Informacija

Koks yra efektyvus būdas uždėti mėlynus guminius butilo kamščius?

Koks yra efektyvus būdas uždėti mėlynus guminius butilo kamščius?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jie atrodo taip.

Turime atlikti daug dujų mėginių ėmimo ir juos surinkti tikrai sunku. Internete ieškojau patarimų, bet jų nėra. Ar turite patirties su šiais? Ar radote gerą būdą jas užsidėti, kuris nesunaikintų rankų, širdžių ir svajonių?


Norėdami paaiškinti, kietoji dalis yra pirmiausia įdėti mėlynus kamščius į vamzdelius. Kai jie gerai įsilieja, galime juos suspausti rankiniu užspaudimo įrankiu. Nuo tada, kai paskelbiau tai, man pasisekė (šiek tiek) geriau naudojant audinio gabalėlį / uždėjus dangtelį ir stiklinį buteliuką tarp spaustukų. Su per dideliu spaudimu iš tikrųjų sudaužiau buteliuką ir visur sudužo stiklas. Geriausias būdas jas įdėti – susukti, tačiau tai dažniausiai atsiranda dėl to, kad po ilgo naudojimo atsiranda mėlynių rankų.

Norėčiau turėti fotoaparatą, bet jie atrodo maždaug taip:


Pagal tai, ką galiu pasakyti iš šio aparato (https://www.youtube.com/watch?v=TwRtsAG5Oy4), pirmiausia ant butelių uždedami mėlyni dangteliai, tada ant viršaus uždedamas laisvas aliuminio kaklelio sandariklis. kapsulės, kuri po to spaudžiama aparate, kad užsandarinamas dangtelis, taigi, jei naudojate daug dujų mėginių ėmimo metodų, gali būti verta investuoti į panašaus aparato / technologijos įsigijimą mėginiams užsandarinti, nes tai būtų efektyviausia ilgainiui. .

REDAGUOTI: kaip nurodė @user137, taip pat yra rankinio užspaudimo įrankių, kuriuos galite naudoti, kurie yra žymiai pigesni, kuriuos, kaip nurodė @user137, galite rasti čia


Mielės turi kvėpuoti

Kaip skaitytojai galėjo atspėti iš ankstesnių įrašų, mano alaus pomėgiai yra minimaliai įprasti. Laimei, „Basic Brewing Radio“ podcast'as reguliariai plečiasi gerokai daugiau nei įprastas “fermentuotas salyklas, pagardintas apynių tizanu” (vieną iš šių dienų turiu pabandyti sukurti savo “Imbierinio alaus gamyklą” nuo nulio& #8230). Prieš porą savaičių jie padarė labai įdomų epizodą, apimantį aeracijos metodų eksperimentą. Mano ego naudinga žinoti, kad teisingai atspėjau, kaip bus rezultatai. Gražaus paties eksperimento aprašymo kopiją galite gauti čia, bet čia yra paprasta versija:

Įprasta pradėti gaminti sumaišius ingredientus dideliame puode ir užvirinant. Be galimo poveikio skoniui, tai taip pat padeda sterilizuoti tai, ką ruošiatės fermentuoti, o tai padeda išvengti, kad jame augtų ne tik mielės (ir galbūt bakterijos), kurias tyčia įdėjote. Deja, šis taip pat pašalina didžiąją dalį deguonies, esančio užpilame, nes dujos nėra gerai ištirpusios karštuose vandeninguose skysčiuose. Kad mielės pakankamai augtų prieš įsitvirtindamos „fermentacijos“ proceso stadijoje, mielės naudojasi deguonimi, kad suteiktų biologinę galią per kvėpavimą ir šiek tiek daugiau deguonies, kuris naudojamas ląstelių membranų medžiagai gaminti. atskiras procesas. Tai reiškia, kad po virinimo paprastai reikia kažkaip aeruoti skystį, kai jis atvės.

Tradiciškai tai būtų daroma purtant arba maišant užpilą arba, galbūt, kelis kartus pilant jį pirmyn ir atgal tarp dviejų talpyklų. Žmonės iš esmės yra tingūs gyvūnai, tačiau atrodo, kad daugelis žmonių mėgsta naudoti oro siurblius. Fredas Johnsonas nusprendė palyginti aeraciją su oro siurbliais (su “oro akmeniu” ir be jo) su aeravimu purtant.

Nemanau, kad galėčiau paaiškinti rezultatus, neatskleisdamas ryškumo, todėl štai: purtymas veikia daug geriau nei oro siurbliai. Prisimenu, kad prieš metus skaičiau to priežastį knygoje apie akvariumo žuvų laikymą “oro siurblys” ne iš tikrųjų į vandenį patenka daug deguonies. Priežastis, dėl kurios oro siurblys vėdina vandenį, yra ta burbuliukai priverčia vandenį cirkuliuoti, traukdamas vandenį su mažiau deguonies iš rezervuaro apačios į viršų, kur jis gali keistis dujomis su oru per vandens paviršių. Tai taip pat paaiškintų, kodėl eksperimentas parodė, kad vien tik virinto bandomojo vandens pumpavimas į talpyklą savaime žymiai padidina ištirpusio deguonies kiekį. Trumpai tariant, kuo daugiau vandens paviršiaus yra veikiami oro, tuo greičiau jis pasieks normalų deguonies prisotinimo lygį.

Nes labai pavydžiu Fredo Johnsono sugebėjimo į rankas paimti peristaltinius siurblius ir ištirpusio deguonies matuoklį, o šiuo metu negaliu sau leisti net pH matuoklio (jau nekalbant apie mikroskopo sąranką, kurios noriu […sniffle…) ]), norėčiau paimti kelias pastraipas ir pasirinkti keletą galimų eksperimentinio dizaino niuansų, kad pasijusčiau geriau. Vis dėlto bent vienas iš tų nitų man suteikia idėją…

Pirma, po atvėsinimo eksperimento metu užvirintas vanduo per silikoninius vamzdelius buvo pumpuojamas į indus bandymui. Silikonas tikriausiai yra pralaidiausias deguonies kaučiukas[1][4], todėl yra standartinių medicinos prietaisų, kurie veikia kaip dirbtiniai plaučiai, pumpuoja kraują per silikono membranas ore, kad prisotintų jį deguonimi[2] ]. Jei jis tinka kraujui, galbūt šis principas gali būti naudingas ir kitiems skysčiams. Norėčiau pamatyti kai kuriuos eksperimentus, skirtus nustatyti, kaip greitai per silikoninį vamzdelį pumpuojamas vanduo aeruojamas (taip pat manyčiau, kad daug lenkimų vamzdeliuose sukeltų turbulenciją ir padidėtų deguonies prisotinimo greitis, palyginti su siurbimu tiesiai arba švelniai suvyniotas vamzdžių rinkinys). Taip pat norėčiau, kad palyginimui būtų atliktas tas pats eksperimentas su butilo gumos vamzdeliais – butilo kaučiukas yra tai, ką naudojome anaerobinių kultūrinių mėgintuvėlių kamščiams, nes jis gavo labai palyginti mažas dujų pralaidumas[3].

Taip pat man būtų įdomu, ar azoto purškimas būtų veiksmingesnis deguonies pašalinimui iš vandens nei virinimas. Tikriausiai tai turėtų būti daroma naudojant mažesnius mėginius, nors – laboratorijoje azotą burbuliavome per kiekvieną mažą, siaurą 10 ml auginimo terpės mėgintuvėlį maždaug dešimt minučių, prieš tai užkimšdami mėgintuvėlį butilo gumos kamščiu, kad atliktume anaerobinį kultivavimą. . Įtariu, kad būtų daug sunkiau tą patį metodą padidinti iki 6 galonų…

Bet kokiu atveju, čia yra kažkas, su kuo būtų verta žaisti, jei silikonas yra pakankamai pralaidus šiam tikslui: galima paimti į rankas ilgą silikono ir #8220oro vamzdelio ritę” (mažesnis vamzdelis = didesnis paviršiaus ir tūrio santykis ir hipotetiškai greitesnis dujų apykaita), tada sukurkite būdą, kaip misą/misą/bet ką perkelti tiesiai iš verdančio puodo į fermentatorių per susuktą vamzdelį, kad būtų atliktas aeravimas nekratant, burbuliuojant ar kitaip netrikdant skysčio, taip sumažinant. užteršimo grėsmė.

Paprastesnis įsilaužimas gali būti purkštuvo galvutės įrengimas ant tiekimo vamzdelio išėjimo galo. Dar paprastesnis, galbūt suspausti plokščią (bet ne visiškai) vamzdelio išleidimo galą, kad ištekantis skystis išeitų paskleistas į plokščią lakštą, o ne į srovę. Bet kuriuo atveju, tai turėtų labai padidinti skysčio paviršiaus, veikiamo oro kiekį, išeinantį iš vamzdelio ir nusileidžiant į fermentatorių, o tai sukeltų didelį atsitiktinio aeravimo kiekį be jokios papildomos darbo jėgos ar motorinių prietaisų.

Ar aš esu viską žinantis, protingas vaikinas?

[1] Zhang H, Cloud A: “Silikoninės gumos pralaidumo charakteristikos
“ IN Sampe Fall Technical Conference Global Advances in Materials and Process Engineering: 38th International Sampe Technical Conference Society for the Advancement of Material & Process Engineering 2006 m. lapkričio 9 d. ISBN 0938994727
(Straipsnis PDF formatu pasiekiamas čia nuo 20080910)
[2] Carlson RG, Land AJ, Ivey LW, Starek PJ, Rees JR, Subramanian VA, Twichell J,
Baxter J, Bloch JH, Lillehei CW: “Bendras širdies ir plaučių palaikymas su vienkartiniu membraniniu oksigenatoriumi atliekant aortokoronarinės arterijos ir venos transplantacijos operacijas.” Krūtinė. 1972 Oct62(4):424-32.
[3] Hungate RE, Smith W, Clarke RT: “Butilo gumos kamščių tinkamumas anaerobinių ritininių kultūros mėgintuvėlių uždarymui.” J Bacteriol. 1966 Vas.91(2):908-9.
[4] „AZo Journal of Materials Online“: “Silicone Rubber” http://www.azom.com/details.asp?ArticleID=920 (prieiga 20080910)


Šešioliktas skyrius – Paprastas mikroorganizmų, skirtų chalkoforo gamybai, atrankos tyrimas

Neseniai buvo nustatyta, kad metanotrofai išskiria chalkoforą, tai yra metalo ligandą, turintį didelį afinitetą ir specifiškumą variui. Greitas chalkoforo ekspresijos atrankos metodas buvo sukurtas pritaikant chromo azurolio S (CAS) tyrimą, kuris iš pradžių buvo naudojamas sideroforo gamybai įvairiose bakterijų ir grybelių grupėse nustatyti. Šiame tyrime geležies (III) chloridas buvo pakeistas vario (II) chloridu. Cu – CAS tyrimo skystos ir agaro plokštelės gali būti naudojamos izoliuoto metanobaktino aktyvumui ištirti arba organizmų atrankai, siekiant sukurti chalkoforą. Nors čia aprašomas šio tyrimo naudojimas metanotrofų atrankai chalkoforo gamybai, jis gali būti modifikuotas, jei reikia, siekiant patikrinti ir kitus organizmus chalkoforo gamybai. Daugelis sideroforų taip pat gali surišti varį esant CAS. Todėl šis tyrimas turėtų būti atliekamas kartu su pradiniu geležies – CAS tyrimu, siekiant nustatyti, ar teigiami Cu – CAS tyrimo rezultatai atsirado dėl nespecifinio vario surišimo sideroforu. Šis nebrangus tyrimas taip pat gali padėti analizuoti chalkoforo sintezės genetiką.


Bendrosios gumos sukibimo taisyklės

Gumos tipo nustatymas

Yra daugybė gumos rūšių. Gali būti naudinga žinoti, kokio tipo bandote laikytis, kad suprastumėte, kokio lankstumo ir laikymosi reikės. Tikriausiai tai yra dažniausiai pasitaikantys gumos tipai, kuriuos bandysite klijuoti:

  • Nitrilo guma yra įprasta guma, kuri dažnai randama įvairiose srityse, įskaitant žarnas, sandarinimo žiedus, tarpiklius, konvejerio juostas, kabelių apvalkalus ir spausdinimo volelius.
  • Butilo guma yra labai lankstus ir naudojamas tokiuose gaminiuose kaip pamušalai, vidiniai vamzdžiai, sandarikliai ir kamščiai bei vožtuvų lizdai.
  • Poliuretano guma naudojamas formoms ir modeliavimui.
  • Natūrali guma gali būti naudojamas tvirtinimams, kiliminės dangos pagrindui, tarpikliams ir sandarinimams.
  • Silikoninė guma yra labai atsparus dideliam karščiui, todėl yra populiarus tarpinių žiedų, tarpiklių, indų, orkaitės indų, medicinos prietaisų ir protezavimo pasirinkimas.
  • EPDM guma gali būti automobilių žarnose, sandarikliuose ir kt.

Gumos paruošimas sukibimui

Dėl įvairių naudojimo būdų, kol bandysite suklijuoti, jūsų guma gali turėti pelėsių atpalaiduojančių, slydimo priedų ar kitų tepalų. Taigi, kad ir su kokia guma dirbtumėte, prieš bandant sukibti patartina ją nuriebalinti tirpikliu.

Pasirinkite izopropanolį, nes acetonas gali būti per griežtas kai kurioms gumos rūšims. Atminkite, kad jūsų gumoje gali būti plastifikatoriaus, kuris pateks į paviršių ir kels grėsmę jūsų ryšiui ateityje. Štai kodėl svarbu pabandyti identifikuoti savo gumą ir suderinti ją su geriausiais darbui skirtais klijais!


Lanksti metanokoko ir kitų formatą naudojančių metanogenų auginimo sistema.

Metanogenai yra griežtai anaerobiniai mikroorganizmai, priklausantys Euryarchaeota. Kaip didelė ir įvairi grupė, jie išsiskiria tuo, kad jie gali gauti didžiąją, jei ne visą, savo augimui reikalingos energijos iš metano gamybos arba metanogenezės [1]. Apskritai metanogenai metanogenezei naudoja tik ribotą substratų skaičių, pvz., C[O.2] [H.2] formiato metilo grupę turinčių junginių, tokių kaip metilaminai, metilsulfidai ir metanolio acetatas, ir keletą mažų. molekulinės masės alkoholiai. Juose nenaudojamas cukrus, aminorūgštys ar dauguma kitų įprastų organinių substratų [2]. Dauguma metanogenų yra hidrogenotrofai, kurie naudoja [H2] kaip pirminį elektronų donorą, kad redukuotų C[O2] į metaną. Daugelis hidrogenotrofinių metanogenų taip pat gali naudoti formiatą kaip pagrindinį elektronų donorą [2]. Kaip parodyta (1), keturios natrio formiato molekulės yra oksiduojamos, todėl susidaro viena metano molekulė ir trys C[O2] molekulės.

4HCOONa + 2[H2]O [rodyklė dešinėn] C[H4] + 3C[O2] + 4NaOH. (1)

Kadangi vienam moliui C[H.sub.4] susidaro ne daugiau kaip vienas ATP [3], net ir kukliam augimui reikalingas santykinai didelis formiato kiekis. Augant ląstelėms su natrio formiatu, taip pat labai kaupiasi NaOH, o tai padidina terpės pH ir stabdo augimą. Metanokokams šarminis pH taip pat sukelia ląstelių lizę ir greitą žūtį [4]. Dėl to pH kontrolė tampa itin svarbiu rūpesčiu auginant metanogenus su natrio formiatu.

Vienas iš sprendimų yra pH padidėjimą titruoti skruzdžių rūgštimi auginant fermentatoriuje [5]. Auginant kultūros mėgintuvėliuose ir plokštelėse, terpės pH taip pat gali būti reguliuojamas naudojant įmontuotą skruzdžių rūgšties rezervuarą [4]. Šioje auginimo sistemoje terpės pH stabilizuoti naudojamas 6 x 55 mm rūgšties rezervuaras, kuriame yra 200 μl skruzdžių rūgšties [4]. Didėjant pH, skruzdžių rūgšties absorbcija iš viršutinės dalies taip pat didėja, išlaikant pH lygį, kuris palaiko augimą. Nors šis metodas leidžia gerai augti ant terpės, kurioje yra formiato, jo rankų miklumo reikalavimas neleidžia jo naudoti įprastai. Formiato kaip substrato naudojimas taip pat buvo nustatytas chemostato sistemoje. Costa ir kt. [6] naudojo formiatą M. maripaludis auginimui chemostate, tirdamas transkripcijos reguliavimą. Natrio formiatas buvo pridėtas 0,38 M, o pH buvo palaikomas ties 6,95 automatiškai pridedant 10% (v/v) [H2]S[O4] [6]. Ląstelių tankis ir augimo greitis, pasiektas naudojant formatą arba [H2]/C[O2], auginant chemostatu buvo vienodi [6-9].

M. maripaludis auginant su formiatu, formiato dehidrogenazė (Fdh) yra pagrindinis formiato panaudojimo fermentas. M. maripaludis Fdh koduoja du genų rinkiniai fdhA1B1 ir fdhA2B2 [10]. Lupa ir kt. [11] nustatė, kad mutantai su delecija fdhAl blogai augo ant formato tik po ilgesnio atsilikimo. Priešingai, mutantai, turintys delecijas fdhA2, išaugo beveik taip pat, kaip ir laukinio tipo. Dėl šio ir kitų įrodymų buvo pasiūlyta, kad Fdh1 vaidins svarbų vaidmenį fomato panaudojime [11].

Per pastarąjį dešimtmetį M. maripaludis buvo sukurta daug genetinių metodikų. Tai apima veiksmingus atrenkamus genetinius žymenis [12–16], daugybinius plazmidinius maršrutinius vektorius [17], didelio efektyvumo transformaciją [18], tiesioginę genų pakeitimo mutagenezę [19], genų ištrynimo sistemas be žymenų [20], atsitiktinę mutagenezę [21], in vivo transpozono mutagenezė [22, 23], reporterių genų technologijos [24, 25] ir chemostatų auginimas [6-9]. Taigi M. maripaludis genetinis manipuliavimas yra lengvas ir efektyvus, o šie metodai tapo galingais įrankiais tiriant daugelio Methanococcus rūšių metabolizmą ir fiziologiją. Tačiau [H.sub.2] augimo reikalavimas riboja šių genetinių priemonių galimybę plačiai taikyti laboratorijose, kurios neturi nusistovėjusių [H.sub.2] dujų tvarkymo sistemų.

Čia pateikiame terpę, skirtą mezofilinėms jūrinėms rūšims M. maripaludis kultivuoti formiate, naudojant glicilglicino buferį kaip pH stabilizatorių. Paprastai M. maripaludis auginamas aliuminiu uždarytuose mėgintuvėliuose su 5 ml terpės [H.2]/C[O.2] mišinyje (4:1, v/v) esant 276 kPa [26]. Palyginimui, mūsų formiatų auginimo sistemoje slėgis sumažintas iki 104 kPa, todėl galima naudoti nebrangesnius kamščius. Be to, išvengiama dažno dujų papildymo, labai neprarandant augimo derliaus. Paprasti įprastų stiklinių indų modifikacijos taip pat leidžia dirbti litrų mastu naudojant tik dujų išpylimo stotį ir vakuuminį siurblį. Be to, kieta terpė pasižymi dideliu dengimo efektyvumu, tinkančiu genetiniams eksperimentams. Nežymiai pakoregavus terpės sudėtį, procedūra taip pat tinka itin termofiliniam Methanothermococcus okinawensis augimui.

2.1. Padermės, terpė ir augimo sąlygos. Methanococcus maripaludis padermė S2 buvo gauta iš mūsų laboratorinės kolekcijos (Whitman ir kt.) [27] ir auginama 37 °C temperatūroje. Methanothermococcus okinawensis padermė IH1 buvo gauta iš Takai ir kt. ir kultivuojamas 62°C temperatūroje [28].

Kultūros buvo auginamos [H2]/C[O2] terpėje (McNA, minimali terpė su 10 mM natrio acetatu) arba formato terpėje (McF), redukuotoje 3 mM cisteino hidrochloridu. 5 ml kultūros buvo auginamos 28 ml aliuminiu uždarytuose mėgintuvėliuose. McNA mėgintuvėliuose buvo slėgis iki 276 kPa su [H.2]/C[O.2] (4:1, v/v) ir kas 24 valandas po inokuliacijos užpildomi tomis pačiomis dujomis. Išsamūs augimo ant formiato protokolai pateikti A priede. Trumpai tariant, McF terpėje buvo 0,4 M natrio formiato ir ji buvo buferizuota 0,2 M glicilglicinu (pH = 8,0). Pirmiausia terpė buvo apšlakstoma [N2], kad būtų pašalinta didžioji dalis [O2], o po to buvo pridėta 3 mM cisteino chlorido. Vamzdžiai buvo slėgti iki 103 kPa naudojant [N.2]/C[O.2] (4:1, v/v) prieš autoklavavimą. Prieš inokuliaciją kaip sieros šaltinis buvo pridėta 3 mM natrio sulfido.

Išbandyti buferiai buvo gauti iš Sigma Chemical Co. ir juose buvo (su priešjonu) Tricinas/NaOH (N-[Tris(hidroksimetil)metil]glicinas), Bicinas/NaOH (N, N-bis(2-hidroksietil)glicinas) , Tris/HCl (2-amino-2-hidroksi-metil-propan-1,3-diolis), glicinas/NaOH ir glicilglicinas/NaOH. Ruošiant formiato terpę, sudedamosios dalys buvo pridėtos, kaip nurodyta prieduose, o organiniai buferiai buvo pridėti iš pradinių tirpalų, kurių pH yra 7. NaCl koncentracija buvo koreguojama atsižvelgiant į natrio formiato ir natrio kiekį buferyje, kad galutinis rezultatas. natrio jonų koncentracija buvo 0,4 M.

Galutinė terpė taip pat buvo išbandyta, kad būtų galima išdėlioti (B priedas) ir augti 1,5 l kultūrų (C priedas).

2.2. Greitasis Formatų terpės paruošimo protokolas. Sujungus McF terpės komponentus, buvo pridėta cisteino ir terpė be anaerobinių atsargumo priemonių buvo išpilstoma į kultivavimo mėgintuvėlius (D priedas). Nedelsiant vamzdeliai buvo užsandarinti kamščiais ir aliuminio sandarikliais. Tada vamzdeliai buvo prijungti prie dujų išleidimo kolektoriaus, o oras pašalinamas trimis ciklais iš eilės, apimančius 45 sekundes vakuumo, po to 15 sekundžių 104 kPa [N.sub.2]: C[O.2] (4: 1, v/v). Pasikeitus dujomis, terpė buvo autoklave 20 minučių su greitu išmetimu.Kontrolinės terpės terpė buvo dozuojama anaerobinėje kameroje, kaip aprašyta A priede, ir dujos buvo keičiamos tris ciklus su [N.2]/C[O.2] (4:1, v. /v) prieš dedant autoklave.

3.1. Formato terpės ir augimo sąlygų optimizavimas. Norint nustatyti, ar organiniai buferiai slopina augimą, jie buvo dedami į terpę M. maripaludis auginant [H.sub.2]/C[O.2]. Kadangi terpė buvo stipriai buferizuota bikarbonatu ir C[O2], buferiai neturėjo įtakos pradiniam pH. Tokiomis sąlygomis tricinas buvo stipriai slopinamas (1 pav.). Nors glicinas ir bicinas turėjo mažai įtakos ląstelių derliui, abu padidino vėlavimo fazę esant didesnėms koncentracijoms (duomenys nerodomi). Priešingai, Tris ir glicilglicinas nebuvo slopinantys ir dėl to vidutiniškai sumažėjo atsilikimo fazė, tikriausiai palaikant optimalų pH ankstyvosios augimo fazės metu (duomenys nerodomi). Todėl Tricine ir Bicine nebuvo atlikti tolesniuose eksperimentuose.

Tris, glicinas ir glicilglicinas buvo toliau tiriami dėl jų buferinio pajėgumo augimo metu naudojant 200 mM natrio formiatą. Esant 100 mM buferiui, po 20 val. kultūra pasiekė maksimalią absorbciją – apie 0,4–0,45 (2 pav.). Per pirmąsias dvi inkubacijos dienas 37 °C temperatūroje visi trys buferiai palaikė terpės pH apie 7,2–7,6. Tačiau ilgų inkubacijų metu buvo pastebėta sumažėjusi absorbcija ir ląstelių lizė terpėje, buferinėje Tris ir glicinu (2 pav., duomenys nerodomi). Priešingai, kultūrų, papildytų glicilglicinu, absorbcija išliko stabili šešias dienas 37 ° C temperatūroje (2 pav.). Be to, glicilgilcinu buferinėje terpėje kultūros absorbcija nepasikeitė iki šešių savaičių kambario temperatūroje, ir vis tiek buvo galima perkelti pradines kultūras į šviežią terpę. Kultūros McF terpėje taip pat buvo naudojamos ruošiant -80°C šaldymo atsargas 30 % (v/v) glicerolio [26, 29], ir šios kultūros išlaikė gyvybingumą mažiausiai penkerius metus.

Siekiant sumažinti anaerobinės terpės paruošimo kaštus, taip pat buvo išbandyta skirtingų tipų kamščių įtaka augimui. Kultivavimas ant [H.sub.2]/C[O.sub.2] paprastai atliekamas esant 276 kPa slėgiui 28 ml aliuminio sandariose tūbelėse. Dėl šios priežasties dažniausiai naudojami stori butilo gumos kamščiai (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, kat. Nr.: 2048-11800). Šie kamščiai pagaminti taip, kad sumažintų dujų nuotėkį ir išlaikytų daugybę adatų dūrių ruošiant terpę, sėjant ir imant mėginius. Kaip alternatyva, butilo gumos pilki kamščiai (Wheaton Science Products, kat. numeris: W224100-202) yra daug pigesni, nors ir plonesni. Nors šie kamščiai negali išlaikyti aukšto slėgio, jie gali būti tinkami augti ant formiato esant žemesniam slėgiui. Kaip parodyta 2 paveiksle, Wheaton užsandarintos kultūros turėjo panašius augimo profilius ir stabilumą, ypač terpėje, papildytoje glicilglicinu. Priešingai, baltos nuosėdos buvo pastebėtos kultūrose, papildytose Tris ir glicinu (duomenys nerodomi). Terpės sudėtis primena jūros vandenį ir joje yra daug dvivalenčių katijonų. Autoklavavimo metu šios terpės pH padidėja dėl sumažėjusio C[O.sub.2] tirpumo aukštoje temperatūroje. Manoma, kad šios nuosėdos yra fosfato druskos, kurios tampa netirpios esant šarminiam pH. Po autoklavavimo storesniais kamščiais nuosėdos buvo retai stebimos, tikriausiai todėl, kad jos geriau išlaikė C[O.2] autoklavavimo metu.

Esant 100 mM glicilglicino, augimo derlius netiesiškai didėjo esant formiato koncentracijai ir buvo didžiausias esant 0,6 M. Augimas buvo slopinamas 1 M natrio formiatu, tikriausiai dėl natrio toksiškumo (duomenys nerodomi). Esant didelėms formiatų koncentracijoms ir 100 mM glicilglicinui, ląstelės lizuojasi nejudančioje fazėje, tikriausiai dėl terpės šarminimo. Nustatyta, kad gliklicino koncentracijos padidinimas iki 200 mM su 0,4 M formiatu yra optimalus partijos augimui. Esant tokiai būklei, augimo greitis buvo panašus į [H.sub.2]/C[O.2] terpėje. Be to, didžiausias OD600nm 1,0 buvo panašus į 1,4 [H.2]/C[O.2] terpėje (3 pav.). Taigi, ląstelių išeiga vienam elektronų donoro moliui buvo beveik lygiavertė. Pavyzdžiui, terpėje su 0,4 M formiato buvo apie 2 mmol formiato 5 ml, o augimo išeiga buvo apie 340 mg sausos masės [L.sup.-1] arba 0,85 g sausos masės [mol.-1]. formato. 5 ml [H2]/C[O2] kultūrų su 2,7 mmol [H.2] augimo išeiga buvo apie 400 mg sausos masės [L.sup.-1] arba 0,74 g sausos masės [mol.-1] [H.2].

Geras augimas taip pat buvo nustatytas formiato terpėje, kurioje serumo buteliuose buvo 1,0 % (m/v) agaro. Išsami informacija apie paruošimą pateikta B priede, tačiau jis panašus į anksčiau aprašytus protokolus [30, 31]. Panašiai kaip augimas naudojant [H.2]/C[O.2] terpę, izoliuotos kolonijos atsirado po 3–5 dienų inkubacijos, o apsodinimo efektyvumas buvo 100%.

3.2. Paprasta vidutinio masto M. maripaludis ir M. okinawensis kultivavimo sistema su Formatu. Modifikuota formiato terpė taip pat buvo naudinga M. maripaludis ir M. okinawensis auginimui litre arba vidutiniu mastu, ruošiant biomasę fermentų ir kitiems tyrimams. Šiuo tikslu buvo sukurta paprasta auginimo sistema, naudojant įprastus laboratorinius stiklinius indus ir įrangą (C priedas). Daugiausiai sudarytas iš 2 l auginimo butelio, vandens gaudyklės ir dujų gaudyklės, kiekviena rinkinys palaikė 1,5 l kultūros augimą. Augimo metu išmetimo linija leido pasišalinti susidariusiems C[H4] ir C[O.2], vandens gaudyklė neleido vandeniui tekėti atgal į kultūrą, o dujų gaudyklė neleido oro difuzijai atgal į kultūrą. kultūros butelis. Taip pat buvo sukurtas protokolas, užtikrinantis visišką terpės sumažinimą prieš inokuliaciją (C priedas). Nors terpė buvo purškiama prieš inokuliaciją, po inokuliacijos nereikėjo išleisti dujų, o sistemą buvo galima lengvai perkelti į garų gaubtą, inkubatorių ar kitą gerai vėdinamą erdvę. Su 2 % inokuliu M. maripaludis S2 išaugo iki maždaug [OD600 nm] = 0,8 po 15 valandų inkubacijos 37°C temperatūroje. Toje pačioje terpėje M. okinawensis IH1 išaugo iki [OD600 nm] = 0,6 (4 pav.). Tačiau glicilglicino buferinio pradinio tirpalo pH sumažinimas iki 6,5 sumažino M. okinawensis vėlavimo fazę iki 12 valandų 62 °C temperatūroje, nesumažinant išeiga (duomenys nerodomi). Abiejų kultūrų ląstelių išeiga buvo maždaug 1 g (šlapio svorio) iš l.

3.3. Greitas terpės paruošimas be anaerobinės kameros. Anaerobinė kamera dažnai naudojama ruošiant terpę metanogenams, tačiau ji yra brangi ir užima daug laboratorinės erdvės. Norint nustatyti, ar formiato terpę galima paruošti laboratorijose su ribota anaerobine įranga, ji buvo ruošiama aerobiniu būdu, o dujos keičiamos vakuuminiu siurbliu ir dujotiekiu, prijungtu prie paprasto dujinimo kolektoriaus, valdomo trijų krypčių rutuliniu vožtuvu. Sistema buvo sukonstruota iš standartinių suspaudimo jungiamųjų detalių, todėl jos gamybai reikėjo mažai įrangos ir specialių žinių. Jis buvo sukurtas taip, kad vienu metu būtų galima paruošti dešimt tūbelių ar serumo buteliukų. Dujoms stebėti buvo naudojamas vakuuminis manometras. Išleidus terpę aerobiniu būdu, buvo atlikti dujų išleidimo/vakuuminiai ciklai, siekiant pašalinti [O2] iš terpės (D priedas). Įdomu tai, kad augimas terpėje net su vienu dujų išleidimo / vakuumo ciklu buvo beveik toks pat, kaip ir įprastai paruoštoje terpėje (duomenys nerodomi). M. maripaludis kultūros dažnai yra tolerantiškos [O.sub.2], o logaritminės fazės kultūrų augimui įtakos neturi [O.sub.2] dalinis slėgis < 20 kPa, remiantis mūsų patirtimi. Todėl buvo įmanoma, kad didelis inokuliato dydis galėjo apsaugoti ląsteles nuo likučių [O.sub.2]. Norint ištirti šio metodo tinkamumą mažiems inokuliams, buvo atliktas labiausiai tikėtino skaičiaus (MPN) eksperimentas terpėje, paruoštoje su trimis dujų mainų ciklais (1 lentelė). Labiausiai tikėtini skaičiai buvo atitinkamai 50 ir 160 terpėse, paruoštose pagal greitąjį arba standartinį protokolą su anaerobine kamera [32]. Šie dideli skaičiai reikšmingai nesiskyrė ir būtų įmanomi tik tuo atveju, jei augimą galėtų inicijuoti tik viena ar dvi ląstelės abiejose terpėse.

Šis protokolas taip pat buvo tinkamas ruošiant kietą terpę ir dengiant lėkštes mutantams ar kitoms kloninėms kultūroms išskirti (D priedas). Agaro plokštelės buvo suformuotos serumo buteliuose, kaip aprašyta B priede. Po augimo pavienės kolonijos buvo paimtos švirkšto adata ir perkeltos į sultinį [N.2] dujų srove.

Čia sukurta metanogenų terpė ir kultivavimo sistema bandė išspręsti daugybę problemų. Pirma, reagentai ir įranga turėtų būti prieinami daugeliui tyrimų laboratorijų. [H.sub.2] pakeitus formiatu, kaip pagrindiniu metanogenezės substratu, nebereikėjo [H.sub.2] tvarkymo sistemos, todėl sumažėjo sąnaudos ir padidėjo auginimo saugumas. Vidutinės terpės paruošimo išlaidas galima dar labiau sumažinti naudojant daug pigesnius pertvaros kamščius. Be to, pakako paprasto dujų išleidimo kolektoriaus, o anaerobinės kameros nereikėjo. Šie metodai yra paprasti ir nereikalauja didelio mokymo. Džordžijos universitete šią kultivavimo sistemą plačiai naudojo bakalauro studentai, norėdami išskirti ir auginti M. maripaludis mutantus. Nors mokymas vis dar reikalingas, ypač norint saugiai naudoti švirkštus ir slėginius stiklinius indus, daugelio sudėtingų Hungate metodo manipuliacijų [33] išvengiama. Daugeliui biologinių tyrimų dažnai reikia sukurti kultūras iš pavienių ląstelių, taip pat generuoti didelius biomasės kiekius. Abu šie dalykai dažnai būna sudėtingi išrankiems anaerobams. Čia sukurta sistema pasižymėjo dideliu padengimo efektyvumu ir buvo galima sukurti kultūras tik iš kelių ląstelių. Todėl jis tinkamas mutantų išskyrimui ar kitiems genetiniams eksperimentams. Be to, buvo galima sukurti pakankamai biomasės fermentiniams tyrimams ir kitoms biocheminėms analizėms. Glicilglicino buferis neleido terpei šarminti ir leido kultūroms keletą savaičių išlikti gyvybingoms ant stendo. Glicerolio pridėjimas leido išlaikyti gyvybingas kultūras mažiausiai penkerius metus -80 °C temperatūroje. Nepaisant to, formiato terpė užtikrina panašų augimo greitį ir ląstelių derlių, kaip ir [H2]/C[O2] terpė. Be to, šią terpę ir protokolą pritaikė Weimaras ir kt. [34] kelių šulinėlių plokštelės metodui, skirto cheminių junginių bibliotekų atrankai [34]. M. maripaludis buvo auginamas 96 šulinėlių mikrotitravimo plokštelėse, uždarytose AGS AnaeroGen kompaktiniame maišelyje (Oxoid) ir inkubuojamas 37 °C temperatūroje anaerobinėje kameroje, kurioje yra 5% [H.2], 5% C[O. 2 sub.] ir 90 % [N.2] [34]. Todėl šie metodai gali būti lengvai pritaikyti daugeliui eksperimentinių metodų.

A. Methanococcus maripaludis ir Methanothermococcus okinawensis formato augimo bazinė terpė (McF)

(1) Pasirinkite tinkamus stiklinius indus.

Šioje terpėje yra 0,4 M formato. Augimo metu metanogenai paverčia formiatą į C[O2] ir C[H4] dujas ir sukelia slėgio padidėjimą. Taigi kiekvienam litrui terpės ląstelės gali pagaminti apie 10 litrų dujų. Dėl to kultivavimo indai gali sprogti, jei galvutės erdvė nėra pakankamai didelė, kad nesikauptų dujų slėgis. Dėl šios priežasties rekomenduojame, kad viršutinės erdvės tūris būtų ne mažesnis kaip penkis kartus didesnis už terpės tūrį auginimo induose, kuriuose gali būti iki 276 kPa slėgis. Rekomenduojami didžiausi terpės tūriai 28 ml aliuminiu uždarytuose mėgintuvėliuose, 160 ml serumo buteliukuose ir 1 l buteliuose yra atitinkamai 5 ml, 20 ml ir 100 ml. Kai naudojate 1 L butelius, sumažinkite [N.sub.2]/C[O.2] pradinį slėgį iki 34 kPa (žr. toliau).

(2) Prieš naudodami anaerobinėje kameroje, visus stiklinius indus ir įrangą pašalinkite deguonimi. Į kamerą įneškite kultūros mėgintuvėlius arba buteliukus, kamščius, piltuvus ir pipetes bei visus plastikinius reikmenis bent vieną dieną prieš darydami terpę, kad [O.sub.2] desorbuotųsi arba išsisklaidytų.

(3) Dėl vidutinės sudėties (a) žr. 2 lentelę.

Sumaišykite vidutines sudedamąsias dalis ir 60 minučių purkškite [N.sub.2] dujų srove.

(4) Į 100 ml įpilkite 0,05 g cisteino-HCl arba DTT ir toliau 10 min.

(5) Perkelkite terpę į anaerobinę kamerą, paskirstykite terpę į auginimo indus ir uždarykite mėgintuvėlius pilkais butilo kamščiais (Wheaton Science Products, kat. numeris: W224100-202) ir suspauskite aliuminio sandarikliais (Fisher Scientific, kat. numeris: 11). -126-12).

(6) Išėmę iš anaerobinės kameros, mėgintuvėlius ir serumo buteliukus suslėgkite iki 103 kPa naudodami [N.sub.2]/C[O.2] (4:1, v/v) ir autoklave. PH po autoklavo turi būti apie 7,7-7,8. Vieno litro buteliuose prieš autoklavavimą padidinkite slėgį iki 34 kPa [N.sub.2]/C[O.sub.2]. Autoklave veikiant gravitacijos ciklu (greitas išmetimas) 20 minučių. Visada autoklavuokite šiuos butelius, pritvirtintus metaliniais cilindrais arba vieliniais krepšiais, kad apribotumėte skraidantį stiklą sprogimo metu.

(7) Prieš inokuliaciją į 5 ml terpės įpilkite 0,1 ml 2,5 % [Na2]S x 9[H2]O (m/t) [pridėkite 2 ml 2,5% [Na.sub. .2]S x 9[H.2]O (m/t) 100 ml terpės, jei pagaminta 1 litro butelyje]. Įprastiems eksperimentams sulfido įpilkite prieš pat inokuliaciją. Kritiniams eksperimentams įpilkite sulfido 8–24 valandas prieš inokuliaciją.

A.1. Metanothermococcus okinawensis augimo modifikacijos. Norėdami auginti M. okinawensis, sumažinkite glicilglicino buferio pH iki 6,5 ir padidinkite galutinę koncentraciją nuo 0,2 M iki 0,4 M. Kiti terpės ingredientai lieka tokie patys.

Vidutinės sudėties žr. 3 lentelę.

A.2. Atsarginių sprendimų ruošimas

A.2.1. Glicilglicino tirpalo (1 M, pH = 8,0) paruošimas. Naudokite 20 ml 100 ml terpės ir veiksmai yra tokie:

(i) Ištirpinkite 132 g glicilglicino (AMRESCO, kat. numeris: 556-50-3) su 800 ml dd[H.2]O.

(ii) Sureguliuokite pH iki 8,0 su maždaug 18 ml NaOH (5 M).

(iii) Sureguliuokite tūrį iki 1 litro. Laikyti 4°C temperatūroje sandariai uždarytame butelyje.

A.2.2. Bendrojo druskos tirpalo paruošimas. Naudokite 50 ml 100 ml terpės (žr. 4 lentelę).

A.2.3. Geležies pradinio tirpalo paruošimas [35]. Naudokite 0,5 ml 100 ml terpės.

Į mažą užsukamą buteliuką įpilkite 0,2 g Fe[(N[H.sub.4]).sub.2] [(S[O.sub.4]).sub.2] x 6[H.sub. .2]O ir tada įlašinti 2 lašus koncentruoto HCl, po to 100 ml stiklinio distiliuoto vandens.

A.2.4. Mineralinio pėdsakų tirpalo paruošimas [27]. Naudokite 10 ml 1 litrui terpės (žr. 5 lentelę).

Ištirpinkite nitriloacto rūgštį maždaug 800 ml di[H2]O ir sureguliuokite pH iki 6,5 KOH. Įpilkite mineralų eilės tvarka, leiskite kiekvienam ištirpti prieš pridėdami kitą mineralą ir sureguliuokite pH iki 7,0.

A.2.5. 2,5 % natrio sulfido tirpalo paruošimas. 2,5% natrio sulfido tirpalo paruošimo etapai yra tokie:

i) Į kolbą įpilkite 100 ml dd[H.2]O ir pažymėkite vandens liniją. Norėdami apriboti lakiojo vandenilio sulfido susidarymą iš natrio sulfido, įpilkite vieną NaOH granulę (apie 0,1 g). Į kolbą įpilkite dar 10 ml dd[H2]O.

(ii) Virkite 110 ml dd[H.sub.2]O, plaudami [N.sub.2], kol vandens lygis pasieks pažymėtą 100 ml vandens liniją.

iii) Leiskite kolbai atvėsti, praplaunant [N.2], ir perkelkite kolbą į dujų išleidimo stotį dūmų gaubte. Toliau praplaukite naudodami [N.sub.2].

(iv) Kol kolba vėsta, pasverkite šiek tiek daugiau nei 2,5 g [Na2]S x 9[H.2]O. Mūvėkite pirštines ir atlikite tolesnius veiksmus dūmų gaubte. Išvalykite natrio sulfido kristalą, trumpai skalaudami kristalą di[H2]O. Norėdami tai padaryti, sukite kristalą mažoje stiklinėje su šiek tiek vandens, kol jis bus švarus. Nusausinkite kristalą popieriniu rankšluosčiu. Dar kartą pasverkite kristalą, kad galutinis svoris būtų 90–110 % norimo svorio.

v) Išvalytą ir pasvertą natrio sulfidą įpilkite į atšaldytą kolbą, praplaudami [N.2] ir maišykite, kol iš dalies ištirps.

vi) Užkimškite kolbą, nutraukite plovimą ir perkelkite į anaerobinę kamerą. Išpilstykite į 5 ml alikvotas 28 ml aliuminiu uždarytuose mėgintuvėliuose.

vii) Išimkite vamzdžius iš kameros ir paspauskite [N.sub.2] esant 103 kPa.

viii) Autoklave veikiant gravitacijos ciklu (greitas išmetimas) 20 minučių.

(ix) Šiuos natrio sulfido mėgintuvėlius laikykite anaerobinėje kameroje. Jie turėtų išlikti geri vieną ar du mėnesius. Išmeskite, jei susidaro nuosėdos.

A. 2.6. 25% natrio sulfido tirpalo paruošimas. 25% natrio sulfido tirpalo paruošimo etapai yra tokie:

(i) Paruoškite kaip nurodyta aukščiau, bet su 25 g [Na2]S x 9[H.2]O. Išpilstykite į 5 ml alikvotas 28 ml aliuminiu uždarytuose mėgintuvėliuose. 0,5, 1,0 ir 1,5 l kultūroms naudokite atitinkamai 1,0, 2,0 ir 3,0 ml.

(ii) Šiuos natrio sulfido mėgintuvėlius laikykite anaerobinėje kameroje. Jie turėtų išlikti geri du mėnesius. Išmeskite, jei susidaro nuosėdos.

B. Methanococcus maripaludis formato augimo kieta terpė (McF)

Šiuo protokolu paruošiama 1% agaro terpė 70 ml serumo buteliukuose M. maripaludis padengimui ir modifikuota iš Tumbula et al. [18].

(1) Kieta terpė ruošiama su 1 % agaru (m/v), įpilant 10 ml terpės į 70 ml serumo buteliuką. Prieš ruošdami terpę, į kiekvieną atskirą serumo buteliuką įpilkite 0,1 g agaro. Likę ingredientai yra tokie patys kaip ir sultinio.

(2) Perkelkite sultinio terpę (be sulfido) ir butelius su agaru į anaerobinę kamerą, išpilstykite terpę į agaro butelius, uždarykite butelius pilkais butilo kamščiais (Wheaton Science Products, kat. numeris: W224100-202) ir gofruoti su aliuminio sandarikliais (Fisher Scientific, kat. nr.: 11-126-12).

(3) Išimkite sandarius butelius iš anaerobinės kameros, kiekvieną buteliuką suslėgkite iki 103 kPa naudodami [N.sub.2]/C[O.2] (4:1, v/v) ir autoklavuokite. Autoklave veikiant gravitacijos ciklu (greitas išmetimas) 20 minučių. Po apdorojimo autoklave leiskite buteliukams atvėsti ir pridėkite sulfido iki galutinės 2 mM koncentracijos. Švelniai išmaišykite ir leiskite agaro buteliukams visiškai atvėsti nuo šonų mažiausiai penkias valandas (geriausiai veikia kietėjimas per naktį).

(4) Norėdami gauti atskiras M. maripaludis kolonijas, sultinio kultūroje atlikite nuoseklų praskiedimą iki maždaug 100 ląstelių/ml. Uždėkite praskiestą ir neskiestą kultūrą (teigiama kontrolė), įpildami 0,5 ml kultūros suspensijos į agaro butelius, naudodami 1 ml švirkštus. Įpilkite skysčio į agaro paviršių, buteliui atsiremdami į šoną. Švelniai pasukite agaro buteliuką, kad kultūros suspensija tolygiai pasiskirstytų agaro paviršiuje. Padėkite agaro buteliuką ant šono dar keturias valandas, kad kultūros suspensija visiškai įsigertų į agarą. Įsitikinkite, kad agaro paviršius yra plokščias ir guli horizontaliai, kitaip kolonijos susidarys tik vienoje agaro pusėje.

(5) Inkubuokite padengtus butelius, pastatydami juos vertikaliai 37 °C temperatūroje. Taigi inkubacijos metu susidaręs vanduo nutekės į butelio dugną.

(6) Kolonijos atsiras po trijų ar penkių dienų inkubacijos.Kadangi skystis kaupiasi buteliuko apačioje, 1 cm apačioje atsiras susiliejantis augimas. Nekratykite buteliuko inkubacijos metu, kad išvengtumėte netyčinio viršutinės agaro dalies pasėjimo.

(7) Norėdami paimti atskiras kolonijas į sultinį anaerobinėje kameroje, 24 valandas prieš naudojimą į sultinio mėgintuvėlius įpilkite 2 mM sulfido (sulfido pradinio preparato, žr. A priedą). Anaerobinėje kameroje atidarykite agaro buteliuko kamštį, angą sterilizuokite elektriniu kaitinimo elementu ir į agaro buteliuką įkiškite 1 ml švirkštą, adata atsargiai paliesdami vienos kolonijos viršų. Tada įsmeikite adatą į sultinio vamzdelį ir du kartus praplaukite švirkštą su terpe, kad į sultinį patektų keletas ląstelių. Visiškas augimas dažnai pastebimas po 1-2 dienų.

C. Vidutinio masto M. maripaludis ir M. okinawensis kultivavimo sistema

Šis protokolas yra tinkamas 1,5 l kultūrų auginimui formiato terpėje naudojant stiklinius indus, modifikuotus, kad būtų galima išleisti susidariusias dujas.

C.1. 1 diena: terpės paruošimas ir degazavimas

(1) Ruošdami inokuliatą, vieną dieną prieš pradedant vidutinio dydžio kultūrą, pasėkite 0,3 ml šviežios kultūros į vieną ar daugiau serumo buteliukų, kuriuose yra 30 ml formiato terpės. Inkubuokite nekratydami tinkamoje temperatūroje.

(2) Išpilstykite 1,5 l McF terpės į modifikuotą 2 l laikymo buteliuką (5 pav.).

(3) Norėdami išpilti terpę po autoklave, įdėkite 2 cc keičiamą stiklo filtro švirkštą (Micro-Mate, kat. numeris: 14-825-1B) su Luer-to-tubing jungtimi (Sigma-Aldrich, 1/16- 3/32 col., kat. numeris: Z118028) į butilo gumos kamštį (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, kat. Nr.: 2048-11800). Prie įkištos adatos galo pritvirtinkite maždaug 20 cm ploną vamzdelį (Zeus PTFE šviesios sienelės vamzdeliai, P/N: TFT22-NT, AWG 22, LOT numeris: 623928). Įstatykite kamštį į kultivavimo indo šoninę rankeną. Kamštis neužsandarintas, kad galėtų iškristi ir išleisti bet kokį slėgį, kuris gali susidaryti užsikimšus išmetimo linijoms.

(4) Laisvai uždėjus 2 l buteliuko dangtelį, autoklave supilkite šį mazgą kartu su dujų gaudykle (165 ml serumo buteliukas, užkimštas mėlynu butilo gumos kamščiu ir suspaustas aliuminio sandarikliais), vamzdeliais ir švirkštais, jungiančiais vidutinį butelį. , dujų gaudyklė ir vandens gaudyklė.

(5) Po autoklavavimo leiskite steriliai terpei atvėsti bent iki 90°C, prieš sumontuodami dujų tiekimo ir išleidimo linijas. Pirmiausia pradėkite purkšti [N.sub.2]/C[O.2] (4:1 v/v) per terpę srauto greičiu

25 ml/min. Tuo pačiu metu prijunkite vidutinį butelį prie dujų gaudyklės ir vandens gaudyklės. Į vandens gaudyklę įpilkite apie 300 ml vandens. Uždarykite 2 l buteliuko dangtelį, kad pradėtumėte dujų srautą per išmetimo sistemą.

(6) Purškimas turi pakeisti butelio viršutinę dalį bent dešimt kartų. Esant 25 ml/min srauto greičiui, terpė turėtų būti purškiama 200 min. arba maždaug 5 l dujų.

(7) Purškiant įpilama cisteino hidrochlorido iki galutinės 0,5 g koncentracijos [L.sup.-1]. Norėdami paruošti šį cisteino hidrochlorido pradinį tirpalą, prie 5 ml švirkšto su Luer-Lok antgaliu (BD[TM], kat. Nr. : 309646) nuėmus stūmoklį. Į švirkštą įpilkite 3 ml dd[H.sub.2]O ir tada įpilkite 0,75 g cisteino hidrochlorido (Sigma, kat. Nr.: 52-89-1). Švelniai pasukiokite tirpalą, kad visiškai ištirptų cisteinas. Uždėkite adatą (BD, 15 G x 3 1/2 colio, kat. numeris: 511108) ant 0,2 [mikro]M filtro galo ir greitai įpurškite šviežiai pagamintą cisteino hidrochlorido tirpalą į 1,5 l kultūros buteliuką. šoninės rankos kamštis.

(8) Kai dujų išleidimas baigtas ir terpė atvės iki augimo temperatūros arba žemesnės, inkubuokite visą agregatą augimo temperatūroje, 37 °C M. maripaludis arba 62 °C M. okinawensis per naktį. .

C.2. 2 diena: inokuliacija ir tolesnis inkubavimas

(1) Kitą rytą švirkštu per šoninę rankeną įpilkite natrio sulfido iki 2 mM. Dažnai patogu įpilti 3 ml 25 % (m/v) sterilaus tirpalo, paruošto pagal A priedėlį. Toliau inkubuokite terpę augimo temperatūroje dar šešias valandas, kad terpė visiškai sumažėtų.

(2) Į buteliuką pasėkite 30 ml kultūros (apytiksliai [OD600 nm] = 0,6) nuo 1 dienos. Per naktį arba maždaug 15 valandų M. maripaludis S2 gali užaugti iki [OD600 nm] = 0,8 esant 37 °C. Panašiai M. okinawensis IH1 gali išaugti iki maždaug [OD600 nm] = 0,6 esant 62°C.

D. Greitas Formiato terpės Methanococcus maripaludis auginimui paruošimas

Šis greitasis protokolas skirtas laboratorijoms, kuriose yra ribota anaerobinė įranga. Visas procedūras galima atlikti nenaudojant anaerobinės kameros.

D.1. Skystos terpės paruošimas

(1) Ant stalo sumaišykite visas terpės sudedamąsias dalis, kaip aprašyta A priedėlyje. Įpilkite cisteino hidrochlorido (0,05 g/100 ml) nepurškdami terpės prieš pat išpilstydami terpę į mėgintuvėlius.

(2) Aerobiškai paskirstykite terpę į aliuminiu uždarytus vamzdelius. Užsandarinkite kiekvieną mėgintuvėlį pilku butilo kamščiu (Wheaton Science Products, kat. numeris: W224100-202) ir suspauskite aliuminio sandarikliais (Fisher Scientific, kat. numeris: 11-126-12).

(3) Nuneškite sandarius vamzdelius į dujų išleidimo stotį, kaip parodyta 6 paveiksle. Atlikite tris dujų mainų ciklus kiekviename vamzdyje. Kiekvieną ciklą sudaro 45 s vakuumo, po kurio 15 s slėgis 103 kPa, naudojant [N.2]/C[O.2] (4:1, v/v). Šiuo metu terpė vis dar gali būti rausvos spalvos, nes rezazurinas nesumažėja. Autoklave terpė turi tapti bespalvė. Jei naudojate didesnio tūrio serumo buteliukus, padidinkite ciklo laiką. Pavyzdžiui, sistemai su stipria vakuumo linija pakanka 160 ml serumo buteliukų, 90 s vakuumo ir 30 s slėgio.

(4) Autoklavas gravitacijos ciklu (greitas išmetimas) 20 min.

D.2. Kietos terpės paruošimas. Greitasis protokolas paruošia 1% agaro terpę 70 ml serumo buteliukuose.

Ant stalo sumaišykite visas terpės sudedamąsias dalis, kaip aprašyta A priedėlyje, ir įpilkite cisteino hidrochlorido (0,05 g/100 ml), nepurškdami terpės, bet prieš pat išpilstydami į butelius.

(1) Kieta terpė ruošiama su 1 % agaro (m/v) iki 10 ml terpės 70 ml serumo buteliuke. Prieš ruošdami terpę, į kiekvieną serumo buteliuką įpilkite 0,1 g agaro.

(2) Aerobiškai paskirstykite terpę į agaro turinčius serumo buteliukus. Uždarykite kiekvieną buteliuką pilku butilo kamščiu (Wheaton Science Products, kat. numeris: W224100-202) ir užspauskite aliuminio sandarikliais (Fisher Scientific, kat. numeris: 11-126-12).

(3) Atneškite sandarų butelį į dujų išpylimo stotį, kaip parodyta 6 paveiksle. Atlikite tris dujų keitimo ciklus kiekviename balione, kiekvieną ciklą sudaro 45 s vakuumo, po kurio 15 s slėgis iki 103 kPa, naudojant [N.sub. 2]/C[O.2] (4:1, v/v). Šiuo metu terpė vis dar gali būti rausva, nes resazurinas nesumažėja. Autoklave terpė taps bespalvė.

(4) Autoklavas gravitacijos ciklu (greitas išmetimas) 20 min. Po apdorojimo autoklave leiskite buteliams atvėsti, kad jie liestųsi, naudodami dujinimo stotį, kad anaerobiniu būdu įpiltumėte natrio sulfido, kurio galutinė koncentracija yra 2 mM (apie sulfido pradinio tirpalo ruošimą žr. A priedą). Švelniai išmaišykite ir leiskite agaro buteliukams visiškai atvėsti nuo šonų mažiausiai penkias valandas (geriausiai veikia kietėjimas per naktį).

D.3. Kolonijų sodinimas ir skynimas ant stalo. „Hungate“ technika [33] naudojama anaerobiniam perkėlimui dujų išleidimo stotyje. Trumpai, prieš perkeliant, liepsna sterilizuokite kaniulę ir pradėkite [N.sub.2] dujų srautą. Nuplaukite sterilų švirkštą su [N.sub.2], įkišdami adatą į kaniulę ir tris kartus siurbdami švirkštą, kad pašalintumėte orą. Užpildykite švirkštą [N.sub.2] dujų. Sterilizavę kamščio viršų, nedelsdami ištraukite [N.sub.2] iš švirkšto, stumdami adatą per kamštį. Šia procedūra pašalinamas į adatos galiuką patekęs oras.

(1) Dengimas atliekamas taip, kaip aprašyta B priedo 4–6 žingsniuose, bet naudojant dujinę stotį visiems anaerobiniams perkėlimams.

(2) Norėdami paimti atskiras kolonijas į sultinį, naudokite Hungate techniką [33]. Dujų išpylimo stotyje nuimkite aliuminio užsandarintą kamštį iš agaro butelio ir uždekite angą. Kad serumo buteliuke [O.sub.2] nebūtų, įveskite [N.sub.2] dujų srautą su sterilia [N.2] dujų išleidimo kaniule (7 pav. a)). Norėdami perkelti koloniją, naudokite 1 ml švirkštą ir 22 Ga x 1 colio adatą. Sulenkite adatą maždaug 45 laipsnių kampu, atlenkdami adatos galą prie adatos dangtelio. Įsitikinkite, kad adatos galo skylė po lenkimo yra apatinėje pusėje (7 pav. b)). Taip lengviau surinkti koloniją adatos galiuko viduje. Įdėkite šį švirkštą į agaro buteliuką, kelis kartus siurbdami stūmoklį, kad užpildytumėte švirkštą N2. Švirkšto cilindrą atitraukę maždaug 1 cm atgal, adata atsargiai palieskite vienos kolonijos viršų (7 pav. a)). Ištraukite švirkštą iš buteliuko ir įsmeikite adatą į sultinio terpės vamzdelį. Du kartus praplaukite švirkštą 0,2 ml terpės, kad nuplautumėte ląsteles nuo adatos. Visiškas augimas dažnai pastebimas po 1-2 dienų.

Autoriai pareiškia, kad neturi interesų konfliktų.

[1] R. Hedderich ir W. B. Whitman, "Metaną gaminančios archejos fiziologija ir biochemija", Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria, t. 2, 2006 m.

[2] Y. C. Liu ir W. B. Whitman, „Metabolinė, filogenetinė ir ekologinė metanogeninės archejos įvairovė“, Niujorko mokslų akademijos analai, t. 1125, 171-189 p., 2008 m.

[3] R. K. Thauer, K. Jungermann ir K. Decker, "Energijos išsaugojimas chemotrofinėse anaerobinėse bakterijose", Bacteriological Reviews, t. 41, 100-180 p., 1977 m.

[4] N. L. Schauer ir W. B. Whitman, „Formatų augimas ir pH kontrolė lakiosiomis skruzdžių ir acto rūgštimis metanokokų partijose“, Journal of Microbiological Methods, vol. 10, 1-7 p., 1989 m.

[5] N. L. Schauer ir J. G. Ferry, "Metabolism of formate in Methanobacterium formicicum", Journal of Bacteriology, t. 142, p. 800-807, 1980 m.

[6] KC Costa, SH Yoon, M. Pan, JA Burn, NS Baliga ir JA Leigh, „[H.sub.2] ir formiato poveikis augimo derliui ir Methanococcus maripaludis metanogenezės reguliavimui“, Bakteriologijos žurnalas , t. 195, 1456-1462 p., 2013 m.

[7] A. K. Haydock, I. Porat, W. B. Whitman ir J. A. Leigh, "Nuolatinė Methanococcus maripaludis kultūra apibrėžtomis maistinėmis sąlygomis", FEMS Microbiology Letters, t. 238, 85-91 p., 2004 m.

[8] EL Hendrickson, AK Haydock, BC Moore, WB Whitman ir JA Leigh, „Funkciškai skirtingi genai, reguliuojami vandenilio apribojimo ir augimo greičio metanogeninėje archejoje“, Jungtinių Amerikos Valstijų nacionalinės mokslų akademijos darbai, t. . 104, 8930-8934 p., 2007 m.

[9] J. A. Leigh, "Metanogenų augimas apibrėžtomis vandenilio sąlygomis", Methods in Enzymology, vol. 494, 111-118 p., 2011 m.

[10] G. E. Wood, A. K. Haydock ir J. A. Leigh, "Metanogeninio archeono Methanococcus maripaludis formato dehidrogenazės genų funkcija ir reguliavimas", Journal of Bacteriology, t. 185, 2548-2554 p., 2003 m.

[11] B. Lupa, E. L. Hendrickson, J. A. Leigh ir W. B. Whitman, "Nuo formato priklausoma [H.sub.2] gamyba, naudojant mezofilinį metanogeną Methanococcus maripaludis", Applied and Environmental Microbiology, t. 74, 6584-6590 p., 2008 m.

[12] G. S. Beckler, L. A. Hook ir J. N. Reeve, "Chloramfenikolio acetiltransferazė neturėtų užtikrinti metanogenų atsparumo chloramfenikoliui", Applied and Environmental Microbiology, t. 47, p. 868-869, 1984 m.

[13] A. Bockas ir O. Kandleris, "Archaebacteria sensitivity Antibiotics", Archabacteria, t. 8, p. 525-544, 1985 m.

[14] P. Gernhardt, O. Possot, M. Foglino, L. Sibold ir A. Klein, "Integracijos vektoriaus, skirto naudoti Methanococcus voltae archaebakterijoje ir eubakterijų atsparumo geno ekspresija", kūrimas, Molecular & General Genetics. , t. 221, 273-279 p., 1990 m.

[15] W. G. Weisburg ir R. S. Tanner, „Archaebakterijų jautrumas aminoglikozidams“, FEMS Microbiology Letters, t. 14, 307-310 p., 1982 m.

[16] C. A. Franke, C. M. Rice, J. H. Strauss ir D. E. Hruby, "Neomicino rezistencija kaip dominuojantis atrankos žymuo vaccinia viruso rekombinantų atrankai ir išskyrimui", Molecular and Cellular Biology, t. 5, 1918-1924 p., 1985 m.

[17] W. L. Gardner ir W. B. Whitman, Methanococcus maripaludis ekspresijos vektoriai: acetohidroksirūgšties sintazės ir beta-galaktozidazės perteklius, Genetics, t. 152, 1439-1447 p., 1999 m.

[18] D. L. Tumbula, R. A. Makula ir W. B. Whitman, „Methanococcus maripaludis transformacija ir į Pst I panašios restrikcijos sistemos identifikavimas“, FEMS Microbiology Letters, t. 121, 309-314 p., 1994 m.

[19] JE Kim, KH Kim, SW Lee, W. Seol, K. Shiba ir S. Kim, „Su pailgėjimo faktoriumi susijęs domenas įterpiamas į žmogaus cisteino-tRNR sintetazę alternatyviu sujungimu“, Nucleic Acids Research, vol. . 28, 2866-2872 p., 2000 m.

[20] B. C. Moore ir J. A. Leigh, „Methanococcus maripaludis be žymių mutagenezė demonstruoja alanino dehidrogenazės, alanino racemazės ir alanino permeazės vaidmenis“, Journal of Bacteriology, vol. 187, p. 972-979, 2005 m.

[21] J. Ladapo ir WB Whitman, "Auksotrofų išskyrimo metanogeninėse archebakterijose metodas: autotrofinės C[O.sub.2] fiksacijos acetil-CoA kelio vaidmuo Methanococcus maripaludis", Nacionalinės akademijos darbai. Jungtinių Amerikos Valstijų mokslai, t. 87, 5598-5602 p., 1990 m.

[22] I. Porat ir W. B. Whitman, "Triptofano auksotrofai buvo gauti atsitiktinai įterpus transpozonus Methanococcus maripaludis triptofano operone", FEMS Microbiology Letters, vol. 297, 250-254 p., 2009 m.

[23] F. Sarmiento, J. Mrazek ir W. B. Whitman, „Geno masto genų funkcijos analizė hidrogenotrofiniame metanogeniniame archeone Methanococcus maripaludis“, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, t. 110, 4726-4731 p., 2013 m.

[24] T. J. Lie ir J. A. Leigh, "Metanococcus maripaludis reguliavimo atsakas į alaniną, tarpinį azoto šaltinį", Journal of Bacteriology, t. 184, 5301-5306 p., 2002 m.

[25] T. J. Lie ir J. A. Leigh, „Genetinis Methanococcus maripaludis reguliavimo mutacijų ekranas ir jo naudojimas nustatant eulyarchaeal represoriaus NrpR indukcijos trūkumus mutantus“, Applied and Environmental Microbiology, vol. 73, 6595-6600 p., 2007 m.

[26] B. F. Sarmiento, J. A. Leigh ir W. B. Whitman, "Genetic systems for hydrogenotrophic metanogens", Methods in Enzymology, vol. 494, 43-73 p., 2011 m.

[27] W. B. Whitman, J. Shieh, S. Sohn, D. S. Caras ir U. Premachandran, "22 mezofilinių metanokoko izoliacija ir charakteristika", Systematic and Applied Microbiology, t. 7, p. 235-240, 1986 m.

[28] K. Takai, A. Inoue ir K. Horikoshi, "Methanothermococcus okinawensis sp. nov., termofilinis, metaną gaminantis archeonas, išskirtas iš Vakarų Ramiojo vandenyno giliavandenės hidroterminės ventiliacijos sistemos", International Journal of Systematic and Evolutionary Mikrobiologija, t. 52, 1089-1095 p., 2002 m.

[29] D. Tumbula, J. Keswani, J. Shieh ir W. Whitman, Metanogeno pradinių kultūrų palaikymas glicerolyje -70 °C temperatūroje. Archaea-A laboratorijos vadovas, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, JAV, 1995 m.

[30] W. J. Jonesas, W. B. Whitmanas, R. D. Fieldsas ir R. S. Wolfe'as, "Metanokokų augimas ir padengimo efektyvumas agaro terpėje", Applied and Environmental Microbiology, t. 46, p. 220-226, 1983 m.

[31] R. L. Uffen ir R. S. Wolfe, „Anaerobinis purpurinių nesierinių bakterijų augimas tamsiomis sąlygomis“, Journal of Bacteriology, t. 104, p. 462-472, 1970 m.

[32] J. De Man, "MPN lentelės, pataisytos", European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, t. 17, 301-305 p., 1983 m.

[33] M. P. Bryantas, „Komentaras apie Hungate techniką anaerobinių bakterijų kultūrai“, „The American Journal of Clinical Nutrition“, t. 25, 1324-1328 p., 1972 m.

[34] M. Weimar, J. Cheung, D. Dey ir kt., "Kelių šulinių plokštelių metodų kūrimas naudojant grynąsias metanogenų kultūras, siekiant nustatyti naujus inhibitorius, slopinančius atrajotojų metano emisiją", Applied and Environmental Microbiology, vol. 83, straipsnis e00396-17, 2017 m.

[35] W. E. Balch ir R. S. Wolfe, „Naujas požiūris į metanogeninių bakterijų auginimą: nuo 2-merkaptoetansulfonrūgšties (HS-CoM) priklausomas Methanobacterium ruminantium augimas slėginėje atmosferoje“, Applied and Environmental Microbiology, t. 32, p. 781-791, 1976 m.

[36] JA Romesser, RS Wolfe, F. Mayer, E. Spiess ir A. Walthermauruschat, "Methanogenium, nauja jūrinių metanogeninių bakterijų gentis ir methanogenium cariaci sp. nov. ir Methanogenium marisnigri sp. nov. apibūdinimas, "Mikrobiologijos archyvas, t. 121, 147-153 p., 1979 m.

Feng Long, Liangliang Wang, Boguslaw Lupa ir William B. Whitman

Mikrobiologijos katedra, Džordžijos universitetas, Atėnai, GA 30602-2605, JAV

Susirašinėti reikėtų William B. Whitman [email protected]

Gauta 2017 m. birželio 22 d. Priimta 2017 m. rugpjūčio 24 d. Paskelbta 2017 m. lapkričio 19 d.

Akademinis redaktorius: William W. Metcalf

Antraštė: 1 pav. Pasirinktų buferių poveikis augimui. M. maripaludis S2 buvo auginamas McN ([H.sub.2]/C[O.2]) terpėje su skirtingomis tirtų buferių koncentracijomis. Kultūros absorbcija buvo nustatyta po vienos dienos.

Antraštė: 2 pav. M. maripaludis S2 augimas naudojant 200 mM formiato ir 100 mM Tris, glicino ir glicilglicino buferių. Buvo naudojami dviejų rūšių serumo buteliukų kamščiai. Mėlyni kamščiai yra stori butilo gumos kamščiai (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, kat. Nr.: 2048-11800, 704,82 USD/1000). Jie dažniausiai naudojami [H.sub.2]/C[O.2] terpei. M. maripaludis auginimo metu buvo patikrintas ir butilo gumos pilkos spalvos kamšteliai (Wheaton Science Products, kat. Nr.: W224100-202, 174,2 USD/1000).

Antraštė: 3 pav. M. maripaludis S2 augimas [H.sub.2]/C[O.2] ([??]) ir formato terpėje ([??s ]). Inokuliato dydis buvo 5 x [104] ląstelės 5 ml kultūros. Visos vertės buvo penkių kultūrų vidurkiai.

Antraštė: 4 pav. M. maripaludis S2 ([??]) ir M. okinawensis ([??]) augimas vidutinio masto kultūros sistemoje. Inokuliatas buvo [1010] ląstelių 1,5 l kultūros. Visos reikšmės yra trijų kultūrų vidurkiai.

Antraštė: 5 pav. Vidutinio masto auginimo sistema su kultūros buteliu, purškimu ir išmetimu. Auginimo sistemą sudaro 2 l auginimo butelis (A), vandens gaudyklė (B: 160 ml serumo buteliukas su mėlynu butilo kamščiu ir aliuminio sandarikliu) ir dujų gaudyklė (C: 150 ml Erlenmejerio kolba). Auginimo butelis pagamintas iš Pyrex butelio (kat. numeris: 06-414-1E), kurio viršutinė dalis yra 28 mm aliuminio sandariklio vamzdis, pritvirtintas kaip šoninė rankena.Šoninė rankena užsandarinta mėlynu butilo gumos kamščiu be aliuminio sandariklio (Bellco Glass Inc., Vineland, NJ, kat. numeris: 2048-11800). Nuėmus aliuminio sandariklį, kamštis gali iššokti ir išleisti bet kokį slėgį, kuris gali susidaryti užsikimšus išmetimo linijai. Dujų tiekimo linija (D, E ir F) skirta terpei purkšti po autoklavavimo ir yra sumontuota su F, 2 cm3 keičiamu stiklo filtro švirkšto cilindru (Micro-Mate[TM], kat. Nr.: 14-825- 1B) supakuota su medvilne ir užsandarinta guminiu kamščiu Nr. 00 (Balch ir Wolfe [35]), D: Luer-to-tubing jungtis (Sigma-Aldrich, 1/16-3/32 in., kat. numeris: Z118028 ), ir E: adata (BD, 22 G x 1 colis, kat. numeris: 305155) su plonu vamzdeliu (Zeus[TM] PTFE šviesios sienelės vamzdeliai, P/N: TFT22-NT, AWG 22). Po purškimo adata nuimama prieš inokuliaciją paliekant mėgintuvėlį kultūroje. Kiti komponentai: G: Nalgene[TM] vamzdeliai (80 PVC vamzdeliai-FDA/USPVI, 1/8 ID x 3/16 OD x 1/32 sienelė, Thermo Scientific kat. numeris: 8000-0010) H: Monoject[TM] adata (16 G x 1 1/2", kat. numeris: 140394) ir aš: adata (BD, 15 G x 3 1/2 colio, kat. Nr.: 511108).


Cheminės dezinfekcijos priemonės

Sveikatos priežiūros srityje „alkoholis“ reiškia du vandenyje tirpius cheminius junginius – dašetilo alkoholį ir izopropilo alkoholį, kurių baktericidinės savybės paprastai yra nepakankamai įvertintos 482 . FDA neišvalė jokių skystų cheminių sterilizatorių ar didelio lygio dezinfekavimo priemonių, kurių pagrindinė veiklioji medžiaga yra alkoholis. Šie alkoholiai greitai veikia baktericidiškai, o ne bakteriostatiškai prieš vegetatyvines bakterijų formas, jie taip pat yra tuberkuliocidiniai, fungicidiniai ir virucidiniai, tačiau nesunaikina bakterijų sporų. Jų cidinis aktyvumas smarkiai sumažėja, kai skiedžiama žemiau 50 % koncentracijos, o optimali baktericidinė koncentracija yra 60 % & ndash 90 % tirpalai vandenyje (tūris/tūris) 483, 484 .

Veikimo.

Labiausiai įmanomas alkoholio antimikrobinio poveikio paaiškinimas yra baltymų denatūravimas. Šį mechanizmą patvirtina pastebėjimas, kad absoliutus etilo alkoholis, dehidratuojantis agentas, yra mažiau baktericidinis nei alkoholio ir vandens mišiniai, nes esant vandeniui baltymai denatūruojami greičiau 484, 485 . Baltymų denatūracija taip pat atitinka pastebėjimus, kad alkoholis naikina dehidrogenazes Escherichia coli 486 , ir kad etilo alkoholis padidina atsilikimo fazę Enterobacter aerogenes 487 ir kad vėlavimo fazės efektas gali būti pakeistas pridedant tam tikrų aminorūgščių. Manoma, kad bakteriostatinį poveikį sukelia greitam ląstelių dalijimuisi būtinų metabolitų gamybos slopinimas.

Mikrobicidinis aktyvumas.

Metilo alkoholis (metanolis) turi silpniausią baktericidinį poveikį iš alkoholių, todėl retai naudojamas sveikatos priežiūros srityje488. Įvairių koncentracijų etilo alkoholio (etanolio) baktericidinis aktyvumas buvo tiriamas prieš įvairius mikroorganizmus ekspozicijos laikotarpiais nuo 10 sekundžių iki 1 valandos483. Pseudomonas aeruginosa buvo nužudytas per 10 sekundžių dėl visų koncentracijų etanolio nuo 30% iki 100% (v/v), ir Serratia marcescens, E, coli ir Salmonella typhosa buvo nužudyti per 10 sekundžių dėl visų koncentracijų etanolio nuo 40% iki 100%. Gramteigiami organizmai Staphylococcus aureus ir Streptokokas piogenai buvo šiek tiek atsparesni, juos nužudė per 10 sekundžių, kai etilo alkoholis buvo 60% ir ndash95%. Izopropilo alkoholis (izopropanolis) buvo šiek tiek labiau baktericidinis nei etilo alkoholis E. coli ir S. aureus 489 .

Etilo alkoholis, kurio koncentracija 60 % ir ndash80 %, yra stiprus virucidinis agentas, inaktyvuojantis visus lipofilinius virusus (pvz., herpes, vakcinos ir gripo virusus) ir daugelį hidrofilinių virusų (pvz., adenovirusą, enterovirusą, rinovirusą ir rotavirusus, bet ne). hepatito A virusas (HAV) 58 arba poliomielito virusas) 49 . Izopropilo alkoholis nėra aktyvus prieš nelipidinius enterovirusus, bet yra visiškai aktyvus prieš lipidinius virusus72. Tyrimai taip pat parodė, kad etilo ir izopropilo alkoholis gali inaktyvuoti hepatito B virusą (HBV) 224, 225 ir herpes virusą, o etilo alkoholis - žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) 227, rotavirusą, echovirusą ir astrovirusą 491.

Tiriant etilo alkoholio poveikį prieš M. tuberculosis95 % etanolis per 15 sekundžių nužudė tuberkuliozės bacilas skrepliuose arba vandens suspensijoje 492 . 1964 m. Spauldingas pareiškė, kad alkoholiai yra tinkamiausias tuberkuliocidinio aktyvumo germicidas, ir jie turėtų būti standartas, pagal kurį lyginami visi kiti tuberkuliocidai. Pavyzdžiui, jis palygino jodoforo (450 ppm), pakeisto fenolio (3 %) ir izopropanolio (70 % tūrio) tuberkuliocidinį aktyvumą, naudodamas mucino kilpos testą (10 6). M. tuberculosis per kilpą) ir nustatė, kad sąlyčio laikas, reikalingas visiškam sunaikinimui, buvo atitinkamai 120 ir ndash 180 minučių, 45 ir ndash 60 minučių ir 5 minutės. Mucino kilpos testas yra sunkus testas, sukurtas ilgam išgyvenamumui užtikrinti. Taigi šie skaičiai neturėtų būti ekstrapoliuojami į poveikio trukmę, reikalingą, kai šie baktericidai naudojami medicininėje ar chirurginėje medžiagoje 482 .

Etilo alkoholis (70%) buvo veiksmingiausia koncentracija audinių fazei naikinti Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, ir Histoplasma capsulatum o pastarųjų trijų organizmų kultivavimo fazės aerozoliuojasi ant įvairių paviršių. Kultūros fazė buvo atsparesnė etilo alkoholio poveikiui ir užteršto paviršiaus dezinfekcijai prireikė maždaug 20 minučių, palyginti su <1 minutę audinių fazei 493, 494 .

Izopropilo alkoholis (20%) veiksmingai naikina cistas Akantamoeba culbertsoni (560), kaip ir chlorheksidinas, vandenilio peroksidas ir timerosalis 496 .

Alkoholiai nerekomenduojami sterilizuoti medicinines ir chirurgines medžiagas, nes jie neturi sporicidinio poveikio ir negali prasiskverbti į medžiagas, kuriose yra daug baltymų. Mirtinos pooperacinės žaizdos infekcijos su Clostridium atsirado, kai alkoholiais buvo sterilizuojami bakterijų sporomis užteršti chirurginiai instrumentai 497 . Alkoholiai buvo efektyviai naudojami dezinfekuojant burnos ir tiesiosios žarnos termometrus 498, 499, ligoninių gaviklius 500, žirkles 501 ir stetoskopus 502. Šviesolaidiniams endoskopams 503, 504 dezinfekuoti buvo naudojami alkoholiai, tačiau sugedus šiam dezinfekantui, užsikrėtė 280, 505. Alkoholiniai rankšluosčiai daugelį metų buvo naudojami mažiems paviršiams, pvz., kelių dozių vaistų buteliukų ar vakcinų buteliukų guminiams kamščiams dezinfekuoti. Be to, alkoholis kartais naudojamas išoriniams įrangos (pvz., stetoskopų, ventiliatorių, rankinių ventiliacijos maišelių) 506, gaivinimo manekenų 507, ultragarso instrumentų 508 ar vaistų ruošimo zonų dezinfekavimui. Du tyrimai parodė 70 % izopropilo alkoholio veiksmingumą dezinfekuojant daugkartinio naudojimo keitiklių galvutes kontroliuojamoje aplinkoje509, 510. Priešingai, buvo aprašyti trys kraujotakos infekcijų protrūkiai, kai intensyvios terapijos sąlygomis keitiklių galvutėms dezinfekuoti buvo naudojamas alkoholis511.

Dokumentuoti alkoholių trūkumai ant įrangos yra tai, kad jie pažeidžia lęšių instrumentų tvirtinimo detales su šelaku, po ilgo ir pakartotinio naudojimo linkę išsipūsti ir sukietėti guminius ir tam tikrus plastikinius vamzdelius, balina gumines ir plastikines plyteles 482 ir pažeidžia tonometro antgalius (dėl klijų gedimo). ) po 1 darbo metų įprastinio naudojimo 512 . Tonometro biprizmės, mirkytos alkoholyje 4 dienas, susidarė šiurkščius priekinius paviršius, galinčius pakenkti ragenai. Atrodė, kad susilpnėjo biprizmėms gaminti naudotos cementuojančios medžiagos 513 . Buvo pranešta apie ragenos drumstumą, kai prieš akispūdžio matavimą tonometro galiukai buvo nuvalyti alkoholiu514. Alkoholiai yra degūs, todėl turi būti laikomi vėsioje, gerai vėdinamoje vietoje. Jie taip pat greitai išgaruoja, todėl sunku pasiekti ilgesnį ekspozicijos laiką, nebent daiktai būtų panardinti.

Chloras ir chloro junginiai

Apžvalga.

Hipochloritai, plačiausiai naudojami iš chloro dezinfekavimo priemonių, yra skysti (pvz., natrio hipochloritas) arba kieti (pvz., kalcio hipochloritas). Jungtinėse Valstijose labiausiai paplitę chloro produktai yra vandeniniai 5,25 % ir ndash 6,15 % natrio hipochlorito tirpalai (žr. žodynėlį), paprastai vadinami buitiniu balikliu. Jie pasižymi plačiu antimikrobinio aktyvumo spektru, nepalieka toksiškų likučių, neturi įtakos vandens kietumui, yra nebrangūs ir greitai veikia 328 , pašalina išdžiūvusius ar fiksuotus organizmus ir bioplėveles nuo paviršių 465 ir retai sukelia sunkų toksiškumą 515–517 . Natrio hipochloritas, kurio koncentracija naudojama buitiniuose balikliuose (5,25–6,15 %), gali sudirginti akis arba sukelti burnos ir ryklės, stemplės ir skrandžio nudegimus 318, 518–522 . Kiti hipochloritų trūkumai apima koroziją metalams esant didelėms koncentracijoms (>500 ppm), organinių medžiagų inaktyvavimą, audinių spalvos pasikeitimą arba balinimą, toksiškų chloro dujų išsiskyrimą maišant su amoniaku ar rūgštimi (pvz., buitinėmis valymo priemonėmis) 523–525 ir santykinis stabilumas 327 . Mikrobicidinis chloro aktyvumas daugiausia priskiriamas nedisocijuotai hipochloro rūgščiai (HOCl). HOCI disociacija iki mažiau mikrobicidinės formos (hipochlorito jonų OCl ‑) priklauso nuo pH. Chloro dezinfekcinis veiksmingumas mažėja, kai pH padidėja, o tai lygiagrečiai nedisocijuoto HOCI virsmo OCl ‑ 329, 526. Galimas pavojus yra kancerogeno bis(chlormetil) eterio susidarymas, kai hipochlorito tirpalai liečiasi su formaldehidu 527, ir gyvūnų kancerogeno trihalometano gamyba, kai karštas vanduo yra hiperchlorintas 528 . Peržiūrėjusi išlikimą aplinkoje ir ekologinius duomenis, EPA nustatė, kad šiuo metu registruotas hipochloritų naudojimas neturės nepagrįsto neigiamo poveikio aplinkai529.

Alternatyvūs junginiai, išskiriantys chlorą ir naudojami sveikatos priežiūros srityje, yra chloro dioksidas, natrio dichlorizocianuratas ir chloraminas-T. Šių junginių pranašumas prieš hipochloritus yra tas, kad jie ilgiau išlaiko chlorą ir todėl turi ilgesnį baktericidinį poveikį. Natrio dichlorizocianurato tabletės yra stabilios ir dėl dviejų priežasčių tirpalų, paruoštų iš natrio dichloroizocianurato tablečių, mikrobicidinis aktyvumas gali būti didesnis nei natrio hipochlorito tirpalų, kuriuose yra toks pat bendras chloro kiekis. Pirma, naudojant natrio dichlorizocianuratą, tik 50 % viso turimo chloro yra laisvo (HOCl ir OCl &ndash ), o likusi dalis yra sujungta (monochloroizocianuratas arba dichlorizocianuratas), o kai laisvas turimas chloras sunaudojamas, pastarasis išleidžiamas, kad būtų atkurtas pusiausvyra. Antra, natrio dichlorizocianurato tirpalai yra rūgštūs, o natrio hipochlorito tirpalai yra šarminiai, ir manoma, kad vyrauja labiau mikrobicidinis chloro tipas (HOCl)530-533. Dezinfekavimo priemonės chloro dioksido pagrindu paruošiamos šviežios pagal poreikį sumaišant du komponentus (bazinį tirpalą [citrinų rūgštis su konservantais ir korozijos inhibitoriais] ir aktyvatoriaus tirpalą [natrio chloritas]). In vitro suspensijos bandymai parodė, kad tirpaluose, kuriuose yra apie 140 ppm chloro dioksido, redukcijos koeficientas viršijo 10 6 S. aureus po 1 minutės ir Bacillus atrophaeus sporos per 2,5 minutės, esant 3 g/l galvijų albumino. Reikia atsižvelgti į įrangos sugadinimo galimybę, nes ilgalaikis naudojimas gali pažeisti išorinį plastikinį įterpimo vamzdžio dangą 534. Kito tyrimo metu chloro dioksido tirpalai, esant 600 ppm arba 30 ppm, žuvo Mycobacterium avium-intracellulare per 60 sekundžių po kontakto, tačiau užteršimas organinėmis medžiagomis reikšmingai paveikė mikrobicidines savybes 535 .

Buvo ištirtas naujos dezinfekcinės priemonės – superoksiduoto vandens – mikrobicidinis aktyvumas. Elektrolizinio fiziologinio tirpalo, siekiant sukurti dezinfekavimo arba antiseptikų, koncepcija yra patraukli, nes pagrindinės druskos ir elektros medžiagos yra nebrangios, o galutinis produktas (ty vanduo) nekenkia. aplinka. Pagrindiniai šio vandens produktai yra hipochloro rūgštis (pvz., apie 144 mg/l koncentracijos) ir chloras. Kaip ir bet kurio germicido atveju, superoksiduoto vandens antimikrobiniam aktyvumui didelę įtaką daro veikliosios medžiagos (turimo laisvo chloro) koncentracija 536 . Vienas gamintojas gamina dezinfekavimo priemonę naudojimo vietoje, per dengtus titano elektrodus 9 ampere perleisdamas fiziologinį tirpalą. Sukurto produkto pH yra 5,0 ir ndash 6,5, o oksidacijos-redukcijos potencialas (redokso) yra >950 mV. Nors superoksiduotas vanduo turi būti šviežias naudojimo vietoje, išbandžius švariomis sąlygomis, dezinfekavimo priemonė suveikė per 5 minutes, kai buvo 48 valandos537. Deja, gaminiui gaminti reikalinga įranga gali būti brangi, nes reikia atidžiai stebėti tokius parametrus kaip pH, srovė ir redokso potencialas. Tirpalas nėra toksiškas biologiniams audiniams. Nors Jungtinės Karalystės gamintojas teigia, kad tirpalas nėra korozinis ir nepažeidžia endoskopų bei apdorojimo įrangos, vienas lanksčių endoskopų gamintojas (Olympus Key-Med, Jungtinė Karalystė) anuliavo garantiją endoskopams, jei juos dezinfekuoti naudojamas superoksiduotas vanduo538. Kaip ir vartojant bet kurią baktericidinę formulę, vartotojas turėtų pasiteirauti įrenginio gamintojo, ar jis suderinamas su baktericidiniu preparatu. Reikia atlikti papildomus tyrimus, siekiant nustatyti, ar šis tirpalas gali būti naudojamas kaip alternatyva kitoms dezinfekavimo priemonėms ar antiseptikams, skirtas rankų plovimui, odos antiseptikams, patalpų valymui ar įrangos (pvz., endoskopų, dializatorių) dezinfekcijai 400, 539, 540. 2002 m. spalio mėn. FDA išvalė superoksiduotą vandenį kaip aukšto lygio dezinfekavimo priemonę (FDA, asmeninis pranešimas, 2002 m. rugsėjo 18 d.).

Veikimo.

Tikslus mechanizmas, kuriuo laisvas chloras naikina mikroorganizmus, nebuvo išaiškintas. Inaktyvacija chloru gali atsirasti dėl daugelio veiksnių: sulfhidrilo fermentų ir amino rūgščių oksidacijos, aminorūgščių žiedo chloravimo, tarpląstelinio turinio praradimo, sumažėjusio maistinių medžiagų pasisavinimo, baltymų sintezės slopinimo, sumažėjusio deguonies pasisavinimo, kvėpavimo komponentų oksidacijos, sumažėjusio adenozino trifosfato gamybos pertrūkių DNR ir depresinė DNR sintezė 329, 347. Tikrasis mikrobicidinis chloro mechanizmas gali būti susijęs su šių veiksnių deriniu arba chloro poveikiu kritinėms vietoms347.

Mikrobicidinis aktyvumas.

Mažos laisvo chloro koncentracijos (pvz., HOCl, OCl &ndash ir elementinis chloras-Cl2) turi biocidinį poveikį mikoplazmai (25 ppm) ir vegetatyvinėms bakterijoms (<5 ppm) per kelias sekundes, kai nėra organinės apkrovos329, 418. Norint nužudyti, reikia didesnės chloro koncentracijos (1000 ppm). M. tuberculosis naudojant oficialių analitinių chemikų asociacijos (AOAC) tuberkuliocidinį testą 73 . 100 ppm koncentracija nužudys &ge99,9 % B. atrophaeus sporos per 5 minutes 541, 542 ir sunaikina mikozės sukėlėjus per <1 valandą 329 . Parūgštintas baliklis ir įprastas baliklis (5000 ppm chloro) gali inaktyvuoti 10 6 Clostridium difficile sporos per 10 minučių 262 . Viename tyrime buvo pranešta, kad 25 skirtingi virusai buvo inaktyvuoti per 10 minučių su 200 ppm chloro 72 . Keletas tyrimų įrodė, kad praskiestas natrio hipochloritas ir kitos dezinfekavimo priemonės yra veiksmingos inaktyvuojant ŽIV 61 . Chloras (500 ppm) slopina Candida po 30 sekundžių ekspozicijos 54 . Atliekant eksperimentus, naudojant AOAC naudojimo praskiedimo metodą, 100 ppm laisvo chloro nužudė 10 6 ir ndash10 7 S. aureus, Salmonella choleraesuis, ir P. aeruginosa per <10 minučių 327 . Kadangi buitiniame baliklyje yra 5,25 % & ndash 6,15 % natrio hipochlorito arba 52 500 & ndash 61 500 ppm chloro, 1:1 000 skiedimas suteikia apie 53 & ndash62 ppm turimo chloro, o 1:10 skiedimas buitinio baliklio yra apie ndash5 2150 ppm.

Yra duomenų apie chloro dioksidą, kurie patvirtina gamintojų baktericidinius, fungicidinius, sporicidinius, tuberkuliocidinius ir virusus naikinančius etiketės teiginius 543–546. Įrodyta, kad chloro dioksido generatorius yra veiksmingas nukenksminant lanksčius endoskopus 534, tačiau šiuo metu FDA nėra patvirtinęs, kad jis gali būti naudojamas kaip aukšto lygio dezinfekavimo priemonė 85 . Chloro dioksidas gali būti gaunamas maišant tirpalus, pvz., chloro tirpalą su natrio chlorito tirpalu 329 . 1986 m. chloro dioksido produktas buvo savanoriškai pašalintas iš rinkos, kai dėl jo naudojimo nutekėjo celiuliozės pagrindu pagamintos dializatoriaus membranos, dėl kurių bakterijos galėjo migruoti iš dializatoriaus dializės skysčio pusės į kraujo pusę547.

Natrio dichlorizocianuratas, esant 2500 ppm turimo chloro, yra veiksmingas prieš bakterijas, kai yra iki 20 % plazmos, palyginti su 10 % plazmos natrio hipochloritu, kai yra 2500 ppm548.

&ldquoSuperoksiduotas vanduo&ldquo buvo išbandytas prieš bakterijas, mikobakterijas, virusus, grybus ir sporas 537, 539, 549. Šviežiai pagamintas superoksiduotas vanduo greitai (<2 min.) pasiekia 5 log.10 patogeninių mikroorganizmų mažinimas (t. M. tuberculosis, M. chelonae, poliomielito virusas, ŽIV, atsparus daugeliui vaistų S. aureus, E. coli, Candida albicans, Enterococcus faecalis, P. aeruginosa) nesant organinės apkrovos. Tačiau šio dezinfekavimo priemonės biocidinis aktyvumas labai sumažėjo, kai yra organinės medžiagos (pvz., 5 % arklio serumo) 537, 549, 550. Dirbtinai užterštuose endoskopuose bakterijų ar virusų nebuvo aptikta po 5 minučių trukmės superoksiduoto vandens poveikio551, o HBV-DNR nebuvo aptikta nė viename endoskope, eksperimentiškai užteršto HBV teigiamais mišriais serumais po 7 minučių dezinfekavimo laiko552.

Hipochloritai yra plačiai naudojami sveikatos priežiūros įstaigose įvairiose aplinkose. 328 Neorganinis chloro tirpalas naudojamas tonometro galvutėms 188 dezinfekuoti ir stalviršių bei grindų dezinfekcijai vietoje. Kraujui nukenksminti buvo rekomenduojamas 1:10 ir ndash1:100 skiedimas 5,25 % & ndash 6,15 % natrio hipochlorito (t. y. buitinio baliklio) 22, 228, 553, 554 arba EPA registruotos tuberkuliocidinės dezinfekcijos priemonės 17. Jei ant nekritinių paviršių išsiliejo nedidelis kraujo kiekis (t. y. kraujo lašai), vietą galima dezinfekuoti 1:100 praskiedimu 5,25–6,15 % natrio hipochlorito arba EPA registruota tuberkuliocidine dezinfekavimo priemone.Kadangi hipochloritai ir kiti baktericidai yra iš esmės inaktyvuojami esant kraujui 63, 548, 555, 556 , dideliems kraujo išsiliejimui paviršius turi būti nuvalytas prieš naudojant EPA registruotą dezinfekavimo priemonę arba buitinio baliklio tirpalą santykiu 1:10 (galutinė koncentracija). taikomas 557 . Jei įmanoma susižaloti aštriais daiktais, paviršius iš pradžių turi būti nukenksminamas 69, 318 , tada nuvalomas ir dezinfekuojamas (1:10 galutinė koncentracija) 63 . Visada reikia būti ypač atsargiems, kad būtų išvengta perkutaninių sužalojimų. CPR treniruočių manekenams nukenksminti rekomenduojama 10 minučių naudoti bent 500 ppm chloro558. Viso stiprumo baliklis buvo rekomenduojamas adatų ir švirkštų, naudojamų nelegalių vaistų injekcijoms, savidezinfekcijai, kai nėra adatų keitimo programų. Rekomenduojamų baliklio koncentracijų skirtumas rodo, kad sunku išvalyti adatų ir švirkštų vidų bei adatų ir švirkštų naudojimą parenterinei injekcijai559. Gydytojai neturėtų keisti chloro naudojimo ant aplinkos paviršių, remdamiesi bandymų metodikomis, kurios nemodeliuoja tikrosios dezinfekcijos 560, 561. Kiti naudojimo būdai sveikatos priežiūros srityje apima kaip drėkinamąją priemonę atliekant endodontinį gydymą 562 ir kaip manekenų, skalbinių, stomatologijos prietaisų, hidroterapijos rezervuarų 23, 41 dezinfekavimo priemonę, reguliuojamas medicinines atliekas prieš išmetimą 328 ir vandens paskirstymo sistemą hemodializės centruose ir hemodializės aparatuose 563 .

Chloras ilgą laiką buvo naudojamas kaip dezinfekavimo priemonė vandens valymui. Hiperchlorinimas a Legionella- užterštos ligoninės vandens sistemos 23 dėka smarkiai sumažėjo (nuo 30% iki 1,5%) izoliacija. L. pneumophila iš vandens išleidimo angų ir su sveikatos priežiūra susijusios legionierių ir rsquo ligos nutraukimas paveiktame skyriuje 528, 564. Komunalinių vandens valymo įrenginių atlikta vandens dezinfekcija monochloraminu žymiai sumažino su sveikatos priežiūra susijusią legioneliozės riziką 565, 566. Chloro dioksidas taip pat buvo naudojamas kontrolei Legionella ligoninės vandentiekyje. Hidroterapijos įrangai dezinfekuoti buvo naudojamas 567 Chloraminas T 568 ir hipochloritai 41.

Hipochlorito tirpalai vandentiekio vandenyje, kurio pH >gt8, laikomi kambario temperatūroje (23 ir°C) uždaruose, nepermatomuose plastikiniuose induose, per 1 mėnesį gali prarasti iki 40 % ir 50 % laisvo chloro kiekio. Taigi, jei vartotojas 30 dieną nori turėti tirpalo, kuriame būtų 500 ppm chloro, jis turėtų paruošti tirpalą, kuriame 0 momentu yra 1000 ppm chloro. Natrio hipochlorito tirpalas nesuyra po 30 dienų, kai laikomas uždarytoje. rudas butelis 327 .

Miltelių, sudarytų iš chlorą atpalaiduojančios medžiagos ir labai sugeriančios dervos mišinio, naudojimas išsiliejusių kūno skysčių dezinfekcijai buvo įvertintas laboratoriniais tyrimais ir ligoninių palatomis. Akrilo dervos dalelių įtraukimas į kompoziciją žymiai padidina skysčio, kurį galima sugerti, tūrį, nes derva gali sugerti 200 ir ndash 300 kartų daugiau skysčio, nei ji pati sveria, priklausomai nuo skysčio konsistencijos. Kai eksperimentinės kompozicijos, kuriose yra 1%, 5% ir 10% turimo chloro, buvo įvertintos standartizuotu paviršiaus bandymu, tos, kurių sudėtyje yra 10%, parodė baktericidinį aktyvumą. Viena iš chlorą išskiriančių granulių problemų yra ta, kad patekusios ant šlapimo gali susidaryti chloro garai569.

Formaldehidas

Apžvalga.

Formaldehidas naudojamas kaip dezinfekavimo ir sterilizavimo priemonė tiek skystoje, tiek dujinėje būsenoje. Skystas formaldehidas bus trumpai aptartas šiame skyriuje, o dujinė forma apžvelgta kitur570. Formaldehidas parduodamas ir naudojamas daugiausia kaip vandens pagrindu pagamintas tirpalas, vadinamas formalinu, kuris sudaro 37 % formaldehido masės. Vandeninis tirpalas yra baktericidas, tuberkulocidas, fungicidas, virucidas ir sporicidas 72, 82, 571-573. OSHA nurodė, kad formaldehidas darbo vietoje turėtų būti tvarkomas kaip galimas kancerogenas, ir nustatė formaldehido poveikio darbuotojams standartą, kuris riboja 8 valandų vidutinę svertinę poveikio koncentraciją 0,75 ppm574, 575. Standartas apima antrą leistiną poveikio ribą, trumpalaikio poveikio ribą (STEL) – 2 ppm, kuri yra didžiausias leidžiamas poveikis per 15 minučių576. Formaldehido nurijimas gali būti mirtinas, o ilgalaikis nedidelio kiekio ore arba odoje poveikis gali sukelti į astmą panašius kvėpavimo sutrikimus ir odos sudirginimą, pvz., dermatitą ir niežulį. Dėl šių priežasčių darbuotojai turėtų turėti ribotą tiesioginį kontaktą su formaldehidu, o šios aplinkybės riboja jo vaidmenį sterilizavimo ir dezinfekcijos procesuose. Pagrindinės OSHA standarto nuostatos, saugančios darbuotojus nuo formaldehido poveikio, pateiktos Federalinių taisyklių kodekso (CFR) 1910.1048 dalies 29 antraštinėje dalyje (ir lygiaverčiuose reglamentuose valstijose, kuriose yra OSHA patvirtinti valstijos planai)577.

Veikimo.

Formaldehidas inaktyvuoja mikroorganizmus, alkilindamas baltymų amino ir sulfhidralines grupes bei purino bazių žiedo azoto atomus 376 .

Mikrobicidinis aktyvumas.

Įvairios koncentracijos vandeniniai formaldehido tirpalai sunaikina daugybę mikroorganizmų. Norint inaktyvuoti poliomielito virusą per 10 minučių, reikėjo 8 % formalino koncentracijos, tačiau visi kiti tirti virusai buvo inaktyvuoti 2 % formalinu 72 . Keturi procentai formaldehido yra tuberkuliocidinis agentas, inaktyvuojantis 10 4 M. tuberkuliozės per 2 minutes 82 , o 2,5 % formaldehido inaktyvuota apie 10 7 Salmonella Typhi per 10 minučių esant organinėms medžiagoms 572 . Atliekant lyginamuosius bandymus su 4% vandeniniu formaldehidu ir 2% glutaraldehidu, formaldehido sporų poveikis buvo lėtesnis nei glutaraldehido. B. anthracis 82 . Norint pasiekti 10 4 inaktyvavimo koeficientą, formaldehido tirpalui prireikė 2 valandų kontakto, o glutaraldehidui prireikė tik 15 minučių.

Nors formaldehido alkoholis yra cheminis sterilizatorius, o formaldehidas yra aukšto lygio dezinfekavimo priemonė, formaldehido naudojimą sveikatos priežiūrai riboja jo dirginantys garai ir aštrus kvapas net esant labai mažam kiekiui (<1 ppm). Dėl šių ir kitų priežasčių, pavyzdžiui, kaip įtariamo žmogaus kancerogeno, susijusio su nosies ir plaučių vėžiu578, šis germicidas neįtrauktas į 1 lentelę. Kai jis naudojamas, tiesioginis darbuotojų poveikis paprastai yra ribotas, tačiau per didelis formaldehido poveikis buvo dokumentuota inkstų transplantacijos skyrių darbuotojams 574, 579 ir stambiosios anatomijos laboratorijos studentams 580 . Formaldehidas naudojamas sveikatos priežiūros įstaigoje ruošiant virusines vakcinas (pvz., nuo poliomielito ir gripo) kaip balzamavimo priemonė ir anatominiams mėginiams išsaugoti, ir istoriškai buvo naudojamas sterilizuoti chirurginius instrumentus, ypač sumaišius su etanoliu. 1997 m. atlikta apklausa parodė, kad formaldehidą hemodializatorių perdirbimui naudojo 34 % JAV hemodializės centrų ir 60 % mažiau nei 1983 m. 249, 581. Jei naudojamas kambario temperatūroje, tam pačiam pacientui pakartotinai naudotus vienkartinius hemodializatorius dezinfekuoti reikia 4 % koncentracijos ir mažiausiai 24 valandų ekspozicijos 582, 583. Vandeniniai formaldehido tirpalai (1% ir ndash2%) taip pat buvo naudojami dializės aparatų vidinių skysčių takų dezinfekcijai583. Siekiant sumažinti galimą pavojų dializuojamų pacientų sveikatai, prieš naudojant dializės įrangą reikia kruopščiai nuplauti ir patikrinti, ar nėra formaldehido likučių.

Paraformaldehidas, kietas formaldehido polimeras, gali būti išgarinamas šiluma, kad būtų galima nukenksminti laminarinio srauto biologines saugos spintas, kai atliekant techninės priežiūros darbus ar keičiant filtrus reikia patekti į sandarią spintos dalį.

Glutaraldehidas

Apžvalga.

Glutaraldehidas yra prisotintas dialdehidas, plačiai pripažintas kaip aukšto lygio dezinfekantas ir cheminis sterilizatorius 107 . Vandeniniai glutaraldehido tirpalai yra rūgštūs ir paprastai nėra sporicidiniai. Tik tada, kai tirpalas yra &ldquoaktyvintas&rdquo (padaromas šarminiu) naudojant šarmines medžiagas iki pH 7,5&ndash 8,5, tirpalas tampa sporicidinis. Suaktyvinus šių tirpalų galiojimo laikas yra mažiausiai 14 dienų, nes glutaraldehido molekulės polimerizuojasi esant šarminiam pH lygiui. Ši polimerizacija blokuoja aktyviąsias glutaraldehido molekulių vietas (aldehido grupes), kurios yra atsakingos už jo biocidinį aktyvumą.

Nauji glutaraldehido preparatai (pvz., glutaraldehidas-fenolis-natrio fenatas, sustiprintas rūgšties glutaraldehidas, stabilizuotas šarminis glutaraldehidas), pagamintos per pastaruosius 30 metų, įveikė greito aktyvumo praradimo problemą (pvz., naudojimo laikas 28 ir ndash 30 dienų), išlaikant puikų mikrobą. veikla 584-588. Tačiau antimikrobinis aktyvumas priklauso ne tik nuo amžiaus, bet ir nuo naudojimo sąlygų, tokių kaip skiedimas ir organinis stresas. Gamintojų ir šių preparatų literatūroje teigiama, kad neutralūs arba šarminiai glutaraldehidai pasižymi mikrobicidinėmis ir antikorozinėmis savybėmis, pranašesnėmis už rūgščių glutaraldehidų savybes, o keletas paskelbtų ataskaitų patvirtina šiuos teiginius 542, 589, 590. Tačiau du tyrimai nerado jokio skirtumo tarp šarminių ir rūgščių glutaraldehidų mikrobicidinio aktyvumo 73, 591 . Glutaraldehido tirpalų naudojimas sveikatos priežiūros įstaigose yra plačiai paplitęs dėl jų privalumų, įskaitant puikias biocidines savybes esant organinėms medžiagoms (20 % galvijų serumo) ir nerūdijančio poveikio endoskopinei įrangai, termometrams, guminei ar plastikinei įrangai. (4 ir 5 lentelės).

Veikimo.

Glutaraldehido biocidinis aktyvumas atsiranda dėl jo mikroorganizmų sulfhidrilo, hidroksilo, karboksilo ir amino grupių alkilinimo, o tai keičia RNR, DNR ir baltymų sintezę. Gliutaraldehidų veikimo mechanizmas plačiai apžvelgtas kitur 592, 593.

Mikrobicidinis aktyvumas.

Mikroorganizmų inaktyvavimas in vitro glutaraldehidais buvo plačiai ištirtas ir peržiūrėtas592, 593. Keletas tyrėjų parodė, kad &ge2% vandeniniai glutaraldehido tirpalai, buferiniai iki pH 7,5 ir ndash8,5 su natrio bikarbonatu veiksmingai sunaikino vegetatyvines bakterijas per <2 minutes. M. tuberculosis, grybeliai ir virusai per <10 minučių ir sporos Bacila ir Clostridium rūšis per 3 valandas 542, 592-597. Sporos C. difficile 2% glutaraldehido žudo greičiau nei kitų rūšių sporas Clostridium ir Bacila 79, 265, 266. Buvo pranešta apie mikroorganizmus, kurie labai atsparūs glutaraldehidui, įskaitant kai kurias mikobakterijas (M. chelonae, Mycobacterium avium-intracellulare, M. xenopi) 598-601 , Methylobacterium mesophilicum 602 , Trichosporonas, grybelinės askosporos (pvz., Microascus cinereus, Cheatomium globosum), ir Cryptosporidium 271, 603 . M. chelonae išsilaikė 0,2 % glutaraldehido tirpale, naudojamame kiaulių širdies vožtuvų protezavimui laikyti 604 .

Inaktyvuotas dviejų procentų šarminio glutaraldehido tirpalas 10 5 M. tuberculosis ląstelės penicilindro paviršiuje per 5 minutes 18°C ​​temperatūroje 589 . Tačiau vėlesni tyrimai 82 suabejojo ​​glutaraldehidų mikobaktericidinėmis savybėmis. Dviejų procentų šarminis glutaraldehidas veikia lėtai (20–30 minučių). M. tuberculosis ir nepalankiai lyginamas su alkoholiais, formaldehidais, jodu ir fenoliu 82 . Sustabdymai M. avium, M. intracellulare, ir M. gordonae buvo atsparesni inaktyvavimui 2% šarminio glutaraldehido (numatomas laikas iki visiško inaktyvavimo:

60 minučių), nei buvo virulentiški M. tuberculosis (numatomas laikas, per kurį reikia užbaigti inaktyvavimą

25 minutes) 605 . Žuvimo greitis buvo tiesiogiai proporcingas temperatūrai, o standartizuota suspensija M. tuberculosis nepavyko sterilizuoti per 10 minučių 84 . FDA išvalytas cheminis sterilizatorius, kuriame yra 2,5 % glutaraldehido, naudoja padidintą temperatūrą (35 ir laipsnių C), kad sutrumpėtų laikas, reikalingas aukšto lygio dezinfekcijai (5 minutės) 85, 606 , tačiau jis naudojamas tik automatiniuose endoskopo perdirbimo įrenginiuose su šildytuvu. Kitame tyrime, kuriame buvo naudojami membraniniai filtrai 2% šarminio glutaraldehido mikobaktericidiniam aktyvumui matuoti, visiškas inaktyvavimas buvo pasiektas per 20 minučių 20°C temperatūroje, kai tiriamasis inokuliatas buvo 10 6 M. tuberculosis vienai membranai 81 . Keli tyrėjai 55, 57, 73, 76, 80, 81, 84, 605 įrodė, kad glutaraldehido tirpalai inaktyvuoja nuo 2,4 iki >5,0 log.10 apie M. tuberculosis per 10 minučių (įskaitant atsparumą daugeliui vaistų M. tuberculosis) ir 4.0&ndash6.4 žurnalas10 apie M. tuberculosis per 20 minučių. Remiantis šiais duomenimis ir kitais tyrimais, 20 minučių kambario temperatūroje laikoma minimalia ekspozicijos trukme, reikalinga patikimai nužudyti. Mikobakterijos ir kitos vegetatyvinės bakterijos su &ge2% glutaraldehido 17, 19, 27, 57, 83, 94, 108, 111, 117-121, 607.

Naudojimo metu glutaraldehidas paprastai skiedžiamas, o tyrimai parodė, kad glutaraldehido koncentracija sumažėja po kelių dienų naudojimo automatinėje endoskopo plovyklėje 608, 609. Sumažėjimas atsiranda dėl to, kad instrumentai nėra kruopščiai išdžiovinami, o vanduo patenka į prietaisą, todėl padidėja tirpalo tūris ir praskiedžiama jo efektyvi koncentracija 610 . Tai pabrėžia būtinybę užtikrinti, kad pusiau kritinė įranga būtų dezinfekuojama priimtinos koncentracijos glutaraldehidu. Duomenys rodo, kad 1,0 % & ndash 1,5 % glutaraldehido yra mažiausia efektyvi koncentracija >2 % glutaraldehido tirpalams, kai jie naudojami kaip aukšto lygio dezinfekavimo priemonė 76, 589, 590, 609. Galima įsigyti cheminių bandymo juostelių arba skystų cheminių medžiagų monitorių 610, 611, kad būtų galima nustatyti, ar, nepaisant pakartotinio naudojimo ir skiedimo, yra veiksminga glutaraldehido koncentracija. Bandymų dažnis turėtų būti pagrįstas tirpalų naudojimo dažnumu (pvz., naudojamas kasdien, tikrinamas kasdien, naudojamas kas savaitę, tikrinamas prieš naudojant 30 kartų per dieną, tikrinamas kas 10 kartų), tačiau juostelės neturėtų būti naudojamos norint pratęsti. galiojimo laikas pasibaigęs. Duomenys rodo, kad 612 laikui bandymo juostelėje esančios cheminės medžiagos blogėja, todėl ant buteliukų reikia nurodyti gamintojo nurodytą galiojimo datą. Ant buteliuko su bandymo juostelėmis turi būti nurodyta data, kai jis atidaromas ir naudojamas ant buteliuko nurodytą laikotarpį (pvz., 120 dienų). Bandymo juostelių stebėjimo rezultatai turi būti dokumentuojami. Glutaraldehido bandymo rinkinių tikslumas ir diapazonas buvo preliminariai įvertintas 612, tačiau jų patikimumas buvo suabejotas613. Kad būtų užtikrinta minimali efektyvi aukšto lygio dezinfekavimo priemonės koncentracija, kai kurių cheminių bandymo juostelių gamintojai rekomenduoja naudoti kokybės kontrolės procedūras, kad būtų užtikrintas tinkamas juostelių veikimas. Jei cheminės bandymo juostelės gamintojas rekomenduoja atlikti kokybės kontrolės procedūrą, naudotojai turi laikytis gamintojo ir rsquos rekomendacijų. Koncentracija turėtų būti laikoma nepriimtina arba nesaugia, kai bandymas rodo, kad praskiedimas yra mažesnis už produkto ir minimalią efektyvią koncentraciją (MEC) (paprastai iki &le1,0%&ndash1,5% glutaraldehido), nes indikatorius nekeičia spalvos.

2,0% glutaraldehido ir ndash7,05% fenolio ir ndash 1,20% natrio fenato produktas, kuriame yra 0,125% glutaraldehido ir ndash 0,44% fenolio ir ndash0,075% natrio fenato, praskiestas santykiu 1:16, nerekomenduojamas, nes jame nėra didelio baktericidinio aktyvumo. organinių medžiagų ir neturi tuberkuliocidinio, fungicidinio, virucidinio ir sporicidinio aktyvumo 49, 55, 56, 71, 73-79, 614. 1991 m. gruodžio mėn. EPA paskelbė įsakymą sustabdyti visų šio produkto partijų pardavimą, nes veiksmingumo duomenys rodo, kad produktas nėra veiksmingas prieš sporas ir galbūt kitus mikroorganizmus ar negyvus objektus, kaip teigiama etiketėje615. FDA išvalė glutaraldehido ir ndashfenolio / fenato koncentratą kaip aukšto lygio dezinfekavimo priemonę, kurioje yra 1,12% glutaraldehido ir 1,93% fenolio / fenato naudojimo koncentracijoje. Kiti FDA išvalyti glutaraldehido sterilizatoriai, kuriuose yra 2,4 % ir ndash 3,4 % glutaraldehido, naudojami neskiesti 606 .

Glutaraldehidas dažniausiai naudojamas kaip aukšto lygio dezinfekavimo priemonė medicinos įrangai, pvz., endoskopams 69, 107, 504, spirometriniams vamzdeliams, dializatoriams 616, keitikliams, anestezijos ir kvėpavimo terapijos įrangai 617, hemodializės proporcijoms ir dializės tiekimo sistemoms189, pakartotiniam naudojimui189. laparoskopinių vienkartinių plastikinių trokarų 619 . Glutaraldehidas nerūdija metalo ir nepažeidžia instrumentų su lęšiais, gumos. arba plastikai. Glutaraldehidas neturėtų būti naudojamas nekritiniams paviršiams valyti, nes jis yra per toksiškas ir brangus.

Buvo pranešta apie kolitą, kurį, kaip manoma, sukėlė glutaraldehido poveikis endoskopo tirpalo kanaluose likusio dezinfekavimo tirpalo kanaluose ir jo galima išvengti kruopščiai nuplaunant endoskopą 318, 620-630 . Viename tyrime nustatyta, kad liekamasis glutaraldehido kiekis po rankinės dezinfekcijos buvo didesnis ir kintamesnis (< 0,2 mg/l iki 159,5 mg/l) nei po automatinės dezinfekcijos (0,2 ir ndash 6,3 mg/l)631. Panašiai keratopatiją ir ragenos dekompensaciją sukėlė oftalmologiniai instrumentai, kurie buvo netinkamai išskalauti po mirkymo 2% glutaraldehido 632, 633.

Sveikatos priežiūros personalas gali būti veikiamas padidėjusio glutaraldehido garų kiekio, kai įranga apdorojama prastai vėdinamose patalpose, kai išsilieja, kai aktyvuojami arba keičiami glutaraldehido tirpalai634 arba kai naudojamos atviros panardinamosios vonios. Ūmus arba lėtinis poveikis gali sukelti odos sudirginimą arba dermatitą, gleivinių (akių, nosies, burnos) sudirginimą arba plaučių simptomus 318, 635–639. Taip pat buvo pranešta apie nosies užgulimą, alerginį kontaktinį dermatitą, astmą ir rinitą sveikatos priežiūros darbuotojams, kurie buvo veikiami glutaraldehido 636, 640-647.

Siekiant užtikrinti saugią darbo aplinką, reikia stebėti glutaraldehido poveikį. Bandymas gali būti atliekamas keturiais būdais: silikagelio vamzdeliu/dujų chromatografija su liepsnos jonizacijos detektoriumi, dinitrofenilhidrazinu (DNPH) impregnuota filtro kasetė/didelės našumo skysčių chromatografija (HPLC) su ultravioletiniu (UV) detektoriumi, pasyvus ženklelis/ HPLC arba rankinis glutaraldehido oro monitorius 648 . Silikagelio vamzdelis ir DNPH impregnuota kasetė yra tinkami stebėti 0,05 ppm lubų ribą. Pasyvus ženklelis, kurio aptikimo riba yra 0,02 ppm, yra laikomas nereikšmingu Amerikos vyriausybinės pramonės higienos tarybos (ACGIH) lubų lygyje. Laikoma, kad lubų lygis yra per arti glutaraldehido matuoklio ir 0,03 ppm aptikimo ribos, kad rodmenys būtų patikimi648. ACGIH nereikalauja specialaus glutaraldehido stebėjimo grafiko, tačiau reikalingas stebėjimo grafikas, siekiant užtikrinti, kad lygis būtų mažesnis už ribą.Pavyzdžiui, iš pradžių reikia stebėti glutaraldehido kiekį, po procedūrų ar įrangos pakeitimų ir reaguojant į darbuotojų skundus649. Jei nėra OSHA leistinos poveikio ribos, jei glutaraldehido lygis yra didesnis nei ACGIH viršutinė riba – 0,05 ppm, būtų protinga imtis korekcinių veiksmų ir pakartotinai stebėti 649 .

Inžinerinės ir darbo praktikos valdymo priemonės, kurias galima naudoti sprendžiant šias problemas, yra ištraukiamieji gaubtai, oro sistemos, užtikrinančios 7–ndash15 oro mainus per valandą, garų gaubtai be ortakių su absorbentais glutaraldehido garams, sandarūs panardinamų vonių dangčiai, asmeninės apsaugos priemonės ( pvz., nitrilo arba butilo gumos pirštines, bet ne natūralaus latekso pirštines, akinius), kad būtų kuo mažiau kontakto su oda ar gleivine, ir automatinius endoskopinius procesorius 7 650 . Jei inžinerinės kontrolės priemonės nesugeba išlaikyti lygio žemiau lubų ribos, įstaigos gali apsvarstyti galimybę naudoti respiratorius (pvz., pusės veido respiratorių su organinių garų kasetė 640 arba &ldquoC&rdquo tipo tiekiamo oro respiratorių su visu veiduku, veikiančiu teigiamo slėgio režimu). 651 . Apskritai pirmenybė teikiama inžinerinei kontrolei, o ne darbo praktikai ir administracinei kontrolei, nes joms nereikia aktyvaus sveikatos priežiūros darbuotojo dalyvavimo. Nors 1993 m. JAV apeliacinis teismas sustabdė OSHA viršutinės ribos vykdymą577, apriboti poveikį darbuotojams iki 0,05 ppm (pagal ACGIH) yra protinga, nes esant tokiam lygiui glutaraldehidas gali dirginti akis, gerklę ir nosį 318 , 577, 639, 652. Jei glutaraldehido šalinimas per sanitarinę kanalizacijos sistemą yra ribojamas, natrio bisulfatas gali būti naudojamas glutaraldehidui neutralizuoti ir padaryti jį saugiu šalinimui.

Vandenilio peroksidas

Apžvalga.

Literatūroje yra keletas pranešimų apie stabilizuoto vandenilio peroksido savybes, baktericidinį veiksmingumą ir galimą naudojimą sveikatos priežiūros srityje. Paskelbtose ataskaitose teigiama, kad vandenilio peroksidas turi gerą baktericidinį poveikį ir patvirtina jo baktericidines, virucidines, sporicidines ir fungicidines savybes 653–655. (4 ir 5 lentelės) FDA svetainėje pateikiami išvalytų skystų cheminių sterilizatorių ir aukšto lygio dezinfekavimo priemonių, kurių sudėtyje yra vandenilio peroksido, sąrašas ir jų pašalintos sąlyčio sąlygos.

Veikimo.

Vandenilio peroksidas veikia gamindamas destruktyvius hidroksilo laisvuosius radikalus, kurie gali atakuoti membranos lipidus, DNR ir kitus esminius ląstelių komponentus. Katalazė, kurią gamina aerobiniai organizmai ir fakultatyviniai anaerobai, turintys citochromo sistemas, gali apsaugoti ląsteles nuo metaboliškai gaminamo vandenilio peroksido, skaidydama vandenilio peroksidą iki vandens ir deguonies. Šią gynybą užgožia dezinfekcijai naudojamos koncentracijos 653, 654.

Mikrobicidinis aktyvumas.

Vandenilio peroksidas veikia prieš daugybę mikroorganizmų, įskaitant bakterijas, mieles, grybus, virusus ir sporas 78, 654. 0,5 % pagreitintas vandenilio peroksidas parodė baktericidinį ir virucidinį aktyvumą per 1 minutę, o mikobaktericidinį ir fungicidinį – per 5 minutes656. Vandenilio peroksido šlapime baktericidinis veiksmingumas ir stabilumas buvo įrodytas prieš įvairius su sveikatos priežiūra ir susijusius patogenus, turinčius didelį ląstelių katalazės aktyvumą (pvz., S. aureus, S. marcescens, ir Proteus mirabilis) reikėjo 30–60 minučių 0,6 % vandenilio peroksido poveikio, kad ląstelių skaičius sumažėtų 10 8, o organizmai, kurių katalazės aktyvumas mažesnis (pvz., E. coli, Streptokokas rūšys ir Pseudomonas rūšis) reikia tik 15 minučių ir rsquo ekspozicijos 657 . Tiriant 3 %, 10 % ir 15 % vandenilio peroksido, skirto erdvėlaivių bakterijų populiacijai sumažinti, buvo visiškai sunaikintos 10 6 sporos (t. Bacila rūšys) įvyko esant 10 % koncentracijai ir 60 minučių ekspozicijos laikui. 3 % koncentracija 150 minučių nužudė 106 sporas šešiuose iš septynių poveikio tyrimų 658 . 10% vandenilio peroksido tirpalas sumažino 10 3 B. atrophaeus sporų, o &ge10 5 sumažėja, kai per 30 minučių 20°C 659, 660 temperatūroje tiriama prieš 13 kitų patogenų. 3,0 % vandenilio peroksido tirpalas buvo neveiksmingas prieš VRE po 3 ir 10 minučių ekspozicijos laikų 661 ir sukėlė tik 2 log.10 skaičiaus sumažinimas Akantamoeba cistos maždaug per 2 valandas 662 . 7 % stabilizuotas vandenilio peroksidas pasirodė esąs sporicidinis (6 val. ekspozicijos), mikobaktericidinis (20 minučių), fungicidinis (5 min.) esant viso stiprumo, virucidinis (5 minutės) ir baktericidinis (3 minutes) praskiedus santykiu 1:16. buvo naudojamas kiekybinis nešiklio testas 655 . 7 % vandenilio peroksido tirpalas, išbandytas po 14 dienų streso (užkrėstų nešioklių ir kvėpavimo terapijos įrangos pavidalu), buvo sporicidinis (>7 log10 sumažinimas per 6 valandas), mikobaktericidinis (>6,5 log10 sumažinimas per 25 minutes), fungicidinis (>5 log10 sumažinimas per 20 minučių), baktericidinis (>6 log10 sumažinimas per 5 minutes) ir virucidinis (5 log10 sumažinimas per 5 minutes) 663 . Sinergetinis sporicidinis poveikis buvo pastebėtas, kai sporos buvo veikiamos vandenilio peroksido (5,9 % & ndash23,6 %) ir peracto rūgšties 664 deriniu. Kiti tyrimai parodė antivirusinį vandenilio peroksido aktyvumą prieš rinovirusą 665. Trijų rinovirusų serotipų inaktyvavimui, naudojant 3% vandenilio peroksido tirpalą, prireikė 6&ndash8 minučių, šį kartą pailgėjo mažėjant koncentracijai (18-20 min. esant 1,5%, 50&ndash60 min., kai koncentracija 0,75%).

Vandenilio peroksido koncentracija nuo 6% iki 25% yra perspektyvi kaip cheminiai sterilizatoriai. Produktas, parduodamas kaip sterilizatorius, yra iš anksto sumaišyta, paruošta naudoti cheminė medžiaga, kurioje yra 7,5 % vandenilio peroksido ir 0,85 % fosforo rūgšties (žemam pH palaikyti) 69 . 7,5 % vandenilio peroksido mikobaktericidinis aktyvumas buvo patvirtintas tyrime, rodančiu >10 5 atsparių daugeliui vaistų inaktyvavimą. M. tuberculosis po 10 minučių ekspozicijos 666 . Trisdešimties minučių prireikė >99,9% poliomielito viruso ir HAV667 inaktyvavimui. Trijų procentų ir 6 % vandenilio peroksido nepavyko inaktyvuoti HAV per 1 minutę atliekant nešiklio testą58. Palyginus 7,5 % vandenilio peroksido veiksmingumą po 10 minučių su 2 % šarminiu glutaraldehidu po 20 minučių atliekant endoskopų rankinę dezinfekciją, reikšmingo baktericidinio aktyvumo skirtumo nepastebėta668. ). Iš slaugos ar medicinos personalo skundų dėl kvapo ar toksiškumo negauta. Viename tyrime 6 % vandenilio peroksidas (nepanaudotas produktas buvo 7,5 %) buvo veiksmingesnis atliekant aukšto lygio lanksčių endoskopų dezinfekciją nei 2 % glutaraldehido tirpalas 456 . Nauja, greitai veikianti 13,4 % vandenilio peroksido formulė (kuri dar nepatvirtinta FDA) parodė sporicidinį, mikobaktericidinį, fungicidinį ir virucidinį veiksmingumą. Gamintojo duomenys rodo, kad šis tirpalas sterilizuojasi per 30 minučių ir užtikrina aukšto lygio dezinfekciją per 5 minutes669. Šis gaminys nebuvo naudojamas pakankamai ilgai, kad būtų galima įvertinti medžiagų suderinamumą su endoskopais ir kitais pusiau kritiniais prietaisais, todėl instrumentų gamintojai turi atlikti tolesnį vertinimą.

Normaliomis sąlygomis vandenilio peroksidas yra ypač stabilus, kai yra tinkamai laikomas (pvz., tamsiose talpyklose). Skilimas arba stiprumo praradimas mažose talpyklose yra mažesnis nei 2 % per metus, esant aplinkos temperatūrai 670 .

Prekyboje parduodamas 3% vandenilio peroksidas yra stabili ir efektyvi dezinfekavimo priemonė, kai naudojamas ant negyvų paviršių. Jis buvo naudojamas nuo 3% iki 6% koncentracijos dezinfekuoti minkštus kontaktinius lęšius (pvz., 3% 2 ir ndash3 val.) 653, 671, 672, tonometro biprizmes 513, ventiliatorius 673, audinius 397 ir endoskopus 456. Vandenilio peroksidas buvo veiksmingas dezinfekuojant audinius pacientų kambariuose397. Buvo pranešta apie ragenos pažeidimą dėl vandenilio peroksidu suvilgyto tonometro antgalio, kuris nebuvo tinkamai išplautas674. Vandenilio peroksidas taip pat buvo lašinamas į šlapimo drenažo maišus, siekiant pašalinti maišelį kaip šlapimo pūslės bakteriurijos ir aplinkos taršos šaltinį675. Nors vandenilio peroksido lašinimas į maišelį sumažino maišelio mikrobinį užterštumą, ši procedūra nesumažino su kateteriu susijusios bakteriurijos675.

Buvo pranešta apie cheminį dirginimą, panašų į pseudomembraninį kolitą, kurį sukėlė 3 % vandenilio peroksidas arba 2 % glutaraldehidas621. Į pseudomembraną panašaus enterito ir kolito epidemija septyniems pacientams virškinimo trakto endoskopijos skyriuje taip pat buvo siejama su nepakankamu 3 % vandenilio peroksido išplovimu iš endoskopo 676 .

Kaip ir naudojant kitus cheminius sterilizatorius, vandenilio peroksido praskiedimas turi būti stebimas reguliariai tikrinant mažiausią efektyvią koncentraciją (t. y. 7,5 % ir ndash 6,0 %). „Olympus America“ atliktas 7,5 % vandenilio peroksido suderinamumo bandymas nustatė ir kosmetinius pokyčius (pvz., juodai anoduoto metalo apdailos pakitimus)69 ir funkcinius pakitimus su išbandytais endoskopais („Olympus“, rašytinis pranešimas, 1999 m. spalio 15 d.).

Jodoforai

Apžvalga.

Jodo tirpalus ar tinktūras sveikatos priežiūros specialistai jau seniai naudojo kaip odos ar audinių antiseptikus. Kita vertus, jodoforai buvo naudojami ir kaip antiseptikai, ir kaip dezinfekavimo priemonės. FDA neišvalė jokių skystų cheminių sterilizatorių ar aukšto lygio dezinfekavimo priemonių, kurių pagrindinė veiklioji medžiaga yra jodoforai. Jodoforas yra jodo ir tirpiklio arba nešiklio derinys. Gautas kompleksas yra ilgalaikio atpalaidavimo jodo rezervuaras ir vandeniniame tirpale išskiria nedidelį kiekį laisvo jodo. Žinomiausias ir plačiausiai naudojamas jodoforas yra povidono jodas, polivinilpirolidono junginys su jodu. Šis produktas ir kiti jodoforai išlaiko baktericidinį jodo veiksmingumą, tačiau, skirtingai nei jodas, paprastai nėra dėmių ir santykinai neturi toksiškumo ir dirginimo 677, 678.

Keletas pranešimų, kuriuose dokumentuotas vidinis povidono-jodo ir poloksamero-jodo 679-681 antiseptinių preparatų užterštumas mikrobais, paskatino iš naujo įvertinti jodoforų chemiją ir naudojimą 682 . &ldquoLaisvas&rdquo jodas (I2) prisideda prie baktericidinio jodoforų aktyvumo, o jodoforų skiedimai pasižymi greitesniu baktericidiniu poveikiu nei viso stiprumo povidono jodo tirpalas. Pastebėjimo, kad skiedimas padidina baktericidinį aktyvumą, priežastis neaiški, tačiau povidono-jodo praskiedimas gali susilpninti jodo ryšį su polimeru nešikliu ir kartu padidėti laisvojo jodo kiekis tirpale 680. Todėl, norint pasiekti antimikrobinį aktyvumą, jodoforai turi būti skiedžiami pagal gamintojo ir rsquo nurodymus.

Veikimo.

Jodas gali greitai prasiskverbti į mikroorganizmų ląstelės sienelę, o mirtinas poveikis, kaip manoma, atsiranda dėl baltymų ir nukleorūgščių struktūros ir sintezės sutrikimo.

Mikrobicidinis aktyvumas.

Paskelbtos ataskaitos apie jodoforų antimikrobinį veiksmingumą in vitro rodo, kad jodoforai yra baktericidiniai, mikobaktericidiniai ir virucidiniai, tačiau gali prireikti ilgesnio sąlyčio laiko, kad būtų sunaikinti tam tikri grybai ir bakterijų sporos 14, 71–73, 290, 683–686. Trijų markių povidono ir jodo tirpalas parodė greitesnį (sekundžių iki minučių) sunaikinimą S. aureus ir M. chelonae 1:100 praskiedimu nei pradinis tirpalas 683 . Įrodytas 75 ir ndash 150 ppm turimo jodo virucidinis aktyvumas prieš septynis virusus 72 . Kiti tyrėjai suabejojo ​​jodoforų veiksmingumu prieš poliomielito virusą esant organinėms medžiagoms 685 ir rotavirusą SA-11 distiliuotame arba vandentiekio vandenyje 290 . Gamintojų ir rsquo duomenys rodo, kad komerciniai jodoforai nėra sporicidiniai, tačiau jie yra tuberkuliocidiniai, fungicidiniai, virucidiniai ir baktericidiniai, kai rekomenduojama naudoti – praskiedus.

Jodoforai buvo naudojami ne tik kaip antiseptikas, bet ir kraujo pasėlių buteliukų bei medicininės įrangos, tokios kaip hidroterapijos rezervuarai, termometrai ir endoskopai, dezinfekavimui. Antiseptiniai jodoforai netinka naudoti kaip kietų paviršių dezinfekavimo priemonės dėl koncentracijos skirtumų. Jodoforuose, sukurtuose kaip antiseptikai, laisvojo jodo yra mažiau nei tose, kurios yra dezinfekavimo priemonės 376 . Jodo arba jodo pagrindu pagamintų antiseptikų negalima naudoti ant silikoninių kateterių, nes jie gali neigiamai paveikti silikono vamzdelius 687 .

Ortoftalaldehidas (OPA)

Apžvalga.

Ortoftalaldehidas yra aukšto lygio dezinfekavimo priemonė, kurią FDA patvirtino 1999 m. spalio mėn. Jame yra 0,55 % 1,2-benzendikarboksaldehido (OPA). OPA tirpalas yra skaidrus, šviesiai mėlynas skystis, kurio pH yra 7,5. (4 ir 5 lentelės)

Veikimo.

Preliminarūs OPA veikimo būdo tyrimai rodo, kad ir OPA, ir glutaraldehidas sąveikauja su aminorūgštimis, baltymais ir mikroorganizmais. Tačiau OPA yra mažiau stipri kryžminio ryšio priemonė. Tai kompensuoja lipofilinis aromatinis OPA pobūdis, kuris gali padėti jį įsisavinti per išorinius mikobakterijų ir gramneigiamų bakterijų sluoksnius 688-690 . Atrodo, kad OPA naikina sporas, blokuodama sporų dygimo procesą691.

Mikrobicidinis aktyvumas.

Tyrimai parodė puikų mikrobicidinį aktyvumą in vitro 69, 100, 271, 400, 692-703. Pavyzdžiui, OPA turi puikų mikobaktericidinį aktyvumą (5 log10 sumažinimas per 5 minutes) iki glutaraldehido. Vidutinis laikas, reikalingas 6 žurnalams pagaminti10 sumažinimas už M. bovis naudojant 0,21 % OPA buvo 6 minutės, palyginti su 32 minutėmis naudojant 1,5 % glutaraldehidą 693 . OPA parodė gerą aktyvumą prieš ištirtas mikobakterijas, įskaitant glutaraldehidui atsparias padermes, tačiau 0,5 % OPA nebuvo sporicidinė 270 minučių veikiant. PH padidinimas nuo nesureguliuoto lygio (apie 6,5) iki pH 8 pagerino OPA 694 sporicidinį aktyvumą. Biocidinio aktyvumo lygis buvo tiesiogiai susijęs su temperatūra. Didesnis nei 5 žurnalai10 sumažinimas B. atrophaeus 35°C temperatūroje sporos buvo stebimos per 3 valandas, o 20°C temperatūroje – per 24 valandas. Be to, esant ekspozicijos laikui ir 5 minutėms, biocidinis aktyvumas sumažėjo didėjant koncentracijai serume. Tačiau veiksmingumas nesiskyrė, kai ekspozicijos laikas buvo &ge10 minučių697. Be to, OPA yra veiksminga (>5-log10 sumažinimas) prieš daugybę mikroorganizmų, įskaitant glutaraldehidui atsparias mikobakterijas ir B. atrophaeus sporos 694 .

Bandomųjų padermių laboratorinio pritaikymo įtaka, pvz P. aeruginosa, iki 0,55 % OPA buvo įvertinta. Atsparių ir daugeliui atsparių padermių jautrumas OPA labai padidėjo po laboratorinio pritaikymo (log10 redukcijos koeficientai padidėjo atitinkamai 0,54 ir 0,91 atsparių ir daugybei atsparių padermių) 704 . Kiti tyrimai atskleidė natūraliai atsirandančias ląsteles P. aeurginosa buvo atsparesni įvairioms dezinfekavimo priemonėms nei subkultūros ląstelės 705 .

OPA turi keletą galimų pranašumų, palyginti su glutaraldehidu. Jis pasižymi puikiu stabilumu plačiame pH diapazone (pH 3 ir ndash9), nėra žinomas akių ir nosies takų dirgiklis 706 , nereikalauja poveikio stebėjimo, turi vos juntamą kvapą ir jo nereikia aktyvuoti. OPA, kaip ir glutaraldehidas, turi puikų medžiagų suderinamumą. Galimas OPA trūkumas yra tas, kad jis nudažo baltymus pilkai (įskaitant neapsaugotą odą), todėl su juo reikia elgtis atsargiai69. Tačiau odos dėmių atsiradimas reikštų netinkamą tvarkymą, dėl kurio reikia papildomo mokymo ir (arba) asmeninių apsaugos priemonių (pvz., pirštinių, akių ir burnos apsaugos ir skysčiams atsparių chalatų). OPA likučiai, likę ant netinkamai vandeniu išplautų transstemplinių aido zondų, gali nudažyti paciento burną 707 . Kruopštus valymas, naudojant tinkamą OPA poveikio laiką (pvz., 12 minučių) ir gausus zondo skalavimas vandeniu turėtų pašalinti šią problemą. Vieno tyrimo rezultatai suteikė pagrindą rekomendacijai, kad norint išplauti OPA dezinfekuotus instrumentus, vienam kanalui reikės mažiausiai 250 ml vandens, kad cheminių medžiagų likučiai sumažėtų iki tokio lygio, kuris nepakenktų pacientų ar personalo saugai (<1 ppm)708. Dirbant su užterštais instrumentais, įranga ir cheminėmis medžiagomis reikia dėvėti asmenines apsaugos priemones 400 . Be to, įranga turi būti kruopščiai nuplaunama, kad nepakeistų paciento odos ar gleivinės spalvos.

2004 m. balandžio mėn. OPA gamintojas išplatino naudotojams informaciją apie pacientus, kuriems, kaip pranešama, pasireiškė į anafilaksiją panaši reakcija po cistoskopijos, kai aptaisas buvo apdorotas naudojant OPA. Iš maždaug 1 milijono urologinių procedūrų, atliktų naudojant OPA pakartotinai apdorotus instrumentus, 24 atvejai (17 atvejų Jungtinėse Valstijose, šeši Japonijoje, vienas Jungtinėje Karalystėje) buvo pranešta apie anafilaksiją panašių reakcijų po pakartotinės cistoskopijos (paprastai po keturių iki devynių). gydymas). Prevencinės priemonės apima OPA likučių pašalinimą kruopščiai nuplaunant ir nenaudojant OPA pakartotiniam urologinių prietaisų, naudojamų gydant pacientus, sergančius šlapimo pūslės vėžiu, perdirbimui (Nevine Erian, asmeninis pranešimas, 2004 m. birželio 4 d. Pranešimas apie produktą, Pažangūs sterilizavimo produktai, 2004 m. balandžio 23 d. ) 709 .

Yra keletas OPA klinikinių tyrimų. Klinikinio naudojimo tyrime OPA ekspozicija 100 endoskopų 5 minutes lėmė >5 log10 bakterijų kiekio sumažėjimas. Be to, OPA buvo veiksmingas per 14 dienų naudojimo ciklą 100 . Gamintojo duomenys rodo, kad OPA ilgiau tarnaus automatiniame endoskopo perdirbime, kol pasieks MEC ribą (MEC po 82 ciklų), nei glutaraldehidas (MEC po 40 ciklų) 400 . Aukšto slėgio skysčių chromatografija patvirtino, kad OPA lygis viršija 0,3 % mažiausiai 50 ciklų 706, 710 . OPA turi būti sunaikinta laikantis vietinių ir valstybinių taisyklių. Jei OPA šalinimas per sanitarinę kanalizacijos sistemą yra ribojamas, glicinas (25 gramai/galonas) gali būti naudojamas OPA neutralizavimui ir saugiam šalinimui.

Aukšto lygio dezinfekavimo priemonių etiketės teiginiai apie OPA tirpalą esant 20°C temperatūrai skiriasi visame pasaulyje (pvz., 5 minutės Europoje, Azijoje ir Lotynų Amerikoje, 10 minučių Kanadoje ir Australijoje ir 12 minučių Jungtinėse Amerikos Valstijose). Šios etiketės teiginiai visame pasaulyje skiriasi dėl bandymų metodikos ir licencijavimo reikalavimų skirtumų. Automatizuotame endoskopo perdirbimo įrenginyje, turinčiame FDA patvirtintą galimybę palaikyti 25°C tirpalo temperatūrą, OPA kontakto laikas yra 5 minutės.

Peracto rūgštis

Apžvalga.

Peracto, arba peroksiacto, rūgštis pasižymi greitu poveikiu prieš visus mikroorganizmus. Ypatingi peracto rūgšties pranašumai yra tai, kad joje nėra kenksmingų skilimo produktų (pvz., acto rūgšties, vandens, deguonies, vandenilio peroksido), ji pagerina organinių medžiagų pašalinimą 711 ir nepalieka likučių. Jis išlieka veiksmingas esant organinėms medžiagoms ir yra sporicidinis net žemoje temperatūroje (4 ir 5 lentelės). Peracto rūgštis gali korozuoti varį, žalvarį, bronzą, paprastą plieną ir cinkuotą geležį, tačiau šį poveikį galima sumažinti naudojant priedus ir keičiant pH.Jis laikomas nestabiliu, ypač kai atskiestas, pavyzdžiui, 1% tirpalas per 6 dienas hidrolizės metu praranda pusę savo stiprumo, o 40% peracto rūgštis netenka 1% ir 2% veikliųjų medžiagų per mėnesį654.

Veikimo.

Mažai žinoma apie peracto rūgšties veikimo mechanizmą, tačiau manoma, kad ji veikia panašiai kaip ir kitos oksiduojančios medžiagos, ty denatūruoja baltymus, sutrikdo ląstelės sienelės pralaidumą ir oksiduoja sulfhidrilo ir sieros ryšius baltymuose, fermentuose ir kituose metabolituose 654 .

Mikrobicidinis aktyvumas.

Peracto rūgštis inaktyvuos gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, grybus ir mieles per &le5 minutes, esant <100 ppm. Esant organinėms medžiagoms, reikia 200&ndash500 ppm. Virusų dozavimo diapazonas yra platus (12 ir ndash 2250 ppm), o mielių ekstrakte poliomielito virusas inaktyvuojamas per 15 minučių ir 1500 ir ndash 2250 ppm. Viename tyrime 3,5 % peracto rūgšties buvo neveiksmingos prieš HAV po 1 minutės poveikio, naudojant nešiklio testą58. Peracto rūgštis (0,26%) buvo veiksminga (log10 redukcijos faktorius >5) prieš visas tiriamas mikobakterijų padermes (M. tuberculosis, M. avium-intracellulare, M. chelonae ir M. fortuitum) per 20&ndash30 minučių, kai yra arba nėra organinės apkrovos 607, 712 . Naudojant sporų suspensijos testą 654, 659, 713-715, naudojant bakterijų sporas, 500 ir ndash10 000 ppm (0,05 % ir ndash1 %) sporas inaktyvuoja per 15 sekundžių iki 30 minučių.

Jungtinėse Amerikos Valstijose naudojamas automatinis aparatas, peracto rūgštis naudojantys medicininiams (pvz., endoskopams, artroskopams), chirurginiams ir odontologijos instrumentams chemiškai sterilizuoti 716-718. Kaip minėta anksčiau, dantų antgalius reikia sterilizuoti garais. Steriliklis, 35 % peracto rūgštis, praskiedžiamas iki 0,2 % filtruotu vandeniu 50°C temperatūroje. Imituoto naudojimo bandymai parodė puikų mikrobicidinį aktyvumą 111, 718-722, o trys klinikiniai tyrimai parodė puikų mikrobų naikinimą ir jokių klinikinių nesėkmių, dėl kurių kilo infekcija 90, 723, 724. Didelis sistemos efektyvumas buvo įrodytas palyginus sistemos efektyvumą su etileno oksidu. Tik peracto rūgšties sistema visiškai nužudė 6 log10 apie M. chelonae, E. faecalis, ir B. atrophaeus sporos su organiniu ir neorganiniu poveikiu 722 . Tyrimas, kuriame palygintos urologinės endoskopinės įrangos, apdorotos aukšto lygio dezinfekcija (su glutaraldehidu), sąnaudos, našumas ir priežiūra su peracto rūgšties sistema, neparodė klinikinių skirtumų tarp dviejų sistemų. Tačiau naudojant šią sistemą kilo didesnės išlaidos nei atliekant aukšto lygio dezinfekciją, įskaitant apdorojimo (6,11 USD ir 0,45 USD už ciklą), pirkimo ir mokymo (24 845 USD, palyginti su 16 USD), įrengimo (5 800 USD prieš ) ir išlaidas. endoskopo remontas (6 037 USD prieš 445 USD) 90 . Be to, trys infekcijos klasteriai, naudojant peracto rūgšties automatinį endoskopo perdirbėją, buvo susieti su netinkamai apdorotais bronchoskopais, kai su sistema buvo naudojamos netinkamos kanalų jungtys725. Šiose grupėse pabrėžiama mokymo, tinkamų tam tikro modelio endoskopo jungčių sistemų ir kokybės kontrolės procedūrų svarba, siekiant užtikrinti, kad būtų laikomasi endoskopo gamintojo rekomendacijų ir profesinės organizacijos gairių. Jungtinėje Karalystėje siūlomoje alternatyvioje aukšto lygio dezinfekavimo priemonėje yra 0,35 % peracto rūgšties. Nors šis produktas greitai veikia prieš daugybę mikroorganizmų 466, 726, 727, jis sutepa endoskopų metalą ir yra nestabilus, todėl jo naudojimo laikas yra tik 24 valandos 727 .

Peracto rūgštis ir vandenilio peroksidas

Apžvalga.

Galimi du cheminiai sterilizatoriai, kurių sudėtyje yra peracto rūgšties ir vandenilio peroksido (t. y. 0,08 % peracto rūgšties ir 1,0 % vandenilio peroksido [neprekiaujama] ir 0,23 % peracto rūgšties ir 7,35 % vandenilio peroksido (4 ir 5 lentelės).

Mikrobicidinis aktyvumas.

Peracto rūgšties ir vandenilio peroksido baktericidinės savybės buvo įrodytos 728 . Gamintojo duomenys parodė, kad šis peracto rūgšties ir vandenilio peroksido derinys per 20 minučių inaktyvavo visus mikroorganizmus, išskyrus bakterijų sporas. 0,08 % peracto rūgšties ir 1,0 % vandenilio peroksido produktas veiksmingai inaktyvavo glutaraldehidui atsparias mikobakterijas 729 .

Peracto rūgšties ir vandenilio peroksido derinys buvo naudojamas hemodializatorių dezinfekavimui 730 . Dializės centrų, naudojančių peracto rūgšties ir vandenilio peroksido pagrindu pagamintą dezinfekavimo priemonę dializatoriams perdirbti, procentas padidėjo nuo 5 % 1983 m. iki 56 % 1997 m. 249 . „Olympus America“ neremia 0,08% peracto rūgšties ir 1,0% vandenilio peroksido naudojimo (Olympus America, asmeninis pranešimas, 1998 m. balandžio 15 d.) jokiame Olympus endoskope dėl kosmetinės ir funkcinės žalos ir neprisiima atsakomybės už cheminę žalą, atsiradusią naudojant Šis produktas. Šio produkto šiuo metu nėra. FDA išvalė naujesnį cheminį sterilizatorių, kuriame yra 0,23 % peracto rūgšties ir 7,35 % vandenilio peroksido (4 ir 5 lentelės). Išbandžius 7,35 % vandenilio peroksido ir 0,23 % peracto rūgšties produktą, Olympus America padarė išvadą, kad jis nesuderinamas su bendrovės lanksčiais virškinimo trakto endoskopais, ši išvada buvo pagrįsta panardinimo tyrimais, kai mėgintuvėliai sugedo dėl juodo polimero išsipūtimo ir atsipalaidavimo. vamzdžio sluoksnis (Olympus America, asmeninis bendravimas, 2000 m. rugsėjo 13 d.).

Fenoliai

Apžvalga.

Fenolis užėmė svarbią vietą ligoninių dezinfekcijos srityje nuo tada, kai Lister savo novatorišką darbą antiseptinės chirurgijos srityje panaudojo kaip baktericidinį preparatą. Tačiau per pastaruosius 30 metų daugiausia dėmesio buvo skiriama daugeliui fenolio darinių arba fenolių ir jų antimikrobinių savybių. Fenolio dariniai atsiranda, kai funkcinė grupė (pvz., alkilas, fenilas, benzilas, halogenas) pakeičia vieną iš vandenilio atomų aromatiniame žiede. Du fenolio dariniai, dažniausiai randami kaip ligoninių dezinfekavimo priemonių sudedamosios dalys orto- fenilfenolis ir orto-benzilas-para-chlorfenolis. Šių junginių ir daugelio kitų fenolio darinių antimikrobinės savybės yra daug geresnės, palyginti su pirminės cheminės medžiagos savybėmis. Fenolius sugeria akytos medžiagos, o dezinfekavimo priemonės likučiai gali sudirginti audinius. 1970 m. buvo pranešta, kad odos depigmentaciją sukėlė fenolio baktericidiniai plovikliai, kurių sudėtyje yra para-tretinio butilfenolio ir para- tretinis amilfenolis 731 .

Veikimo.

Didelėse koncentracijose fenolis veikia kaip grubus protoplazminis nuodas, prasiskverbiantis ir suardantis ląstelės sienelę bei nusodinantis ląstelės baltymus. Mažos fenolio koncentracijos ir didesnės molekulinės masės fenolio dariniai sukelia bakterijų mirtį, nes inaktyvuojamos esminės fermentų sistemos ir iš ląstelės sienelės nutekėja esminiai metabolitai732.

Mikrobicidinis aktyvumas.

Paskelbtos ataskaitos apie dažniausiai naudojamų fenolių antimikrobinį veiksmingumą parodė, kad jie yra baktericidiniai, fungicidiniai, virucidiniai ir tuberkuliocidiniai 14, 61, 71, 73, 227, 416, 573, 732-738. Vienas tyrimas parodė nedidelį fenolio poveikį arba jo visai neveikia koksakių B4, echoviruso 11 ir poliomielito viruso 1 736 atveju. Panašiai 12 proc. orto-fenilfenolis nesugebėjo inaktyvuoti nė vieno iš trijų hidrofilinių virusų po 10 minučių poveikio, nors 5 % fenolio buvo mirtina šiems virusams 72 . 0,5 % fenolio skiedimas (2,8 % orto-fenilfenolio ir 2,7 proc. orto-benzilas-para-chlorfenolis) inaktyvavo ŽIV 227 ir 2 % fenolio tirpalas (15 % ortofenilfenolio ir 6,3 % para-tretinio amilfenolio) inaktyvavo visus, išskyrus vieną, iš 11 tirtų grybų71.

Gamintojų ir standartizuotus AOAC metodus naudojantys duomenys rodo, kad komerciniai fenoliai nėra sporicidiniai, bet yra tuberkuliocidiniai, fungicidiniai, virucidiniai ir baktericidiniai, kai rekomenduojama naudoti – praskiedus. Bandymai pagrįsti fenolių baktericidinius teiginius, naudojant AOAC naudojimo praskiedimo metodą, kartais nepavykdavo 416, 737. Tačiau tų pačių tyrimų rezultatai labai skyrėsi identiškus produktus bandančiose laboratorijose.

Daugelis fenolinių germicidų yra EPA registruoti kaip dezinfekavimo priemonės, skirtos naudoti ant aplinkos paviršių (pvz., naktinių stalelių, aptvarų ir laboratorinių paviršių) ir nekritinių medicinos prietaisų. Fenoliai nėra FDA patvirtinti kaip aukšto lygio dezinfekavimo priemonės, skirtos naudoti su pusiau kritiniais daiktais, tačiau gali būti naudojami iš anksto išvalyti arba nukenksminti svarbiausius ir pusiau kritinius prietaisus prieš galutinį sterilizavimą arba aukšto lygio dezinfekciją.

Fenolių naudojimas darželiuose buvo suabejotas dėl hiperbilirubinemijos kūdikiams, dedantiems į lovelius, kuriuose buvo naudojami fenoliniai plovikliai739. Be to, buvo pranešta, kad bilirubino kiekis kūdikiams, kurie buvo paveikti fenolio, padidėja, palyginti su ne fenolio paveiktais kūdikiais, kai fenolis buvo paruoštas pagal gamintojų rekomenduojamą praskiedimą 740 . Jei darželio grindims valyti naudojami fenoliai, juos reikia skiesti taip, kaip rekomenduojama gaminio etiketėje. Fenolių (ir kitų dezinfekavimo priemonių) negalima naudoti valant kūdikių lovelius ir inkubatorius, kai jie yra užimti. Jei kūdikių loveliams ir inkubatoriams galutinai išvalyti naudojami fenoliai, paviršiai turi būti kruopščiai nuplauti vandeniu ir išdžiovinti prieš pakartotinai naudojant kūdikių lovelius ir inkubatorius 17 .

Kvarteriniai amonio junginiai

Apžvalga.

Ketvirtiniai amonio junginiai plačiai naudojami kaip dezinfekavimo priemonės. Buvo pranešta apie su sveikatos priežiūra ir kitomis susijusiomis infekcijomis, kurias sukėlė užteršti ketvirtiniai amonio junginiai, naudojami pacientų priežiūros reikmenims ar įrangai, pvz., cistoskopams ar širdies kateteriams, dezinfekuoti 741, 742. Ketvirčiai yra geros valymo priemonės, tačiau dėl didelio vandens kietumo 743 ir medžiagų, tokių kaip vatos ir marlės pagalvėlės, jos gali būti mažiau mikrobicidinės dėl netirpių nuosėdų arba atitinkamai vatos ir marlės pagalvėlės sugeria veikliąsias medžiagas. Vienas tyrimas parodė reikšmingą nuosmukį (

40 % & ndash 50 % mažesnė po 1 valandos) ketvirčių, išsiskiriančių naudojant medvilninius skudurus arba celiuliozės pagrindu pagamintus valytuvus atviro kibiro sistemoje, koncentracija, palyginti su neaustiniais raištelių valytuvais uždaro kibiro sistemoje. 744 Kaip ir daugelyje kitų dezinfekavimo priemonių (pvz., fenolių, jodoforų), gramneigiamos bakterijos gali išgyventi arba augti jose 404 .

Chemiškai ketvirčiai yra organiškai pakeisti amonio junginiai, kuriuose azoto atomo valentingumas yra 5, keturi pakaitų radikalai (R1-R4) yra tam tikro dydžio arba grandinės ilgio alkilo arba heterocikliniai radikalai, o penktasis (X &#) 8209) yra halogenidas, sulfatas arba panašus radikalas745. Kiekvienas junginys pasižymi savo antimikrobinėmis savybėmis, todėl reikia ieškoti vieno junginio, pasižyminčio išskirtinėmis antimikrobinėmis savybėmis. Kai kurie sveikatos priežiūroje naudojamų ketvirtinių amonio junginių cheminiai pavadinimai yra alkildimetilbenzilamonio chloridas, alkildidecildimetilamonio chloridas ir dialkildimetilamonio chloridas. Naujesni ketvirtiniai amonio junginiai (t. y. ketvirtos kartos), vadinami dvigubos grandinės arba dialkilo ketvirtiniais (pvz., didecildimetilamonio bromidas ir dioktildimetilamonio bromidas), tariamai išlieka aktyvūs kietame vandenyje ir yra tolerantiški anijoniniams likučiams 746 .

Kai kuriuose pranešimuose užfiksuota profesinė astma dėl benzalkonio chlorido poveikio 747 .

Veikimo.

Baktericidinis keturkampių veikimas buvo siejamas su energiją gaminančių fermentų inaktyvavimu, esminių ląstelių baltymų denatūravimu ir ląstelės membranos sutrikimu746. Yra įrodymų, patvirtinančių šias ir kitas galimybes 745 748 .

Mikrobicidinis aktyvumas.

Gamintojų ir rsquo duomenų lapų bei paskelbtos mokslinės literatūros rezultatai rodo, kad ketvirtinės, parduodamos kaip ligoninių dezinfekavimo priemonės, paprastai yra fungicidinės, baktericidinės ir virucidinės prieš lipofilinius (apvalkalus) virusus. 54-56, 58, 59, 61, 71, 73, 186, 297, 748, 749 . Įrodyta, kad ketvirtinių amonio junginių mikobaktericidinis aktyvumas yra silpnas55, 73. Ketvirtiniai amonio junginiai (taip pat 70 % izopropilo alkoholio, fenolio ir chloro turinčios servetėlės ​​[80 ppm]) efektyviai (>95 %) pašalina ir (arba) inaktyvuoja teršalus (t. y. atsparus daugeliui vaistų). S. aureus, atsparus vankomicinui Entercoccus, P. aeruginosa) iš kompiuterių klaviatūrų su 5 sekundžių taikymo laiku. Po 300 dezinfekavimo priemonių panaudojimo kompiuterių klaviatūrose nebuvo jokių funkcinių pažeidimų ar kosmetinių pakitimų 45 .

Bandymai atkurti gamintojų pateiktus teiginius apie baktericidinį ir tuberkuliocidinį poveikį, naudojant AOAC testus su ribotu ketvirtinių amonio junginių skaičiumi, retkarčiais buvo nesėkmingi 73, 416, 737. Tačiau bandymų rezultatai labai skyrėsi laboratorijose, tiriančiose identiškus produktus 416, 737.


Diskusija

Toliau aptariame svarbius svarstymus ir rekomendacijas N2O greičio matavimai naudojant 15 N-tracer inkubacijų, įskaitant duomenų ataskaitų teikimą ir archyvavimą.

Anoksinių sąlygų palaikymas prieš inkubaciją ir inkubacijos metu

Atsargumo priemonės būtinos 15 N inkubacijos metu be oksidacijos vandenyse, kad būtų galima nustatyti N2O gamyba ar vartojimas į N2. Viena susirūpinimą keliančių sričių yra O2 užteršimas oru imant mėginius iš Niskin butelių, dėl kurio, kaip pranešta, padidėja ištirpusio O2 net 1 μM (De Brabandere ir kt., 2012). Jei įmanoma, „Niskin“ buteliuke sukurtą viršutinę dalį geriau pakeisti CO2 arba N2 o vanduo pašalinamas, o ne tiesiog leidžiamas oro invazija. Taip pat rekomenduojama, kur įmanoma, vengti plastikinių ir guminių komponentų, pvz., O2 gali pasklisti per šias medžiagas arba iš jų (pvz., De Brabandere ir kt., 2012), o kamščiai turi būti deguonies ir prieš inkubaciją laikomi anaerobinėje kameroje arba He atmosferoje (žr. skyrių “Skamščiai”).

Vandens surinkimo sistemos skiriasi deguonies užterštumo laipsniu. Siurblio profiliavimo sistema (PPS) leidžia imti mėginius tiesiai iš vandens stulpelio, o tai sumažina O2 užterštumas imant mėginius (pvz., Padilla ir kt., 2016). Imant mėginius iš „Niskin“ butelių, mėginys yra užterštas deguonimi (De Brabandere ir kt., 2012), todėl dauguma tyrimų grupių paprastai pravalo su He, kad pašalintų O.2 inkubaciniuose buteliuose (pvz., Holtappels ir kt., 2011 Kalvelage ir kt., 2013 Frey ir kt., 2020 Sun ir kt., 2020). Skystos fazės išvalymas He prieš inkubaciją pakeičia aplinkos sąlygas ir pašalina dujas, pvz., N.2O, CH4, ir H2S, kurios yra glaudžiai susijusios su N ciklu. Todėl, pasikeitus eksperimentinėms sąlygoms, gaunami galimi rodikliai, kaip paprastai būna tokio tipo inkubacijos atveju. Jei pageidaujama, šie substratai turi būti pridedami atgal po išvalymo. Viršutinės erdvės sukūrimas taip pat gali padėti nupiešti ištirpusį O2 į viršutinę erdvę, o labiau tirpus N2O lieka ištirpęs vandens mėginyje. Neinvazinis stebėjimas O2 koncentraciją inkubaciniame butelyje primygtinai rekomenduojama (žr. skyrių “Iinkubacija”).

Butelių tipai

15 N denitrifikacijos inkubacijai buvo naudojami įvairūs butelių tipai ir dydžiai, įskaitant, pavyzdžiui, 1 arba 0,5 l gintaro spalvos stiklo butelius su tefloniniais kamščiais, kuriuose yra dviejų ilgių 1/8″ tygon vamzdeliai su vožtuvais (Devol ir kt., 2006 m. Bourbonnais ir kt., 2012), 500 ml maišelius (Ward ir kt., 2009 Bourbonnais ir kt., 2012) arba 12 ml ekstainerius (Holtappels ir kt., 2011 Bourbonnais ir kt., 2012). Tedlar ® maišelius paprastai sunku užpildyti, nes nesusidaro burbuliukai, o vožtuvai paprastai nėra visiškai sandarūs. Taigi, inkubuoti maišeliuose nerekomenduojama. N matuoti rekomenduojami didesni serumo buteliukai (mažiausiai 60 ml) su butilo gumos kamščiais2O gamybos tempai kaip N2O pagaminto nedidelio tūrio ekstaineriuose gali nepakakti, kad jį būtų galima aptikti naudojant IRMS, jei rodikliai yra maži.

Kamščiai

Niemann ir kt. (2015) nustatė, kad stori juodi, nehalogenintos butilo gumos kamščiai išplauna didelius kiekius įvairių organinių junginių, turinčių toksinį poveikį aerobinių metano oksidacijos inkubacijų metu. Išbandytas pilkas bromo ir chlorobutilo kamščio tipas neatrodė, kad išplautų organinių medžiagų. Todėl rekomenduojame naudoti šių tipų kamščius, tačiau atlikti papildomus bandymus, tiriančius galimą toksinį šių kamščių poveikį N.2O gamyba ir vartojimas Reikia 15 N žymėtų inkubacijų. Prieš anoksinį arba žemą O2 Inkubacijos metu ekstainerio dangteliai turi būti laikomi He atmosferoje, kad būtų pašalintas O2. Pilkus butilo gumos kamštelius, skirtus serumo stikliniams buteliukams, reikia virti maždaug 5 minutes išvalytame (pvz., Milli-Q) vandenyje ir laikyti He atmosferoje, kad būtų pašalintas O.2 (De Brabandere ir kt., 2012).

15 N-Tracer priedas

Idealiu atveju galutinė pridėto atsekamosios medžiagos koncentracija turėtų būti kuo artimesnė aplinkos koncentracijai. Tačiau tai sunku pasiekti deguonies vandens kolonėlės mėginiams, kuriuose yra ištirpusio NH4 + ir NE2 – paprastai labai nesikaupia. Inkubuojant denitrifikaciją, pridedama bent 5� μM 15 N-NO2 – arba 15 N-NO3 Naudoti – atsekamieji elementai [pvz., Devol ir kt. (2006) Bourbonnais ir kt. (2012)], siekiant nustatyti žymėto N gamybą2O arba N2 produktai, kai kainos yra žemos. Todėl atsekamųjų medžiagų paprastai pridedama, kai koncentracija yra 10� % aplinkos koncentracijos, todėl tiriamos galimos normos. Galutinė atsekamosios medžiagos koncentracija paprastai yra 0,5𠄵 μM 15 N-NH4 + arba 15 N-NO2 – vandens stulpelių mėginiams iš oligotrofinių vandenų (žr. Ji et al., 2015 Frame et al., 2017).

Fiksatoriaus pasirinkimas

Nors vis dar trūksta išsamaus skirtingų fiksatorių palyginimo, HgCl naudojimas2 patariama. Ostrom ir kt. (2016) parodė, kad ZnCl2 arba HgCl2 veikia kaip abiotinio N katalizatorius2O gamyba iš Fe 2+ oksidacijos, sujungtos su NO2 – sumažinimas anoksinėje aplinkoje, kur Fe 2+ koncentracija yra gana didelė (Antarktidos ežeras, nuosėdų porų vandenys). Tai neturėtų kelti susirūpinimo vandens kolonėlės mėginiams, nes Fe 2+ ir NO2 – koncentracijos paprastai yra per mažos, kad šis abiotinis procesas būtų reikšmingas. Tačiau tuo pat metu vis labiau suprantama, kaip antropogeninė veikla veikia gyvsidabrio ciklą, ir dedamos pastangos sumažinti išmetamų teršalų kiekį. 2017 m. per Minamatos konvenciją Europa sutiko sumažinti Hg, įskaitant HgCl, vartojimą.2. Nuo to laiko Švedija HgCl uždraudė2 seka iš mokslinių tyrimų laivų ir kitų Europos šalių. Reikia skubiai rasti gerų alternatyvų.

Duomenų ataskaitų teikimas ir archyvavimas

Rekomenduojame pateikti visus susijusius metaduomenis ir duomenis į atviro kodo viešųjų duomenų saugyklą, pvz., Pangea 3 , Biologinės ir cheminės okeanografijos duomenų valdymo biurą (BCO-DMO 4 ) arba visos Europos vandenynų ir jūrų duomenų valdymo infrastruktūrą (SeaDataNet 5). ). Į metaduomenis turėtų būti įtraukta mėginių ėmimo data, stoties ir GPS vietos vieta, gylis (m), 15 N apdorojimas, pridėtas 15 N žymeklio kiekis, butelis ir viršutinės erdvės tūris (jei taikoma), ar mėginys buvo išvalytas, ar ne, ir dujos, naudojamos valymui skystoji fazė, inkubacijos laikas, naudojamas konservantas, taip pat savo vietoje temperatūra, deguonis ir maistinės medžiagos (NO3 –, NR2 – ir NH4 + ) koncentracijos. δ 15 N (palyginti su oru) ir δ 18 O (prieš VSMOW), taip pat apskaičiuoti [ 44 N2O], [ 45 N2O] ir [46 N2O] (nmol N2O L 𠄱 arba nmol N L 𠄱 ) (žr. skyrių “Rate skaičiavimai”) taip pat turėtų būti nurodyta kiekvienam laiko taškui. N2O gamybos ir vartojimo normos gali būti nurodytos nmol-N2O (arba N) L 𠄱 d 𠄱 arba nmol N2O (arba N) kg 𠄱 d 𠄱, jei vienetai yra nuoseklūs ir aiškiai nurodyti. Įprasti žodynai turėtų būti naudojami visose metaduomenų bazėse ir duomenų formatuose, vadovaujantis Britanijos okeanografijos duomenų centro (BODC) Nacionalinės aplinkos tyrimų tarybos (NERC) žodyno serveriu (NVS2.0) nustatytomis gairėmis. Pavyzdžiui, šie terminai buvo pateikti NERC žodyno serveriui (NVS2.0), siekiant palengvinti duomenų archyvavimą ir paiešką ateityje.

N2OPR = azoto oksido gamyba [N2O CAS 10024-97-2] per dieną vienam eksperimentinio vandens mėginio tūrio vienetui pridedant 15 N [ 15 N CAS 14390-96-6, CAS 68378-96-1 ir CAS 31432-46-9] izotopais pažymėto žymeklio , inkubavimas ir išvalymas bei gaudyklių matavimas GC-IRMS.

N2OCON = azoto oksido suvartojimas [N2O CAS 10024-97-2] per dieną vienam eksperimentinio vandens mėginio tūrio vienetui naudojant 15 N [ 15 N CAS 10024-97-2] izotopu pažymėtą atsekamosios medžiagos pridėjimą, inkubavimą ir išvalymą bei gaudyklių matavimą GC-IRMS.

Metaduomenyse taip pat turėtų būti paminėti visi galimi papildomi duomenų rinkiniai (pvz., mikrobiologinės sekos).


Kaip nepritraukti būtybių

  • Idealiu atveju stovėkite toliau nuo vietų, kuriose, kaip žinoma, pritraukia graužikai, pvz., prie šiukšliadėžių ar natūralių maisto šaltinių, pvz., daržovių sodų.
  • Jei įmanoma, stovėkite uždarame garaže ir laikykite duris uždarytas.
  • Įsitikinkite, kad garaže nėra laikomo maisto ir pagrindinių lizdų medžiagų, tokių kaip laikraščiai, kartonas, šiaudai, skudurai ir lauko baldų pagalvėlės.
  • Ieškokite tarpų aplink garažo langus ir duris, kur gali patekti graužikai. Oro juostos po šoninėmis durimis gali padėti jas užsandarinti. Taip pat patikrinkite, ar nepažeistos ištraukiamų garažo durų vertikalios tarpinės.
  • Nelaikykite garaže šiukšliadėžių, naudojamų maisto atliekoms.
  • Saugokite, kad automobilio salonas nebūtų maisto vyniotinių, jų kvapas gali pritraukti graužikus.
  • Reguliariai važiuokite automobiliu, atgrasydami varmintus apsigyventi. Ir retkarčiais prieš užvesdami automobilį pagirkite garsinį signalą, kad atbaidytumėte snaudžiančius gyvūnus.

10 geriausių kvėpavimo eksperimentų | Augalai

Kūginė kolba, išlenktas vamzdelis, dygstančios sėklos, šarminis kalis nedideliame inde, gyvsidabrio indelis.

Dygstančios sėklos surenkamos į kūginę kolbą, į kurią taip pat įdedamas indas su kalio rūgštimi. Šios kūginės kolbos anga uždaroma viena skylute kamščiu, pro kurį įkišamas du kartus stačiu kampu išlenktas stiklinis vamzdelis. Tolimasis šio vamzdelio galas įdedamas į gyvsidabrio indą. Dabar šis aparatas kurį laiką netrukdomas.

Gyvsidabris tolimajame išlenkto stiklo vamzdžio gale pakyla iki 15 cm aukščio.

Dygstančios sėklos patiria aerobinį kvėpavimą, nes jos naudoja kūginėje kolboje esantį deguonį. Kadangi dygstančios sėklos sunaudoja visą deguonį, slėgis kolbos viduje sumažėja. Taigi gyvsidabrio lygis pakyla tolimajame sulenkto stiklo vamzdžio gale.

Stikliniame vamzdyje šis lygis siekia tik 15 cm aukštį. Kadangi šis lygis yra maždaug penktadalis oro. Kadangi deguonis sudaro penktadalį visos sudėties, galima daryti išvadą, kad sėklos panaudojo šias oro dujas kvėpuodamos.

2. Eksperimentas, skirtas parodyti, kad energija yra šilumos gamyba kvėpavimo metu:

Termoso buteliukas (2), kamštiena, termometras (2), 50 dygstančių sėklų, 50 sausų sėklų.

1. Paimkite du termoso buteliukus su viena skylute kamščiu.

2. Į vieną termosą įpilkite apie 50 dygstančių sėklų, o į kitą – apie 50 sausų sėklų.

3. Pro kamščio angą įkiškite termometrą į kiekvieną termosą taip, kad jo lemputė būtų įdubusi sėklose (47 pav.).

4. Pasižymėkite pradinę temperatūrą termometre ir palaikykite tokias kelias valandas. Atkreipkite dėmesį į galutinę temperatūrą.

Temperatūra nesikeičia termometre, įdėtame į sausas sėklas, o temperatūra pakyla kitame termometre, kuris yra įtaisytas termose su dygstančiomis sėklomis.

Sausų sėklų atveju termometro rodmenys nesikeičia, nes jos nekvėpuoja. Tačiau ryškus temperatūros kilimas dygstant sėkloms akivaizdžiai atsiranda dėl šilumos energijos išlaisvinimo iš kvėpavimo substrato, ty dygstančių sėklų.

3. Eksperimentas aerobiniam kvėpavimui įrodyti:

Keletas dygstančių sėklų ar žiedpumpurių dedamos į kolbą su kamščiu prie burnos. Reikia pasirūpinti, kad nuo žiedpumpurių būtų pašalintos visos žalios dalys, priešingu atveju CO2, išlaisvintas bus iš karto panaudotas fotosintezei.

Per kamštį įkišamas stiklinis vamzdelis. Dabar į kolbą įpilama viena ar dvi kaustinės kalio lazdelės. Kad žiedpumpuriai ir kaustinės kalio lazdelės būtų vietoje, uždedami du vatos kamšteliai. Kolba su vamzdeliu apverčiama virš gyvsidabrio lovelio, taip nutraukiant ryšį su išoriniu oru. Jis tvirtinamas spaustuku ir stovu.

Po kelių valandų pastebima, kad gyvsidabris pakilo vamzdelyje ir apima beveik penktadalį viso tūrio. Pakilusio gyvsidabrio tūris gali būti didžiausias penktadalis viso kolbos tūrio,2 atmosferoje yra tik apie 20 proc.

Taip yra dėl to, kad anglies dioksidas, išsiskiriantis kvėpuojant, buvo absorbuojamas kaustinės kalio rūgšties, skatinančios dalinį vakuumą. Kolboje esantis deguonis buvo panaudotas kvėpavimui. Dujos, kurios lieka kolboje, yra azotas.

Žinome, kad beveik penktadalis oro tūrio yra deguonis. Taigi šis eksperimentas, be deguonies suvartojimo ir anglies dioksido išsiskyrimo, taip pat įrodė, kad paimto deguonies tūris yra beveik lygus išskiriamo anglies dioksido kiekiui.

4. Eksperimentas anaerobiniam kvėpavimui įrodyti:

Dygstančios sėklos, mėgintuvėlis, gyvsidabris, KOH kristalai, Petri lėkštelė ir kt.

Gyvsidabris pilamas į mėgintuvėlį iki apvado. Paimkite gyvsidabrio pilną Petri lėkštelę ir nykščiu padėkite gyvsidabriu užpildytą mėgintuvėlį apverstą. Nykštis pašalinamas Petri lėkštelės viduje. Dabar į mėgintuvėlį su žnyplėmis įdėkite keletą sėklų (dygstančių arba pamirkytų). Leiskite šiam aparatui kurį laiką pabūti.

Po kurio laiko gyvsidabrio lygis mėgintuvėlyje sumažėja. Dabar į aukščiau pateiktą mėgintuvėlį įdėkite keletą KOH kristalų. Po kurio laiko gyvsidabrio lygis pakils iki buvusios padėties.

Gyvsidabrio lygio sumažėjimas mėgintuvėlyje rodo, kad dygstant sėkloms išsiskyrė šiek tiek dujų. Tik CO2 dujas gali sugerti KOH kristalai. Matome, kad įvedus KOH kristalus, gyvsidabrio lygis pakyla, todėl sėklos išskiria CO.2 anaerobinėmis sąlygomis.

5. Eksperimentas, rodantis anglies dioksido susidarymą aerobinio kvėpavimo metu:

Butelis, dygstančios sėklos, kamštis, kamštis, stiklinis vamzdelis, vanduo, plačiakankis vamzdelis su čiaupu, kalkių vanduo.

1. Paimkite plataus burnos buteliuką ir įdėkite į jį keletą dygstančių sėklų.

2. Uždarykite buteliuko angą dviejų skylučių kamščiu.

3. Įkiškite du kartus stačiu kampu sulenktą stiklinį vamzdelį per vieną iš kamštienos angų, o per kitą angą įkiškite plačiadantį vamzdelį, kuris veikia kaip vandens rezervuaras ir su čiaupu.

4. Kitą sulenkto stiklinio vamzdelio galą panardinkite į stiklinėje esantį vandenį (43 pav.).

5. Palaikykite eksperimentą keletą valandų, kad sėklos galėtų kvėpuoti.

6. Dabar pakeiskite vandens pripildytą stiklinę su kalkėmis užpildyta stikline ir atidarykite vandens rezervuaro čiaupą, kad vanduo patektų į butelį su sėklomis.

Po kurio laiko išeina oro burbuliukai ir kalkių vanduo tampa pieniškas.

Kalkių vanduo tampa pieniškas dėl anglies dioksido, išsiskiriančio dygstant sėkloms. Kai vanduo pilamas atidarius vandens rezervuaro čiaupą, jis išstumia orą per išlenktą vamzdelį, o orui praeinant per kalkių vandenį pastarasis tampa pieniškas dėl to, kad ore yra anglies dioksido.

6. Eksperimentas to retortinės metodu pademonstruokite augalų kvėpavimą:

i. Kad išdžiūtų sėklos, kad nekvėpuotų

ii. Kad kvėpuodamas O2 absorbuojamas yra lygus CO2 paleistas ir

iii. Kad CO2 susidaro kvėpuojant.

Retortos (3), stiklinės (3), stovai (3), mirkytos sėklos, sausos sėklos, druskos tirpalas, kalio kalio tirpalas.

1. Paimkite tris retortas ir sujunkite jas atskirai trimis atskirais stovais.

2. Į vienos retortos svogūnėlį įberkite sausų sėklų ir pamerkite jos vamzdelį į stiklinę, užpildytą kaustinės kalio tirpalu (45 pav.).

3. Į antrosios retortos svogūnėlį įberkite išmirkytų sėklų ir pamerkite jos vamzdelį į stiklinę su druskos tirpalu.

4. Į trečiosios retortos kolbą taip pat įberkite išmirkytas sėklas ir pamerkite jos vamzdelį į stiklinę, kurioje yra kausto kalio tirpalo.

5. Palaikykite aparatą keletą valandų ir stebėkite.

Pirmoje ir antroje retortose ir stiklinėse pokyčių nėra, tačiau trečiajame aparate kaustinės kalio tirpalas pakyla retortos vamzdelyje. Išvadas dėl visų šių trijų sąlygų galima padaryti taip:

Pirmajame aparate pokyčių nėra, nes kvėpavimo substratai, ty sėklos, yra sausi ir nekvėpuoja. Jei kvėpavimas būtų buvęs, CO2 išsiskyręs būtų sugertas kaustinės kalio. Taigi galiausiai tirpalas turėjo patekti į retortos vamzdelį. Taigi, nėra kvėpavimo.

Antrame aparate taip pat pokyčių nėra, nes išmirkytos sėklos kvėpuoja. Jie sugeria deguonį, esantį retortoje, ir gamina beveik vienodą kiekį anglies dioksido. Kadangi taip išsiskiriantis anglies dioksidas yra netirpus druskos tirpale, pokyčių nebus.

Trečioje stiklinėje kaustinės kalio tirpalas patenka į retortos vamzdelį. Taip yra dėl to, kad išmirkytos sėklos kvėpuoja. Jie sugeria deguonį ir išskiria vienodą kiekį anglies dioksido. Taip išsiskiriantį anglies dioksidą sugeria kaustinis kalis ir taip susidaro vakuumas. Norint įveikti šį vakuumą, į vamzdelį patenka šarminio kalio tirpalas, rodantis, kad kvėpuojant CO2 yra gaminamas.

7. Eksperimentas to Ganong’ respirometru nustatykite šių kvėpavimo substratų kvėpavimo koeficiento (R.Q.) reikšmę:

Ganong’s respirometras, kvėpavimo substratas, druskingas vanduo, kaustinis kalis, stovas, vanduo, filtravimo popierius, stiklinė, svarstyklės su svėrimo dėžute.

1. Įpilkite šiek tiek vandens į apatinį respirometro lemputės galą ir, uždėję filtravimo popierių, įdėkite daigių sėklų (arba kitokio kvėpavimo substrato lemputėje).

2. Dabar iš dalies užpildykite respirometrą druskos vandeniu. Sūrus vanduo naudojamas dėl to, kad CO2 negali joje ištirpti (51 pav.).

3. Pasukite lemputės kamštį taip, kad dvi skylės būtų viena priešais kitą. Esant tokiai būklei, lauko oras gali patekti į lemputes.

4. Dabar sureguliuokite išlyginimo vamzdžio ir graduoto vamzdelio lygį taip, kad abiejuose vamzdeliuose būtų tame pačiame lygyje fiziologinio tirpalo.

5. Dabar vėl pasukite kamštį taip, kad būtų atskirtos dvi skylės, o lemputė uždaryta.

6. Stebėkite sūraus vandens lygį ir leiskite kvėpavimo takų substratui kvėpuoti kelias valandas.

7. Atkreipkite dėmesį į galutinį lygį. Įveskite kaustinį kalio kristalą ir atkreipkite dėmesį į pokyčius.

(A) Jei kvėpavimo substratas yra angliavandeniai (pvz., kviečiai, kukurūzai, avižos, gramai, žirniai ir kt.):

Pastebėjimai ir rezultatai:

Druskingo vandens lygis nesikeičia, nes angliavandeniuose yra O tūris2 sugertas yra lygus CO tūriui2 išlaisvintas, kaip parodyta tokia lygtimi:

CO tūris2 išsiskyrimą galima įvertinti pridedant KOH kristalų. Pastarasis sugers CO2 kurias gamina sėklos, todėl galiausiai padidėja druskos lygis. CO tūris2 galima apskaičiuoti iš pirmojo atėmus antrąjį lygį. Tarkime, kad tai 35 c.c.

Taigi, R.Q. = t. CO2/T. iš O2= 35/35 = 1

(B) Jei kvėpavimo substratas yra riebalinis (pvz., garstyčių arba ricinos sėklos):

Pastebėjimai ir rezultatai:

Jei kvėpavimo substratas yra riebalinis, mažesnis CO kiekis2 bus išleistas nei O2 absorbuojamas. Bus sukurtas vakuumas, o norint jį įveikti, vamzdyje padidės fiziologinio tirpalo lygis. Šis padidėjimas bus lygus deguonies pertekliui. Pažymėkite kaip V1.

Tai gali būti parodyta tokia lygtimi:

Į druskos tirpalą įpilkite KOH kristalų. Fiziologinio tirpalo lygis vėl didėja, nes KOH sugeria CO2. Sukuriamas vakuumas ir norint jį įveikti padidėja fiziologinio tirpalo lygis. Pažymėkite kaip V2.

Apskaičiuokite CO tūrį2 pateikė V2 (iš pirmojo lygio pakilimo atėmus antrąjį pakilimą) ir O tūris2 pridedant abu lygio pakilimus, ty V1+ V2.

(C) Jei kvėpavimo substratas yra sultingas augalas (pvz., kaktusas):

Pastebėjimai ir rezultatai:

Sukulentai naktį demonstruoja nepilną oksidaciją. Taigi, jei eksperimentas vyksta naktį arba jei lemputė yra padengta juodu popieriumi, angliavandenių oksidacija bus nepilna.

Organinės rūgštys susidaro procese, kaip parodyta tokia lygtimi:

Tačiau dienos metu šios organinės rūgštys oksiduojasi, kaip parodyta šioje lygtyje:

Taigi R.Q. = 4/3 = 1,3, t. y. daugiau nei vienas.

d) Jei kvėpavimo substratas yra organinė rūgštis:

Šiuo atveju didesnis CO kiekis2 išsiskiria, palyginti su absorbuotu deguonimi, kaip parodyta pagal šią lygtį:

Taigi, graduotame vamzdyje iš pradžių sumažėja druskos vandens lygis. Pažymėkite kaip V1. Lygis pakyla pridedant KOH tirpalo, nes pastarasis sugeria CO2 ir taip lygis didėja. Pažymėkite kaip V2.

Taigi, V1 yra lygus anglies dioksido pertekliui ir V2 yra lygus bendram CO kiekiui2 pagaminta. To dėka O tomas2 sugertas bus V2– V1.

8. Eksperimentuokite, norėdami išmatuoti kvėpavimo koeficientą (R.Q.), naudodami porą respiroskopų:

Respiroskopai (2), stiklinės (2), mažas vamzdelis, KOH, siūlai, medinis stovas, vanduo, krakmolingos sėklos, pvz., kukurūzai, kviečiai ir kt., aliejinės sėklos, pvz., ricinos, garstyčios ir kt., termometras.

1. Pritvirtinkite porą respiroskopų ant medinio stovo.

2. Į išbrinkusias dviejų vamzdelių dalis paimkite vienodus kiekius nurodytos medžiagos, t. y. sėklų.

3. Viename iš vamzdelių sriegio pagalba pritvirtinamas mažas vamzdelis, kuriame yra KOH (52 pav.).

4. Abiejų vamzdelių apatinius galus panardinkite į stiklinėse esantį vandenį.

5. Prietaise pritvirtinkite termometrą, kad būtų galima fiksuoti temperatūrą, kuriai esant medžiagoje vyksta kvėpavimas.

6. Laikykite atidarytus abiejų vamzdžių uždarymo čiaupus ir guminiu vamzdeliu išsiurbkite orą, kol vanduo graduotuose vamzdeliuose pakils iki iš anksto nustatytos žymės. Pradinis lygis abiejuose vamzdeliuose turi būti vienodas ir atkreipkite dėmesį į tai.

7. Nedelsdami uždarykite čiaupą ir vamzdelius sandarinkite. Palaukite maždaug valandą ir pažymėkite galutinius lygius graduotuose vamzdeliuose.

8. Paimkite kitus kvėpavimo substratus, t. y. riebalus ir organines rūgštis, ir pakartokite eksperimentą dar kartą, kaip aprašyta aukščiau.

Angliavandenių, naudojamų kaip kvėpavimo substratas, atveju vandens lygis vamzdyje A išlieka nepakitęs, o vamzdyje B pakyla.

Jei riebios sėklos naudojamos kaip kvėpavimo substratas, vandens lygis pakyla abiejuose vamzdeliuose.

Jei organinės rūgštys yra kvėpavimo substratas, vandens lygis vamzdyje A sumažėja, o vandens lygis B vamzdyje pakyla.

Angliavandenių lygis mėgintuvėlyje A išlieka nepakitęs, o tai rodo, kad CO2 išleistas yra lygus O2 absorbuojamas kvėpuojant.

Vamzdyje B vandens lygis pakyla, nes CO2 išleistas yra absorbuojamas KOH. Juo CO2 sumą galima apskaičiuoti. Taigi, R.Q. yra 1.

Jei riebalai yra kvėpavimo substratas, lygis vamzdyje A padidėja, nes absorbuojamas daugiau deguonies ir mažiau CO.2 paleistas. Norėdami tai įveikti, lygis pakyla. Vamzdžio B lygio padidėjimas atsiranda dėl CO2 išleidžiamas kvėpuojant. Taigi, R.Q. galima apskaičiuoti, ir jis yra mažesnis nei vienas.

Jei organinės rūgštys yra kvėpavimo substratas, lygis vamzdyje A sumažėja, o tai rodo, kad tokiais atvejais CO kiekis yra didesnis.2 išsiskiria ir mažesnis O kiekis2 yra absorbuojamas kvėpuojant. Lygio padidėjimas vamzdyje B rodo CO kiekį2 išleidžiamas kvėpuojant. Rezultatas šioje byloje rodo, kad R.Q. yra daugiau nei vienas, nes C02 išleistas yra daugiau nei O2 absorbuojamas procese.

9. Eksperimentas, siekiant parodyti kvėpavimo fermentus (oksidazę, peroksidazę, dehidrogenazę ir katalazę) augalų audiniuose:

Bulvės, Petri lėkštelės, gvajako guma (benzidinas), alkoholis, vanduo, spiritinė lempa, vandenilio peroksidas, 2, 3, 5-trifeniltetrazolio chloridas, mėgintuvėlis ir kt.

1. Supjaustykite ploną skersinę bulvės pjūvį ir sudėkite į Petri lėkštelę.

2. Panardinkite sekciją į 2% alkoholinį gumos gvajako (benzidino) tirpalą. Palaukite apie 15 minučių ir stebėkite pokyčius.

3. Paimkite kitą šviežią bulvių dalį, išvirkite vandenyje ir pakartokite tą pačią procedūrą, nurodytą 1 ir 2 punktuose.

1. Paimkite kitą šviežių bulvių skyrių ir pakartokite tą pačią procedūrą, nurodytą 1 ir 2 punktuose oksidazei.

2. Po 15 minučių pašalinkite visą gvajako (benzidino) tirpalą, įpildami praskiesto vandenilio peroksido tirpalo (3 % H2O2 30 dalių vandens).

3. Paimkite kitą šviežią bulvių dalį, išvirkite vandenyje ir su ja pakartokite tą pačią procedūrą, kaip nurodyta 1 ir 2 punktuose.

1. Į ploną bulvių dalį į Petri lėkštelę įpilkite 0,5 % 2, 3, 5 trifeniltetrazolio chlorido tirpalo ir stebėkite spalvą.

2. Paimkite kitą naują dalį, užvirinkite vandeniu, pakartokite tą pačią procedūrą, nurodytą 1 punkte, ir stebėkite.

1.Paimkite ploną bulvių dalį, įpilkite ant jos praskiesto vandenilio peroksido tirpalo (1 dalis H2O2 30 dalių vandens) ir stebėkite pokyčius.

2. Paimkite kitą naują dalį, užvirinkite vandeniu, pakartokite tą pačią procedūrą, kaip minėta 1 punkte, ir stebėkite.

Pastebėjimai ir rezultatai:

Mėlyna spalva atsiranda dėl guajako dervos (benzidino) alkoholinio tirpalo oksidacijos.

Mėlyna spalva vystosi kaip ir oksidazės atveju, tačiau keičiasi greitis, kuriuo mėlynos spalvos intensyvumas vystosi. Taip yra todėl, kad dalyvaujant H2O2 peroksidazės oksiduoja įvairius substratus, tokius kaip aminai, fenoliai ir kt.

Vanduo susidaro, kai H2O2 reaguoja su vandenilio atomais ir elektronais, dalyvaujant peroksidazei, kaip nurodyta toliau:

Raudona spalva atsiranda dėl pridėtos tetrazolio druskos.

Taip yra todėl, kad dehidrogenazės pašalina vandenilio atmosferą, kad oksiduotų substratą. Tokius vandenilio atomus priima akceptoriai, kurie taip redukuojasi.

Išsiskiria deguonies burbuliukai.

Taip nutinka todėl, kad katalazė sukelia vandenilio peroksido skaidymą į vandenį taip:

10. Kvėpavimo ir fotosintezės reiškinių palyginimo eksperimentas:

Dvi ilgakaklelės kolbos, du gyvsidabrio loveliai, švieži žali lapai, žiedai, kalio kalio kristalai, stovai (2).

1. Paimkite keletą šviežiai nuskintų žalių lapų ir sudėkite juos į ilgakaklę kolbą.

2. Į kitą kolbą įdėkite ką tik nuskintų jaunų gėlių.

3. Sudrėkinkite lapus ir žiedus su nedideliu kiekiu vandens.

4. Apverskite abi kolbas ant atskirų gyvsidabrio turinčių lovelių. Abi kolbas sujunkite su stovu, kad jos būtų tam tikroje padėtyje ir visas aparatas būtų išsklaidytoje šviesoje. (50 pav.).

5. Maždaug po 12 valandų į abi kolbas įdėkite kausto kalio kristalą ir stebėkite.

Kolboje su žaliais lapais gyvsidabrio lygis šiek tiek pakyla, tačiau kolboje su jaunomis gėlėmis stebimas staigus ir didelis gyvsidabrio lygio kilimas.

Kolboje su žaliais lapais vienu metu vyksta ir fotosintezė, ir kvėpavimas. O2 išsivystęs fotosintezės procese, absorbuojamas kvėpavimo procese. Priešingai, CO2 išsiskiriantis kvėpuojant, absorbuojamas fotosintezės metu. Kadangi procesai vyksta išsklaidytoje šviesoje, todėl fotosintezės greitis nėra labai didelis ir kolboje gali kauptis šiek tiek anglies dioksido, dėl kurio gali šiek tiek pakilti gyvsidabrio lygis po to, kai jį absorbuoja kaustinis kalis.

Kolboje, kurioje yra jaunos gėlės, stebimas staigus ir didelis gyvsidabrio lygio padidėjimas, nes nevyksta fotosintezės procesas, o kvėpavimo procese kaupiasi CO.2 kolboje nuolat vyksta. Kaustinio kalio kristalai sugeria CO2 kolboje, sukeldamas staigų gyvsidabrio lygio padidėjimą.


Rekomenduojami straipsniai (6)

Suprasti atsakymą į Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 prie elektronų akceptorių nitratų ir sulfatų – biosintetinės išlaidos moduliuoja substrato pasirinkimą

Sulfatus redukuojančios bakterijos (SRB) yra įvairi anaerobinių mikroorganizmų grupė, kuri energiją gauna redukuodami sulfatus. Kai kurios SRB rūšys pasižymi dideliu kvėpavimo universalumu dėl galimo alternatyvių elektronų akceptorių naudojimo. Geras pavyzdys yra Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774, kuris auga esant nitratui (galutinis produktas: amonis), kurio greitis ir derlius yra didesnis nei terpėje, kurioje yra sulfatų (galutinis produktas: sulfidas). Šiame darbe mechanizmai, palaikantys kvėpavimo universalumą D. desulfurikanai buvo atskleisti analizuojant bakterijos proteomą skirtingomis eksperimentinėmis sąlygomis. Labiausiai pastebimas skirtumas tarp dvimačių gelio elektroforezės žemėlapių yra didelis dėmių, esančių išskirtinai nitratų terpėje, skaičius. Dauguma baltymų, kurių gausa, dalyvauja energijos apykaitoje ir aminorūgščių (arba baltymų) biosintezėje, ypač dalyvaujančių amonio asimiliacijos procesuose. qPCR analizė, atlikta skirtingais bakterijų augimo etapais, parodė, kad genai, dalyvaujantys redukuojant nitratus ir nitritus (napA ir nrfA, atitinkamai) turi skirtingus išraiškų profilius: while napA labai nesiskyrė, nrfA buvo labai išreikštas 6 valandų laiko taške. Nitritų kiekis, išmatuotas išilgai augimo kreivės, atskleidė piką po 3 val. Taigi pradinis nitratų suvartojimas ir kartu vykstanti nitritų gamyba turi paskatinti nrfA išraiška. Alternatyvių energijos gamybos mechanizmų suaktyvinimas, neskaitant kelių N asimiliacijos metabolizmų ir detoksikacijos procesų, išsprendžia galimas išgyvenimo problemas prisitaikant prie skirtingos aplinkos ir prisideda prie didesnio bakterijų augimo greičio.

Tyrimas dėl in vivo Mažojo subvieneto (ββ′) C-galo uodegos vaidmenys Saccharomyces cerevisiae Ribonukleotidų reduktazė: INDĖLIS PRIE KOFAKTORIAUS FORMAVIMO IR TARPSUBJEKTŲ ASOCIACIJOS AKTYVIOJI HOLOENZYME

Mažasis subvienetas (β2) Ia klasės ribonukleotidų reduktazės (RNR) sudėtyje yra diferric tirozilo kofaktorius (Fe).2 III -Y • ​​), kuris inicijuoja nukleotidų mažinimą dideliame subvienete (α2) per ilgo nuotolio radikalų perdavimo (RT) kelią holo-(α).2)m2)n kompleksas. β C-galinės uodegos2 daugiausia yra atsakingi už sąveiką su α2, su konservuotu tirozino likučiu uodegoje (Tyr 356 in Escherichia coli NrdB) pasiūlė dalyvauti kofaktoriaus surinkime/priežiūroje ir RT. Nesant jokios holo-RNR struktūros, β uodegos vaidmuo surenkant / prižiūrint klasterius ir jos polinkis holo komplekse liko nežinomi. Šiame tyrime pasinaudojome neįprastu heterodimeriniu pobūdžiu Saccharomyces cerevisiae RNR mažasis subvienetas (ββ′), iš kurio tik β yra kofaktorius, siekiant išspręsti abi šias problemas. Mes parodome, kad kofaktoriaus surinkimui nereikia nei β-Tyr 376, nei β′-Tyr 323 (Tyr 356 atitikmuo NrdB). in vivo, priešingai nei anksčiau pasiūlytas mechanizmas E. coli kofaktoriaus priežiūra ir surinkimas in vitro. Be to, tyrimai su atkurtu ββ′ ir an in vivo gyvybingumo tyrimas rodo, kad β-Tyr 376 yra būtinas RT, o Tyr 323 β′ nėra. Nors β′ C-galinės uodegos nereikia kofaktoriaus susidarymui ir RT, ji yra būtina sąveikai su β ir α, kad susidarytų aktyvus holo-RNR. Rezultatai kartu pateikia pirmuosius įrodymus, kad β ir β′ C-galų uodegos yra nukreiptos orientacijos α atžvilgiu holofermente, atitinkančios dviejų subvienetų prijungimo modelį, ir prieštarauja RT visoje β β' sąsajoje.