugelis pirminių Brennerio argumentų už kirminų naudojimą laboratorijoje vis dar yra teisingi dėl jų mažo dydžio, trumpo gyvavimo ciklo (maždaug trys dienos nuo kiaušinėlio iki suaugusio) ir didelio palikuonių skaičiaus (beveik 300 kiaušinėlių), todėl galime labai daug užauginti. greitai. Tačiau dėl genetikos ir molekulinės biologijos pažangos šie kirminai buvo naudingi netikėtais būdais.

Kodėl kirminai vis dar yra geras pavyzdinis organizmas?

  • Aktualus: Daugelis kirminų genų turi žmogaus atitikmenis, kurie gali būti stebėtinai panašūs! Taigi, nors C. elegans atrodo ir elgiasi kitaip nei žmonės, tyrinėdami kirminų genus ir baltymus, galite sužinoti, kaip veikia ir mūsų ląstelės.
  • Paprasta: C. elegans suaugusieji turi tik 302 neuronus (palyginti su mūsų 100 mlrd.).
  • Ir vis dėlto sudėtinga: Ši palyginti maža nervų sistema vis tiek gali sukelti sudėtingą elgesį, pavyzdžiui, maisto paieškas, poravimąsi, kenksmingų dirgiklių vengimą ir net mokymąsi.
  • Gerai charakterizuojamas: Jie buvo pirmieji daugialąsčiai organizmai, kurių visas genomas buvo sekvenuotas. Turime išsamų visų jų neuronų žemėlapį ir kaip jie sujungti, daugelis šių neuronų ir daugelis jų genų buvo plačiai ištirti.

Kaip atliekame kirminų tyrimus?

Žali ir raudoni fluorescenciniai baltymai, žymintys skirtingus neuronų tipus kirmino galvoje

Ilgus metus trukusios studijos laboratorijose visame pasaulyje suteikė fantastišką metodų rinkinį.

  • Kirminai pasižymi daugybe gerai apibūdintų elgsenų ir savybių (uoslės, skonio, lytėjimo, judėjimo, mokymosi), kurias galime naudoti norėdami ištirti, kaip veikia jų neuronai.
  • Mes galime įvesti naują DNR į kirminus, t. y. padaryti juos „transgeniniais“. Mes netgi galime išreikšti žmogaus baltymus kirminų ląstelėse!
  • Fluorescenciniai žymenys (pvz., žalias fluorescencinis baltymas, GFP) gali padėti mums vizualizuoti dominantį baltymą, duoti užuominų apie tai, ką jis veikia, arba gali pažymėti tam tikrus neuronus, leidžiančius patikrinti, ar jie normaliai vystosi.
  • Galime išreikšti fluorescencinius „indikatorinius“ baltymus, kurie keičia spalvą priklausomai nuo neurono aktyvumo ir leidžia mums sekti, ką veikia konkretūs neuronai.
  • Galime mutuoti dominančius genus ir grąžinti naują kopiją su DNR sekos pakeitimais arba be jų, kurie padeda suprasti, kaip jie veikia.

Derindami šias strategijas, mokslininkai gali nustatyti, kuriose ląstelėse konkretus genas yra išreikštas, prie kokio elgesio jis prisideda ir su kokiais kitais genais jis sąveikauja. Šis metodas ypač naudingas genų, prisidedančių prie žmogaus biologinių procesų, šeimos nariams. Toliau pateikiami keli pavyzdžiai, kaip nematodų kirminai gali padėti suprasti žmonių sveikatą ir ligas.

Priklausomybė nuo narkotikų ir psichinės ligos

Žalias fluorescencinis baltymas žymi neuronus, ekspresuojančius serotoniną ir dopaminą. Šie neurotransmiteriai keičia kirminų greitį ant maisto, kaip greitai jie valgo ir kiaušinių dėjimo greitį.

Reaguodami į jutiminę informaciją ir pasinaudodami savo praeities patirtimi, mes keičiame savo elgesį dėl tolimojo pasiuntinio molekulių („neurotransmiterių“). Kirminai naudoja tuos pačius neurotransmiterius, kad reguliuotų savo elgesį. Pavyzdžiui, kai jie susiduria su geru maistu, jie sulėtėja ir deda kiaušinėlius, o tai reikalauja dopamino. Dopaminas vaidina svarbų vaidmenį sergant priklausomybe nuo narkotikų, šizofrenija, ADHD ir Parkinsono liga. Taigi supratimas apie signalizacijos kelius, kuriais grindžiamas šis kirminų elgesys, gali padėti mums suprasti signalizacijos kelius, susijusius su žmogaus sąlygomis (ir kaip juos gydyti). Serotoninas yra dar vienas pavyzdys žmonėms, jis yra susijęs su depresija ir nerimu, o kirminuose jis kontroliuoja kiaušinėlių dėjimo ir maitinimosi greitį (jie deda daugiau kiaušinių ir valgo greičiau, jei duosite jiems Prozac!).

Kirminų naudojimas kurtumui tirti

Maždaug pusė kurtumo atvejų yra paveldimi, kuriuos sukelia tam tikrų genų sekos pokyčiai. Tyrinėjant šeimas, kuriose yra kurčiųjų asmenų, buvo nustatyta daug atsakingų genų. Daugelis šių genų turi labai panašius kirminų atitikmenis, todėl galime naudoti kirminus, kad pabandytume suprasti, kaip jie sukelia kurtumą ir kokį vaidmenį šie genai atlieka sveikiems asmenims. Nors kirminai negirdi, klausa priklauso nuo virpesių aptikimo, kuris labai panašus į prisilietimo aptikimą. Kirminai reaguoja į prisilietimą judėdami priešinga kryptimi, taigi, jei kirmino genas veikia liesdamas, tai suteikia mums stebimą elgesį, kurį reikia ištirti.

Senėjimas ir su amžiumi susijusios ligos

Kirmėlių ląstelės sensta panašiai kaip žmogaus ląstelės, todėl galime jas naudoti kaip ligos modelį. Trumpas gyvavimo ciklas C. elegans reiškia, kad galime greitai pastebėti senėjimo poveikį. Galime į kirminus sudėti genus ir baltymus, sukeliančius su amžiumi susijusias ligas (pvz., Alzheimerio, Hantingdono ar Parkinsono ligas), ir ištirti, kodėl jie sukelia senstančių gyvūnų ligas. Galime genetiškai manipuliuoti kirminais, kad jie taptų mažiau jautrūs ligoms, ir tada ištirti priežastis. Tokie tyrimai nustatė, kad insulinas yra pagrindinis veiksnys, turintis įtakos mūsų senėjimui ir tikimybei susirgti senėjimo ligomis.

„jaunas“ suaugęs kirminas, turintis su senėjimu susijusį baltymą, pažymėtą fluorescenciniu baltymu. Jis pasiskirsto visame kūne
„senas“ suaugęs kirminas, kuriame agregavosi tas pats baltymas

C. elegans puikiai tinka didelio našumo ekranams

Kadangi kirminai yra pigūs ir lengvai auginami dideliais kiekiais, jie idealiai tinka didelio masto ekranams. Atranka dėl mutantų, turinčių tam tikrą defektą, tada identifikuojant geną, gali padėti mums geriau suprasti žmonių ligas. Atliekant naujų molekulių, kurios ištaiso šį defektą, patikrinimas gali nustatyti ir naujus vaistus!


2 pagrindinis protokolas

Kirmėlių maitinimas dsRNR

RNRi galima sukelti šeriant kirminų bakterijas, ekspresuojančias dsRNR (Timmons ir kt., 2001). Pirma, cDNR, atitinkanti dominantį geną, klonuojama į bakterinės ekspresijos vektorių tarp priešingų fago T7 polimerazės promotoriaus vietų. Tada maitinimo vektorius transformuojamas į E. coli HT115 padermė, pernešanti DE3 lizogeną ( vienetas 1.8), užtikrinanti IPTG indukuojamą fago T7 RNR polimerazės ekspresiją. HT115(DE3) padermei taip pat trūksta Rnc genas, kuris koduoja Rnazę III ir todėl jam trūksta dsRNR skaidymo. RNRi maistas paruošiamas ir sėjamas į NGM lėkštes, kuriose yra IPTG. Gyvūnai dedami ant RNAi maisto, o hermafroditas ir palikuonys tiriami ir įvertinami fenotipai.

Norėdami vienu metu maitindami nukreipti du genus, mes ir kiti (Min ir kt., 2010) nustatėme, kad geriausia sujungti du cDNR fragmentus, po vieną iš kiekvieno geno, į vieną maitinimo vektorių. Dviejų maišymas E. coli štamai taip pat veikia, tačiau yra labiau linkę į klaidas, kurias sukelia nevienodas maišymasis arba RNR ekspresija dviejose skirtingose ​​​​šėrimo padermėse. Nebandykite šerti gyvūnų, kuriems anksčiau dėl nežinomų priežasčių buvo sušvirkšta dsRNR, dsRNR mikroinjekcija (net nespecifinė dsRNR) šėrimo metu slopins RNRi.

Šį protokolą galima lengvai išplėsti, kad būtų galima ištirti molekulines ir biochemines konkretaus geno produkto išeikvojimo pasekmes.

RNAi tiekiant mikrotitro formatu 3 ir 4 pagrindinio protokolo ir 2 alternatyvaus protokolo tema leidžia atlikti sisteminius tyrimus (Fraser ir kt., 2000, Sonnichsen ir kt., 2005, Wat0son ir kt., Wat0 ir kt. al., 2013).

Medžiagos

L4440 dvigubo T7 RNAi maitinimo vektorius (26.3.5 pav. Addgene)

Daugkartinė dvigubo T7 RNR maitinimo vektoriaus L4440 klonavimo vieta. Priešingi fago T7 promotoriai yra šalia daugybinės L4440 klonavimo vietos. Rodomos MCS būdingos apribojimo vietos, o unikalios vietos pažymėtos paryškintu šriftu.

E. coli RNAi maitinanti padermė HT115(DE3) (CGC)

Puikus sultinys (TB vienetas 1.1) kurių kiekvienoje yra 50 μg/ml ampicilino ir tetraciklino ( vienetas 1.4)

TB, kurioje yra 50 μg/ml ampicilino

NGM/amp/IPTG plokštės (žr. receptą)

Gravid / jaunas suaugęs, L1 lervos arba L4 lervos C. elegans atitinkamos (-ų) padermės (pvz., N2, CGC)

NGM/amp/IPTG plokštelės (žr. receptą), pasėtos HT115 su tuščiu L4440 RNAi maitinimo vektoriumi

Papildomi reagentai ir įranga DNR fragmentams subklonuoti ( vienetas 3.16), transformuojasi E. coli ( vienetas 1.8), auga E. coli ( vienetas 1.2), perkėlimas ir dauginimas C. elegans (žr. 1 paramos protokolą)

PASTABA: Atlikite kiekvieną RNRi eksperimentą trimis egzemplioriais.

Paruoškite RNAi maitinimo padermę

Klonuokite dominančio geno cDNR į L4440 dvigubo T7 RNR maitinimo vektorių ( vienetas 3.16).

Venkite intronų—Intronų buvimas maitinimo konstrukcijoje gali sumažinti trukdžių efektyvumą. L4440 alternatyvos apima Litmus 28i ir 38i (NEB) ir su šliuzu suderinamas L4440, L4440-dest-RNAi (Rual ir kt., 2004) ir L4440-gtwy (Caldwell ir kt., 2006) versijas. L4440 ir L4440-gtwy galima įsigyti per Addgene.

Paverskite RNAi maitinimo konstrukciją į E. coli šėrimo padermė HT115(DE3) ( vienetas 1.8).

Paimkite koloniją ir pasėkite 2 ml nuostabaus sultinio (TB), kuriame yra 50 μg/ml kiekvieno ampicilino ir tetraciklino, ir auginkite per naktį 37ଌ temperatūroje ( vienetas 1.2).

Pradinę kultūrą pasėkite į 1 litrą TB, kuriame yra 50 μg/ml ampicilino, ir inkubuokite kratydami 37ଌ temperatūroje 8–16 valandų ( vienetas 1.2).

Tetraciklinas šioje kultūroje yra nereikalingas ir, tiesą sakant, gali sumažinti RNRi efektyvumą (Kamath ir kt., 2001).

Kultūros gali būti sumažintos, tačiau maisto perteklių iš didelių kultūrų galima laikyti �ଌ temperatūroje keletą mėnesių.

Surinkite bakterijas

5a. Centrifugavimui: Centrifuguokite bakterijas 10 min 800 × g, 4ଌ. Bakterijų nuosėdas pakartotinai suspenduokite M9 buferyje (kiekvienam litrui kultūros naudokite 25 ml) ir perkelkite į 50 ml kūginį mėgintuvėlį.

Surinkite maistą centrifuguodami, jei maisto reikia skubiai.

Jei laikas leidžia, leiskite bakterijoms pasyviai nusodinti, kad sumažintumėte dsRNR maisto užteršimo tikimybę.

5b. Pasyviems krituliams: Pakeiskite TB terpę M9 buferiu taip:

Leiskite bakterijoms nusėsti ant kultivavimo kolbos dugno per naktį 4°C temperatūroje. Atsargiai išsiurbkite iš kolbos kuo daugiau terpės, nepažeidžiant bakterijų, kurios kolbos apačioje sudaro minkštą sluoksnį. Sukite kolbą, kad likusiame TB tūryje suspenduotų bakterijas, ir supilkite į 50 ml kūginį mėgintuvėlį.

Bakterijas susmulkinkite klinikinėje centrifugoje 10 min 800 × g (4500 aps./min.), 20ଌ. Išimkite sultinį įsiurbdami.

Šios granulės paprastai būna minkštos, o išpylus terpę gali netekti bakterijų.

Nuplaukite bakterijas 5 granulių tūrių M9 buferyje, maišydami, kol gumulėliai ištirps.

6. Bakterijas granuliuokite klinikinėje centrifugoje 10 min 800 × g (4500 aps./min.), 20ଌ.

7a. Greitam/trumpalaikiam naudojimui: Išplautas bakterijas pakartotinai suspenduokite 5 nuosėdų tūriuose M9 buferio. Laikyti iki 1 mėnesio 4ଌ temperatūroje.

RNAi maistas yra paruoštas naudoti po pakartotinio suspendavimo bet kuriame buferyje.

7b. Sandėliavimui: Išplautas bakterijas pakartotinai suspenduokite M9/15% glicerolyje. Kelis mėnesius laikykite 10 ml alikvotose �ଌ temperatūroje.

8. Įdėkite atitinkamą skaičių NGM/amp/IPTG lėkščių su vienu lašeliu (� μl) kiekvieno RNRi maisto.

9. Leiskite plokštelėms išdžiūti per naktį kambario temperatūroje.

Tai taip pat leidžia indukuoti dsRNR gamybą ir maitinant nuolat gamina skvarbiausius RNRi fenotipus.

Sėklos gali būti laikomos sandariai uždarytoje talpykloje iki kelių savaičių 4ଌ temperatūroje. Prieš naudodami RNAi plokšteles pašildykite iki kambario temperatūros.

Auginkite kirminus ant RNAi maisto ir analizuokite fenotipus

10a. Embrioninių ir poembrioninių fenotipų testas: Padėkite vieną gravidą suaugusįjį C. elegans ant NGM/amp/IPTG plokščių. Kaip kontrolę, pavienius sunkius suaugusius žmones padėkite ant HT115(DE3), kuriame yra tuščias L4440 RNAi maitinimo vektorius. Po 24 valandų perkelkite kiekvieną suaugusįjį, maitintą RNRi arba kontroliniu maistu, į naują to paties tipo lėkštelę ir kiekvienoje lėkštelėje suskaičiuokite palikuonių (kiaušinių ir lervų) skaičių.

Padėjus sunkius suaugusius žmones ant RNRi plokštelių, galima įvertinti RNR gebėjimą gaminti embrioninius ir poembrioninius fenotipus toje pačioje plokštelėje.

10b. Embriono mirtinų fenotipų testas: Pavienius L4 gyvūnus padėkite ant NGM/amp/IPTG (RNAi) ir kontrolinių —t.y., sėjamų HT115(DE3), kuriame yra tuščios L4440 RNAi maitinimo vektoriaus—lėkštelės. Po 24 valandų perkelkite kiekvieną suaugusįjį į naują to paties tipo lėkštę, į kurią jis buvo pasėtas (t. y. RNRi arba kontrolinis) ir kiekvienoje lėkštelėje suskaičiuokite palikuonių (kiaušinių ir lervų) skaičių.

10c. Postembrioninių fenotipų testas: Ant RNAi ir kontrolinių plokštelių uždėkite 20 naujai išsiritusių L1 lervų.

11. Kiekvieną dieną apžiūrėkite lėkštes, kad nustatytumėte, ar RNAi maistas gamina embrioninius ir (arba) poembrioninius fenotipus.

Embrionų buvimas RNRi plokštelėse praėjus 24 valandoms po suaugusiojo pašalinimo rodo, kad RNRi sukuria embrioninį mirtiną fenotipą. Tačiau visada būtinai palyginkite RNAi plokštes su kontrolinėmis plokštelėmis.

Kai kuriais atvejais poembrioninius fenotipus galima lengvai nustatyti lyginant RNAi maitinamus palikuonis su kontroliniu šertu.


Ne žinduoliai stuburiniai gyvūnai

2.20.2.1.1 Nematodai

Chemoreceptorių ląstelės ir jų molekuliniai receptoriai yra gerai ištirti Caenorhabditis elegantiškas . Deja, šios srities literatūrą trikdo tendencija chemoreakciją į vandenyje tirpius junginius vadinti „skoniu“, o cheminį atsaką į lakiuosius junginius vadina „uosle“, nors abiem atsakams tarpininkauti naudojamas tas pats galutinis organas (amfido chemoreceptoriai). Kaip aptarta aukščiau, skonio ir kvapo atskyrimas pagal cheminę dirgiklio prigimtį paprastai nėra naudingas (pvz., palyginkite šamų skonį ir uoslę). Gerai ištirtas nematodo chemoreceptorius C. elegans susideda iš suporuotų varliagyvių organų, kurių kiekvieną inervuoja 12 neuronų (1 pav. ir kt., 1975). Iš jų 11 yra chemosensoriniai, kiti yra termoreceptiniai (Bargmann ir Mori, 1997). Aštuoni chemosensoriniai neuronai (ADF, ADL, ASE, ASG, ASH, ASI, ASJ, ASK) išplečia dendritus per amfido poras odelėse, kad būtų gana tiesioginiame kontakte su aplinka. Šios ląstelės reaguoja į vandenyje tirpias medžiagas. Trys kiti amfido chemosensoriniai neuronai (AWA, AWB, AWC) turi dendritus, besitęsiančius netoli amfido porų, tačiau yra uždengti „apvalkalo“ arba „sparno“ ląstele ir todėl neturi tiesioginio kontakto su aplinka. AWA, AWB ir AWC ląstelės reaguoja į lakias medžiagas, tikriausiai tas, kurios gali išsisklaidyti arba būti pernešamos per apvalkalo elementą. Dažniausiai tiriamas chemotaksinis elgesys yra beveik vien nulemtas šių amfido chemoreceptorių (Bargmann ir Mori, 1997). Kaip aprašyta aukščiau, nematodų chemotaksinis elgesys paprastai skirstomas į „skonį“ ir „kvapą“ pagal cheminio dirgiklio pobūdį (atitinkamai tirpus vandenyje arba lakus). Aš siūlau, kad visas elgesys, sukeliamas varliagyvių, turėtų būti labiau traktuojamas kaip „kvapas“, nes nė vienas iš išmatuotų elgsenų nėra susijęs su įtariamo maisto objekto skoniu. Greičiau amfidra skatina judėjimo elgesį, kaip ir uoslės pojūtis stuburiniams gyvūnams skatina artėjimo / vengimo judėjimo reakcijas.

Nematodai, įskaitant C. elegans, turi aibę mažiau žinomų chemoreceptorių – vidinių lūpų neuronų, kurie yra labiau burnos ertmėje ir, atrodo, tarpininkauja į skonį panašų elgesį (Tabish ir kt., 1995). Tačiau mažai žinoma apie šių perioralinių numanomų chemoreceptorių funkciją ar atsakus. Trett ir Perry (1985), remdamiesi struktūra, teigia, kad vidinės lūpų sensilla IL2 neuronas veikia kaip kontaktiniai chemoreceptoriai (kaip aprašyti skonio pumpurai), tačiau šios spėlionės dar turi būti patvirtintos funkciniais ar elgesio tyrimais. Iki šiol tirti nematodai turi šešias radialiai simetriškas suporuotas vidines lūpų sensiles su kutikulinėmis angomis, nukreiptomis į vidinę burnos ertmės rostralinio galo pusę (žr. 1 pav.). Kiekvieną sensilumą inervuoja du neuronai (IL1 ir IL2), iš kurių vienas (IL2) tęsia procesą, kad pasiektų išorinę aplinką, o kitas sensorinis dendritas baigiasi tiesiai po paviršiumi po odelės anga (Ward). ir kt., 1975). Tačiau parazitų rūšių vidinė lūpų sensilla gali būti tik mechanosensorinė, nes jų jutimo procesai negali patekti į paviršių ( Fine ir kt., 1997), tačiau tokia tvarka netrukdys aptikti lakiųjų medžiagų, tokių kaip AWA, AWB ir AWC amfido neuronai.

Figūra 1 . Chemoreceptorių organai ant nematodų galvos. a, Diagrama, rodanti galvos sensilla vietą Pratylenchus sp. CS, cefalinis sensillum ILS, vidinis lūpų sensilumas OLS, išorinis lūpų sensilumas. b, vidinio lūpų sensilumo diagrama (a skydelyje pavaizduota raudonai). IL2, kurio dendritinis galas yra veikiamas išorinėje aplinkoje, yra chemosensorinis neuronas, o IL1, kurio galas nėra veikiamas, yra mechanosensorinis. c, amfide yra daug chemosensorinių neuronų, kurie aptinka arba tirpias (ASE, ASG, ASH, ADF, ADL, ASI, ASJ, ASK) arba lakias (AWA, AWB, AWC) medžiagas. Neaišku, ar amfido chemoreceptoriai turėtų būti laikomi „skoniais“ pagal šiame skyriuje pateiktą apibrėžimą, nes šių receptorių ląstelių stimuliavimas sukelia chemotaksį, o ne maitinimą. a, Atkurta iš Trett, M. W. ir Perry, R. N. 1985. Funkcinės ir evoliucinės šaknų pažeidimo nematodų rūšių (genties) sensorinės anatomijos pasekmės Pratylenchus). Revue Nematol. 8(4), 341–355, gavus IRD leidimą. b, Piešinys, pagrįstas Ward, S., Thomson, N., White, J. G. ir Brenner, S. 1975. Elektroninė mikroskopinė nematodo priekinės sensorinės anatomijos rekonstrukcija Caenorhabditis elegantiškas. J. Comp. Neurol. 160(3), 313–337. c, atgaminta iš uoslės epitelio ląstelių biologijos. In: Neurobiology of Taste &amp Smell Farbman, A. red. T. E. Finger, W. L. Silver ir D. Restrepo Autorių teisės © 2000, Wiley. Perspausdinta su John Wiley &amp Sons, Inc. leidimu.


7. Užšaldymas ir atkūrimas C. elegans akcijų

Caenorhabditis elegantiškas gali būti užšaldytas ir neribotą laiką laikomas skystame azote (− 196 ° C) (Brenner, 1974). Sėkmingo užšaldymo raktai yra tinkamo vystymosi stadijos gyvūnų naudojimas, glicerolio pridėjimas į šaldymo terpę ir laipsniškas aušinimas iki -80 °C. Šviežiai išbadėjusios jaunos lervos (L1-L2 stadija) geriausiai išgyvena užšaldant. Gerai šeriami gyvūnai, suaugusieji, kiaušinėliai ir daueriai gerai išgyvena. Geriausia naudoti kelias lėkštes sliekų, kurios ką tik išnaudojo E. coli OP50 veja, kurioje yra daug L1-L2 gyvūnų. Naudojamas 15 % galutinis glicerolio tūris šaldymo tirpale. Užšaldant pageidautina, kad temperatūra per minutę sumažėtų 1 °C. Tai galima pasiekti sudėjus kirminus (į šaldiklio buteliukus) į polistirolo talpyklą -80 °C temperatūroje. Putų polistirolo talpykla gali būti komercinė gabenimo dėžė (kurios sienelės yra bent ¾ colio storio) arba maža putų polistirolo dėžutė su angomis laikantys buteliukus. Po 12 ar daugiau valandų -80 °C temperatūroje buteliukus su šaldikliu reikia perkelti į nuolatinę šaldiklio vietą ilgalaikiam saugojimui.

CGC šaldymui naudojami du sprendimai C. elegans : skysto užšaldymo tirpalas (Brenner, 1974) ir minkštas agaro šaldymo tirpalas (Leon Avery, asmeninis bendravimas). Ilgalaikiam atsargų laikymui skystame azote rekomenduojamas skystas užšaldymo tirpalas. Naudojant šį tirpalą, kirminai nusėda ant šaldiklio buteliuko dugno, todėl jokie gyvybingi gyvūnai negali būti lengvai paimti neatšildžius viso buteliuko turinio. Minkštas agaro užšaldymo tirpalas yra naudingas užšaldant darbines atsargas C. elegans . Agaro pridėjimas padeda išlaikyti kirminus pakibusius visame tirpale. Galima paimti nedidelį kaušelį užšaldyto turinio, o likusį galima palikti buteliuke ir grąžinti į šaldiklį, kad vėliau būtų galima naudoti. Buteliukai, užšaldyti naudojant minkštąjį agaro užšaldymo tirpalą, turi būti laikomi -80 °C temperatūroje. Jei jie laikomi skystame azote, turinys tampa per kietas ir buteliuką reikės pašildyti, kad būtų galima išimti kaušelį turinio. Atšilimo laikotarpis sumažina gyvų kirminų ištraukimo iš buteliuko skaičių. Laikant -80 ir°C temperatūroje, buteliuko nereikia šildyti, jo turinys yra pakankamai minkštas, kad jį būtų galima naudoti nedelsiant. Iš kiekvieno minkšto agaro atsargų buteliuko 3–4 kartus pašaliname kirminus.

Kirmėlės gali būti užšaldytos 1,8 ml kriotaneliuose. CGC naudoja „Nunc Cryotube“ buteliukus (#65234) su vidiniais sriegiais ir užšaldo šešis kiekvienos gautos padermės buteliukus. Du buteliukai užšaldomi naudojant minkštąjį agaro užšaldymo tirpalą ir laikomi +8722 80 °C temperatūroje, kad būtų naudojami kaip darbinės atsargos. Keturi buteliukai užšaldomi naudojant skystąjį užšaldymo tirpalą, vienas atšildomas kaip testeris, o kiti trys įdedami į mažiausiai dvi skirtingas skysto azoto talpyklas. Norint užpildyti įtempimo užklausas, naudojamos darbinės atsargos, kurios laikomos − 80 °C temperatūroje. Kai ištuštinamas paskutinis atsargų, laikomų − 80 °C, buteliukas, kirminai vėl užšaldomi naudojant minkštąjį agaro šaldymo tirpalą, kad būtų pakeisti šie buteliukai. Teoriškai skystame azote laikomų atsargų niekada nereikės naudoti, nes minkštųjų agaro atsargos nuolat keičiamos, kai jos išsenka.

Atsigavimas C. elegans iš atsargų, laikomų skystame azote, yra 35–45% viso sušaldytų gyvulių skaičiaus. Šis skaičius po daugelio metų laikymo skystame azote sumažėja tik šiek tiek. Daugelį metų − 80 °C temperatūroje (> 10) laikomų atsargų atgaunamas ne toks didelis, kaip skystas azotas, tačiau tokiu būdu kirmėles galima saugiai laikyti daugelį metų (CGC, neskelbti duomenys). Žinoma, dingus elektrai gali būti prarastos visos atsargos, laikomos − 80 °C temperatūroje, todėl labai protinga bent vieną visų atsargų kopiją laikyti skystame azote. Kai kurios mutantų padermės (ypač tam tikri Dpy mutantai) neišgyvena sušalę taip gerai, kaip laukiniai gyvūnai.

Protokolas 7. Užšaldymas C. elegans naudojant skystą šaldymo tirpalą

S buferis [129 ml 0,05 M K2HPO4, 871 ml 0,05 M KH2PO4, 5,85 g NaCl]


Kaip smegenys kompensuoja jutimo praradimą ir nurodo savo ankstyvąsias evoliucines šaknis

Caenorhabditis elegantiškas. Vaizdas: Vikipedija.

Žmogaus smegenys turi nepaprastą gebėjimą reaguoti į jutimo praradimą, sustiprindamos likusius veikiančius pojūčius. Dėl kompensavimo mechanizmo smegenyse, žinomo kaip kryžminis plastiškumas, kai kurie pojūčiai sustiprėja praradus kitą jutimo įvestį, pavyzdžiui, pagerėja aklų žmonių klausa.

Iki šiol šis mechanizmas buvo tiriamas žmonėms ir kitiems žinduoliams, darant prielaidą, kad tai yra sudėtingų smegenų, susidedančių iš milijardų ląstelių, pavyzdžiui, žmonių, funkcija. Dabar naujas tarptautinis tyrimas, kuriam vadovavo Jeruzalės hebrajų universiteto mokslininkai, atskleidė, kad smegenų kompensacinis mechanizmas yra pagrindinis bruožas, kuris egzistuoja ir ne tokiose sudėtingose ​​nervų sistemose. Tyrimas taip pat atskleidė, kaip mechanizmas veikia smegenyse per tarpsensorinę signalizacijos sistemą.

Tyrimas, kuris buvo paskelbtas žurnale PLOS biologija, buvo atliktas kartu Izraelio ir Kanados medicinos tyrimų institute (IMRIC) Hebrajų universiteto Medicinos fakultete, bendradarbiaujant su MRC molekulinės biologijos laboratorija Kembridže (JK) ir Fredo Hutchinsono vėžio tyrimų centru Sietle (JAV). .

"Vienas žaviausių smegenų galimybių yra gebėjimas kompensuoti jutimo įvesties praradimą. Galime daug pasimokyti iš to, kaip gana paprasta nervų sistema gali vykdyti tokią sudėtingą smegenų funkciją kaip ši. Šiame tyrime atskleidėme viršutinę nervinio sudėtingumo, reikalingo tokiam kompensaciniam mechanizmui, ribą, kuri leidžia mums lengviau ištirti ir suprasti, kaip jis veikia, nuo molekulinio iki elgesio lygio“, – sakė dr. Ithai Rabinowitch, vadovavęs mokslinius tyrimus dirbdamas Hebrajų universiteto Medicininės neurobiologijos katedroje.

Siekdama geriau suprasti, kaip veikia kryžminis plastiškumas, tyrėjų grupė ištyrė organizmą, kurio nervų sistema iš esmės ne tokia sudėtinga nei žmonių – apvaliąją kirmėlę C. elegans. Jis yra vieno milimetro ilgio, minta bakterijomis, o jo nervų sistemoje yra tik 302 neuronai (palyginti su 100 milijardų žmogaus smegenyse).

Tyrėjai ištyrė ryšį tarp lytėjimo praradimo ir galimo uoslės pagerėjimo. Norėdami tai padaryti, jie sutelkė dėmesį į kirminus, turinčius genetinę mutaciją, kuri pašalina jų lytėjimo jausmą.

Jie išsiaiškino, kad C. elegans mutantai, kurie negali jausti prisilietimo prie kūno, turi patobulintą uoslę. Jie sugebėjo tiksliai nustatyti šį jutimo veikimo pokytį su specifinės sinapsės stiprumo pokyčiu uoslės grandinėje.

„Mes sugebėjome pakeisti šiuos efektus dirbtinai stimuliuodami lietimo neuronus ir sukūrę naują sinapsę į uoslės grandinę“, – paaiškino daktaras Rabinovičius. „Dar turime nuveikti ilgą kelią, bet jau galime galvoti apie būsimas programas, skirtas gydyti nepageidaujamą šalutinį poveikį praradus jutimo įvestį.

Šis tyrimas papildo daugybę tyrimų, kuriuose tiriamas neuropeptidų vaidmuo smegenų tarpsensorinėje signalizacijoje, ir išplečiamos žinios apie ląstelių ir molekulinius procesus, kuriais grindžiamas kryžminis modalinis plastiškumas. Šie rezultatai taip pat gali rodyti senovės evoliucines šio kompensavimo mechanizmo šaknis, dabar, kai jis buvo atskleistas daug mažiau išvystytoje sistemoje nei mūsų.


Lietimo reflekso grandinė

Lietimo receptorių neurono mechaninių dirgiklių jutimas sukelia judėjimo ir kitokio elgesio pokyčius. Judėjimas nuo prisilietimo dirgiklio kontroliuojamas trijų neuronų reflekso grandine. C. elegans judėjimas atsiranda dėl kintamo nugaros ir ventralinės sienelės kūno raumenų susitraukimo. Šį raumenų susitraukimą suaktyvina ventralinės virvelės motoriniai neuronai (A motoriniai neuronai – judėjimui atgal ir B motoriniai neuronai – judėjimui į priekį), kuriuos savo ruožtu reguliuoja keturios poros interneuronų, besitęsiančių per visą pilvo virvelę (AVA ir AVD judėjimui atgal AVB ir PVC judėjimui į priekį) [13]. Lietimo neuronai sudaro tarpines jungtis su šiais interneuronais, kad suaktyvintų judėjimą nuo lietimo dirgiklio (priekiniai lietimo neuronai prie AVD ir užpakalinės PVC antrinės jungtys apima kitus interneuronus) [13]. Kad būtų išvengta tuo pačiu metu veikiančių pirminių ir atvirkštinių reakcijų, priekiniai ir užpakaliniai lietimo neuronai taip pat sudaro spėjamas slopinančias glutamatergines sinapses su interneuronais, kuriuos aktyvuoja kiti lietimo neuronai (priekiniai lietimo neuronai prie PVC ir užpakaliniai su AVD) [13, 47].

Atrodo, kad santykinis reflekso grandinės stiprumas keičiasi vystymosi metu, kaip matyti iš reakcijos į plokštelės bakstelėjimą, kuris sukuria nekryptinį stimulą, kuris, tikėtina, suaktyvina ir priekinį, ir užpakalinį prisilietimą [93]. In early larva, C. elegans responds to plate tap by either moving forward or reversing at equal frequencies, suggesting the head and tail-touch circuits display equal strength and sensitivity. However, older animals almost always reverse, pointing to a developmental preeminence of the anterior touch circuit that corresponds to the rise of the postembryonic touch receptor neurons AVM and PVM [18].

In addition to locomotion, touch sensed by the touch receptor neurons modulates feeding behaviors, egg laying, and defecation. C. elegans slows upon encountering bacterial food, a texture-sensing behavior requiring the dopaminergic CEP, ADE, and PDE neurons [68]. The touch neurons synapse onto these neurons [13] and may override their signaling in preference of moving away from the touch stimulus [56]. Stimulating touch receptor neurons also suppresses pharyngeal pumping and head oscillations in foraging behavior. The mechanism for suppressing pharyngeal pumping is unknown, though the touch neurons form connections with PVR neurons that synapse onto neurons in the pharynx [13]. Suppression of head oscillations results from anterior touch stimulation of the AVD and AVA interneurons, which trigger RIM neurons to release tyramine that inhibits motor neurons and contraction of muscles radially surrounding the base of the head [1]. In both cases, the feeding behavior of the worm is suspended as touch avoidance becomes paramount. Touch stimulation also suppresses egg-laying behavior. Egg laying requires HSN neurons, which receive chemical synapses from PLM neurons that may inhibit their function [13]. Finally, touch stimulation also resets the defecation cycle of the animal [49], though no intermediate neural connections have been identified.


Metodai

Strains, genome sequencing, and transgenesis

C. elegans strains were propagated as described 50 and N2 and TU2769 uIs31 [pMec17::GFP] were used as wild-type controls. A complete list of strains is presented in Supplementary Table 1. All experiments were performed with L4 or young adult hermaphrodites.

The molecular defect in unc-70(e524) ir unc-70(n493) was determined by sequencing genomic DNA isolated from mixed staged worms (gDNA kit, Qiagen). In brief, the fragment corresponding to the unc-70 locus was amplified with long-range PCR with the primers MK16 and MK09R (Supplementary Table 2). A 9000-bp fragment was isolated and sequenced to reveal a single consistent nucleotide change apparent in each mutant: unc-70(e524) encodes G6024A and E2008K, while unc-70(n493) encodes T6132C and L2044P (Supplementary Fig. 1).

Young adult worms were injected with constructs of interest (25ng·μl 𢄡 or 10ng·μl 𢄡 ) together with a co-transformation marker (Pmyo-3::mCherry, Pmyo-2::mCherry, or Punc-122::RFP at 2� ng·μl 𢄡 ) and linearized N2 carrier DNA (50ng·μl 𢄡 ). At least three lines were subjected to initial analyses results from a single line are presented for clarity. UNC-70 isoforms were injected into unc-70(s1502)oxIs95 animals, which harbor a null allele of unc-70 and an integrated transgene that restores wild-type UNC-70 to the hypodermis 18 . Strains carrying stable arrays were crossed with N2 Bristol to create strains carrying the same array in both the unc-70(s1502) and N2 backgrounds. Transgenic expression of UNC-70(TSMod) in unc-70(s1502) mutants partially rescued locomotion and touch defects. Other transgenics were created in an N2 wild-type background.

Constructs for transgenic expression

Wild-type UNC-70

A plasmid encoding wild-type UNC-70 was built as follows. First, RNA was extracted from mixed stage worms (TRIZOL, Ambion RNA isolation kit), eluted in RNAse-free water, and used as template for RT-PCR (VILO cDNA kit, Invitrogen), which was conducted in the presence of RNAse inhibitor (Superrase, Ambion). unc-70 cDNA was isolated in two fragments: a 5′ 3200 bp fragment was amplified with primers MK16 and MK12R and 3′ 3600 bp fragment was amplified with primers MK13F and MK09R. The two fragments were joined using overlap extension PCR (Phusion polymerase, NEB) and blunt-cloned into a pCR Blunt sequencing vector (Invitrogen). Sequencing this product revealed that it corresponds to the major transcript encoded by unc-70, K11C4.3a, which is expressed in adult neurons, hypodermis and muscles 17, 18 .

The endogenous unc-70 promoter was isolated from genomic DNA using primer pair MK17, which contains a HindIII site and an SpeI site, and cloned into the pCR Blunt vector to create pCR:pUnc70. Both, pCR:pUnc70 and unc-70 cDNA were digested with HindIII and SpeI to create pCR:unc70E containing the endogenous promoter fused to the full-length unc-70 open reading frame. In a last step, unc-54 3′UTR was inserted into pCR:unc70E and injected into unc-70(s1502)oxIs95 transgenic animals together with co-transformation marker, Pmyo-3::mCherry unc-70(s1502)oxIs95 mutant animals expressing full-length unc-70 cDNA showed a complete rescue of the uncoordinated (Unc) phenotype associated with unc-70 (not shown).

UNC-70(TSMod)

The tension sensor, TSMod 5 , was inserted into UNC-70 in between spectrin repeats 8 and 9, following residue 1166. This was accomplished with a four-way way Gateway ™ recombination strategy. The four entry clones contained: (1) unc-70 promoter, as described above (2) the N-terminal fragment of unc-70 (encoding residues 1-1166), (3) TSMod and (4) the C- terminal fragment of unc-70 (encoding residues 1167-2267) fused to the unc-54 3′UTR. The fragments were amplified by PCR using primers 1𠄸 (Supplementary Table 2) and combined with the appropriate DONR vector in a standard BP reaction, yielding four Entry clones: pENTR Unc70P[1 5], pENTR ATG-R8[5 4], pENTR TSMod[4 3] and pENTR R9-TAA[3 2]. These clones were combined in a standard LR reaction overnight with pDEST14 (Invitrogen) yielding the assembled construct Punc-70::UNC-70(1 to 1166)::TSMod::UNC-70(1167 to 2267)::unc-54 3′ UTR, which was verified by sequencing.

High FRET (5aa), low FRET (TRAF), cytoTSMod, and N-TSMod

Constitutively high FRET and low FRET constructs were made by replacing the TSMod sensor in UNC-70 with mTFP-Venus FRET pair separated by a 5aa linker or a TRAF domain, respectively 35, 38 . Entry clones were made as described above, yielding pENTR TSMod5aa[4 3] and pENTR TSModTRAF[4 3].

Cytoplasmic TSMod (cytoTSMod) was isolated from pENTR TSMod[4 3] using the MK42 primer pair and cloned into pCR pUnc70E using the restriction sites Spe1 and Nsi1. The unc-70 cDNA coding sequence in pCR pUnc70E was removed by cutting with Spe1 and Pst1-HF, leaving the unc-70 promoter and unc-54 3′UTR in the backbone.

An N-terminal fusion of TSMod to UNC-70 was made as follows: TSMod was amplified by PCR using primers MK42F and MK43R flanked by SpeI and SalI restriction sites and inserted after the first 15 bp of unc-70 cDNA under the control of the endogenous unc-70 propaguotojas. The TSMod and unc-70 sequences were separated by a flexible linker consisting of five glycines.

Dominant-negative SPC-1 α spectrin

Single step RT-PCR was performed as described above using primer pair MK42 to amplify a cDNA encoding the first 170 residues of SPC-1 a spectrin, which contains spectrin domains 0 and 1 (Ref. 51). The resulting product was cloned into vector MG115 containing pMEC-17 52 and a C-terminal mCherry tag.

Dynamics of body and neuron curvature

Image collection

To image neuron dynamics in moving worms at high resolution ( Fig. 1 , ​ ,2 2 and Supplementary Fig. 2, 3), individual uIs31 [TRN::GFP] worms were mounted on 1𠄲% agarose pads, as described 53 . Worms were free to move without crawling out of the field of view, allowing diffraction-limited observation of neuron morphology. Still images and short movies (0.5 fps, about 75 s) were collected at 20x magnification on a Leica SP5. These movies were analyzed posthoc to derive the curvature of both the body and the AVM neuron, neuron length, L, and neuron strain, ΔL/L. At least 17 animals and an average of 6.9 still images were examined for each genotype.

Image analysis

Body curvature was calculated as follows: Using Fiji (Ref. 54), the ventral side of the animal was marked with 10� individual points between the terminal bulb of the pharynx and the nose. The coordinates were imported into IgorPro (Wavemetrics) to calculate curvature according to:

Where, x′ ir x″ are the first and second derivative of the projection in x ir y atitinkamai. When the animal bends toward its ventral (dorsal) side, curvature is positive (negative). Body curvature was used together with a model of body deformation (Supplementary Information) to calculate body strain ( Fig. 1c ).

Neuron (AVM) curvature was measured by modifying the strategy for body curvature to account for bucking observed during ventral flexures in unc-70 mutantai. The neurite was traced with 20� points distributed along a

100 μm segment centered at the nerve ring and the curvature at each point was calculated. The mean±standard deviation (SD) of these curvatures yielded one data point ( Fig. 2b , Supplementary Fig. 3b). The standard deviation of the neuron curvature in each frame was calculated as a running average of 20 frames and plotted against body curvature ( Fig. 2b , Supplementary Fig. 2b, S3b).

Neuron length, L, was determined by tracing the anterior branch of AVM from the nerve ring to the nose. This path was imported into IgorPro and the length and curvature of that path was calculated for several consecutive images in a stack. Neuron length was normalized to yield the effective strain, (LL0)/L0, su L as the instantaneous neuron length and L0 is the length as zero curvature, which was determined by fitting a line to the raw data (L(c) = L0 +χ୼) and estimated from the fit parameters according to L(0) = L0. The slope, Χ, is a measure of the compliance (inverse of the stress) of the neuron.

Dynamic AFM force spectroscopy

Primary cell culture

Touch receptor neurons were isolated from wild-type (TU2769 uIs31) and mutant animals using standard protocols 55 and plated onto peanut lectin-coated glass bottom Petri dishes (WillCo). Mixed cultures of embryonic cells were grown for up to 7 days in L-15 medium supplemented with heat-inactivated fetal calf serum (10% v/v), penicillin (10mg mL 𢄡 ), and streptomycin (100 units). Individual TRNs were visualized by their expression of GFP ( Fig. 3a ).

AFM force spectroscopy

We used an AFM designed for cell measurements (Bruker BioScope Catalyst, generous loan of Stephen Minne, Andrea Slade and James Shaw, BrukerNano) mounted on a Nikon Eclipse 2000 equipped for epifluorescence to perform AFM force spectroscopy as described 56 . Cantilevers (Olympus Biolever, 6mN m 𢄡 ) were coated overnight with peanut lectin (1 mg/mL) in MES buffer (pH 6.0, 50 mM) and calibrated according to a thermal noise method 57 .

Individual TRNs were identified by GFP fluorescence and positioned under a cantilever, which was used to pull membrane nanotubes after 100� ms contact time and 400 pN contact force. Interaction frequency was adjusted so that

20% of all cell-cantilever contacts yielded a nanotube event, a maneuver that ensures that only single tether events were analyzed. Pulling velocity was changed randomly to decrease history effect. No history effect was observed. The number of cells analyzed for each genotype and condition is given in Supplementary Table S3. Force-distance curves were analyzed using a step fitting algorithm 56 . Mean tether force was plotted against extrusion velocity and fit to a recently proposed model 30 to estimate the static force, f0, which was used to estimate tension according to f 0 = 2 π 2 κ ( T m + W 0 ) 29, 30 , where Tm is the in-plane membrane tension and W0 is the bilayer-cytoskeleton adhesion energy, and κ is the bending rigidity. The bending rigidity was assumed to be 2.7 · 10 � Nm (Ref. 29). Log-log transformed data was used to perform linear regression followed by Tukey-type test on multiple regressions in order to assess statistical significance as a function of genotype. Logarithmically transformed data was well fit by a line with slope 1/3 (not shown) as predicted by the power law 30 . The p-value is shown in Fig. 3 for individual comparisons under the hypothesis that the elevation of the line is the same. Latrunculin A (1μM) and Cytochalasin D (2μM) were applied to cells, treated TRNs were analyzed by dynamic AFM force spectroscopy and compared to data drawn from untreated neurons analyzed on the same day.

In vivo laser axotomy and analysis of neurite retraction

Young adult wild type and mutant worms were immobilized in a drug-free manner using a 5% agar pad, as described 53 . All strains used for these experiments ( Fig. 4 , Supplementary Fig. 4) contained the uIs31 transgene to drive GFP expression in the TRNs. Immobilized worms were placed on the stage of a laser scanning confocal microscope equipped with two, pulsed Ti::Sa lasers (Prairie Technologies). One laser was used for imaging and the other for axotomy. Both lasers have an average power of 2.7 W (at 860 nm), 190 fs pulse width and a repetition rate of 80MHz. The ablation laser was tuned to 720 nm and GFP imaging was performed at 920nm. The energy per pulse of the ablation laser was attenuated to

2 nJ and a pulse train of

2 ms was delivered into the sample through a 60x, 0.9 NA water immersion objective. In order to achieve a focused spot at the sample plane, the ablation laser beam was expanded to fill the back aperture of the microscope lens.

To quantify the evolution of the gap-width vs time, kymographs were binarized, denoised and outlined in Fiji. Measurement of the distance of the two neuronal ends from the outlined image was performed in IgorPro. The time evolution of the resulting gap width was fitted to a single exponential as described 33 .

In vivo FRET imaging and analysis

Image collection

Young adult worms were immobilized without drugs on a 5% agarpad, as described 53 and imaged with a 63x/1.32 oil immersion lens on a confocal microscope equipped with an Ar ion laser and avalanche photodiode detectors coupled to an upright microscope equipped for epifluorescence illumination (Leica SP5 II, Leica DM6000). Donor (mTFP) and acceptor (Venus) fluorophores were activated with the 458nm and 514nm laser lines, respectively and collected with photodiode detectors tuned to 465�nm and 520�nm, respectively. Detector collection efficiency and linearity was determined by imaging dilute, homogenous FITC solutions (0.001�%, in logarithmic increments) and based on this measurement the gain on the donor and acceptor sensors were adjusted to 150% and 100% to equalize detection efficiency φD/φA. Exact values were determined based on the counts at a given ROI for these settings. Bleed-through factors were determined by imaging transgenic worms with an intact donor (GN495) or acceptor (GN498) fluorophore prior to each imaging session and were 0.37ଐ.05 for the donor channel and 0.17ଐ.07 for the acceptor channel.

Three image types were collected for each neurite: 1) acceptor excitation-acceptor emission (A) 2) donor excitation-donor emission (D) 3) donor excitation-acceptor emission (F). Portions of the ALM and PLM neurites were identified for imaging based on animal orientation and morphology other neuronal ROIs included neurites arranged parallel to the long axis of the worm’s body.

Image analysis and estimation of FRET efficiency by sensitized emission

For each micrograph, intensity profiles were computed across the diameter of the neurite of interest and fit by a Gaussian to estimate the background intensity, neurite width, and centerline position. The latter information (width, centerline) was used to determine the relevant ROI for subsequent processing. This process was applied to all images to yield the data required to estimate FRET efficiency by sensitized emission following a linear correction for spectral bleed-through. The FRET efficiency, E was computed on a pixel-by-pixel basis according to:

Where, cF ir qD are the bleedthrough-corrected values for the FRET and donor channels, respectively, KD is the quantum yield of the donor chromophore 38 , and ψDA is the ratio of the collection efficiencies of the donor and acceptor emission sensors. The uncertainty of each pixel was estimated as described 58 and pixels with errors 𾔀% were rejected from analysis the remaining pixels were averaged to yield an average E for each ROI.

To better understand the accuracy of this sensitized emission technique, we also performed fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on the same transgenic animals as described 38 . Briefly, worms were immobilized as described and imaged with an SP5 confocal system equipped with a Becker&Hickl SPC-150 module for time-correlated photon counting. Photons were accumulated for up to 150 frames using a 20x oil immersion lens and υ% transmission of a pulsed Ti::Sa laser at 870nm through a 475/28nm emission bandpass filter.

Fluorescence lifetime histogram was fitted using a double exponential decay function, convolved with a synthetic IRF, to extract the amplitude weighted mean of the two components of the excited state lifetime. The lifetime of the donor by itself (in absence of the acceptor) was measured using mTFP transfected MDCK cells. FRET efficiency was calculated according to E = 1 - τ D A τ D D in which τDA is the lifetime of the donor in presence of the acceptor and τDD is the lifetime of the donor alone. These independent estimates of FRET efficiency yielded essentially identical values for all TSMod isoforms tested (Supplementary Fig. 6). Moreover, FRET efficiency values for the low FRET (TRAF) and high FRET (5aa) UNC-70 isoforms are similar to published values derived from in vitro measurements of mTFP-TRAF-Venus and mTFP-5aa-Venus 35 .

FRET imaging following laser axotomy

Transgenic animals expressing UNC-70(TSMod) and UNC-70(TRAF) were immobilized on the stage of the Leica SP5 imaging station and TRNs were axotomized with a pulsed Ti::Sa laser (2.7W, 860nm) using 70% transmission and were ablated by scanning over a 1024휲 pixel ROI for 200ms and allowed to retract for

5 s before imaging the proximal end, as described above. A final image was taken to calculate FRET after cutting.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)

Transgenic animals were immobilized on agarose pads, as described 53 and placed on the stage of confocal microscope. UNC-70(TSMod) was analyzed with a Leica SP5 II and a 63x/1.3 oil immersion lens. Under the control of FRAP Wizard software, a short segment (2𠄴 μm long) of a TSMod-expressing neurite was illuminated at full power for 1.5s at 458nm and 514nm. The same region of interest (ROI) was subsequently imaged for 10 frames at 0.6 fps and 20 frames at 0.1 fps, exciting the Venus fluorophore. This system lacked the temporal resolution needed to analyze rapid recovery of cytosplasmic cytoTSMod. Therefore, a Prairie Technologies dual 2-photon microscope was used to image and bleach the neurite of cytoTSMod simultaneously using 920nm excitation with a 60x/0.9 water immersion lens. A line scan of

10�μm in length was imaged at 1000 fps for 1s to image the recovery process. Image stacks were analyzed to plot intensity prieš time and fitted with to D = ln ( 2 ) ω 2 τ 59 .

Imunofluorescencija

Animals were fixed and subjected to antibody labeling as described 4 . Fixed animals were treated with anti-myotactin antibodies (MH46, Developmental Studies Hybridoma Bank) at 1:50 dilution in B-PBST (PBS + 0.1% Triton-X100 + 3% BSA), incubated overnight at 4ଌ, and washed several times in B-PBST. Next, samples were treated with an anti-mouse secondary antibody (Alexa567-tagged, 1:2000, LifeTechnologies) overnight, washed in B-PBST, and mounted in VectorShield, cured for several hours (4ଌ), and imaged in a Leica SP5 confocal system. Interpunctum interval (IPI) was determined from intensity profiles, as described 60 . The binsize for IPI histograms was calculated according to Freedman-Diaconis rule: width=3.49N 0.3 , where N is the number of observations. Histograms were normalized to yield a probability density function, which were fit by a Gamma-distribution.

Statistical and computational analysis

Unless indicated, computations and statistical analyses were performed using IgorPro 6.04 (Wavemetrics) and image analysis was performed with NIH ImageJ or Fiji software 54 .


Žiūrėti video įrašą: L4440 Treated C. elegans (Sausis 2023).