We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
The E. coli lac operonas
2.6.1 pav.: Lakas Operonas
- lac Z kodai, skirti b-galaktozidazė, kuris yra fermentas, skaldantis b-galaktozidus (pvz., laktozę).
- lac Y kodai, skirti permesti, kuris dalyvauja pernešant b-galaktozidus į ląstelę.
- lac A kodai, skirti b-galaktozido transacetilazė, kuris acetilina b-galaktozidus.
- Mutacija bet kuriame lac Z arba lac Y gali sukelti a lac- genotipas, t.y. ląstelės, kurios negali panaudoti b-galaktozidų kaip maistinės medžiagos.
- A lac A-mutantas, neturintis transacetilazės aktyvumo, vis dar gali panaudoti b-galaktozidus (vis dar yra lac+ genotipas). Jo vaidmuo bgalaktozidų metabolizme nėra aiškus.
Rėmėjas
DNR sritis, dalyvaujanti surišant RNR polimerazę, kad inicijuotų transkripciją.
Terminatorius
DNR seka, dėl kurios RNR polimerazė nutraukia transkripciją.
- Trijų genų klasteris, lac ZYA, yra transkribuojamas į vieną mRNR (policistroninis žinutė) iš a propaguotojas tik prieš srovę nuo lac Z genas.
- Viduje konors nebuvimas iš an induktorius genų klasteris yra ne perrašomas.
- Kai an induktorius pridedamas (pvz. laktozė arba nehidrolizuojamas analogas izopropiltiogalaktozidas – IPTG) transkripcija prasideda nuo vieno promotoriaus (lac P) ir per lac ZYA genus pereina į terminatoriaus seką, esančią pasroviui nuo lakas A genas.
Pastaba
Lac ZYA mRNR pusinės eliminacijos laikas yra ~ 3 minutės, o tai leidžia palyginti greitai pakeisti indukciją (t. y. ląstelės greitai nustoja gaminti fermentus, pasibaigus indukcijai).
2.6.1 pratimas
Su kokia molekule sąveikauja induktorius (laktozė), kad paveiktų transkripcijos reguliavimą (t. y. lac operono indukciją)?
- Atsakymas
Tai nėra b-galaktozidazė, permazė ar transacetilazė, tai yra atskiras baltymas, vadinamas represoriaus baltymu.
- Lac genus valdo mechanizmas, vadinamas neigiamas reguliavimas.
- Tai reiškia, kad jie yra transkribuojami, nebent juos išjungtų reguliatoriaus baltymas.
- Mutacija, kuri inaktyvuoja reguliatoriaus baltymą sukelia lacZYA genai būti nuolat reiškiamas.
Lac operone yra dviejų tipų genai:
- Struktūriniai genai - jie koduoja fermentus, reikalingus tam tikram biocheminiam keliui (pvz., lac Z, Y ir A).
- Reguliatoriaus genai - jie koduoja baltymus, dalyvaujančius reguliuojant struktūrinius genus.
lac I yra lac operono reguliatoriaus genas.
- Šis genas yra tiesiai prieš lac struktūrinių genų promotoriaus sritį.
- The lac I genas turi savo propaguotojas (konstitucinis) ir terminatorius.
- Jis sukuria monocistroninį pranešimą ir koduoja vieną baltymą - lac represoriaus baltymas.
- Tai gali užkirsti kelią transkripcijai
- Jis gali atpažinti ir surišti mažos molekulės induktorių (laktozę arba IPTG)
Lac represoriaus transkripcijos prevencija
- lac represorius (aktyvus kaip a tetramerinis baltymas) jungiasi prie DNR sekos, vadinamos operatorius (lac O regionas).
- Operatoriaus sritis yra tarp lac promotoriaus sritis (RNR polimerazės prisijungimo ir transkripcijos inicijavimo vieta) ir lac Z genas.
- Pirmosios 26 bazinės poros lac Z genas apima operatoriaus sritį.
- Nėra taip, kad represoriaus baltymas „blokuoja“ RNR polimerazės judėjimą per lac Z genas.
- Represorių surišimas ir RNR polimerazės prisijungimas (prie promotoriaus) yra vienas kitą paneigiantys prie lac rengėjas / operatorius (lac PO) regionas.
Kaip keičiasi represoriaus/operatoriaus sąveika esant induktoriaus molekulei?
- The induktorius gali prisijungti prie represoriaus ir sudaryti a represoriaus/induktoriaus kompleksas, kuris nebesieja su operatoriumi.
- Pagrindinis šios sąveikos bruožas yra tas represoriaus baltymas turi dvi surišimo vietas, vienas skirtas induktorius ir vienas operatoriui.
- Kai induktorius jungiasi savo vietoje, jis pakeičia represoriaus baltymo konformaciją taip, kad operatoriaus surišimo vieta turi daug mažesnį afinitetą DNR operatoriaus sričiai.
- Šis valdymo tipas vadinamas allosterinė kontrolė.
- Rezultatas toks pridedant induktorių, represorius paverčiamas tokia forma, kuri išsiskiria iš operatoriaus.
2.6.2 pav.: Induktorius
Teigiamai lac operono kontrolę atlieka cAMP-CAP kompleksas
- E. coli teikia pirmenybę gliukozė virš kitų anglies šaltinių.
- Kada E. coli auginamas ant gliukozės, jei dedama kito cukraus (pvz., laktozės). fermentai sužadinami panaudoti kitą cukrų tik tada, kai išnaudojama gliukozė.
- Kai E. coli badauja gliukozės, ji sintezuoja neįprastą nukleotidą: ciklinis 3'5' adenozino monofosfatas (ciklinis AMP arba CAMP):
2.6.3 pav.: CAMP
- Atrodo, kad bakterijose padidėjęs cAMP kiekis yra „perspėjimo“ signalas, rodantis žemą gliukozės kiekį:
2.6.4 pav.: cAMP lygio ir lac operono sąveika
Dibutirilo cAMP
- an analogas cAMP, kuris gali praeiti pro E. coli membraną ir į ląstelę.
- Jei jo bus dedama į terpę, kurioje yra gliukozės ir laktozės, tai sukels indukcija iš lac operonas.
- Taigi jis imituoja cheminį pranešimą, kuris apgauna E. coli reaguoti taip, lyg būtų gliukozės kiekis žemas.
- Mutantai iš E. coli buvo išskirti, kurių negalima paskatinti metabolizuoti bet koks cukraus, išskyrus gliukozę. Buvo dvi bendros mutantų kategorijos:
- I klasė. Fermento trūkumas adenilato ciklazė. Šie mutantai nesugeba gaminti cAMP net tada, kai gliukozės koncentracija yra maža.
- II klasė. Trūksta tam tikro baltymo, žinomo kaip cAMP receptoriaus baltymas (CRP) arba, taip pat žinomas kaip katabolito receptoriaus baltymas (CRP).
- Maksimali transkripcija iš lac operonui reikalingas a buvimas cAMP/CRP kompleksas.
- cAMP/CRP kompleksas jungiasi prie konkrečios sekos lac valdymo srityje, vadinamoje "BŽŪP“ svetainę.
- BŽŪP svetainė yra tiesiog prieš srovę iš RNR polimerazės surišimo vietos.
- CAP vietos mutacijos, kurios neleidžia prisijungti prie cAMP-CRP, taip pat užkerta kelią aukštam CAP ekspresijos lygiui lac operonas.
- Taigi, susietas cAMP/CRP kompleksas suaktyvina transkripcija (teigiama kontrolė), tuo tarpu įrišta lac represorius slopina transkripcija (neigiama kontrolė).
- cAMP/CRP kompleksas turi afinitetą DNR ir RNR pol.
- Pagerina kompleksinį RNR pol susidarymą su DNR promotoriaus sritimi.
Indukcija lac operonas su laktozės analogais
- The lac operonas gali būti sukeltas laktozės
- b-galaktozidazė (lacZ geno produktas) metabolizuoja laktozę
- Sumažėjus laktozės kiekiui, lac operonas vėl yra slopinamas lac represorius (lacI geno produktas)
- Nemetabolizuojami laktozės analogai gali nuolat sukelti (t. y. slopinti) lac operonas
- izopropil-b-tiogalaktozidas arba IPTG, yra nemetabolizuojamas laktozės analogas
DNR „pėdsakai“ eksperimentai
- Jei baltymas jungiasi prie DNR srities, jis gali apsaugoti tą DNR sritį nuo virškinimo dnaze (DNRazė I: endonukleazė vietose, esančiose greta pirimidino nukleotidų).
- DNR fragmentas gali būti pažymėtas 5' galuose 32P ir tada etiketė gali būti geriau pašalinta iš vieno galo (t. y. 3' geno galo) naudojant atitinkamą restrikcijos endonukleazę.
- Jei šis DNR fragmentas, kurio viename gale yra etiketė, sudaro kompleksą su DNR surišančiu baltymu, baltymas apsaugo DNR sritį, prie kurios jis jungiasi, nuo DNR I skaidymo.
- Virškinimas atliekamas taip, kad būtų neišsamus, šios diskusijos tikslais įsivaizduokite, kad kiekviena DNR molekulė yra suskaidoma tik vieną kartą. Be to, skilimo vieta atsitiktinai parenkama iš galimų vietų.
- DNR fragmentai, atskirti ir išanalizuoti pagal dydį (naudojant gelio elektroforezę) po virškinimo, parodys saugomą sritį:
2.6.5 pav.: DNR pėdsakas
Pėdsakai eksperimentų rezultatai
lac DNR, inkubuota su cAMP/CAP baltymu arba RNR polimeraze arba lac I represoriaus baltymu:
2.6.6 pav.: lac represorius su cAMP
RNR polimerazė sąveikauja su specifinėmis promotoriaus sekomis ir sukuria „pėdsaką“ ~ 70 bazinių porų srityje.
- Pastebėta, kad ši apsauga buvo akivaizdesnė vienoje sruogoje nei kitoje (ty jei kita kryptis buvo pažymėta, rezultatai neparodė tokios didelės apsaugos).
- Ši DNR apsaugos sritis apėmė DNR vietas, iš kurių mutagenezės eksperimentai sukėlė arba „aukštyn“ arba „žemyn“ promotoriaus stiprumo reguliavimą.
- Šios mutageninės „karštosios“ dėmės, turinčios įtakos promotoriaus stiprumui, buvo -10 arba -30 padėtyse prieš transkripcijos pradžios vietą (+1 padėtis aukščiau pateiktoje diagramoje):
2.6.7 pav.: Promoterio stiprumo mutacijos
- Promoterius galima klasifikuoti pagal jų „jėgą“.
- Tai reiškia giminaitį transkripcijos inicijavimo dažnis (transkripcijos inicijavimo įvykiai per minutę) ir yra susiję su RNR polimerazės afinitetas promotoriaus sričiai.
- Daug reklamuotojų E. coli buvo apibūdintos ir buvo nustatyta „konsensuso“ promotoriaus seka:
2.6.8 pav.: Konsensuso rėmėjo stiprumas
Pastaba
Lac promotorius yra santykinai silpnas propaguotojas
RNR polimerazė
- E. coli RNR polimerazė yra holofermentas, sudarytas iš subvienetų b', b, a (dimeras) ir s70.
- s70 Subvienetas yra subvienetas, kuris jungiasi prie promotoriaus srities, bet negali inicijuoti RNR sintezės.
- Po s70 subvienetas subvienetas jungiasi, kiti subvienetai jungiasi, sudarydami funkcinę RNR polimerazę.
- Po maždaug 10 bazinių porų transkribavimo s70 subvienetas lapai ir šerdies polimerazė tęsiasi toliau.
The lac Operatoriaus regionas
- The lac operatoriaus regioną sudaro (netobulas) apverstas kartojimas regione.
- Nenuostabu, kad aktyvios represoriaus molekulės yra sudarytos iš homodimero.
- Homodimero struktūroje yra pora a-spiralės sričių, kurios įterpiamos į gretimus pagrindinius DNR griovelius.
- Atstumas vienas nuo kito yra maždaug 34 angstremai.
Patikslinta atsakymų santrauka
Mano pirminis atsakymas pateikė įrodymų, kad trp represorius yra dimeras, ir ši išvada galioja, ypač kalbant apie jo funkcinę formą. Vis dar laikau teiginį Vikipedijoje, kad tai tetrameras, neteisingu, nors dabar matau, kaip jis galėjo atsirasti. Atrodo, kad tai klaidingai interpretuojami in vitro rezultatai, rodantys, kad gali egzistuoti pusiausvyra tarp dimero ir tetramero (ne tik tetramero). Išplėčiau tai papildomame skyriuje.
Funkcinis dimeris
Funkcinė forma tikrai yra dimeras, kaip iš pradžių pranešė Schievitz ir kt. (1985). Šio dokumento santraukoje yra toks teiginys:
„Escherichia coli trp represoriaus kristalinė struktūra buvo išspręsta iki atominės skiriamosios gebos. Dimerinis baltymas turi puikią subvieneto sąsają, kurioje penkios iš šešių kiekvieno subvieneto spiralių yra tarpusavyje susijusios.
Jis buvo kristalizuotas kartu su operatoriaus DNR, o struktūra buvo įrašyta į baltymų duomenų bazę (PBP) kaip 1TRO. Pateikiu vaizdą iš toliau pateikto PBP įrašo. Daugelis kitų DNR surišančių baltymų taip pat turi dimerines struktūras.
Tirpale stebima dimero ir tetramero pusiausvyra
Teiginys Vikipedijoje tikriausiai kyla iš Fernando ir Royer (1992) ataskaitos, kuri vėliau patvirtinta, kad tirpale yra pusiausvyra tarp dimero ir aukštesniųjų oligomerų (dominuoja tetrameras). Nustatyta, kad triptofanas perkelia pusiausvyrą į dimerą. Autoriai teigia, kad tai turi fiziologinės reikšmės, nors tai vis dar atrodo ginčytina.
2.6: Lac Operon BŽŪP svetainės DNR pėdsakai – biologija
BioBuilder&rsquos „iTune“ įrenginys veikla pabrėžia projektavimo-konstravimo-testavimo ciklo &bdquotest&rdquo etapą. Dirbsite su keliais fermentus generuojančios genetinės grandinės variantais. Grandinių DNR sekos skiriasi nedideliais skirtumais, todėl tikimasi, kad tai pakeis ląstelių gaminamo fermento kiekį. Norėdami kiekybiškai išmatuoti grandines ir rsquo išėjimus, naudosite fermentinį tyrimą. Tada palyginsite savo rezultatus su tuo, ką galėtumėte numatyti pagal žinomą šiek tiek skirtingų DNR sekų elgesį.
Daugumai sukurtų sistemų, reikšmingi skirtumai tarp stebimo ir numatomo elgesio yra nepriimtini. Kaip nurodyta 7-1 pav, ką aviacijos inžinierius pagalvotų apie naują sparno formą, kuri, pridėjus prie lėktuvo korpuso, privertė lėktuvą skristi netikėtais būdais? Projektavimas ir statyba tokio neapibrėžtumo akivaizdoje pareikalautų didelių išlaidų ir gali kilti pavojus gyvybei. Inžinieriams būtų beveik neįmanoma judėti į priekį kuriant savo dizainą, jei paprastų dalių ir veržlių bei varžtų arba rezistorių ir stiprintuvų deriniai sukeltų netikėtą elgesį.
7-1 pav. Nenumatytas elgesys. Keisdamas standartinę lėktuvo uodegą (kairėje) į naują formą (dešinėje), inžinierius turi susirūpinti dėl nenumatytų elgsenų, pavyzdžiui, skirtumų, turinčių įtakos tai, kaip lėktuvas gali saugiai nusileisti.
Labiau nusistovėjusios inžinerijos disciplinos remiasi moduliniais komponentais, kuriuos galima funkciškai surinkti įvairiais būdais, todėl derinius lengva pritaikyti pagal individualius ir asmeninius poreikius. Elementai turi būti ne tik fiziškai sujungti, bet ir sujungti, jie taip pat turi elgtis pagal specifikaciją. Paprasčiau tariant, Surinktos dalys turi veikti taip, kaip tikimasi.
Šiuo metu sintetinės biologijos srityje biologijos inžinieriai vis dar dirba siekdami tokio funkcinio genetinių dalių surinkimo. Nors mokslininkai apibūdino daugelį ląstelių elgsenos molekuliniu lygmeniu ir daugeliu atvejų galima suskirstyti į katalogą genetinius elementus, būtinus ir pakankamus biologinei funkcijai atlikti.derinant šiuos genetinius komponentus naujais būdais, dažnai gaunami netikėti rezultatai. Sintetiniai biologai netrukus galės fiziškai surinkti genetinę medžiagą, kad būtų galima palyginti lengvai surinkti bet kokią norimą seką, tačiau šios sekos įtraukimas į naują ląstelių kontekstą gali paveikti jos funkciją neaiškiai ir kintant, net jei seka buvo nuodugniai ištirta ir gerai apibūdinta. atskirai arba kituose kontekstuose.
Moduliškumas, izoliacija, ir matavimas dalių, be standartizavimo, yra labai svarbios sudedamosios dalys, užtikrinančios tokį funkcinį surinkimą (žr DNR inžinerijos pagrindai skyrių tolimesnei diskusijai). Šiame skyriuje nagrinėjame, kaip šie papildomi principai taikomi standartinėje inžinerijoje apskritai ir ypač sintetinėje biologijoje. Tada mes išsamiai aprašome „iTune“ įrenginio eksperimentą, kad išbandytume įvairias genetines grandines ląstelėse, kad palygintume jų numatomą ir išmatuotą elgesį.
Moduliškumas reiškia idėją, kad inžinieriai gali kurti ir generuoti sistemas, derindami funkcinius vienetus arba &bdquomodules.&rdquo Kad ir kaip intuityvi ši sąvoka skirta inžinerijai, moduliškumo idėja genetinėms dalims buvo pritaikyta visai neseniai. Moduliškumą tikslinga taikyti biologijai, nes tam tikriems DNR fragmentams galime priskirti atskiras funkcijas, tačiau, nors dabar šį principą laikome savaime suprantamu dalyku, norint jį patvirtinti, reikėjo atlikti reikšmingus tyrimus (žr. kitą šoninę juostą).
GENAI KAIP MODULIAI
Sintetinė biologija apima genetinių &bdquoparts&rdquo rinkinį, kurį galima derinti ir manipuliuoti, kad būtų sukurtas tikslus elgesys. Idėja, kuria grindžiama ši prielaida, ir kad bruožai kyla iš atskirų funkcinių DNR dalių ir iš tikrųjų yra palyginti nauja. Tik tada, kai XX amžiaus dešimtmečio pradžioje buvo iš naujo atrasti Gregor Mendel&rsquos eksperimentų su žirnių augalais rezultatai, mokslininkai pradėjo suprasti, kad bruožai gali išlikti skirtingi, o tai atveria kelią mūsų dabartiniam genetikos supratimui.
Ilgą laiką buvo manoma, kad palikuonys susilieja su tėvų genetiniais bruožais. Mendel&rsquos kruopštus darbas, veisdamas žirnių augalus, parodė, kad maišymas vyksta ne visada ir kad kartais bruožas gali būti ištikimai perduodamas iš motininio augalo į palikuonį. Mendelis atliko šiuos paveldėjimo tyrimus, atidžiai suskaičiuodamas ir išmatuodamas kai kuriuos pagrindinius savo žirnių augalų bruožus, tokius kaip gėlių spalva ir ankšties forma. Jo duomenys parodė, kad bruožai gali išlikti skirtingi ir buvo perduodami nepriklausomai nuspėjamu santykiu. Jo rezultatai rodo, kad paveldimumas turėtų būti vertinamas kaip atskiri subjektai, kuriuos jis pavadino veiksniais, bet kurie vėliau buvo pavadinti genais. Jo darbas parodė, kaip šie veiksniai nuspėjamai pereina iš kartos į kartą. Ši idėja šiandien laikoma savaime suprantama, tačiau savo laiku ji buvo novatoriška ir paskatino įkurti klasikinės genetikos sritį.
Prireikė daugiau nei 50 metų, kad būtų pateiktas molekulinis Mendelio pastebėtų paveldėjimo modelių paaiškinimas. Mūsų šiuolaikinis supratimas daugiausia priklauso nuo DNR ir rsquos dvigubos spiralės struktūros, kaip aprašė Watsonas ir Crickas, ir klasikiniais genų ekspresijos tyrimais lac operone iš Jacob ir Monod. Dėl šių ir kitų mokslo pažangų mes dabar suprantame pagrindines biologijos idėjas, tokias kaip genetinės informacijos srautas iš DNR per RNR į baltymus ir bruožų pertvarkymas į DNR sekas, kurios koduoja funkciją. DNR dalių idėja sintetinėje biologijoje yra šių klasikinių laimėjimų produktas.
Muzikos įrašų pramonės pokyčiai yra tinkamas (bet ne tobulas) pavyzdys privalumai, gauti iš padidinto moduliškumo. Didžiąją XX amžiaus dalį labiausiai paplitęs ir pelningiausias muzikos platinimo būdas buvo įrašai, o vėliau – kasetės ir kompaktiniai diskai. Visais šiais formatais muzika buvo parduodama daugiausia kaip pilno ilgio albumai. Pavienės dainos buvo prieinamos, tačiau jos buvo žymiai brangesnės, todėl net jei žmonėms patiko tik kelios albumo dainos, jie dažniausiai pirkdavo albumą.Albumas buvo standartinis muzikos industrijos ir jos atlikėjų &ldquounit&rdquo. Šis vienetas visiškai pasikeitė dvidešimt pirmojo amžiaus pradžioje, kai muzika buvo suskaitmeninta. Dėl šio pažangos tapo lengva atsisiųsti muziką, o ne pirkti fizinį albumą. Dainos iš albumo buvo lengvai atskiriamos, todėl dainos tapo nepriklausomais moduliais, kuriuos klausytojai galėjo maišyti ir suderinti pagal pageidavimą ir poreikį. Plačiai paplitusi galimybė kurti tinkintus grojaraščius iš šių modulinių dainų pakeitė žmonių požiūrį į savo muzikos kolekciją ir pakeitė standartinį pramonės &ldquounit&rdquo.
Patobulintas moduliškumas ir pritaikymas, kurį matome komercinėje muzikoje, apibendrina mūsų besikeičiančias sąvokas apie a genų ekspresijos vienetas, kurie atvėrė kelią termino genetic &ldquoparts&rdquo vartojimui sintetinėje biologijoje. Ankstyvasis Mendelio darbas parodė, kad bruožai buvo atskiri subjektai. Analogiškai su įrašyta muzika, organizmas, rodantis bruožą, gali būti laikomas analogišku visam albumui ir bruožas egzistuoja tik organizmo kontekste, kaip ir daina egzistuoja tik viso albumo kontekste. Dr. Francois Jacob ir Dr. Jacques'as Monod, kurių darbas išsamiai aprašytas vėliau šiame skyriuje, dramatiškai perteikia šį paveikslą, aprašydami laktozės apykaitą, perfrazuodami bruožus į dinaminius genetinius elementus, o ne į visus organizmus su savybėmis. Buvo identifikuoti tam tikri DNR ruožai, kurie veikė kartu, kad kontroliuotų ląstelių ir rsquos elgesį, tačiau tų ruožų genetiniai elementai buvo nedalomi ir nebuvo lengvai pritaikomi naujam tikslui. Šis orientyras gali būti laikomas kažkur tarp &ldquoalbum&rdquo ir &ldquosingle&rdquo muzikos industrijos fazių. Dabar genų inžinerijos ir keičiamų genetinių dalių eroje yra žinoma daug genetinių sekų, koduojančių specifines funkcijas ir jas galima tiksliai manipuliuoti. Galime tinkinti šių genetinių elementų grojaraštį, perkombinuodami juos specialiais būdais, kad atitiktų mūsų poreikius. Šios manipuliacijos būdai išsamiau aprašyti DNR inžinerijos pagrindai skyrių. Čia mes tyrinėjame inžinerines galimybes, kurios atsiranda, nes galime maišyti ir suderinti genetines dalis.
Kai modulinės medžiagos yra maišomos ir derinamos, atsiranda naujų komplikacijų, įskaitant padidėjusią galimybę, kad moduliai gali sąveikauti vienas su kitu nepageidaujamais būdais. Viena iš priemonių, leidžiančių sumažinti nenumatytą modulių sąveiką, yra izoliuoti dalių elgesį. Pirkdami automobilį apsvarstykite galimus modulinius variantus. Bazinį modelį galite atnaujinti įvairiais būdais: patobulintos garsiakalbių sistemos, galingesnis variklis, šildomos galinės sėdynės ir kt. Šie priedai pasiekiami iš dalies (ha!) dėka modulinio dizaino metodo, kurį taikė automobilių ir rsquos inžinieriai. Be šio požiūrio, naujovinimo į išgalvotą garsiakalbių sistemą išlaidos būtų pernelyg didelės, nes priekinę konsolę reikėtų visiškai pertvarkyti, kad ji atitiktų kiekvienos markės garsiakalbius. Vietoj to, lankstumas, susijęs su papildomu atnaujinimu, buvo įtrauktas į ankstyvuosius projektavimo etapus, todėl pirkimo metu atlikti pakeitimai nereikalauja didelių perprojektavimo pastangų. Buvo tikimasi, kad kiekvienas automobilio ir rsquos modulis bus pritaikytas individualiems poreikiams, o dizaineriai iš pat pradžių įdėjo daug pastangų, kad dalys būtų atskirtos.
Funkcionaliniam surinkimui reikia ne tik sukurti fiziškai atskiras dalis, kurias galima derinti įvairiais būdais, bet ir, kad dalys būtų eksponuojamos elgesys kurie yra atskiriami nuo kitų juos supančių elementų. Pavyzdžiui, kaip 7-2 pav iliustruoja, stereo sistemos veikimas neturi turėti įtakos vairuotojo vairo veikimui. Būtų tikras vairavimo iššūkis, jei sukant radijo rankenėlę pasisuktų ir vairas. Toks elgsenos atskyrimas tarp dalių veikimo vadinamas izoliacija.
7-2 pav. Izoliacija automobilių projekte. Šiuolaikinį automobilį sudaro keli komponentai, įskaitant sėdynes, ratus, vairą ir stereo sistemą. Komponentai veikia savarankiškai, todėl vieno komponento naudojimas netrukdo kitų automobilio komponentų darbui.
Panašų numatomą genetinių dalių projektavimą ir izoliaciją sunku pasiekti statant naudojant genetines dalis. Ląstelė yra skysta aplinka, kurioje nuolat maišosi molekulės, baltymai ir ląstelių struktūros. Kaip galima izoliuoti jų elgesį, kai jie nuolat susiduria su naujais partneriais ir kaimynais? Be to, kai kuriuose mobiliojo ryšio nustatymuose &ldquoupgrades&rdquo gali veikti taip, kaip tikimasi, o kituose – ne taip, kaip tikimasi. Veikla Koks spalvingas pasaulis skyriuje pateikiamas šio iššūkio pavyzdys. Net jei iš pradžių atrodo, kad atnaujinimai veikia, ląstelių ir rsquos vietinė aplinka yra dinamiška, todėl reikia, kad korinis dizainas veiktų esant daugeliui aplinkos ir augimo sąlygų. Galiausiai, skirtingai nei bet kuris kitas inžinerinis substratas, gyvos medžiagos gali ir laikui bėgant mutuos, kaip mes tyrinėjame Auksinė duona skyrių. Sukurto gaminio evoliucija projektavimo iššūkį dar labiau padidina.
Norėdami valdyti visą biologinio projektavimo sudėtingumą, galime naudoti galingą inžinerinį įrankį abstrakcija, kaip aprašyta Biodizaino pagrindai skyrių, todėl sprendimai dėl vieno dizaino elemento gali būti priimami nepriklausomai nuo sprendimų dėl kitų elementų. Automobilio ir rsquos stereo sistema gali būti pakeista nepažeidžiant vairo. Be to, moduliškumas, izoliacija ir abstrakcija turėtų leisti priimti sprendimus dėl įrenginių nedarant įtakos sistemos dizainui. Grįžtant prie automobilių analogijos, jums nereikia pirkti sunkvežimio, o ne automobilio vien todėl, kad norite varyti priekiniais ratais.
Tačiau ar toks požiūris praktiškai veikia sintetinę biologiją? Sintetiniai biologai norėtų pasiekti tašką, kai jie galėtų nuspėjamai ir racionaliai sujungti dalis su žinomomis tapatybėmis ir santykiniais stiprumais į naujas sintetines grandines. Išmatuodami faktinį sintetinių sistemų, sudarytų iš gerai apibūdintų dalių, našumą ir lygindami matavimus su tuo, kas buvo prognozuota, biobuilders gali įvertinti savo projektus ir priartėti prie teisingo būsimų projektų sėkmės ar nesėkmės numatymo.
Matavimo principai
Kai kuriuos dalykus sunku išmatuoti. Pavyzdžiui, laimė neturi masto ar vieneto, dėl kurio visi galėtume sutarti, ir nėra instrumentų, leidžiančių ją patikimai aptikti. Kiti dalykai yra matuojami visą laiką: skaitinę reikšmę galime susieti su kortomis kaladėje, pažymių vidurkiu ar komandų įskaitomis sporto lygoje. Nesvarbu, ar gaminate maistą, ar perkate drabužius nuo lentynos, pasikliaujate daiktų skaičiaus, dydžio, laiko matavimais ar skaičiavimais. Matavimai praneša apie daiktų būklę ir jų elgesį, santykius ar savybes.
Kai ką galima išmatuoti, vienetai suteikia mums bendrą būdą palyginti elementus. Vienetų standartizavimas kiekvienam matavimui nėra trivialus, kaip aprašėme DNR inžinerijos pagrindai skyrių, tačiau daugeliui punktų yra vienetų, dėl kurių susitarėme. Puikus pavyzdys yra arklio aukščio matavimas &ldquohands&rdquo. Ačiū Henrikui VIII, kuris standartizavo ranką iki 4 colių, net šis pasenęs vienetas vis dar turi reikšmingos matavimo informacijos. Kiekvienas, kuris yra susipažinęs su rankų matavimu, žino, kad arklio, stovinčio 16 rankų aukštyje, ketera (prie peties) yra 64 (16 x 4) coliai, o kito arklio, kurio 16,3 rankos ilgis – 67 (16 x 4 + 3) coliai, ne 65,2 (16,3 x 4) colio.
Prasmingi matavimai, nesvarbu, koks vienetas, yra šiuolaikinių mokslinių metodų požymis. Kaip mums parodė Mendelis, skaičiuodami daiktus matome modelius. Kokybiniai duomenys taip pat gali būti labai informatyvūs, kaip išnagrinėta Eau Tas kvapas skyrių. Tačiau čia mes atkreipiame dėmesį į tai, kaip matematiniai matavimai leidžia mums manipuliuoti ir konvertuoti informaciją į kitus vaizdus. Skaičiai taip pat leidžia mums atlikti palyginimus ir prognozes.
Pavyzdžiui, pabandykite palyginti savo ėjimą į mokyklą su draugo ėjimu, kai turite tik kokybinius matavimus. Tokiu atveju jūs apsiribojate sakydami tokius dalykus kaip: &bdquoschool yra labai toli nuo mano namų, daug toliau nei nuo jūsų, bet aš einu greičiau nei jūs.&rdquo Bet išmatavus mylias, laiką ir greitį staiga įmanoma išsiaiškinkite, kiek anksčiau turite išeiti iš namų, kad susitiktumėte mokykloje 8 val Jei žinote atstumus ir ėjimo greitį, galite numatyti kelionės trukmę. Šios pamokos taikymas inžinerijai: matavimas suteikia mums galimybę numatyti, kuris gali būti labai naudingas, bet tik tuo atveju, jei galime atlikti atitinkamus matavimus. Toliau aprašoma, kodėl matavimas yra svarbus.
Kas &rsquos paprastai matuojama
Inžinieriai matavimus naudoja ne tik norėdami aprašyti, bet ir valdyti, surinkti ir tobulinti matuojamus objektus. Modulinių dalių surinkimas parodo matavimų svarbą. Norint patikimai sudaryti vieną dalį su kita, turi būti žinomos atitinkamos kiekvienos dalies savybės ir jos turi atitikti tam tikrus sutartus standartus. Priešingu atveju krumpliaračiai sukasi, veržlės tilps ant varžtų sriegių, o „Lego“ kaladėlės gali būti surinktos į Mirties žvaigždės ir Eifelio bokšto modelius. Modulinės dalys, atitinkančios tam tikrus matavimo standartus, tapo modernių gamyklų ir efektyvios surinkimo linijų gamybos pagrindu. Kai kurie palyginimai ir matavimai, kuriais remiasi inžinieriai, yra išsamiai aprašyti 7-1 lentelė.
Matavimas
apibūdinimas
Statinis našumas
Priskiria valdomų įėjimų diapazoną daliai ir išmatuojamai galutiniam išėjimui (-ams)
Naudinga užtikrinti, kad vienos dalies ir rsquos išvesties pakaktų kitai grandinės daliai suaktyvinti
Dinamiškas našumas
Dalis&rsquo išvestis laikui bėgant, reaguojant į įvesties signalo pasikeitimą
Rodo, kaip sistema elgsis po pradinės stimuliacijos, kuri gali skirtis nuo stabilizuoto ilgalaikio elgesio
Įvesties suderinamumas
Kaip dalis reaguoja į įvairius įvestis
Iliustruoja dalių ir rsquos lankstumą kuriant įvairias dalis / įvestis
Patikimumas
Išmatuotas kaip vidutinis laikas iki gedimo (MTF)
Naudojamas norint nustatyti, kiek laiko galima tikėtis, kad sistema veiks taip, kaip nurodyta iš pradžių
Medžiagų ar išteklių sunaudojimas
Nustato maitinimo šaltinio arba išteklių telkinio pasirinkimą
Be kita ko, turi įtakos važiuoklės sprendimams
7-1 lentelė. Tipiniai inžinerijos disciplinų matavimai
Sintetinės biologijos matavimų atlikimas ir ataskaitų teikimas
Tai, ką išmatuosite, parodys skirtingus dalykus apie tai, kaip sintetinės DNR grandinės veikia ląstelėje. Tiksliausias grandinės aktyvumo matavimas būtų atliktas, jei pavyktų sumažinti iki mikroskopinio dydžio, kaip tai daro ponia Frizzle. Magiškas mokyklinis autobusas knygų seriją, o tada stebuklingai atsisėskite ant DNR, kad suskaičiuotumėte RNR polimerazių, kurios kas sekundę juda išilgai DNR, skaičių. Elektronine prasme tai būtų tarsi elektronų skaičiavimas jiems tekant srove. Tačiau labiau eksperimentiškai pagrįsta yra išmatuoti transkripcijos ir vertimo produktus. Kiek mRNR pagaminama per sekundę arba kaip baltymai kaupiasi laikui bėgant? Šie RNR ir baltymų matavimai yra įmanomi, tačiau reikalauja daug įrangos, laiko ir žinių. Kad „BioBuilder&rsquos iTunes“ laboratorijos veikla būtų šiek tiek lengvesnė, &beta-galaktozidazė Matuojamas (&beta-gal) aktyvumas, kuris yra netiesioginis, bet geras kiekvienos grandinės veikimo atspindys.
Patirtis parodė, kad kai DNR grandinės perkeliamos iš vieno biologinio konteksto į kitą, gali būti sunku numatyti, kaip veiks genetinės dalys. Dalies aktyvumas yra nevienodai paveiktas įvairiais lygiais, įskaitant transkripcijos, transliacijos ir baltymų aktyvumo greitį naujoje ląstelių aplinkoje. Patikimo surinkimo iššūkį didina tai, kad kuriant gyvas sistemas, pagamintas iš kelių genetinių dalių, sunku numatyti, kaip dalys susisieks viena su kita. Pavyzdžiui, vienos dalies generuojamas stiprus &ldquoon&rdquo signalas gali būti nepakankamai stiprus, kad suaktyvintų paskesnę dalį, su kuria ji turėtų veikti.
Tačiau sintetinė biologija nėra pirmoji inžinerinė pastanga susidurti su šiais surinkimo iššūkiais. Vienas iš būdų, kurį taiko labiau nusistovėjusios inžinerijos disciplinos, yra plėtoti duomenų lapus, kuriuose aprašoma, kaip bet kuri dalis veiks kaip konkrečių parametrų funkcija. Norėdami sudaryti tokius duomenų lapus, inžinieriai turi surinkti pakankamai duomenų, kad galėtų visiškai apibūdinti savo dalį, išbandydami juos su tam tikrais įvesties duomenimis ir esant įvairioms sąlygoms bei aplinkoms.
Sintetiniai biologai gali sukurti panašius savo dalių duomenų lapus. Pavyzdžiui, viename duomenų lape, kuris buvo paskelbtas standartinių biologinių dalių registro transkripcijos faktoriui, pranešama apie dalies statinį našumą, dinaminį našumą, įvesties suderinamumą ir patikimumą. Tai yra tie patys parametrai, aprašyti anksčiau 7-1 lentelė. Idealiu atveju šie matavimai ir dalių ir rsquos elgesio aprašymai galiotų kiekvieną kartą, kai jie naudojami. Tačiau net jei jo elgsena skiriasi priklausomai nuo konteksto, instrukcijos ir informacija, pateikta detalių duomenų lape, gali leisti biobuilderiui atsižvelgti į šį kintamumą.. Šis &ldquodata-sheet&rdquo metodas veikia tik toms dalims, kurios skiriasi patikimai ir nuspėjamai, o tai ne visada būna, tačiau tai yra svarbus pirmasis žingsnis funkcinio standartizavimo link.
Kitas veiksnys, lemiantis dalies tvirtumą (arba jo nebuvimą), yra įprastas matavimo metodų kintamumas tarp laboratorijų. Net du žmonės toje pačioje laboratorijoje, matuojantys tą patį dalyką, greičiausiai nesuteiks identiškų verčių dėl subtilių technikos, terpės, ląstelių augimo būsenos ir dar žino ko kito. Sintetiniai biologai nori nustatyti pagrindines šių pokyčių priežastis, tačiau supranta, kad tai yra ilgalaikis tikslas. Šiuo metu, galite naudoti kalibravimo nuorodas, kad palygintumėte vienoje vietoje atliktus matavimus su kitoje vietoje atliktais matavimais. BioBuider&rsquos iTune Device laboratorija naudoja etaloninį standartą būtent dėl šios priežasties.
Pagrindinės „iTune“ įrenginių laboratorijos koncepcijos
Vykdydami šią „BioBuilder“ veiklą galite ištirti genetinių dalių, kurios, kaip tikimasi, kartu sukurs skirtingus fermento kiekius, biologinį aktyvumą. Kiekviena iš šių dalių buvo atskirai apibūdinta kaip &ldquoweak,&rdquo &ldquomedium,&rdquo arba &ldquostrong.&rdquo Šioje veikloje klausiama, ar galite numatyti šių atskirai apibūdintų dalių elgseną, kai jos derinamos skirtingais būdais. Norint pradėti, būtina šiek tiek suprasti genų ekspresiją ir promotoriaus bei ribosomų surišimo vietos dalių vaidmenį, kaip aprašyta toliau.
Rėmėjai ir RBS
Dažnai vadinama "centrine genų ekspresijos dogma", mantra "DNR daro RNR gamina baltymus" yra sutrumpintas principas, reiškiantis, kad baltymai surenkami transliuojant RNR sekas, o RNR sekos transkribuojamos iš DNR sekų. Baltymai atlieka daug pagrindinių užduočių ląstelėje, todėl transkripcija ir vertimas kontroliuoja daugelį ląstelių ir rsquo elgesio ir savybių. Nenuostabu, kad transkripcija ir transliacija buvo plačiai ištirta, o daugelis pagrindinių komponentų, kurie yra būtini ir pakankami kontroliuojamai genų ekspresijai, yra žinomi (7-3 pav).
7-3 pav. Simbolinis genų ekspresijos vieneto vaizdavimas. Protoriaus seka, pavaizduota rodykle kairėje, suriša RNR polimerazę, kad inicijuotų transkripciją. Ribosomų surišimo vieta, sutrumpinta kaip &ldquoRBS&rdquo ir pavaizduota puslankiu, yra DNR seka, koduojanti mRNR segmentą, prie kurio ribosoma jungiasi, kad inicijuotų transliaciją. Atviras skaitymo rėmelis, sutrumpintas &ldquoORF&rdquo ir pavaizduotas rodykle dešinėje, reiškia DNR seką, koduojančią baltymą. Protoriaus ir ORF rodyklių kryptis nurodo kryptį, kuria jie nuskaitomi.
Dėl transkripcijos, propaguotojai yra DNR sekos, kurios suriša RNR polimerazę, sudėtingą daugelio baltymų fermentą, kad inicijuotų RNR grandinių susidarymą iš DNR šablono. Vertimo atveju inicijavimo svetainė vadinamaribosomų surišimo vieta (RBS), nes ribosoma atpažįsta šią seką, kad pradėtų baltymų sintezę iš RNR šablono. Šios sekos didžiąja dalimi yra atsakingos už natūraliai vykstantį transkripcijos ir transliacijos reguliavimą, o sintetiniai biologai taip pat gali jas naudoti savo reguliavimo schemoms pristatyti. Remdamiesi daugeliu žinomų promotoriaus ir RBS sekų, mokslininkai nustatė a konsensuso seka šioms dalims, kaip parodyta 7-4 pav. Pavyzdžiui, konsensuso promotoriaus seka buvo nustatyta lyginant nukleotidus kiekvienoje padėtyje daugelyje promotoriaus sekų. Konsensusas grindžiamas nukleotidų modeliu, dažniausiai aptinkamu kiekvienoje padėtyje.
7-4 pav. Konsensuso sekų apibrėžimas. Kelios sakinio (kairėje) ir geno (dešinėje) &ldquosequo&rdquo yra sulygiuotos, kad būtų sukurta konsensuso seka, kuri apatinėje eilutėje parodyta pilka spalva. Žalia raidės žymi dažniausiai pasitaikančią raidę kiekvienoje padėtyje, kuri apibrėžia sutarimo seką. Raudonos raidės toje vietoje nėra dažniausiai pasitaikančios raidės, todėl jos neįtraukiamos į konsensuso seką.
Konsensuso sekos yra svarbios sintetinei biologijai, nes, paprastai kalbant, dalis geriausiai veikia, kai ji labai sutampa su konsensuso seka. Ir atvirkščiai, kuo daugiau nukleotidų skiriasi nuo konsensuso sekos, tuo mažiau ta dalis gali atlikti savo darbą. Taigi konsensuso promotoriaus seka tikriausiai yra "stiprus promotorius", o tai reiškia, kad ji tikriausiai gerai suriš RNR polimerazę ir dažnai inicijuos transkripciją, o promotorius arba RBS seka, kuri nukrypsta nuo konsensuso, bus "silpna" ir atliks savo darbą ne taip efektyviai nei seka su geresnių rungtynių. Tačiau stiprus nebūtinai reiškia geriau. Priklausomai nuo taikymo, inžinierius gali norėti tik nedidelio aktyvumo lygio, jei, pavyzdžiui, ląstelės ir rsquos paviršiuje būtų daromos poros arba jei būtų reguliuojamas ląstelių mirties atsakas.
Lako operonas
Ląstelės ir rsquos gebėjimas prireikus įjungti ir išjungti genų produktus yra labai svarbus jos išlikimui. Septintajame dešimtmetyje daktaras Francois Jacobas ir dr. Jacques'as Monod nustatė pagrindinius genų ekspresijos principus, tirdami laktozės transportavimą ir metabolizmą bakterijose. Laktozės metabolizmo genai yra susitelkę į lac operonas (7-5 pav), tačiau bakterijos taupo energiją, įjungdamos šiuos genus tik tada, kai nėra gliukozės.Bakterijos teikia pirmenybę gliukozei kaip maisto šaltiniui ir stengsis panaudoti laktozę tik tuo atveju, jei jos pageidaujamo maisto nėra. Molekulinės detalės Jacobo ir Monod&rsquos paaiškinime dėl jo reguliavimo yra klasikinis indukuojamo geno modelis. Čia aptariame tik „iTune Device“ laboratorijai svarbią informaciją.
7-5 pav. Simbolinis lac operono vaizdavimas. Lac operonas susideda iš vieno promotoriaus (pLac, žalia rodyklė), valdančio tris pasroviui esančias RBS&ndashORF poras (atitinkamai žalios puslankiai ir mėlynos rodyklės). Operonas gamina fermentus, reikalingus cukrui metabolizuoti, tik tada, kai nėra gliukozės.
Pagrindinis laktozės metabolizmo baltymas yra fermentas, vadinamas &beta-galaktozidaze, dažnai trumpinamas &beta-gal, ir jį DNR koduoja ORF, vadinamą lacZ. Beta-gal fermentas skaido laktozę į gliukozę ir galaktozę, kurią ląstelė gali panaudoti kitoms savo funkcijoms vykdyti. Tyrėjai taip pat nustatė, kad &beta-gal reaguoja su įvairiomis molekulėmis, panašiomis į laktozę, įskaitant sintetinius analogus, tokius kaip ONPG, kuriuos naudosite „iTune Device“ laboratorijoje.
LacZ ekspresija ir viso lac operono ekspresija yra reguliuojama tiek teigiamai, tiek neigiamai transkripcijos lygiu (7-6 pav). Teigiamas reguliavimas atsiranda, kai DNR surišantis baltymas padidina transkripcijos kiekį per DNR elementus, esančius pasroviui nuo jo DNR surišimo vietos. Ir atvirkščiai, neigiamas reguliavimas yra terminas, naudojamas apibūdinti atvejį, kai DNR surišantys baltymai sumažina transkripcijos kiekį, kai suriša DNR. Lac operono teigiami ir neigiami reguliavimo veiksniai yra jautrūs cukraus rūšiai bakterijų ir rsquos aplinkoje. Kai yra gliukozės, reguliavimo veiksniai išjungia pasroviui esančių ORF transkripciją. Jei yra laktozės, o gliukozės nėra, tie patys transkripciją reguliuojantys veiksniai keičia jų elgesį, o operono transkripcija sukelia laktozės transportavimą ir metabolizmą.
Tas pats teigiamai ir neigiamai reguliuojamas promotorius, kuris kontroliuoja lacZ, taip pat kontroliuoja kitus lac operono genus, įskaitant tą, kuris koduoja laktozės transportavimo baltymą. Viena mRNR yra transkribuojama iš lac operono ir rsquos promotoriaus, todėl susidaro daug baltymų produktų, reikalingų laktozės metabolizmui ir transportavimui. Kiekvienas produktas gali būti išverstas iš vienos mRNR dėl RBS, kurie yra susiję su kiekvienu ORF. Tai kompaktiška ir elegantiška genetinė architektūra, kurią gamta sureguliavo taip, kad prireikus pagamintų reikiamą kiekvieno baltymo kiekį.
7-6 pav. Lac operono reguliavimas. lacI ORF koduoja transkripcijos represorių, kuris blokuoja Plac promotorius ir todėl blokuoja viso operono ekspresiją. Laktozė arba jos analogas IPTG slopina LacI represoriaus baltymą, todėl Plac promotorius veikti ir palengvinti pasroviui esančio operono slopinimą.
Papildomas skaitymas ir ištekliai
§ Canton, B., Labno, A., Endy, D. Sintetinių biologinių dalių ir prietaisų tobulinimas ir standartizavimas. Gamtos biotechnologija 2008 26:787-93.
§ Jacob F., Monod J. Genetiniai reguliavimo mechanizmai baltymų sintezėje. JMB. 19613:318-56.
&sekta Kelly, J. R. ir kt. BioBrick promotorių aktyvumo matavimas naudojant in vivo etaloninį standartą. Biologinės inžinerijos žurnalas (2009)3:4.
§ McFarland, J. Nefelometras: instrumentas, skirtas įvertinti bakterijų skaičių suspensijose, naudojamose apskaičiuojant opsoninį indeksą ir vakcinoms. JAMA. 190714:1176-8.
&sekta Milleris, J.H. Molekulinės genetikos eksperimentai Cold Spring Harbor 1972 Cold Spring Harbor Laboratory Press.
&sekta Salis, H.M. Ribosomų surišimo vietos skaičiuotuvas. Metodai Enzymol. 2011498:19-42.
§ Svetainė: Biologinių dalių registras (http://parts.igem.org/Main_Page).
„iTune“ įrenginių laboratorija
Šioje laboratorijoje pagrindinis dėmesys skiriamas baltymams ir DNR sekoms, reikalingoms genui išreikšti (promotoriams, ORF, RNR polimerazei ir t. t.), taip pat yra įvadas į pagrindinę fermentologiją. Moduliškumo, izoliacijos ir matavimo inžinerinės koncepcijos yra tiriamos analizuojant devynis genų reguliavimo projektus. Kiekvienas dizainas turi unikalų promotoriaus ir RBS derinį, kontroliuojantį fermento beta-galaktozidazės ekspresiją. Spektrofotometrinė analizė ir fermentų kinetiniai tyrimai yra pagrindiniai biotechnologijų įgūdžiai, akcentuojami šioje laboratorijoje.
Dizaino pasirinkimai
Priešingai nei natūraliai atsirandantis lac operonas, „iTune Device“ genų grandinių genetinės architektūros yra paprastesnės struktūros, kurių vienas promotorius ir vienas RBS valdo vieną ORF (žr. 7-7 pav). Siekiant sušvelninti bet kokį šių teigiamų ir neigiamų reguliavimo veiksnių poveikį „iTune“ įrenginio matavimams, ląstelės auginamos sodrioje terpėje, bet be ląstelės ir rsquos teigiamo reguliuojančio baltymo, ir esant IPTG – molekulei, kuri slopina neigiamą reguliuojantį baltymą. Mes galime pritaikyti „iTune“ grandinių elgseną dėl kiekvienos DNR dalies modulinio elgesio. Kaip aprašė Jokūbas ir Monodas E. coli&rsquos natural lac operon, iTune Device&rsquos dalys turi atskiras funkcijas ir veikimo charakteristikas, kurias sintetiniai biologai naudoja savo naudai kurdami biologinį dizainą.
7-7 pav. Lac operono modifikacija. Iš genetinių konstrukcijų, pvz., tų, kurios tiriamos naudojant „iTune Device“ veiklą, pašalintos antrosios ir trečiosios RBS-ORF poros. Gautas geno ekspresijos vienetas turi vieną promotorių-RBS-ORF.
Eksperimentinis klausimas
„BioBuilder iTune Device“ laboratorijoje išmatuosite lacZ geno produkto &beta-gal aktyvumą, kad įvertintumėte skirtingų promotoriaus ir RBS derinių veikimą. Promotorius ir RBS dalys buvo apibūdintos kaip &ldquoweak,&rdquo &ldquomedium,&rdquo arba &ldquostrong&rdquo, atsižvelgiant į jų suderinimą su tokių dalių koncensus sekomis. Tačiau tai, kaip jie veiks kartu, gali priklausyti nuo auginimo terpės, padermės fono ir jų vertinimo metodų. Jei turite laiko ar susidomėjimo, galite atlikti šiuos matavimus skirtingose bakterijų padermėse, skirtingose augimo stadijose esančiose padermėse arba su papildomomis DNR grandinėmis gyvojoje sistemoje. Bet kuris iš šių veiksnių gali pakeisti šių paprastų promotorių: RBS: lacZ grandinių veikimą ląstelėje.
Ką galėtumėte nuspėti apie šių grandinių aktyvumą prieš paleisdami laboratoriją joms matuoti? 7-2 lentelė gali padėti sutvarkyti jūsų įvertinimus, taip pat atskleisti bet kokius jūsų mąstymo paklaidas ir supratimo spragas. Jei savavališkai spėjame, kad silpno promotoriaus ir silpno RBS derinys duos 10 vienetų, o stiprus/stiprus derinys – 1000 vienetų, kaip galime įvertinti viską tarp jų? Pradinės vertės diagramoje yra teorinės ir gali neatspindėti skaičių, kuriuos gaunate šioms grandinėms vykdydami šį eksperimentą. Esmė yra paklausti, ko prireiks norint padaryti gerą prognozę.
1*. transkripcija (aktyvinti / perspausti)2. RNR apdorojimas (alternatyvus sujungimas)3. mRNR transportavimas (įstrigo branduolyje = suardytas)4*. mRNR vertimas (greitis ir pakartotinis inicijavimas: 5'cap/polyA tail)5. mRNR degradacija (ilgas poliA tail = ilgesnis tarnavimo laikas)6. Baltymų aktyvumas / skaidymas (modifikacija po vertimo)
CIS – DNR GERINIMO SEKA (reguliacinė)
TRANS- AKTIVATORIUS BALTYMAS SUSIRIŠIA CIS SEKA
CIS elementai = reguliavimo DNR sek. kur TF jungiasi
--- ty: (reklamatoriai / stiprikliai)
TRANS-geną reguliuojantys baltymai, atpažįstantys cis elementus.
----ie: (TFIID, aktyvatoriai)
Pieno biotechnologija
Visos metabolinės funkcijos ląstelėje, susijusios su skilimo ir biosintezės keliais prokariotuose ir eukariotuose, yra atliekamos ekspresuojant specifinius genus, užkoduotus jų DNR augimui ir vystymuisi. Tačiau visi ląstelėje esantys genai nėra išreikšti visą laiką, nebent jų funkcijos yra absoliučiai būtinos. Dauguma genų įjungiami tik tada, kai tokių genų produktai reikalingi augimui tam tikroje aplinkoje (signalas). Jų išraiška išjungiama, kai jų produktai arba nebereikalingi, arba ląstelėje jau yra pakankamas šių produktų kiekis. Šis genų ekspresijos įjungimas ir išjungimas ląstelėje yra labai galinga griežtai reguliuojama genų funkcionalumo kontrolės sistema. Išjungus genų ekspresiją, kai jų produktai nereikalingi, organizmas gali išvengti nereikalingo energijos švaistymo, nes ląstelėje turimi energijos ištekliai yra riboti. Ląstelė turi labai protingai panaudoti sutaupytus energijos išteklius, kad susintetintų produktus, kurie padidina ląstelių augimo greitį. Genų ekspresiją bakterijų populiacijoje pirmiausia reguliuoja trys mechanizmai, ty šiuose organizmuose veikiančios konstitucinės, indukuojamos ir represuojamos sistemos.
7.2 Konstitucinė išraiška
Konstitucinė genų ekspresija nėra reguliuojama, o tai būdinga genams, kurių produktai yra būtini ląstelių funkcijoms. Šie genai visada lieka įjungti ir nuolat ir stabiliai gamina norimus fermentus ar baltymus, kad ląstelė augtų ir išgyventų. Tokie genai vadinami namų išlaikymo arba konstituciniais genais, kurie koduoja RNR ir baltymus, turinčius pagrindines gyvybines funkcijas, pavyzdžiui, rRNR, ribosomų baltymus ir glikolitinius / kvėpavimo fermentus.
7.3 Indukuojami ir represuojami genai
Indukuojami ir represuojami genų produktai reikalingi tik tam tikromis aplinkybėmis. Indukuojami genai „įjungiami“ reaguojant į substrato (induktoriaus) buvimą aplinkoje, pvz. laktozė lako operone.
Represuojami genai „išjungiami“ reaguojant į aplinkos signalą, pvz. tuo pačiu metu esanti laktozė/gliukozė arba ksilozė/gliukozė, kurios slopins genus, reikalingus laktozės arba ksilozės panaudojimui.
7.4 Neigiamas ir teigiamas genų ekspresijos reguliavimas
Bakterijos keičia genų ekspresiją naudodamos teigiamą arba neigiamą reguliavimą. Esminis skirtumas tarp teigiamo ir neigiamo reguliavimo yra tas, kai reguliuojamoji molekulė, ty vienas represorius (lac operonas) arba represorius kartu su induktoriumi/galutiniu produktu (trp operonas), jungiasi su promotoriumi, taip pat tai, ar molekulė didėja (induktorius), ar mažėja. (represorius) genų ekspresija.
Prokariotų genų ekspresija yra griežtai reguliuojama transkripcijos, transliacijos ir fermentų funkcijų lygiu. Kadangi transkripcija ir transliacija yra susieti prokariotuose, genų ekspresijos kontrolės lygis yra santykinai didesnis transkripcijos lygiu.
Operonas yra genetinis jungiklis, veikiantis prokariotuose tik tam, kad koordinuotai reguliuotų genų, dalyvaujančių medžiagų apykaitos keliuose (degradaciniuose ir biosintetiniuose) jų funkcionalumą, grupę. Šie genai yra transkribuojami kartu, kontroliuojant tą patį promotorių, į vieną policistroninę mRNR, kuri galiausiai paverčiama į atskirus jų polipeptidus. Operonas susideda iš trijų pagrindinių elementų: struktūrinių genų, reguliavimo sekų, ty. promotoriaus ir operatoriaus regionai bei reguliavimo genas. Geriausiai žinomas operono sistemos pavyzdys yra „lac operonas“ E. coli, kuris dabar plačiai naudojamas kaip modelis laktozės panaudojimo bakterijose mechanizmui suprasti.
Operonas yra funkcinis genų ekspresijos vienetas bakterijose. Tai yra unikali genų reguliavimo sistema, veikianti tik prokariotuose. „Lac operono“ modelį 1961 m. pasiūlė Jacob ir Monod, kad apibūdintų koordinuotą genų, koduojančių fermentus, reikalingus laktozės panaudojimui E. coli, reguliavimą.
7.6.1 „lac operono“ elementai
„Lac operonas“ susideda iš šių pagrindinių elementų, kaip parodyta 7.1 pav.
7.6.1.1 Trys struktūriniai genai
„Lac operonas“ susideda iš trijų struktūrinių genų, ty. lacZ, lacY ir lacA koduojančius fermentus / baltymus, kurie yra funkciškai susiję su laktozės metabolizmu E. coli. Visi šie trys genai yra kontroliuojami vieno promotoriaus ir yra susiję su laktozės skaidymu.
i) LacZ koduoja β-galaktozidazę, kuri skaido laktozę į gliukozę ir galaktozę.
ii) LacY koduoja laktozės permeazę, reikalingą laktozės transportavimui į E. coli ląsteles.
iii) LacA koduoja tiogalaktozido transacetilazę, kurios tiksli funkcija dar nežinoma.
7.6.1.2 Reguliavimo sekos
„lac operono“ reguliavimo sekos yra šios.
i) LacO – operatoriaus sritis (O), prie kurios prisijungia „lac“ represorius, kad blokuotų RNR polimerazės prisijungimo promotorių, taip išjungdamas „lac operoną“.
ii) LacP – promotorinė sritis (P), prie kurios jungiasi RNR polimerazė, kad inicijuotų struktūrinių genų transkripciją į policistroninę mRNR.
iii) LacI – reguliuojantis genas, koduojantis trans veikiantį „lac“ represoriaus baltymą, kuris jungiasi prie operatoriaus srities, kad blokuotų transkripciją, kai nėra laktozės – lac operono induktoriaus. Tiesą sakant, tikrasis lac operono induktorius yra alo-laktozė, laktozės izomeras.
iv) LacI yra ne lac operone, o prieš kelis nukleotidus nuo lac operono kartu su savo promotoriumi, kad sintezuotų "lac" represorių
Be šių, yra keletas efektorių molekulių, kurios aktyvuoja arba deaktyvuoja represoriaus arba RNR polimerazės prisijungimą prie atitinkamų vietų lac operono promotoriaus-operatoriaus srityse. „Lac operono“ organizavimas ir jo veikimas reguliuojant struktūrinius genus, reikalingus laktozės metabolizmui E. coli, schematiškai iliustruojamas toliau.
Lac operonas yra reguliuojamas skirtingai, kai yra induktoriaus, ty laktozės (alolaktozės), kaip aprašyta toliau.
7.7.1 Jei nėra laktozės
Kai auginimo terpėje, užkrėstoje E. coli, nėra laktozės, lac represorius sintetinamas ekspresuojant lacI iš jo promotoriaus RNR polimerazės pagalba aktyvioje formoje ir difunduojamas į terpę, kad pasiektų operono vietą operone. Represoriaus prisijungimas prie operatoriaus blokuoja RNR polimerazės prisijungimą prie promotoriaus, todėl struktūriniai genai yra išjungiami, todėl policistroninė mRNR nesintetina operono. „Lac operono“ reguliavimas, kai nėra induktoriaus, ty laktozės, parodytas 7.2 pav.
7.7.2 Jei yra laktozės
Kai auginimo terpėje yra laktozės, ji susijungs su represoriumi savo induktoriaus surišimo vietoje ir pakeičia represoriaus konformaciją, kuri nebegali jungtis su operono vieta lac operone. Taigi nėra kliūčių RNR polimerazės prisijungimui prie promotoriaus, todėl visi trys struktūriniai genai yra transkribuojami į policistroninę mRNR, iš kurios visi trys fermentai, reikalingi laktozės metabolizmui, yra paverčiami nepriklausomai, kad atliktų savo specifines funkcijas. "Lac operono" reguliavimas esant induktoriui, ty laktozei, parodytas 7.3 pav.
Tiesą sakant, tikrasis lac operono induktorius yra ne laktozė, o jo izomeras alolaktozė, gaunama iš laktozės, naudojant β-galaktozidazę. Tačiau pagrindinis laktozės (alilaktozės), kaip induktoriaus, apribojimas, kai ji pridedama į terpę, yra nuolatinis E. coli panaudojimas augimo metu, todėl ją reikia nuolat papildyti, kad lac operono indukcija vyktų. Ši problema iš esmės buvo išspręsta sintezuojant IPTG (Iso Propyl Thio Galactoside), struktūrinį laktozės analogą – neatlygintiną lako operono induktorių, kuris veikia kaip veiksmingas dirbtinis induktorius, jo nemetabolizuoja bakterija ir todėl lieka ten. augimo terpėje neribotą laiką. IPTG plačiai naudojamas laboratorijoje, skatinant heterologinių genų ekspresiją E. coli, siekiant didelio masto didelės vertės rekombinantinių baltymų gamybai.
7.7.3 Lac operonas yra neigiamas ir teigiamas reguliuojamas
Lac operonas yra klasikinis operono, kuriam taikomas neigiamas ir teigiamas reguliavimas, pavyzdys. Neigiamas reguliavimas, kaip jau minėta, yra tarpininkaujamas represoriaus molekulės, kuri suriš operatorių, jei nėra induktoriaus, ir tokiu būdu išjungs struktūrinius genus, slopindama jų transkripciją. Teigiamą lac operono reguliavimą sukelia signalinė molekulė, vadinama cAMP (ciklinis adenozino monofosfatas), kuri jaučia gliukozės koncentracijos išeikvojimą terpėje (kai E. coli ląstelės yra bado sąlygomis). Esant didelei gliukozės koncentracijai terpėje, cAMP lygis ląstelėje mažėja ir atvirkščiai, esant žemai gliukozės koncentracijai, cAMP lygis ląstelėje didėja. cAMP aktyvuoja kitą baltymą, vadinamą CRP (cAMP receptorių baltymu), dar vadinamą CAP (catabolite Activator Protein), kuris prisijungs prie CRP vietos lac operone, esančiame šalia lac promotoriaus, tik tada, kai jis yra kompleksuotas su cAMP. Aktyvaus CRP prisijungimas sustiprins RNR polimerazės prisijungimą prie promotoriaus, taip žymiai padidindamas lac operono ekspresiją. „lac operono“ teigiamo reguliavimo veikimas parodytas 7.4 pav.
Papildoma literatūra
Fundamentali bakterijų genetika, Nancy Trun, Janine Trempy (red.), Wiley-Blackwell, 2003 m., ISBN: 978-0-632-04448-1
Nuo genų iki genomų: DNR technologijos koncepcijos ir taikymas, 3 leidimas, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (reds), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6
Microbial Genetics, 2-asis leidimas, Stanly R Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974
Geno molekulinė biologija, šeštasis leidimas, James D. Watson (redaktorius) Cold Spring Harbor Press ir Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1
PIENO BIOTECHNOLOGIJA
Visos metabolinės funkcijos ląstelėje, susijusios su skilimo ir biosintezės keliais prokariotuose ir eukariotuose, yra atliekamos ekspresuojant specifinius genus, užkoduotus jų DNR augimui ir vystymuisi. Tačiau visi ląstelėje esantys genai nėra išreikšti visą laiką, nebent jų funkcijos yra absoliučiai būtinos. Dauguma genų įjungiami tik tada, kai tokių genų produktai reikalingi augimui tam tikroje aplinkoje (signalas). Jų išraiška išjungiama, kai jų produktai arba nebereikalingi, arba ląstelėje jau yra pakankamas šių produktų kiekis. Šis genų ekspresijos įjungimas ir išjungimas ląstelėje yra labai galinga griežtai reguliuojama genų funkcionalumo kontrolės sistema. Išjungus genų ekspresiją, kai jų produktai nereikalingi, organizmas gali išvengti nereikalingo energijos švaistymo, nes ląstelėje turimi energijos ištekliai yra riboti. Ląstelė turi labai protingai panaudoti sutaupytus energijos išteklius, kad sintezuotų produktus, kurie padidina ląstelių augimo greitį. Genų ekspresija bakterijų populiacijoje pirmiausia reguliuojama trimis mechanizmais, t.y.šiuose organizmuose veikiančios konstitucinės, indukuojamos ir represuojamos sistemos.
7.2 Konstitucinė išraiška
Konstitucinė genų ekspresija nėra reguliuojama, o tai būdinga genams, kurių produktai yra būtini ląstelių funkcijoms. Šie genai visada lieka įjungti ir nuolat ir stabiliai gamina norimus fermentus ar baltymus, kad ląstelė augtų ir išgyventų. Tokie genai vadinami namų išlaikymo arba konstituciniais genais, kurie koduoja RNR ir baltymus, turinčius pagrindines gyvybines funkcijas, pavyzdžiui, rRNR, ribosomų baltymus ir glikolitinius / kvėpavimo fermentus.
7.3 Indukuojami ir represuojami genai
Indukuojami ir represuojami genų produktai reikalingi tik tam tikromis aplinkybėmis. Indukuojami genai „įjungiami“ reaguojant į substrato (induktoriaus) buvimą aplinkoje, pvz. laktozė lako operone.
Represuojami genai „išjungiami“ reaguojant į aplinkos signalą, pvz. tuo pačiu metu esanti laktozė/gliukozė arba ksilozė/gliukozė, kurios slopins genus, reikalingus laktozės arba ksilozės panaudojimui.
7.4 Neigiamas ir teigiamas genų ekspresijos reguliavimas
Bakterijos keičia genų ekspresiją naudodamos teigiamą arba neigiamą reguliavimą. Esminis skirtumas tarp teigiamo ir neigiamo reguliavimo yra tas, kai reguliuojamoji molekulė, ty vienas represorius (lac operonas) arba represorius kartu su induktoriumi/galutiniu produktu (trp operonas), jungiasi su promotoriumi, taip pat tai, ar molekulė didėja (induktorius), ar mažėja. (represorius) genų ekspresija.
Prokariotų genų ekspresija yra griežtai reguliuojama transkripcijos, transliacijos ir fermentų funkcijų lygiu. Kadangi transkripcija ir transliacija yra susieti prokariotuose, genų ekspresijos kontrolės lygis yra santykinai didesnis transkripcijos lygiu.
Operonas yra genetinis jungiklis, veikiantis prokariotuose tik tam, kad koordinuotai reguliuotų genų, dalyvaujančių medžiagų apykaitos keliuose (degradaciniuose ir biosintetiniuose) jų funkcionalumą, grupę. Šie genai yra transkribuojami kartu, kontroliuojant tą patį promotorių, į vieną policistroninę mRNR, kuri galiausiai paverčiama į atskirus jų polipeptidus. Operonas susideda iš trijų pagrindinių elementų: struktūrinių genų, reguliavimo sekų, ty. promotoriaus ir operatoriaus regionai bei reguliavimo genas. Geriausiai žinomas operono sistemos pavyzdys yra „lac operonas“ E. coli, kuris dabar plačiai naudojamas kaip modelis laktozės panaudojimo bakterijose mechanizmui suprasti.
Operonas yra funkcinis genų ekspresijos vienetas bakterijose. Tai yra unikali genų reguliavimo sistema, veikianti tik prokariotuose. „Lac operono“ modelį 1961 m. pasiūlė Jacob ir Monod, kad apibūdintų koordinuotą genų, koduojančių fermentus, reikalingus laktozės panaudojimui E. coli, reguliavimą.
7.6.1 „lac operono“ elementai
„Lac operonas“ susideda iš šių pagrindinių elementų, kaip parodyta 7.1 pav.
7.6.1.1 Trys struktūriniai genai
„Lac operonas“ susideda iš trijų struktūrinių genų, ty. lacZ, lacY ir lacA koduojančius fermentus / baltymus, kurie yra funkciškai susiję su laktozės metabolizmu E. coli. Visi šie trys genai yra kontroliuojami vieno promotoriaus ir yra susiję su laktozės skaidymu.
i) LacZ koduoja β-galaktozidazę, kuri skaido laktozę į gliukozę ir galaktozę.
ii) LacY koduoja laktozės permeazę, reikalingą laktozės transportavimui į E. coli ląsteles.
iii) LacA koduoja tiogalaktozido transacetilazę, kurios tiksli funkcija dar nežinoma.
7.6.1.2 Reguliavimo sekos
„lac operono“ reguliavimo sekos yra šios.
i) LacO – operatoriaus sritis (O), prie kurios prisijungia „lac“ represorius, kad blokuotų RNR polimerazės prisijungimo promotorių, taip išjungdamas „lac operoną“.
ii) LacP – promotorinė sritis (P), prie kurios jungiasi RNR polimerazė, kad inicijuotų struktūrinių genų transkripciją į policistroninę mRNR.
iii) LacI – reguliuojantis genas, koduojantis trans veikiantį „lac“ represoriaus baltymą, kuris jungiasi prie operatoriaus srities, kad blokuotų transkripciją, kai nėra laktozės – lac operono induktoriaus. Tiesą sakant, tikrasis lac operono induktorius yra alo-laktozė, laktozės izomeras.
iv) LacI yra ne lac operone, o prieš kelis nukleotidus nuo lac operono kartu su savo promotoriumi, kad sintezuotų "lac" represorių
Be šių, yra keletas efektorių molekulių, kurios aktyvuoja arba deaktyvuoja represoriaus arba RNR polimerazės prisijungimą prie atitinkamų vietų lac operono promotoriaus-operatoriaus srityse. „Lac operono“ organizavimas ir jo veikimas reguliuojant struktūrinius genus, reikalingus laktozės metabolizmui E. coli, schematiškai iliustruojamas toliau.
Lac operonas yra reguliuojamas skirtingai, kai yra induktoriaus, ty laktozės (alolaktozės), kaip aprašyta toliau.
7.7.1 Jei nėra laktozės
Kai auginimo terpėje, užkrėstoje E. coli, nėra laktozės, lac represorius sintetinamas ekspresuojant lacI iš jo promotoriaus RNR polimerazės pagalba aktyvioje formoje ir difunduojamas į terpę, kad pasiektų operono vietą operone. Represoriaus prisijungimas prie operatoriaus blokuoja RNR polimerazės prisijungimą prie promotoriaus, todėl struktūriniai genai yra išjungiami, todėl policistroninė mRNR nesintetina operono. „Lac operono“ reguliavimas, kai nėra induktoriaus, ty laktozės, parodytas 7.2 pav.
7.7.2 Jei yra laktozės
Kai auginimo terpėje yra laktozės, ji susijungs su represoriumi savo induktoriaus surišimo vietoje ir pakeičia represoriaus konformaciją, kuri nebegali jungtis su operono vieta lac operone. Taigi nėra kliūčių RNR polimerazės prisijungimui prie promotoriaus, todėl visi trys struktūriniai genai yra transkribuojami į policistroninę mRNR, iš kurios visi trys fermentai, reikalingi laktozės metabolizmui, yra paverčiami nepriklausomai, kad atliktų savo specifines funkcijas. "Lac operono" reguliavimas esant induktoriui, ty laktozei, parodytas 7.3 pav.
Tiesą sakant, tikrasis lac operono induktorius yra ne laktozė, o jo izomeras alolaktozė, gaunama iš laktozės, naudojant β-galaktozidazę. Tačiau pagrindinis laktozės (alilaktozės), kaip induktoriaus, apribojimas, kai ji pridedama į terpę, yra nuolatinis E. coli panaudojimas augimo metu, todėl ją reikia nuolat papildyti, kad lac operono indukcija vyktų. Ši problema iš esmės buvo išspręsta sintezuojant IPTG (Iso Propyl Thio Galactoside), struktūrinį laktozės analogą – neatlygintiną lako operono induktorių, kuris veikia kaip veiksmingas dirbtinis induktorius, jo nemetabolizuoja bakterija ir todėl lieka ten. augimo terpėje neribotą laiką. IPTG plačiai naudojamas laboratorijoje, skatinant heterologinių genų ekspresiją E. coli, siekiant didelio masto didelės vertės rekombinantinių baltymų gamybai.
7.7.3 Lac operonas yra neigiamas ir teigiamas reguliuojamas
Lac operonas yra klasikinis operono, kuriam taikomas neigiamas ir teigiamas reguliavimas, pavyzdys. Neigiamas reguliavimas, kaip jau minėta, yra tarpininkaujamas represoriaus molekulės, kuri suriš operatorių, jei nėra induktoriaus, ir tokiu būdu išjungs struktūrinius genus, slopindama jų transkripciją. Teigiamą lac operono reguliavimą sukelia signalinė molekulė, vadinama cAMP (ciklinis adenozino monofosfatas), kuri jaučia gliukozės koncentracijos išeikvojimą terpėje (kai E. coli ląstelės yra bado sąlygomis). Esant didelei gliukozės koncentracijai terpėje, cAMP lygis ląstelėje mažėja ir atvirkščiai, esant žemai gliukozės koncentracijai, cAMP lygis ląstelėje didėja. cAMP aktyvuoja kitą baltymą, vadinamą CRP (cAMP receptorių baltymu), dar vadinamą CAP (catabolite Activator Protein), kuris prisijungs prie CRP vietos lac operone, esančiame šalia lac promotoriaus, tik tada, kai jis yra kompleksuotas su cAMP. Aktyvaus CRP prisijungimas sustiprins RNR polimerazės prisijungimą prie promotoriaus, taip žymiai padidindamas lac operono ekspresiją. „lac operono“ teigiamo reguliavimo veikimas parodytas 7.4 pav.
Papildoma literatūra
Fundamentali bakterijų genetika, Nancy Trun, Janine Trempy (red.), Wiley-Blackwell, 2003 m., ISBN: 978-0-632-04448-1
Nuo genų iki genomų: DNR technologijos koncepcijos ir taikymas, 3 leidimas, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (reds), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6
Microbial Genetics, 2-asis leidimas, Stanly R Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974
Geno molekulinė biologija, šeštasis leidimas, James D. Watson (redaktorius) Cold Spring Harbor Press ir Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1
2 egzaminas – Audinių pažeidimas ir šeimininko gynyba
1) Augimo kreivė bus kitokia:
Vėlavimo fazė -> eksponentinė -> stacionari -> EKSPONENTINĖ VĖL (palyginus, jei tik būtų nurodytas vienas anglies šaltinis, pvz., gliukozė, po stacionarios bakterijų augimo kreivė mažėtų, kol pritrūktų maistinių medžiagų. Tai yra normalu).
- Vėlavimo fazė = gliukozės panaudojimas ir laktozės kiekis, o baltymai, kurie turi virškinti laktozę, turi būti "transkribuoti"/sukurti.
- laktozės PLATEAU, nes reikia šiek tiek laiko, kol įsisavinama laktozė ir suaktyvinami fermentai
E.Coli pirmiausia naudoja gliukozę, tada laktozę (kai yra abi):
1) Kai yra gliukozės, laktozės transportavimas į ląstelę yra slopinamas!
FERMENTAS II (gliukozei) yra NEFOSFORILINTAS.
„Lac Permease“ neveikia
2) Kai yra gliukozės, „laktozę metabolizuojančių fermentų“ transkripcija yra „represuota“!
Fermentas II (gliukozei) nefosforilintas.
NĖRA alolaktozės (negali būti indukuojama į ląstelę – "Inducer Exclusion"), todėl "Lac represorius" lieka ant operatoriaus ir NO laktozę metabolizuojančių fermentų transkripcijos. [paprastai, kai yra laktozės, alolaktozė prisijungs prie represoriaus (Lac I genas) / išstums ją, kad RNR galėtų patekti ten, kur buvo ir atlikti laktozę metabolizuojančių genų transkripciją].
3) Kai yra gliukozės, teigiamas reguliavimas (transkripcijos aktyvinimas) BŽŪP "lac operon" yra IŠJUNGTAS! (teigiamo reguliatoriaus išjungimas)!
Fermentas II (gliukozei) nefosforilintas.
negali sąveikauti ir aktyvuoti adenilato ciklazės -> nėra ciklinio AMP gamybos -> nėra CAP-cAMP komplekso = CAP baltymas NEAKTYVUS ir NEGALI jungtis (teigiami reguliatoriai jungiasi prieš promotorių prie daugelio genų / vietų) prie DNR, kad transkripciškai aktyvuotų lac operoną . [Pastaba: CAP turi būti su cikliniu stiprintuvu, kad galėtų prisijungti prie DNR, negali to padaryti vienas ir cAMP yra pagamintas iš ATP (žinokite tai) per adenilato ciklazės fermentą, esantį membranoje].
2) Lac Permease = neaktyvus [INDUCER EXCLUSION] (abu yra), aktyvus (tik laktozė).
3) Lac Repressor = aktyvus [NEIGIAMAS REGLAMENTAS] (abu yra) Neaktyvūs (tik laktozė).
4) Adenilato ciklazės, cAMP gamyba = neaktyvus / mažas (abu) aktyvus / didelis (tik laktozė)
5) CAP-cAMP kompleksas = neaktyvus (abu yra) aktyvus [TEIGIAMAS REGLAMENTAS] (tik laktozė)
6) Lac Operon išraiška = Išjungta (abu yra) Įjungta (tik laktozė).
1. Aktyvus Lac Repressor <--alloaktozė--> neaktyvus "".
2. Aktyvus CAP aktyvatorius <----cAMP---> neaktyvus.
3. Aktyvus CcpA represorius <---Fruktozė-1,6-BP----> neaktyvus.
1) Aerobinis augimas, e-akceptorius = deguonis =
citochromo oksidazė gamina H2O
2) Anaerobinis augimas, organinis e-akceptorius = fumaratas arba nitratas = fumarato reduktazė gamina sukcinatą, nitratų reduktazė gamina amoniaką.
FNR = yra pagrindinis kvėpavimo reguliatorius. Anaerobiškai veikia kaip aktyvatorius ir represorius
P
D. Adenilato ciklazės aktyvumą reguliuoja oksidacija
E. Visa tai, kas išdėstyta aukščiau
Fagocitas = apibrėžiamas pagal savo funkciją, dar žinomas kaip
įsisavinamos dalelės [panašus į užtrauktuką] = struktūra turi krūvą receptorių jų paviršiuje ir turi vidines organeles.
Makrofagai:
– Ilgai gyveno
- Yra audiniuose (brendus)
- Nuo O2 priklausomas žudymas nėra intensyvus
- Sąlygos palankios
tarpląstelinis patogenų augimas
- Patogeno taktika mūšyje =
a) Apeiti kvėpavimo sprogimą
b) Ištrūkti iš fagosomos
c) Užkirsti kelią fagolizosomų susiliejimui
d) Atsparus granulių turiniui
Fagocitozėje dalyvaujantys receptorių tipai:
1) FAGOCITO RECEPTORIAI apibrėžia, kas yra fagocitų ląstelė
1a) „KOMPLEMENTO RECEPTORIAI“, atpažįstantys serumo KOMPLEMENTO KOMPONENTO teigiamus baltymus patogenų paviršiuje.
– 3 KOMPLEMENTŲ KOMPONENTŲ VAIDMENYS = bakterijų lizė, fagocitų chemotaksis, bakterijų opsonizacija [svarbu šiai klasei]
1b) Fc receptoriai – ant fagocitų, suriša pastovią antikūno sritį.
1c) Lektinai = tiesioginis specifinių angliavandenių atpažinimas. specifinis receptorius. ADV: įgytas imunitetas ir komplemento kaskados aktyvinimas nebūtinas, bet.. DISADV: Klaidos paviršiuje turi būti tinkami angliavandeniai. DEKTINAI yra pagrindinė fagocitų lektinų klasė, dalyvaujanti grybelinių patogenų atpažinime. Turi dvejopą paskirtį: dalyvauja įgimtoje, imuninėje signalizacijoje.
2) SUKIBIMO RECEPTORIAI: mobilizuojasi audinyje, kai pereina iš kraujotakos į uždegimo vietą arba taip pat juda.
3) AKTYVAVIMO RECEPTORIAI: pakeiskite fagocitinės ląstelės pobūdį (padidinkite jas geriau naikinti mikroorganizmus = į rinką panašūs receptoriai, Il-1 receptoriai, TNF receptoriai, iFN gama receptoriai =
3a) Ankstyvieji "M1 makrofagai" = "KLASIKINIS AKTYVAVIMAS (raudona) = (1) uždegimas, (2) bakterinės ir virusinės ligos. [KLASIKINIS AKTYVAVIMAS –> DENTAL PROFESSIONAL].
- Klasikiniu būdu aktyvuotų fagocitų savybės (žinokite jas):
1. Padidėjęs fagocitozės greitis
2. Padidinta toksiško reaktyviojo deguonies gamyba
tarpiniai produktai (antimikrobinis)
3. Padidėjusi NO (azoto oksido
antimikrobinis)
4. Sustiprintas fagosomų-lizosomų susiliejimas.
5. Padidėjęs MHC II klasės molekulių skaičius
6. IL-12 sekrecija: CD4 T ląstelių diferenciacija.
3b) Vėliau – "M2 makrofagai" = "ALTERNATYVUS AKTYVAVIMAS (raudona)" = (1) Neuždegiminis, (2) pašalina audinių pažeidimus, (3) Dažnai mažiau riboja patogenus.
Kas veda prie ("priežastys") opsonizacijos? ARBA:
(1) Alternatyvus būdas leidžia atpažinti patogenus (paviršius), kai nėra antikūnų => komplemento aktyvinimas => uždegiminių ląstelių pritraukimas + patogenų opsonizacija + patogenų žudymas.
- Alternatyvus kelias pradeda opsonizaciją suskaidydamas ir nusodindamas C3 fragmentą ant patogeno paviršiaus: opsonino -> C3b opsonizaciją sustiprina fermentas.
(2) Opsonizacija pagal komplemento komponentą: Komplemento komponentai (atpažįstami komplemento receptorių, fagocitinių receptorių tipas) atlieka tris vaidmenis: (a) bakterijų lizė, (b) fagocitų chemotaksis, (c) bakterijų opsonizacija.
- KOMPLEMENTO PRIVALUMAI = Nereikia antikūnų ir gali atpažinti daugybę patogenų.
2) NADPH oksidazės sukeliama savižudybė išskiria antimikrobinius „NETS“ – DNR histonų kompleksai, naikinantys mikroorganizmus (spąstai viduje) – „Su NETS susiję su NETS yra antimikrobiniai“
3) Nuo deguonies priklausomi mechanizmai atsiranda PRIEŠ įsisavinimą (žr. kitą fc)
2) Slopinti opsonizaciją arba inaktyvuoti fagocitozę
1. Kapsulė: S. pneumoniae
2. M baltymas: S. pyogenes
3. Sutrikdyti signalizaciją: RhoGAP baltymai
" Pvz. Fagocitai negali nuryti Streptococcus
pneumoniae su kapsule"
Kam naudinga žala? (Kodėl patogenai sukelia ligas?) =
1. Sukuria naujas kolonizacijos vietas,
2. Palengvina plitimą tarp šeimininkų arba tarp žmonių
3. Gamina maistines medžiagas
4. Antagonizuoja šeimininko gynybą.
[pvz.: Streptococcus pneumoniae išskiria fermentus, kad prasiskverbtų pro nosiaryklės epitelio barjerą. Taip pat išskiria faktorius, slopinančius fagocitozę (pvz., pneumoliziną) ir antikūnų funkciją. Streptococcus pneumoniae = normali nosiaryklės sudedamoji dalis, liga, kurią sukelia išplitimas į distalines vietas. pvz. Strep pneumonae meningitas – sukeltas smegenų infarktas (nuo nosiaryklės iki smegenų)]
- PATOGENAI PAKELA SAVO ŠEIMININKUS, SIEKDAMI SKATINTI AUGIMĄ (VENGTI IMUNINĖS SISTEMOS, KURTI NAUJŲ KOLONIZAVIMO VIETŲ, GAMINTI MAISTINGAS MEDŽIAGAS, PAlengvinti PLITIMĄ).
- PATOGENAI KELIA PAŽALĄ ARBA TIESIOGIAI (PAvyzdžiui, TOKSINAI), ARBA NETIESIOGIAI, SUVEDAMI ŠEIMINĮ PAKEISTI (pvz., UŽdegimą, AUTOIMUNITĄ)
Endotoksinas: gramneigiamų bakterijų ląstelių apvalkalo lipidų ir cukraus komponentas, kuris gali būti labai imunostimuliuojantis
Egzotoksinas: toksinas, kuris išskiriamas į tarpląstelinę aplinką (palyginti su sekrecijos sistemos suleidžiamu toksinu)
pvz. AB toksinai, skaidantys fermentai
Enterotoksinas: toksinas, veikiantis virškinimo trakte
pvz. choleros toksinas
Neurotoksinas: toksinas, veikiantis nervų sistemoje
pvz. stabligės ir botulino toksino
Molekulinė mimika: antigeninis panašumas tarp antigenų, kuriuos gamina patogenai, ir šeimininko (savęs) antigenų. Antikūnai arba T ląstelės, paskatintos atpažinti patogenui specifinį antigeną, kryžmiškai reaguoja su savo antigenu (autoimunitetas).
TRYS TOKSINŲ RŪŠYS:
(1) membranai aktyvūs (ekstraląsteliniai) = SUPERANTIGENAI, poras formuojantys toksinai.
(1a) tie, kurie trukdo ląstelių signalizacijai:
SUPERANTIGENAI =: TCR (T CELL) SIGNALAVIMAS. & CHOLERA TOXIN = cAMP signalizacija.
(1b) CLOSTRIDIALINIAI NEUROTOKSINAI =
stabligės TOKSINAS (slopina ląstelių judėjimą)
BOTULINIO TOKSINAS
= S. aureus pogrupio išskiriami MEDŽIAGOS AKTYVINIAI TOKINAI (TSST-1), VEIKIA IŠ LĄSTELIŲ, ir sukelia TOKSINIO ŠOKO SINDROMĄ.
Superantigenai sukelia NESPECIFIKĄ (nuo antigenų nepriklausomą) T LĄSTELIŲ AKTYVAVIMĄ (2-20 %) = masinę proliferaciją
Pernelyg didelis UŽdegimas sukelia organų nepakankamumą (toksinį šoką)
= tarpląsteliniai taikiniai (ląstelių viduje)
Problema: kaip šie toksinai pasiekia šiuos tikslus?
KAIP A-B TOKSINAI SPRENDŽIA PROBLEMĄ, KAD PATEIKTI PER šeimininko membranas:
1. A-B TOKSINAS, IŠSKIRTAS BAKTERIJŲ: A-SUBVIENETAS AKTYVUMAS (FERMENTINIS DOMENAS).
2. B-SUBVENTAS: PRISIJUNGIMAS PRIE LĄSTELĖS RECEPTORIAUS (-Ų)
3. TOKSINO ENDOCITOZĖ
4. A-SUBVENTO PERKELIMAS IR IŠLEIDIMAS.
1. B subvienetas: jungiasi su gangliozidais ir kraujo grupės antigenais = B SUBVIENETAS: SUSIJUSI ŽARNŲ EPITELIO LĄSTELES.
2. Subvienetas: ADP RIBOSYLTRANSFERAZĖS aktyvumo substratas = adenilato ciklazė = A SUBVIENETAS: ADP RIBOSYLTRANSFERAZĖS AKTYVUMAS SUTRAUKIA TRANSPORTERIO FUNKCIJĄ, SUVEDAMAS Į MASINĖS SKYSČIO SEKRECIJĄ Į ŽARNOS SKIRTĮ.
3. Padidėjęs ciklinis-AMP (cAMP) lygis
a) Didžiulis Cl- jonų ištekėjimas į spindį
b) Na+ ir Cl- absorbcija slopinama
Botulino neurotoksinas (BoNT) – kas tai?
BOTULINIO TOKSINAI TURI PANAŠUS _______, BET ___________ SKIRTINGAS.
Grįžkite namo dėl klostridijų neurotoksinų = BOTULINIO IR stabligės TOKSINAI
- "A SUBVIENETAS" = ATKREIPIA MEMBRANŲ LYDYMO KOMPONENTUS NEURONUOSE IR TODĖL IŠSKYRA NEUROTRANSMISIJĄ.
-"B SUBUNIT" = LABAI PANAŠUS
ABIEŲ TIPŲ TOKSINŲ SURIŠIMO SPECIFIKATAS (NEURONAI).
– SKIRTINGI: B&T TOKSINAI TURI „PRIEŠINGĄ POVEIKĮ“ [B = GLOBAS PARALYŽIS T = SPASTINIS PARALYŽIS] BC VEIKIA DIF. SVETAINĖS (VIETOJI IR CENTRINĖ NERVŲ SISTEMA).- stabligės TOKSINAS (slopina ląstelių judėjimą)
BOTULINIO TOKSINAS
BOTULINIO NEUROTOKSINIS (BoNT) = RAUMENŲ ATLADĖJAMAS BOTULUS = DEŠRA Pastaba: asoc. w Botox = tx tmd, tmj + migrenai.
CD4+ T ląstelės = ekspresuoja ant membranos molekulę, vadinamą CD4 = TIK ATPAŽINTI svetimus peptidus, kuriuos pristato 2 klasės MHC, IŠRAŠYTA APC [CD4 jungiasi prie 2 klasės MHC (išreikšta APC)]
- veikimas: 2 klasės MHC plius peptidas, išreikštas APC (dendritinės ląstelės, makrofagai ir B ląstelės – pastaba: jos taip pat išreiškia 1 klasės MHC. ) sąveikauja su CD4+ T ląstelėmis => CITOKINO SINTEZĖ.
- žinoti, kas sukelia citokinų sintezę.
CD8+ T ląstelės = turi CD8 ant savo membranos = atpažįsta tik svetimus peptidus, pateiktus 1 klasės MHC, IŠSKYRUS VISŲ branduolių turinčiose ląstelėse. [CD8 suriša 1 klasės MHC (išreikštas visose branduolinėse ląstelėse).
- veikimas: MHC 1 klasės plius peptidas, išreikštas bet kurioje branduolio ląstelėje, sąveikauja su CD8+T ląstele => sukelia HOST ląstelės ŽUDYMĄ.
2 MHC KLASĖ = APC (DENDRITINĖS LĄSTELĖS, MAKROFAGAI, B LĄSTELĖS) = HLA-DP, DQ, DR (3 iš mamos, 3 iš tėčio) yra 2 žmogaus klasė = EXOogeninio antigeno apdorojimas (už ląstelės ribų, plaukiojantis) = = turėti PEPTIDŲ SURIŠIMO GROOVE (gali surišti peptidą ir mhc kartu).
IMP – APC YRA BRANDUOLĖS LĄSTELĖS –> TURI IR MHC1, IR MHC2 (TAIP PAT ŽMONIŲ KLASĖS!).
1) Dendritinės ląstelės (DC)
2) Makrofagai (M0)
3) B ląstelės
2. INC. organo ar audinio DYDŽIO, kurį sukelia INC, ląstelių SKAIČIUS (pasireiškia tik ląstelėse, kurios gali dalytis, pvz., dantenose – Neuronai ir širdies raumuo negali dalytis)
3. GRUOŽ. organo ar audinio DYDŽIO, atsirandančio dėl jau egzistuojančių ląstelių MASĖS SUMAŽĖJIMO. (Rezultatai dėl: nenaudojimo, mitybos ar deguonies trūkumo, susilpnėjusios endokrininės stimuliacijos, senėjimo, denervacijos) – gali būti apibendrintas arba lokalizuotas, patologinis arba fiziologinis (dažnas vystymosi metu) Dėl sumažėjusios baltymų sintezės ir padidėjusio baltymų skilimo (atsakingas ubikvitino kelias)
4. Fiziologinis DEC. ląstelių SKAIČIAU iki normalaus SKAIČIO, pvz. Užkrūčio liauka įsitraukia paauglystėje (vaikystės ir suaugusiųjų skirtumas), pvz. Miometriumas įsiskverbia po gimdymo. = Atrofijos forma, apima ląstelių apoptozę.
5. Lipofuscinas (lipochromas) = NEDĖVIMO PIGMENTAS (dažniausiai kaupiasi senyviems pacientams, dažniausiai randamas su hepatocitais, miokardo ląstelėmis ir smegenimis), RUDOJI ATROFIJA (lipofuscino kaupimasis ir oganų atrofija. nuo gelsvos iki šviesiai rudos, riebaluose tirpus pigmentas lipidų / fosfolipidų ir baltymų mišinys, laisvųjų radikalų pažeidimo požymis, pvz., JUOSUOTI RAUMENYS IR KEPENYS.
6. Bilirubinas = hemoglobino ir mioglobino hemo dalies katabolinis produktas.
- patologinė būklė (Jauntice) = kaupimasis kraujyje, skleroje, gleivinėje, organuose. Geltona spalva. Pvz. Hemolizinė gelta (eritrocitų sunaikinimas), obstrukcinė gelta (vidinis / ekstrahepatinis tulžies takų sunaikinimas), kepenų ląstelių gelta (parenchiminis kepenų pažeidimas).
PASTABA: metastazavusių kalcifikacijų atsiranda normaliuose audiniuose.
1. SŪSTIS – PADIDINTI KRAUJO TEKMĄ KRAUJOSE. KRAUJAS IŠSILĖSTI IR SUKURTAS RAUDONŲJŲ KRAUJO LŪSLIŲ (ERITROCITU).
2. EDEMA – PADIDĖJITE SKYSČIO PADIDĖJIMĄ TARPES SKYSČIŲ PADIDĖJANT PADIDĖJANT TARPUS TARP TARPINIŲ KOMPONENTŲ, SUkelia patinimą, IŠSKYRUS KAULŲ
3. KRAUJAVIMAS – KRAUJO SŪKIMAS IŠORĖS KRAUJOJE.
4. TROMBOZĖ – KRAUJOJE SUSIDARO PER GYVENIMĄ .
5. EMBOLIJA – ATSKIRTA KIETOJI, SKYSTA AR DUJINĖ MASĖ KRAUJO KRAUJOJE IŠ KRAUJO IŠ VEIKSMĄ TOLI NUO KILMĖS TAŠKO – Pvz. RIEBALAI, ORO BURUBULĖLIS ARBA N₂, ATEROSKLEROTINĖ PLOKŠTELĖ, AUGIKAS, KAULŲ CIKLAI, Svetimkūniai, TROMBAS.
- Sukelia ląstelių pažeidimą (laisvųjų radikalų pažeidimas):
- Membranų lipidų peroksidacija - didelis membranos pažeidimas.
- Modifikuokite baltymus – sukelkite netinkamą lankstymą ir suskaidymą
- DNR pažeidimas - sukelia vienos ir dvigubos grandinės pertraukas - & gt sukelia ląstelių senėjimą - & gt piktybinę transformaciją
D – DNR skaidymas endonukleazėmis – nukleosomų chromatino fragmentai –
DNR kopėčių išvaizda
Transglutaminazių (kryžminio ryšio apoptozinių citoplazminių baltymų) aktyvinimas
Nėra uždegiminės reakcijos apoptozinių kūnų
PAŽYMĖTAS UŽDEGIMO REAKCIJA:
- LIZOSOMINIAI FERMENTAI - VIRŠKINTI LĄSTELIŲ MEMBRANAS, SUTRIKSTA LĄSTELES
- MAKROFAGAI PO CHEMOTAKTINIŲ FAKTORIŲ IŠSiskyrimo
- ŠIULŲ PAŠALINIMAS FAGOCITINĖS MAKROFAGAIS
Bendrosios ir korinio ryšio charakteristikos:
1. HETEROLIZĖ – Ląstelių degradacija, veikiant ląstelėms IŠORĖS fermentais (pvz., bakterijos, leukocitai) – padidėjęs rausvos spalvos citoplazma
2. Branduoliniai pokyčiai – šviesos mikroskopija
Progresuojanti branduolio kondensacija, galiausiai išnykstant dėmėtiems branduoliams. žinoti šiuos branduolinius pokyčius žr. pav.
2a. PIKNOZĖ – BRANDUOLIO SURAŽĖJIMAS Į MAŽUS, GILIAI BASOFILIUS/JUODUS CHROMATINŲ GRUPULIUS
2b. KARYORHEXIS – BRANDUOTO SUSKAIDYMAS Į KELIUS MAŽUS JUODUS TAŠKELĖLIUS / gabalėlius
2c. KARIOLIZĖ – IR MAŽESNĖS BAZOFILINĖS BRANDUOLIO "IŠBŪKLĖJIMAS", KOL IŠNYKS.
TIPAI:
1) KOGULIACINĖ NEKROZĖ [[pvz. ūminio miokardo infarkto cheminis nudegimas (aspirinas)]
= DAŽNIAUSIAS TIPAS = STAIGUS ORGANŲ KRAUJO TIEKIMO NUTRAUKIMAS (IŠEMIJA): ŠIRDYS IR INKSKTAI (ARTERIJAS SU RIBOTOS UŽKRAUTOS KRAIDUOTĖMIS), ANTINKSČIAI, NĖRA SMEGENUOSE = BALTYMŲ DENATŪRACIJA = ANKSTYVAUSI ANKSTINĖSHIRT. w. BENDRA ARCHITEKTŪRA GERAI IŠSAUGOTA, Progresuojanti branduolio kondensacija, galiausiai išnykstant dėmėtiems branduoliams
Padidėjusi rausvos spalvos citoplazma („eozinofilinė“ „stiklinė“) ir į vaiduoklius panašios struktūros.
2) SKYSTINĖ NEKROZĖ = AUDINIO GRUPIO VIRŠKINIMAS = SKYSČIŲ HISTOLOGIJOS: AUDINIŲ MINŠKĖJIMAS IR SKYSTĖJIMAS, DARŽIAI IŠEMINIS CNS PAŽEIDIMAS, DARŽIAI BAKTERINĖ INFEKCIJA TAIP PAT SUPURATYVA INFEKCIJA (MMIPPURACIJA)
SUSKYSTINTŲ AUDINIŲ NULLĖDŽĖS IR INTENSINGAS NEUTROFILIŲ UŽDEGIMAS ATSAKOMAS = ABSESSAS (židininis neutrofilų rinkinys).
3) KAZEOZINĖ NEKROZĖ = DAŽNIAUSIAI NUSTATYTA TUBERKULOZE
= Į SŪRĮ PANAŠI KONSistenCIJA = HISTOLOGIJA: ARCHITEKTŪRA NEKONSERVUOTA AMORFINĖ RAUŽINĖ, KELI BRANDUOLIŲ GRANULĖLIAI (BE VEIKLOS IŠVAIZDOS) = SUDERINA KOGULIAVIMO IR SKYSČIŲJŲ IR SKYSČIŲJŲ KŪRINIŲ NEKRANTINIŲ TRANSPORTO PRIEMONIŲ DALIS LIMFOCITAI, IR DAUGIABRANDUOTOS MILDŽINĖS LĄSTELĖS. pvz. prie plaučių - pav.
4) GANGRENINĖ NEKROZĖ = IŠPLĖSTI = KRAUJO TIEKIMO Į APATINĖS GALŪNĖS AR ŽARNYNAS NUTRAUKIMAS (ANTRASIS KRAUJŲ UŽSAKARAVIMAS) = DAŽNIAUSIAI BAKTERINĖS INFEKCIJOS, IR DAŽNIAUSIAI BAKTERINĖS INFEKCIJOS = ARBA: (A) W. KOGULIACINĖ NEKROZĖ BE SKYSTĖJIMO. (ŽINOK SKIRTUMĄ TARP DRĖGNO IR SAUSO!) – pvz. NOMA nuotrauka.
5) FIBRINOIDINĖ NEKROZĖ = MATOMA TIK MIKROSKOPINIU TYRIMU = DAŽNAI SUSIJĘS SU IMUNINĖS MEDŽIAGOS SUTEIKTAMU vaskulitu = JUNGIAMASIS AUDINIS IR RAUMENYS PAKEISTI HOMOGENINIU ROŽINĖS MEDŽIAGOS = FIBRINĄ PAMATINANTI. Į FIBRINĄ PANAŠIOS MEDŽIAGOS NUsėdimas ARTERINĖSE SIENELĖSE