Informacija

Ar galime išaiškinti konkuruojančius molekulinius mokymosi ir plastiškumo mechanizmus, matuojant neuronų elektrinį aktyvumą?

Ar galime išaiškinti konkuruojančius molekulinius mokymosi ir plastiškumo mechanizmus, matuojant neuronų elektrinį aktyvumą?

We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ls rE GD La tX yr UZ AV Ie XR xD ts Vo YK OD Qd EG Fm

Su susižavėjimu skaičiau apie kelis molekulinio ir ląstelių masto mechanizmus ir struktūrinius pokyčius, kuriais grindžiamas tai, ką mes vadiname ilgalaikiu plastiškumu. Pavyzdžiui, [1], [2], [3].

Visų pirma, atrodo, kad yra bent: sinapsinis pleiskanojimas, sinapsinis genėjimas, sinaptogenezė, spinogenezė, neurogenezė.

Mano klausimai:

  1. Kaip kiekvienas iš aukščiau išvardytų mechanizmų / įvykių veikia klasikinius ekstraląstelinius vieno / kelių vienetų šuolius, postsinapsinius potencialus (LFP) ir vietinius elektrinius laukus? Ar egzistuoja mechaninis išankstinis modelis, nurodantis biofizinę transformaciją nuo sinapsės lygio pokyčių iki smailių ir LFP? Ar yra smailių simuliatorių, kurie modeliuoja šias savybes?

  2. Naudodami tokį išankstinį modelį, ar galime išspręsti statistinę atvirkštinę problemą, kad iš viso ką nors padarytume apie šiuos LTP / LTD sukeltus nedidelio masto struktūrinius ir funkcinius pokyčius?

  3. Pavyzdžiui, viena analizės metrika gali būti tokia: filtrai po smailės laiko (savaiminiai ir kryžminiai terminai), išvedami naudojant statistinius taško proceso modelius. Kitas dalykas gali būti paties veikimo potencialo forma, kuri paprastai naudojama tik smaigalių rūšiavimui, o tada išmetama.

  4. Ar kažkas panašaus buvo padaryta? O gal tai neįgyvendinama? Jei taip, kodėl?

  5. Galiausiai, jei kas nors galėtų trumpai apžvelgti sinapsės masto fiziologinių / vaizdo gavimo metodų, naudojamų šiems mechanizmams apibūdinti, spektrą, būčiau labai dėkingas!


Čia tiesiog pridedu šiek tiek. Sunku įvertinti ryšio pokyčius remiantis STDP http://klab.smpp.northwestern.edu/wiki/images/2/2b/Stevenson_Inferring_Plasticity_2011.pdf

bet taip – ​​šių klausimų pakanka, kad didelis laukas būtų užimtas a ilgas laikas.


Dėkoju!

Mąsčiau tokia kryptimi.

(1) Užrašykite tinklo neuronų kabelių lygtis, nurodytas: anatominis tinklo išdėstymas, erdvinis dendritų, spygliuočių, sinapsių ir sinapsinių stiprumų pasiskirstymas (pirmyninis modelis).

(2) Įsigykite sąnario mikroskopiją + elektrofiziologijos duomenų rinkinį.

(3) Apverskite pirmyn modelį su sinapsiniais stiprumais kaip laisvaisiais parametrais.

(4) Stebėkite šiuos numanomus parametrus laikui bėgant arba palyginkite juos tarp sąlygų.


Ar galime išaiškinti konkuruojančius molekulinius mokymosi ir plastiškumo mechanizmus, matuojant neuronų elektrinį aktyvumą? – Biologija

Nepaisant miego paplitimo visoje filogenezėje, jo funkcija išlieka sunkiai suprantama. Šioje apžvalgoje mes svarstome vieną įtikinamą kandidatą: smegenų plastiškumą, susijusį su atminties apdorojimu. Daugiausia dėmesio skirdami nuo hipokampo priklausomai graužikų ir žmonių atminčiai, aprašome molekulinius, ląstelinius, tinklo, viso smegenų ir elgesio įrodymus, patvirtinančius miego vaidmenį ruošiantis pradiniam atminties kodavimui ir vėlesniam atminties konsolidavimui neprisijungus. Miegas ir miego trūkumas dvikrypčiai keičia molekulinius signalizacijos kelius, kurie reguliuoja sinapsinį stiprumą ir kontroliuoja su plastiškumu susijusią genų transkripciją ir baltymų transliaciją. Ląstelių lygmeniu miego trūkumas pablogina ląstelių jaudrumą, būtiną sinapsinei potencijai sukelti, ir pagreitina ilgalaikių sinapsinio plastiškumo formų nykimą. Priešingai, greitas akių judėjimas (REM) ir ne greitas akių judėjimas (NREM) miegas sustiprina anksčiau sukeltą sinapsinį potenciją, nors taip pat buvo pastebėta sinapsės depotencija miego metu. Be vienos ląstelės dinamikos, didelio masto ląstelių ansambliai išreiškia suderintą ankstesnių su mokymusi susijusių šaudymo modelių atkūrimą vėlesnio NREM miego metu. Viso smegenų lygmeniu žmonėms buvo pranešta apie analogišką su mokymusi susijusią hipokampo (re)aktyvaciją NREM miego metu. Be to, tie patys žievės NREM svyravimai, susiję su graužikų atkūrimu, taip pat skatina žmogaus hipokampo atminties konsolidaciją, o šiuo procesu galima manipuliuoti naudojant egzogeninius reaktyvavimo signalus miego metu. Atspindintys graužikų molekulinius radinius, specifiniai NREM miego svyravimai prieš kodavimą atnaujina žmogaus hipokampo mokymosi gebėjimus, o miego trūkumas, atvirkščiai, pablogina vėlesnį hipokampo aktyvumą ir susijusį kodavimą. Kartu šie kryžminio aprašomojo lygio išvados rodo, kad unikali miego neurobiologija daro galingą poveikį molekuliniams, ląsteliniams ir tinklo plastiškumo mechanizmams, kurie valdo tiek pradinį mokymąsi, tiek vėlesnį ilgalaikės atminties konsolidavimą.


Išvados

2𠄶 savaites naudojome atskirtas neuronų kultūras, užaugintas virš MEA, kad galėtume stebėti neuronų populiacijos elektrinį aktyvumą [9]. MEA leidžia stabiliai ir ilgai (valandomis iki dienų) įrašyti tarpląstelinius signalus iš visos populiacijos ir leidžia apibūdinti bei sekti atskirų identifikuotų neuronų šuolių savybes. Tokiu būdu buvo galima apibūdinti visuotines tinklo savybes, tokias kaip jo bendras elektrinis aktyvumas, ir gauti pokyčių apibūdinimą per atskirų identifikuotų smaigalių neuronų plastiškumą. Šios analizės negalima atlikti su hipokampo griežinėliais arba organotipinėmis kultūromis, išaugintomis ant MEA arba in vivo, nes tokiais atvejais stebimi vietiniai lauko potencialai (LFP) ir detalus neuronų plastiškumo tyrimas vieno smaigalio lygyje yra beveik neįmanomas. Mes padidinome sinapsinį efektyvumą ir bendrą elektrinį aktyvumą, gydydami hipokampo kultūras 30 min. su GABAA receptorių antagonistas gabazinas (GabT). Po GabT gabazinas buvo išplautas ir buvo stebimas / ištirtas sukelto elektrinio aktyvumo laikas. MEA ekstraląsteliniai elektrodai buvo naudojami registravimui ir stimuliavimui, kad būtų galima kiekybiškai įvertinti sukelto aktyvumo pokyčius. Trumpi (200 μs) bipoliniai impulsai buvo pritaikyti elektrodų eilei (juoda juosta ​ pav. 1A pav. tinklelyje) 1A) ir užfiksuotas sukeltų smaigalių sklidimas visame tinkle. Siekiant išvengti prisotinimo, prieš GabT, jo metu ir po jo buvo naudojamas žemiausios įtampos impulsas, sukeliantis bent vieną smaigalį (​ pav. (1 pav.). 1 ). Jo amplitudė svyravo nuo 200 iki 450 mV, priklausomai nuo kultūros. Po GabT sukeltų spyglių skaičius visą laiką didėjo beveik visuose bandymuose vieno elektrodo lygiu (​ pav. (1B pav.) 1B ) ir visame tinkle (​ pav. (Pav.). 1C 1C).

GabT sukelto atsako sustiprėjimas. A, Sukeltos veiklos laiko eigos pavyzdžiai vienam bandymui su trimis tipiniais elektrodais, esančiais 0,5, 1 ir 2 mm atstumu (žr. intarpas) atitinkamai nuo stimuliuojančio elektrodo (juoda juosta in intarpas). Sukeltų šuolių skaičius didėja po GabT. Hipokampo kultūros buvo stimuliuojamos mažiausiu intensyvumu (200� mV), sukeldamos atsaką. Buvo panaudota 40 impulsų (bandymų), kurių intervalas tarp impulsų yra 4 s. Įdėklas, grafinis MEA tinklelio vaizdas. Kiekvienas kvadratas reiškia elektrodą. Atstumas tarp elektrodų yra 500 μm. Juoda juosta atitinka stimuliuojamus elektrodus, o pilki sunumeruoti kvadratai – elektrodus, kurių aktyvumas parodytas (A). B, Spyglių, sukeltų viename elektrode, analizuojamame kiekvienu laiko tašku, rastrinės diagramos. Kiekviena horizontali linija rodo atsaką į vieną bandymą, užregistruotą iki 250 ms nuo stimulo pradžios. C, NFR laiko eiga. Bendras sukeltų smaigalių skaičius buvo skaičiuojamas 10 ms dėžėse po elektrinės stimuliacijos. Sukeltų spyglių padidėjimas ypač ryškus per pirmąsias 100 ms po stimuliacijos. Duomenys iš vieno eksperimento, parodyto (A-C). D, Vidutinė NFR trukmė (n = 5 kultūros). NFR buvo normalizuotas, palyginti su kontrolinėmis vertėmis. Dėžutės dydis buvo 250 ms. E, Dešimt persidengiančių smaigalių pėdsakų kontrolinėmis sąlygomis (juodi pėdsakai) ir 3 valandos po atskiro elektrodo gabazino išplovimo (raudoni pėdsakai), rodantys pirmojo sukelto smaigalio delsos sumažėjimą. Artefaktai buvo sutrumpinti aiškumo dėlei. F, Trijų neuronų pirmojo smaigalio latentinės trukmės (mėlyni pėdsakai) ir virpėjimas (raudoni pėdsakai) laiko eiga, rodanti, kad latentinis laikas ir virpėjimas sumažėja po GabT. Kiekvienas simbolis atitinka skirtingą neuroną. G, sklidimo konstantos laiko eiga (λ žr. metodus), rodanti aktyvumo plitimo padidėjimą po GabT. Įdėta, buvo suskaičiuotas spyglių skaičius 100 ms laiko lange ir apskaičiuotas vidurkis elektrodams, esantiems 0,5, 1 ir 2 mm atstumu nuo stimuliuojamos elektrodų juostos ir turintiems eksponentinę funkciją. Ae -d/λ (pilka linija). Spalvos kaip ir (E).

Sukelto atsako pokyčiai buvo kiekybiškai įvertinti apskaičiuojant bendrą sukeltų smailių skaičių per 100 ms laiko lange nuo stimulo pradžios, vadinamą sukelto atsako NFR tinklo suaktyvinimo dažniu. NFR reikšmingai padidėjo nuo 1 iki 6 valandų po GabT (1C pav., D): sukeltas atsakas buvo maksimaliai sustiprintas praėjus 3 valandoms po GabT ir pradėjo mažėti po 6 valandų, grįždamas prie kontrolinio lygio praėjus 24 valandoms po GabT.

GabT sukeltas neuronų plastiškumas ne tik pakeitė sinapsinį efektyvumą, bet ir keletą kitų tinklo savybių, tokių kaip greitis ir sukeltų šuolių patikimumas. Greitis buvo įvertintas matuojant sukelto atsako delsą, t. Kai kuriuose eksperimentuose buvo galima nustatyti spyglius, kuriuos sukuria tas pats neuronas (​ pav. (1E pav.) 1E ), todėl galėjome išmatuoti, kaip pasikeitė jo delsa ir virpėjimas neuronų plastiškumo metu. Kontrolinių sąlygų delsa nuo stimulo pradžios svyravo nuo 6 iki 9 ms, sumažėjo 2𠄳 ms po to, kai GabT ir jo virpėjimas panašiai sumažėjo (​ pav. (1F pav.). 1F ). Taip pat išanalizavome, kaip tinkle sklinda spygliai, matuodami sukeltos veiklos erdvės konstantą λ (bendras sukeltų spyglių skaičius kaip atstumo nuo dirgiklio funkcija). Surinkti duomenys iš 4 kultūrų parodė, kad λ padidėjo maždaug 25 % per 1 val. po GabT ir išliko didesnis nei kontrolinės vertės iki 24 valandų (​ pav. (1G pav.). 1G ). Šie rezultatai rodo, kad sinapsinio veiksmingumo padidėjimas veikiant vien gabazinu, nesant kartu esančios stiprios ar tetaninės elektrinės stimuliacijos, sustiprino kultūroje plintantį elektrinį atsaką, tokiu būdu sukeldamas LTP formą, kurią vadiname vidutiniu laiku. LTP (M-LTP), nes po gabazino pašalinimo jis nebuvo nustatytas kaip maksimalus, išsivystė praėjus 1 valandai po GabT ir truko apie 6 valandas. Todėl M-LTP greičiausiai bus susijęs ne tik su vietine prekyba baltymais, bet ir su genų ekspresijos pokyčiais, vykstančiais per kelias valandas. Siekdami suprasti molekulinius įvykius, kuriais grindžiamas M-LTP, išanalizavome genų ekspresijos pokyčius, sukeltus to paties farmakologinio gydymo, ty 30 min. poveikis gabazinui su Affymetrix mikrogardelėmis (RAT 230_2.0 Gene Chip) (Broccard ir kt., rankraštis ruošiamas). Mes nustatėme 342 genus, kurie buvo žymiai sureguliuoti tuo pačiu metu, kai buvo sustiprintas sukeltas elektrinis aktyvumas. Nepaisant to, kadangi genų profiliai buvo gauti iš visos kultūros, mes negalėjome nustatyti neuronų, kuriuose buvo išreikšti reguliuojami genai, tipo. Daugelis šių genų yra gerai žinomi LTP žaidėjai, pvz Bdnf ir jo receptorius TrkB [11], Arc [12], Egr1 [13] ir Homeras 1 [14]. Iškėlėme hipotezę, kad didžioji dauguma nustatytų genų yra LTP indukcija ir palaikymas ir kad jų aktyvinimas organizuoja neuronų plastiškumą. Tiesą sakant, paieška PuBMed duomenų bazėje rodo, kad 40% iš 284 anotuotų genų yra arba gali būti susiję su sinapsės stiprumo pokyčiais, susijusiais su LTP. 43 genai jau buvo įtraukti į LTP, 25 genai buvo klasifikuojami kaip Struktūriniai genai dėl jų struktūrinio vaidmens ląstelių funkcijoje ir jų padidinto reguliavimo gali būti pagrindas struktūriniams ir morfologiniams pokyčiams, susijusiems su LTP. Analogiškai 25 Išankstinis sinapsinis ir 24 Postsinapsinis mūsų atrankoje rasti genai gali tarpininkauti sinaptinių savybių pokyčiams, vykstantiems LTP metu.

ERK1/2 signalizacija vaidina svarbų vaidmenį keliuose su plastiškumu susijusiuose nervų sistemos procesuose [15]. Todėl ištyrėme PD98059 ir U0126 ERK1/2 kelio slopinimo poveikį sukelto atsako stiprėjimui (​ pav. (2 pav.). 2 ). Šių inhibitorių panaudojimas neuronų kultūroms sumažino spontanišką visų ekstraląstelinių elektrodų aktyvumą (​ pav. (2A pav.). 2A). Tinklo uždegimo greitis buvo beveik perpus mažesnis (​ pav. (2B pav.) 2B ) visose tirtose kultūrose (n = 4), tačiau vis tiek buvo galima stebėti didesnio elektrinio aktyvumo periodus. Šiose kultūrose ERK1 / 2 inhibitoriai buvo inkubuojami 45 minutes prieš GabT ir buvo analizuojami sukelto atsako pokyčiai. Esant šiems inhibitoriams, GabT vis tiek sustiprino sukeltą atsaką, nors ir mažesniu mastu (raudonas pėdsakas ​ pav. 2C pav.), 2C), o laiko eiga buvo panaši į tą, kuri stebima be šių inhibitorių. (juodas pėdsakas ​ pav. 2C pav.). 2C). Praėjus 3 valandoms po GabT, normaliomis sąlygomis sukeltų spyglių skaičius pasiekė 198 ± 41 %, tačiau, esant PD98059 ir U0126, padidėjo tik 39 ± 15 %. Todėl ERK1 / 2 kelio slopinimas sumažino, bet nepanaikino GabT sukelto atsako sustiprinimo.

ERK1/2 kelio inhibitorių poveikis. A, reprezentatyvūs pėdsakai iš dviejų atskirų tarpląstelinių elektrodų kontrolinėmis sąlygomis (kairėje) ir esant 50 μM PD98059 (dešinėje). B, Atitinkamas tinklo sudeginimo greitis, apskaičiuotas esant 25 ms pločiui, įprastomis sąlygomis (kairėje) ir esant 50 μM PD98059 (dešinėje), rodantis spontaniško elektrinio aktyvumo sumažėjimą PD98059. Taškinė linija rodo nulinį smaigalį. C, Sukeltas aktyvumas vis dar sustiprėja, kai ERK1 / 2 kelias buvo užblokuotas prieš GabT (žr. Rezultatus). Brūkšninė linija atitinka sukeltos veiklos stiprinimą neužblokuojant ERK1 / 2 kelio prieš GabT. PD98059 (50 μM n = 3) ir U0126 (20 μM n = 3) duomenys buvo sujungti, nes jie panašiai paveikė tinklo savybes. D, Genų ekspresijos pokyčiai, atsirandantys praėjus 1,5 val. po GabT, išmatuoti realiuoju laiku PGR Egr1, Egr2, Egr3, Nr4a1, Bdnf, Homeras1a ir Arc esant gabazinui ir PD98059 (pilkos juostos), palyginti su normalizuota ekspresija, kai yra tik gabazinas (juoda juosta).

Realaus laiko PGR išanalizavome ERK1 / 2 inhibitorių poveikį kai kuriems su LTP susijusiems genams, kurie buvo reguliuojami mūsų mikrogardelių atrankoje: Egr1 [13],Egr2 [16],Egr3 [17],Nr4a1 [18],Bdnf [11],Homeras1a [14] ir Arc [12]. Kaip parodyta ​ paveiksle, 2D, 2D paveiksle, EGR šeimos genų padidintas reguliavimas, kurį sukelia GabT, Nr4a1 ir Arc buvo žymiai sumažintas ir beveik blokuotas ERK1/2 kelio inhibitorių, bet ne padidėjęs Bdnf ir Homeras1a.

Šiame tyrime aprašyti rezultatai rodo, kad po GabT sukeltas elektrinis aktyvumas sustiprėja vidutiniu laiku (M-LTP). Tikimasi, kad ši chemiškai sukeltos LTP forma pakeis daugumą tinkle esančių sinapsių ir todėl paveiks jo pasaulines savybes. Kai LTP sukelia vietinė elektrinė stimuliacija, tikimasi, kad bus pakeistas tik ribotas sinapsių skaičius.

Kaip parodyta ​ pav. 2, 2 pav., M-LTP stiprinimas buvo sumažintas, bet nepašalintas ERK1/2 kelio inhibitorių, sutinkant su mintimi, kad neuronų plastiškumą skatina keli skirtingi keliai dirbti vieningai. Šie rezultatai leido mums susieti elektrinių savybių pokyčius, vykstančius neuronų plastiškumo metu, su konkrečiais pagrindiniais molekuliniais įvykiais.

Ši analizė, jungianti MEA ir DNR mikrogardelius, yra paprasta neuronų plastiškumo tyrimo sistema [4], tačiau neleidžia nustatyti aptiktų genų ekspresijos pokyčių ląstelinės kilmės. Atsižvelgiant į didelį piramidinių neuronų gausą hipokampo kultūrose ir ūminiuose pjūviuose, tikėtina, kad šiuose neuronuose atsiranda aptiktų genų ekspresijos pokyčių, tačiau gali būti, kad jie taip pat atsiranda tarpneuronuose ir glijos ląstelėse. Norint išspręsti šią problemą, reikės atlikti vienos ląstelės genų profiliavimą nepažeistame hipokampe. Preliminarūs eksperimentai, atlikti mūsų laboratorijoje su nepažeistomis organotipinėmis griežinėliais, rodo, kad gydymas gabazinu sukelia labai panašius genų ekspresijos pokyčius disocijuotose kultūrose, kaip čia naudojamos, ir neuronų pjūviuose, išsaugant pirminį fiziologinį ryšį.


Nuorodos

Marder, E. ir Thirumalai, V. Neuromoduliacijos ląstelinis, sinaptinis ir tinklo poveikis. Neuroninis tinklas. 15, 479–493 (2002).

Abbott, L. F. ir Nelson, S. B. Sinapsinis plastiškumas: žvėries prisijaukinimas. Nature Neurosci. 3 (priedas), 1178–1183. (2000).

Sjostrom, P. J. & Nelson, S. B. Spike laikas, kalcio signalai ir sinapsinis plastiškumas. Curr. Nuomonė. Neurobiol. 12, 305–314 (2002).

Kandel, E. R. Atminties saugojimo molekulinė biologija: dialogas tarp genų ir sinapsių. Mokslas 294, 1030–1038 (2001).

Martin, K. C. & Kosik, K. S. Sinaptinis žymėjimas – kas tai? Nature Rev. Neurosci. 3, 813–820 (2002).

Dayan, P. ir Abbott, L. F. in Teorinis neuromokslas (MIT, Kembridžas, 2001).

Marder, E., Abbott, L. F., Turrigiano, G. G., Liu, Z. & Golowasch, J. Atmintis iš vidinių membranų srovių dinamikos. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 93, 13481–13486 (1996).

Zhang, W. & Linden, D. J. Kita engramos pusė: patirties skatinami neuronų vidinio sužadinimo pokyčiai. Nature Rev. Neurosci. 4, 885–900 (2003).

Daoudal, G. & Debanne, D. Ilgalaikis vidinio sužadinimo plastiškumas: mokymosi taisyklės ir mechanizmai. Mokytis. Atm. 10, 456–465 (2003).

Prinz, A. A., Abbott, L. F. & Marder, E. Dinaminis spaustukas ateina su amžiumi. Neurosci tendencijos. 27, 218–224 (2004).

Sharp, A. A., Skinner, F. K. & amp Marder, E. Virpesių mechanizmai dinaminėse gnybtuose sukonstruotose dviejų elementų pusiau centro grandinėse. J. Neurophysiol. 76, 867–883 (1996).

Cajal, R. S. Histologie du System Nerveux de l'Homme et des Vertébrés (Maloine, Paryžius, 1909).

Rall, W. Skirtingi teoriniai sinapsiniai potencialai, apskaičiuoti skirtingiems sinapsinės įvesties soma-dendritiniams skirstiniams. J. Neurophysiol. 30, 1138–1168 (1967).

Rall, W. Membraninių cilindrų ir neuronų laiko konstantos ir elektrotoninis ilgis. Biofizė. J. 9, 1483–1508 (1969).

Rall, W. & Rinzel, J. Šakos įvesties pasipriešinimas ir pastovus įvesties slopinimas į vieną dendritinių neuronų modelio šaką. Biofizė. J. 13, 648–687 (1973).

Johnston, D., Magee, J. C., Colbert, C. M. ir Cristie, B. R. Aktyvios neuronų dendritų savybės. Annu. Kunigas Neurosci. 19, 165–186 (1996).

Migliore, M. & Shepherd, G. M. Atsirandančios aktyviųjų dendritinių laidų pasiskirstymo taisyklės. Nature Rev. Neurosci. 3, 362–370 (2002).

Yuste, R. & Tank, D. W. Dendritinė integracija žinduolių neuronuose, praėjus šimtmečiui po Cajal. Neuronas 16, 701–716 (1996).

Stuart, G., Spruston, N. ir Hausser, M. Dendritai (MIT, Kembridžas, Masačusetsas, 2000).

Schwindt, P. C. ir Crill, W. E. Sinapsinės srovės stiprinimas nuolatiniu natrio laidumu neokortikinių neuronų viršūniniame dendrite. J. Neurophysiol. 74, 2220–2224 (1995).

Magee, J. C. Dendritic Ih normalizuoja laiko sumavimą hipokampo CA1 neuronuose. Nature Neurosci. 2, 508–514 (1999).

Williams, S. R. ir Stuart, G. J. EPSP laiko eigos nepriklausomybę nuo vietos sąlygoja dendritinis I (h) neokortikiniuose piramidiniuose neuronuose. J. Neurophysiol. 83, 3177–3182 (2000).

Magee, J. C. & amp Johnston, D. Sinaptiškai valdomas, asociatyvus signalas dėl hebijos plastiškumo hipokampo neuronuose. Mokslas 275, 209–213 (1997).

Markram, H., Lübke, J., Frotscher, M. & Sakmann, B. Sinapsinio efektyvumo reguliavimas pagal postsinaptinių AP ir EPSP sutapimą. Mokslas 275, 213–215 (1997).

Hines, M. L. ir Carnevale, N. T. NEURON modeliavimo aplinka. Neuroninis kompiuteris. 9, 1179–1209 (1997).

Kochas, C. ir Segevas, I. Neuronų modeliavimo metodai (MIT, Kembridžas, 1998).

Bower, J. ir Beeman, D. GENESIS knyga (Springeris, Berlynas, 1994).

Golding, N. L., Staff, N. P. ir Spruston, N. Dendritiniai spygliai kaip bendradarbiavimo ilgalaikio stiprinimo mechanizmas. Gamta 418, 326–331 (2002).

Turrigiano, G. G. ir Nelson, S. B. Homeostatinis plastiškumas besivystančioje nervų sistemoje. Nature Rev. Neurosci. 5, 97–107 (2004).

Marder, E. & Prinz, A. A. Neuronų ir tinklo funkcijų stabilumo modeliavimas: aktyvumo vaidmuo homeostazėje. Bioesė 24, 1145–1154 (2002).

Turrigiano, G. G., Leslie, K. R., Desai, N. S., Rutherford, L. C. & Nelson, S. B. Nuo veiklos priklausomas kvantinės amplitudės mastelis neokortikiniuose neuronuose. Gamta 391, 892–896 (1998).

Desai, N. S., Rutherford, L. C. ir Turrigiano, G. G. Žievės piramidinių neuronų vidinio sužadinimo plastiškumas. Nature Neurosci. 2, 515–520 (1999).

Goldman, M. S., Golowasch, J., Marder, E. & Abbott, L. F. Pasaulinė neuronų modelių struktūra, tvirtumas ir moduliavimas. J. Neurosci. 21, 5229–5238 (2001).

MacLean, J. N., Zhang, Y., Johnson, B. R. ir Harris-Warrick, R. M. Nuo veiklos nepriklausoma homeostazė ritmiškai aktyviuose neuronuose. Neuronas 37, 109–120 (2003).

Golowasch, J., Abbott, L. F. ir Marder, E. Nuo veiklos priklausomas kalio srovių reguliavimas nustatytame krabo stomatologinio gangliono neurone Vėžys borealis. J. Neurosci. 19, RC33 (1999).

Selverston, A. I. Ar suprantami centriniai modelių generatoriai? Behav. Brain Sci. 3, 535–571 (1980).

Getting, P. A. Nauji neuroninių tinklų veikimo principai. Annu. Kunigas Neurosci. 12, 185–204 (1989).

Friesen, W. O. Abipusis slopinimas: svyruojančių gyvūnų judesių mechanizmas. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 547–553 (1994).

Wang, X. -J. & Rinzel, J. Kintamieji ir sinchroniniai ritmai abipusiai slopinančiuose modelio neuronuose. Neuroninis kompiuteris. 4, 84–97 (1992).

Van Vreeswijk, C., Abbott, L. F. ir Ermentrout, G. B. Kai slopinimas, o ne sužadinimas sinchronizuoja nervinį šaudymą. J. Kompiuteris. Neurosci. 1, 313–321 (1994).

White, J. A., Chow, C. C., Ritt, J., Soto-Trevino, C. & Kopell, N. Sinchronizacija ir virpesių dinamika heterogeniniuose, abipusiai slopintuose neuronuose. J. Kompiuteris. Neurosci. 5, 5–16 (1998).

Marder, E. & Calabrese, R. L. Ritminio motorinio modelio generavimo principai. Physiol. Rev. 76, 687–717 (1996).

Nusbaum, M. P. ir Beenhakker, M. P. Mažų sistemų požiūris į variklio modelio generavimą. Gamta 417, 343–350 (2002).

Harris-Warrick, R. M. ir kt. Paskirstytas dopamino moduliacijos poveikis vėžiagyvių pyloriniame tinkle. Ann. N Y Akad. Sci. 860, 155–167 (1998).

Katz, P. S. ir Frost, W. N. Vidinis neuromoduliavimas: neuronų grandinių keitimas iš vidaus. Neurosci tendencijos. 19, 54–61 (1996).

Steriade, M., Jones, E. G. ir McCormick, D. A. Talamas (Elsevier, Amsterdamas, 1997).

Destexhe, A. & Sejnowski, T. J. Sąveika tarp membranų laidumo, pagrindžiančios talamokortikinius lėtos bangos virpesius. Physiol. Rev. 83, 1401–1453 (2003).

McCormick, D. A. Cholinerginis ir noradrenerginis talamokortikinio apdorojimo moduliavimas. Neurosci tendencijos. 12, 215–221 (1989).

Mountcastle, V. B. in Neurologijos mokslai: ketvirtoji studijų programa (eds Schmidt, F. O. & amp Worden, F. G.) 21–42 (MIT Press, Cambridge, 1979).

Hubel, D. H. & amp Wiesel, T. N. Stulpelių forma ir išdėstymas katės juostinėje žievėje. J. Physiol. 165, 559–568 (1963).

Douglas, R. J. & amp Martin, K. A. Funkcinė mikroschema kačių regos žievei. J. Physiol. 440, 735–769 (1991).

Szentagothai, J. Neuroninių centrų modulinis architektoninis principas. kun. Physiol. Biochem. Pharmacol. 98, 11–61 (1983).

Barlow, H. in Vizualinės žievės modeliai (eds Rose, D. ir Dobson, V.) 37–46 (Wiley, Chichester, 1985).

Braitenbergas, V. ir Schuzas, A. Žievė: neuronų ryšio statistika ir geometrija (Springeris, Berlynas, 1998).

Destexhe, A., Rudolph, M. & Pare, D. Neokortikinių neuronų didelio laidumo būsena in vivo. Nature Rev. Neurosci. 4, 739–751 (2003).

Ho, N. & Destexhe, A. Sinaptinis foninis aktyvumas padidina neokortikinių piramidinių neuronų reakciją. J. Neurophysiol. 84, 1488–1496 (2000).

Wiesenfeld, K. & Moss, F. Stochastinis rezonansas ir triukšmo nauda: nuo ledynmečių iki vėžių ir kalmarų. Gamta 373, 33–36 (1995).

Chance, F. S., Abbott, L. F. ir Reyes, A. D. Gauti moduliavimą iš fono sinapsinės įvesties. Neuronas 35, 773–782 (2002).

Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T. & McCormick, D. A. Sinapsinės veiklos užtvaros kontroliuoja žievės neuronų padidėjimą ir jautrumą. J. Neurosci. 23, 10388–10401 (2003).

Rudolph, M. ir Destexhe, A. Greitai laidus, stochastinis integracinis režimas neokortikiniams neuronams in vivo. J. Neurosci. 23, 2466–2476 (2003).

Wei, D. S. ir kt. Galinių dendritų suskaidytas ir dvejetainis elgesys hipokampo piramidiniuose neuronuose. Mokslas 293, 2272–2275 (2001).

Shepherd, G. M. & amp Brayton, R. K. Loginės operacijos yra kompiuteriu imituojamos sąveikos tarp sužadinamų dendritinių spyglių savybės. Neurologijos 21, 151–165 (1987).

Mel, B. W. Informacijos apdorojimas dendritiniuose medžiuose. Neuroninis kompiuteris. 6, 1031–1085 (1994).

Softky, W. Submilisekundžių sutapimų aptikimas aktyviuose dendritiniuose medžiuose. Neurologijos 58, 13–41 (1994).

Shalden, M. N. ir Newsome, W. T. Kintamasis žievės neuronų iškrovimas: reikšmė jungiamumui, skaičiavimui ir informacijos kodavimui. J. Neurosci. 18, 3870–3896 (1998).

Moore, G. P., Perkel, D. H. & Segundo, J. P. Statistinė analizė ir funkcinis neuronų smailių duomenų interpretavimas. Annu. kun. Physiol. 28, 493–522 (1966).

Rao, R., Olshausen, B. ir Lewickis, M. Tikimybiniai smegenų modeliai (MIT, Kembridžas, 2002).

Hopfield, J. J. Neuroniniai tinklai ir fizinės sistemos su atsirandančiais kolektyviniais skaičiavimo gebėjimais. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 79, 2554–2558 (1982).

Roskies, A. Įrišimo problema: specialusis leidimas. Neuronas 24, 7–125 (1999).

von der Malsburg, C. & Schneider, W. Neuroninis kokteilių vakarėlio procesorius. Biol. Kibernas. 54, 29–40 (1986).

Engel, A. K., Fries, P. & Singer, W. Dinaminės prognozės: virpesiai ir sinchronija apdorojant iš viršaus į apačią. Nature Rev. Neurosci. 2, 704–716 (2001).

Abelesas, M. Kortikonai: smegenų žievės neuroninės grandinės (Cambridge University Press, Kembridžas, 1991).

Rudolph, M. & Destexhe, A. Koreliacijos aptikimas ir rezonansas neuroninėse sistemose su paskirstytais triukšmo šaltiniais. Fizik. Kunigas Lett. 86, 3662–3665 (2001).

Barlow, H. B. in Sensorinės komunikacijos (red. Rosenblith, W.) Ch. 13, 217–234 (MIT, Kembridžas, 1961).

Barlow, H. ir Foldiak, P. in Kompiuterinis neuronas Ch. 4 (reds Durbin, R., Miall, C. & G, M.) 54–72 (Addison-Wesley, Niujorkas, 1989).

Srinivasan, M. V., Laughlin, S. B. & Dubs, A. Nuspėjamasis kodavimas: naujas tinklainės slopinimo vaizdas. Proc. R. Soc. Londonas. B 216, 427–459 (1982).

Ito, M. Smegenėlių ilgalaikė depresija: apibūdinimas, signalo perdavimas ir funkciniai vaidmenys. Physiol. Rev. 81, 1143–1195 (2001).

Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y. & Grant, K. Sinaptinis plastiškumas į smegenis panašioje struktūroje priklauso nuo laiko tvarkos. Gamta 387, 278–281 (1997).

Foldiak, P. Retų reprezentacijų formavimas vietiniu antihebišku mokymusi. Biol. Kibernas. 64, 165–170 (1990).

Wang, X. J., Liu, Y., Sanchez-Vives, M. V. ir McCormick, D. A. Pritaikymas ir laiko dekoravimas pavieniais neuronais pirminėje regos žievėje. J. Neurophysiol. 89, 3279–3293 (2003).

Goldman, M. S., Maldonado, P. & Abbott, L. F. Atleidimo mažinimas ir ilgalaikis šaudymas su stochastinėmis slopinančiomis sinapsėmis. J. Neurosci. 22, 584–591 (2002).

Peters, A. & amp Yilmaz, E. Neuronų organizacija katės regos žievės 17 srityje. Cereb. Cort. 3, 49–68 (1993).

Olshausen, B. A. & Field, D. J. Paprastų ląstelių receptyvaus lauko savybių atsiradimas išmokus retų natūralių vaizdų kodą. Gamta 381, 607–609 (1996).

Perez-Orive, J. ir kt. Svyravimai ir kvapo atvaizdų retėjimas grybo kūne. Mokslas 297, 359–365 (2002).

Hahnloser, R. H., Kozhevnikov, A. A. & Fee, M. S. Itin retas kodas yra paukščio giesmininko nervinių sekų generavimo pagrindas. Gamta 419, 65–70 (2002).

Baranyi, A. ir Feher, O. Sąlyginiai sinapsinio perdavimo pokyčiai motorinėje katės žievėje. Exp. Brain Res. 33, 283–298 (1978).

Kirkwood, A. & Bear, M. F. Hebbian sinapsės regėjimo žievėje. J. Neurosci. 14, 1634–1645 (1994).

Thomson, A. M. Centrinių sinapsių palengvinimas, padidinimas ir stiprinimas. Neurosci tendencijos. 23, 305–312 (2000).

Hebas, D. O. Elgesio organizacija (Wiley, Niujorkas, 1949).

Gupta, A., Wang, Y. & amp Markram, H. Organizing Princips for a diversity of GABAergic interneuros and synapses in neocortex. Mokslas 287, 273–278 (2000).

Silberberg, G., Gupta, A. & amp Markram, H. Stereotypy in neocortical microcircuits. Neurosci tendencijos. 25, 227–230 (2002).

Buonomano, D. V. & Merzenich, M. M. Laikinoji informacija, transformuota į erdvinį kodą neuroniniu tinklu, turinčiu realių savybių. Mokslas 267, 1028–1030 (1995).

Maass, W., Natschlager, T. & Markram, H. Realaus laiko skaičiavimas be stabilių būsenų: nauja neuroninio skaičiavimo sistema, pagrįsta perturbacijomis. Neuroninis kompiuteris. 14, 2531–2560 (2002).

Monier, C., Chavane, F., Baudot, P., Graham, L. J. ir Fregnac, Y. Sinaptinių įėjimų orientacija ir krypties selektyvumas regos žievės neuronuose: derinių įvairovė sukuria smaigalių derinimą. Neuronas 37, 663–680 (2003).

Steriade, M. ir McCarley, R. W. Smegenų kamieno budrumo ir miego kontrolė (Plenum, Niujorkas, 1990).

Bear, M. F. & Singer, W. Vizualinės žievės plastiškumo moduliavimas acetilcholinu ir noradrenalinu. Gamta 320, 172–176 (1986).

Shulz, D. E., Sosnik, R., Ego, V., Haidarliu, S. & Ahissar, E. A neuronal analoge of state-dependent learning. Gamta 403, 549–553 (2000).

Stickgold, R., Hobson, J. A., Fosse, R. & Fosse, M. Miegas, mokymasis ir sapnai: atminties perdirbimas neprisijungus. Mokslas 294, 1052–1057 (2001).

Hinton, G. E., Dayan, P., Frey, B. J. & Neal, R. M. Neprižiūrimų neuroninių tinklų „pabudimo-miego“ algoritmas. Mokslas 268, 1158–1161 (1995).

Frégnac, Y. in Smegenų teorijos ir neuronų tinklų vadovas (red. Arbib, M. A.) 515–522 (MIT, Kembridžas, 2002).


Diskusija

Atlikdami išsamų elektrofiziologinį tyrimą, kompiuterinį modeliavimą ir molekulinę analizę, nustatėme, kad hiperpoliarizacijos suaktyvintas ciklinis nukleotidų valdomas (HCN) ir T tipo kalcis (Ca)V3) kanalai vaidina svarbų vaidmenį pirminių disocijuotų neuronų, taip pat hipokampo organotipinių pjūvių kultūrų homeostatiniame plastiškume, kurį sukelia lėtinis aktyvumo trūkumas.

Ankstesni tyrimai parodė, kad šie kanalai reguliuoja sinapsinę integraciją ir vidinį jaudrumą normaliomis sąlygomis ir prisideda prie sutrikusio tinklo aktyvumo patologinėmis sąlygomis, ypač sergant epilepsija26 �. Šiame darbe pateikiame įrodymų, kad h ir T srovės reguliuojamos homeostatinės adaptacijos metu po 48 h gydymo TTX. Mūsų duomenys rodo, kad visi HCN ir T tipo kalcio kanalų subvienetai yra pirminėse disocijuotose hipokampo kultūrose. Blokuojant smailių perdavimą padidėjo CaV3.1 mRNR ekspresija, tačiau subvieneto baltymo kiekio ar plazmos membranos lokalizacijos pokyčio neaptikome. Reikėtų pažymėti, kad mRNR lygio pokyčiai negali būti interpretuojami kaip tiesioginiai funkcinio baltymo ekspresijos koreliacijos 30 . Nepaisant to, galimas paaiškinimas yra tas, kad T tipo Ca kanalų erdvinis perskirstymas ir (arba) po transliacijos modifikavimas buvo sukeltas homeostatiniu būdu, todėl padidėjo T tipo kanalų laidumas ir atsirado didesnis atoveiksmio potencialas, būdingas fiziologinis parašas. T tipo Ca srovių.

HCN kanalų poveikis vidiniam sužadinimui yra šiek tiek dvikryptis: viena vertus, HCN kanalai sumažina sužadinimo postsinapsinio potencialo (EPSP) sumavimą, šuntuodami dendritines postsinapsines sroves31, 32. Kita vertus, jie prisideda prie ramybės membranos (RMP) potencialo depoliarizacijos 10 . Be to, Dyhrfjeld-Johnsen ir kt. 33 parodė, kad karščiavimo sukeltų traukulių metu Ih sukelia padidėjusį dendritinį jaudrumą, kuris gali paskatinti epilepsiją. Sutinkame, kad aktyvumo trūkumas mūsų auginamuose neuronuose sukėlė įtampos kritimo teigiamų neuronų depoliarizaciją. Įdomu tai, kad mums nepavyko aptikti TTX sukeltų HCN mRNR ar baltymų lygio pokyčių kultūros lizatuose, nepaisant didesnio ląstelių, turinčių įtampos kritimą, skaičiaus. Pažymėtina, kad mes taip pat nustatėme reikšmingą TRIP8b (1a-4) izoformų lygio padidėjimą, kuris reguliuoja HCN kanalų paviršiaus ekspresiją hipokampe19, 20. Yra žinoma, kad HCN kanalo lokalizacija pirmiausia lemia įtampos kritimo atsakų, išmatuotų somoje, mastą. Sutinkame, kad po 48 h aktyvumo trūkumo aptikome proksimalesnį HCN1 kanalo persiskirstymą CA1 neuronuose organotipinėse hipokampo pjūviuose. Thus, our results show a specific redistribution of HCN channels that is considered as a very effective way of homeostatic upregulation of intrinsic excitability.

It is known that network activity gradually develops in dissociated hippocampal cultures and from DIV12, neurons exhibit robust firing and mature integrative properties 34 . Our data show that two days of TTX treatment started between DIV12 to 14 increased burst activity. This is in agreement with earlier observations on treating immature cultures with TTX for 9ꃚys, starting from DIV5 until DIV14 35 . Additionally, our pharmacological experiments showed that HCN and T-type Ca channels participate in the formation of global network bursting activity amplified by TTX-evoked homeostatic regulation. In accordance with previous reports showing that these channels have fundamental role in bursting 36 – 39 , we found that selective blocking of these channels decreased burst frequency. At the same time, we found no changes in other burst parameters or the mean firing rate. It is known that T-type voltage-gated channels and HCN channels work together and regulate the firing frequency during post-inhibitory rebound, first spike latency and spike precision in the deep cerebellar nuclear neurons 40 . In addition, HCN1 channels were reported to create signaling complexes with certain CaV3 subunits 41 . Nevertheless, we cannot rule out the possibility that sodium channels are also affected by activity-deprivation as this has been verified by earlier reports using similar model systems 11 . It is likely that differential regulation of sodium, HCN and T-type calcium channels all contribute to the formation of the bursting phenotype during homeostatic plasticity.

Homeostatic regulation of intrinsic excitability has been described as an efficient way to prevent neurons from becoming hyper- or hypoactive in case of sustained loss of neuronal inputs or highly elevated neuronal activity, respectively. Initial research on activity-deprived neurons identified several voltage-dependent membrane conductances, including mostly potassium currents 42 , which are associated with spike generation and are subjects of homeostatic regulation. Indeed, up- or downregulation of such conductances can have a profound effect on the excitability of neurons often manifesting as changes in the rheobase or input–output gain parameters. Our previous experimental data on extended amygdala neurons 43 , as well as present computational models, have shown that homeostatic regulation of other voltage-gated currents including T-type and HCN channels can dramatically alter the neuron’s integrative properties while standard parameters of their static excitability appear to be less influenced. Considering these, even those intrinsic changes that introduce minor shifts in the static input–output functions of neurons (e.g. LTP of intrinsic excitability) can have a robust functional impact when neurons operate under fluctuating synaptic inputs. Our present model simulations also support this idea by showing that upregulation of both the h- and T-currents boosts firing under the action of excitatory synaptic inputs more than firing under standard current step stimulation.

In summary, our data show that in hippocampal neurons, HCN and T-type voltage-gated calcium channels participate in the activity-dependent homeostatic regulation of their integrative properties facilitating synchronization of network activity and bursting.


Abstraktus

Addiction is caused, in part, by powerful and long-lasting memories of the drug experience. Relapse caused by exposure to cues associated with the drug experience is a major clinical problem that contributes to the persistence of addiction. Here we present the accumulated evidence that drugs of abuse can hijack synaptic plasticity mechanisms in key brain circuits, most importantly in the mesolimbic dopamine system, which is central to reward processing in the brain. Reversing or preventing these drug-induced synaptic modifications may prove beneficial in the treatment of one of society's most intractable health problems.


Pagalbinė informacija

S1 paveikslas

Morphology of adult Panx1 +/+ and Panx1 −/− mouse brains. Photographs of fixed 9 month-old male control (Panx1 +/+ , left panels) and Panx1 −/− (right panels) brains showing no macroscopic differences in dorsal (A, B) and ventral views (C, D). Scale Bars A𠄽 =𠂥 mm.

S2 paveikslas

Comparison of frontal brain sections Panx1 +/+ and Panx1 −/− mouse brains. (A, B) Overview representing slices (1.5 mm) at the level of the dorsal hippocampus reveals no obvious regional differences between cortex (Cx), hippocampus, thalamus, (Th), hypothalamus (Hy) and amygdala (Amy) between Panx1 +/+ (left panels) and Panx1 −/− mice (right panels). All animals were 9 months old. (C–H) Toluidine-blue stained semithin sections (0.8 µm) of the hippocampus showing regions CA1 (C, D), CA3 (E, F) and dentate gyrus (DG in G, H). All regions display normal cellular and dendritic composition in both genotypes. Cp, cerebral peduncle GR, granule cell layer, PO, polymorph layer PY, pyramidal cell layer RAD, stratum radiatum SLU, stratum lucidum Scale bars in A, B =𠂠.5 mm bar in C–H =� µm.

S3 paveikslas

Calbindin and Parvalbumin immunohistochemistry of hippocampus in Panx1 +/+ and Panx1 −/− mice. (A, B) Frontal overview vibratome sections, 50 µm thick, show the characteristic calbindin staining pattern of the hippocampal subregions CA1, stratum lucidum (SLU) of CA3 with the positive mossy fibers and the strongly stained dentate gyrus (DG) in Panx1 +/+ (left panels) and Panx1 −/− mice (right panels). Enlargements of the CA1 area exhibit no difference in staining of the pyramidal cell layer (PY), stratum oriens (OR) and stratum radiatum (RAD) between both genotypes. Overview micrograph of Parvalbumin immunostaining displays similar staining of Panx1 +/+ (E) and Panx1 −/− mice (F). Enlargements of CA1 (G, H) show immunpositive somata of interneurons in the pyramidal cell layer and stratum oriens with the dendrites spanning all layers. Bar in A, B, E, F =� µm bar in B, D, G, H =� µm.

Figure S4

Expression of selected glutamate receptor family genes. Real Time PCR was performed to analyze relative expression changes of grm1 (mGlu family I), grm2 (mGlu family II), grm4 (mGlu family III), grin1 (AMPA receptor family) and gria1 (NMDA receptor family). HSP90 and 18 sRNA expression was used for normalization.

S1 lentelė

Summary of the mean ± SEM values for Panx1 +/+ and Panx1 −/− derived early phase LTP and late phase LTP. Data are listed according to the bath applied pharmacological treatment. Note, that wash in of pharmacology was performed at least 10 min in advance to measurements and was kept upright during the whole phase of LTP recordings. P-Values reveal significances for Holm-Sidack post hoc comparisons, which were performed following one-way ANOVA analyses. ns = non-significant

S2 lentelė

Summary of RNA expression profiling data. Summary of data analysis using PCRArrayDataAnalysis_V3.3 software, version August 2010, (http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php). Metabotropic glutamate receptor 4 (GRM4) is highlighted in red. Samples in wells H01–H05 were used for normalization of the data set.

Methods S1

This section describes methods used to obtain the data described in the supporting information section.

Movie S1

Typical behavior of trained control (Panx1 +/+ cage on the left) and knock-out (Panx1 −/− cage on the right) mice in cookie finding assay. The “X” presented in the lower left corner reiškia where the cookie was stored during training sessions. Control mice immediately try to find the cookie in this corner, and when unsuccessful choose the top right hand corner instead. The Panx1 −/− explores the cage, however, lack indications of a systematic, memory-based exploration strategy.


Biography

Louis-Solal Giboin obtained his PhD in France under the supervision of Véronique Marchand-Pauvert, with whom he studied the cortical control of cervical propriospinal neurons in humans. He is now a post doctorant in charge of the Sensorimotor Performance Lab in the Human Performance Research Centre lead by Markus Gruber at the University of Konstanz in Germany. He is currently working on the neural adaptations induced by motor training and on the role of self-control in the regulation of strenuous physical activity.


Rezultatai

Previous results have shown that PKA anchoring is important for striatal LTP [26] and striatal dependent behavior [72], but these experiments did not delineate whether PKA needs to be anchored near its target molecules, such as DARPP-32 and the AMPA receptor GluA1 subunit, or near a source of activator molecules, such as adenylate cyclase. Though disruption of PKA anchoring prevents phosphorylation of targets such as sodium channels [23] or adenylate cyclase 5 [73] in response to a general elevation in cAMP, the role of anchoring in response to spatially constrained cAMP has not been investigated. In order to clarify which of these two associations is critical to PKA function, a model of the signaling pathways implicated in striatal synaptic plasticity ( Fig. 1A ) was implemented using NeuroRD [57], in a 7.75 µm long dendrite with four spines ( Fig. 1B ).

Validation of the Model

Prior to evaluating the role of PKA and adenylate cyclase location, the model was validated by comparison with experiments that measured phosphorylation of PKA targets in response to bath application of agonists. For this validation, both PKA and adenylate cyclase were located in the spine and dendrite in equal amounts.

The first validation simulates the response to bath application of 10 µM dopamine. Fig. 2A shows that a simulated increase in dopamine from 10 nM (basal level) to 10 µM leads to a 6-fold increase in phosphoThr34 DARPP-32 within 2 min, and a decrease of phosphoThr75 DARPP-32 to 60% of basal ( Fig. 2B ) comparable to the changes measured experimentally using dopamine D1R agonists [74]. In addition, simulated phosphoSer845 GluA1 increases by 8 fold within 5 to 10 minutes ( Fig. 2C ), comparable to measurements performed in the absence of D2 receptor stimulation [48].

(A) Change in phosphoThr34 DARPP-32 is similar to that observed experimentally in response to 10 µM dopamine alone, 600 nM calcium alone (inset), and the combination of dopamine with calcium. (B) Decrease in phosphoThr75 DARPP-32 for same three conditions as (A). (C) Change in phosphoSer845 GluA1 for same three conditions as (A). All responses are similar to experimental measurements.

The second validation simulates the response to a sustained increase in intracellular calcium concentration, as occurs due to experimental activation of NMDA receptors and voltage dependent calcium channels [75]. In response to this calcium increase, simulated phosphorylation of both DARPP-32 residues decreases, to half (Thr34) or two-thirds (Thr75) the basal level ( Fig. 2A and 2B ), in agreement with experimental data [56], [76]. Furthermore, the simulated calcium elevation leads to dephosphorylation of phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 2C ) as previously reported [75].

The last model validation evaluates the change in phosphorylation of Thr34 and Thr75 in response to paired dopamine and calcium elevations. As demonstrated experimentally [75], [76], the addition of calcium reduces the increase in phosphoThr34 caused by dopamine ( Fig. 2A ), and enhances the decrease in phosphoThr75 ( Fig. 2B ). Furthermore, paired elevation of dopamine and calcium completely blocks the simulated phosphorylation of GluA1 Ser845 ( Fig. 2C ).

PKA Activity is Greater when Anchored near Adenylate Cyclase

Using this validated model, we explore the function of PKA anchoring relative to the location of both adenylate cyclase that activates it and PKA targets such as AMPA receptors ( Fig. 1C ). The D1 receptor is a metabotropic G protein coupled receptor functionally associated with adenylate cyclase [30], [31]. Immunohistochemical studies have shown D1 receptors located in spine heads and necks [77]. On the other hand, studies using immunogold labeling suggest D1 receptors are localized in extra synaptic sites homogeneously distributed in dendritic shafts and spines [78]. Therefore, prior to evaluating the effect of colocalization, we first examine the cAMP distribution when the adenylate cyclase/G protein/D1 receptor complex is located either in the spine head or in the submembrane region of the dendritic shaft.

Simulations show that when the adenylate cyclase-D1 receptor complex is located in the spine head, cAMP concentration is significantly higher in the spine head compared to the dendrite ( Fig. 3A ). This gradient is independent of PDE10 distribution (Suppl Fig S1). Conversely, when the complex is located in the submembrane compartment of the dendrite, cAMP concentration is higher in the dendrite than in the spine head ( Fig. 3B ). In summary, regardless of adenylate cyclase location, a cAMP gradient develops, with the highest concentration near the source (adenylate cyclase-D1 receptor complex) therefore, subsequent evaluations of the role of colocalization take into account the local cAMP concentration.

(A) When adenylate cyclase (AC) is in the spine head, there is a large difference (gradient) between spine cAMP and dendrite cAMP. (B) When adenylate cyclase is in the dendrite, there is a small gradient from dendrite to spine.

PKA location is regulated by interaction with A-Kinase anchoring proteins [19]. Various AKAPs anchor PKA to different locations, such as to the spine (e.g. AKAP5) [79], [80] or the dendritic shaft (e.g. MAP2) [81]. Recent evidence suggests that AKAP5 also anchors adenylate cyclase [22], [24], which would colocalize adenylate cyclase, PKA and GluA1 receptors. Alternatively, a pool of adenylate cyclase may be in the dendrite together with the dopamine D1 receptors found there [78]. In order to evaluate whether the critical function of anchoring is to place PKA near adenylate cyclase or near phosphoprotein targets, PKA is localized either in the spine heads or in a small submembrane region of the dendrite. For both of these spatial variations of PKA, the adenylate cyclase/D1 receptor complex is placed either in the spine heads or in the small submembrane region of the dendrite. Thus, four different spatial configurations are simulated ( Fig. 1C ). Note that the volume of the small dendrite region equals the volume of the spine head thus, both global and local concentrations of these molecules are equal for all simulations. This 2൲ experimental design ( Fig. 1C ) allows assessment of the role of PKA location relative to adenylate cyclase - the source of cAMP, or a non-diffusible target - the AMPA receptor GluA1 subunit. Note that membrane associated molecules have limited mobility in the membrane [62] and pools of PKA are anchored in multiple regions within the neuron nonetheless, our approach serves to enhance the effect of colocalization and facilitates evaluation of distinct functions of anchoring.

Simulations show that PKA colocalization with adenylate cyclase, either in the dendrite or the spine, produces a higher quantity of the active catalytic subunit than when PKA is apart from the adenylate cyclase ( Fig. 4A, B ). The large fluctuations in catalytic subunit are caused by its low quantity, which is due to a high affinity for the regulatory subunit and DARPP-32. Both the large fluctuations and the slow dynamics of PKA activation obscure the individual pulses that are visible in the cAMP traces. Colocalization in the spine produces greater PKA activity than colocalization in the dendrite because local spine cAMP is greater when adenylate cyclase is in the spine due to impeded cAMP diffusion. The effect of local cAMP (measured at the site of PKA anchoring) and colocalization (whether PKA was colocalized with adenylate cyclase or not) were evaluated using the SAS procedure GLM. Analysis revealed that local cAMP concentration predicted PKA activity (Pπ.0001, R 2  =𠂠.91), whereas colocalization did not reach significance (P =𠂠.083) thus the role of colocalization is primarily to place PKA in a microdomain of high cAMP concentration.

(A, B) Concentration of free catalytic subunit (PKAc) is greater for the two colocalized cases. (A) Traces are averaged over 4 trials nonetheless the stochastic fluctuations are so large that the traces overlay each other and are difficult to distinguish. (B) Mean and S.E.M. of the total PKA activity (PKAc summed between 50 and 350 s). (C,D) Concentration of phosphoThr34 DARPP-32 is greater for the two colocalized cases. (C) Traces are the average over four trials. (D) Mean and S.E.M. of the concentration of phosphoThr34 DARPP-32 averaged between 50 and 350 s. (E, F) Percent of phosphoSer845 GluA1 is greater for the two colocalized cases. (E) Traces are the average over four trials. (F) Mean and S.E.M. of the percent of phosphoSer845 GluA1 averaged between 50 and 300 s.

The effect of colocalization is propagated to downstream targets: Colocalization of PKA and adenylate cyclase (in spine or dendrite) leads to increased phosphoThr34 DARPP-32 ( Fig. 4C,D ) and phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 4E,F ) compared to non-colocalized cases. In fact, both phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 are completely predicted by PKA activity (P =𠂠.0001, R 2  =𠂠.999 and P =𠂠.0001, R 2  =𠂠.93, respectively). The concentration of phosphoThr34 DARPP-32 (total quantity divided by volume of entire morphology) is illustrated because the gradients are much smaller than those of cAMP (Suppl Fig. S1). Evaluation of GluA1 in single spines on individual trials (Suppl Fig. S2) reveals that GluA1 phosphorylation varies considerably, exceeding 20% more often when PKA and adenylate cyclase are colocalized in the spine. This variability would not be evident in deterministic simulations.

Previous experiments have shown that disruption of PKA anchoring using Ht31 peptide blocks L-LTP induction in hippocampus [25] and LTP induction in the striatum [26]. To evaluate this experimental observation, we performed simulations with PKA uniformly distributed in the morphology, mimicking the disruption of anchoring by Ht31 peptide [23], [25]. The simulation shows that phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 are reduced (ratioρ) when PKA is uniformly distributed ( Fig. 5 ), especially for the case of adenylate cyclase located in the spine. This decreased PKA activity supports experimental studies showing that PKA anchoring is required for LTP induction.

When adenylate cyclase (AC) is in the spine, disruption of PKA anchoring reduces by 30% both phosphoThr34 DARPP-32 (p =𠂠.0006) and phosphoSer845 GluA1 (p =𠂠.0036). When adenylate cyclase is in the dendrite, disruption of PKA anchoring produces a significant decrease in phosphoThr34 DARPP-32 (p =𠂠.0005), but not phosphoSer845 GluA1 (p =𠂠.16). Most of the diffusely distributed PKA is in the dendrite thus, cAMP diffusion out of the spine (when adenylate cyclase is in the spine) to reach the PKA is more difficult than cAMP diffusion within the dendrite (when adenylate cyclase is in the dendrite). Consequently, disruption of PKA anchoring has a larger effect when adenylate cyclase is in the spine. PhosphoThr34 DARPP-32 is averaged between 50 and 350 s and phosphoSer845 GluA1 is averaged between 50 and 300 s.

Spine Neck Length Enhances the Effect of Colocalization

Recent studies have demonstrated that synaptic function and plasticity are correlated with synaptic structure and spine morphology [82], [83]. In particular, spine-neck geometry is an important determinant of NMDA receptor-dependent calcium signaling in the dendrite [84], [85]. To evaluate how spine morphology affects the interaction between PKA and cAMP, simulations are repeated using a spine with either a longer (1.0 µm) or shorter (0 µm) spine neck, representing the range of experimentally measured values in striatal dendrites [86]. Keeping the spine head the same size and shape maintains both the same quantity and concentration of molecules localized in the spine head. For these simulations, the four configurations of PKA and adenylate cyclase introduced previously are used.

Simulations show that spine neck enhances the effect of colocalization through control of cAMP concentration. An increase in spine neck length increases the cAMP gradient due to reduced diffusional coupling. Thus, an increase in neck length produces a larger cAMP in the spine when adenylate cyclase is in the spine, and a smaller cAMP in the spine when adenylate cyclase is in the dendrite. The effect of neck length on cAMP concentration gradient propagates downstream to PKA targets ( Fig. 6A,B ), yielding a larger effect of colocalization for the longer spine neck. Furthermore, local cAMP concentration predicts PKA activity regardless of neck length (Pπ.0001, R 2  =𠂠.93), and PKA activity predicts both phosphoThr34 DARPP-32 (Pπ.0001, R 2  =𠂠.99) and phosphoSer845 GluA1 (Pπ.0001, R 2  =𠂠.93). These results reinforce the observation that colocalization of PKA with its source of cAMP functions to locate PKA in a microdomain of high cAMP concentration, and also show that the effect of colocalization is robust to variation in spine neck length.

(A) The difference in phosphoThr DARPP-32 between colocalized and non-colocalized cases increases with a longer spine neck. (B) The difference in phosphoSer845 GluA1 between colocalized and non-colocalized cases increases with spine neck length. (C) Increase in diffusion constant decreases the activity of PKA when colocalized in the spine with adenylate cyclase (AC), but maintains enhancement over the non-colocalized case. (D) Changes in rate of GluA1 phosphorylation changes the level of phosphoSer845 GluA1, but maintains the difference between colocalized and non-colocalized cases. PhosphoThr34 DARPP-32 is averaged between 50 and 350 s and phosphoSer845 GluA1 is averaged between 50 and 300 s.

Several other simulations were performed to demonstrate that the results were robust to variations in parameters. The effect of colocalization was evaluated for different values of diffusion constants, rate of GluA1 dephosphorylation, and PDE10 location. For all these parameter variations, simulations demonstrate that colocalization of PKA with its activator still yields the greatest PKA activity. GluA1 dephosphorylation rate had no effect on PKA activity (results not shown), whereas an increase in diffusion constant ( Fig. 6C ) predictably decreased, but did not eliminate the effect of colocalization on PKA activity. Similarly, the GluA1 dephosphorylation rate changed the level of GluA1 Ser845 ( Fig. 6D ), but maintained the enhancement in phosphoSer845 GluA1 due to colocalization. Fig. S1 illustrates the effect of distributing PDE10 throughout the morphology (instead of locating it in the spine and submembrane region) for the two cases with adenylate cyclase in the spine. Though cAMP concentration and phosphoThr34 DARPP-32 are slightly increased when PKA is in the dendrite, PKA colocalization with adenylate cyclase still produces a much greater activity.

Effect of Calcium on Dopamine Response

Experimental evidence demonstrates that calcium influx through NMDA receptors is required for plasticity [87], [88] however the molecular mechanisms of calcium action are less clear. One possibility suggested by a previous model [27] is that trumpalaikis calcium elevation (in contrast with prolonged calcium elevation) paired with dopamine enhances phosphoThr34 DARPP-32 compared with dopamine alone. Another possibility is that multiple kinases are required for synaptic plasticity, and, in particular, that calcium is required for CaMKII activation [45]. Therefore to explore the interaction between dopaminergic and glutamatergic transient signals in the medium spiny projection neuron, the model was stimulated with simultaneous dopamine and calcium pulses.

Transient calcium influx to spines was applied at 100 Hz for 1 sec, which approximates the calcium influx through NMDA receptors during LTP protocols [59]. This calcium influx generates a transient increase in calcium concentration that is constrained to the stimulated spines, as observed experimentally. Peak calcium levels in the stimulated spines (1500� nM) are much higher than both the non-stimulated spines (500� nM) and the dendrite (� nM), regardless of PKA and adenylate cyclase location.

Independent of whether PKA and adenylate cyclase were colocalized in the spine or dendrite, the PKA activity, phosphoThr34 DARPP-32, and phosphoSer845 were 10% smaller in response to calcium plus dopamine than in response to dopamine alone ( Fig. 7 ). The inhibition in PKA activity is caused by three pathways: inhibition of adenylate cyclase 5, activation of phosphodiesterase 1B and activation of calcineurin that dephosphorylates phosphoThr34 DARPP-32. The small increase in PKA activity in response to calcium alone is due to enhanced dephosphorylation of phosphoThr75 DARPP-32 by calcium bound PP2A ( Fig. 7B ) which cannot compensate for the other inhibitory actions of calcium, regardless of PP2A distribution or affinity for calcium (results not shown).

(A) Calcium alone produces a large increase in CaMKII phosphorylation and a small increase in PKA activity. Calcium together with dopamine leads to CaMKII phosphorylation only 10% lower than that observed with calcium alone, and PKA activity only 10% lower than that observed with dopamine alone. Both PKA and CaMKII activity are summed between 50 and 350 sec. (B) The calcium induced increase in PKA activity is caused by a small activation in PP2A, leading to a small decrease in phosphoThr75 (not shown).

To evaluate the possibility that calcium is needed for activation of other kinases, we measured the quantity of phosphorylated CaMKII, implicated in striatal LTP [89], in response to calcium, dopamine, and calcium plus dopamine. Fig. 7A shows that calcium stimulation alone causes a tremendous increase in phosphoCaMKII when compared with dopamine stimulation alone, while the combination of dopamine and calcium produces only a 10% reduction compared to calcium alone. This suggests that the increase in phosphoCaMKII more than compensates for the small decrease in PKA activity due to calcium. Though PKA and CaMKII have distinct targets in the model, extracellular signal-regulated kinase type II, important for dopamine signaling in the striatum [90], is phosphorylated by several kinases [91], and other points of PKA and CaMKII convergence are possible. In summary, these results suggest that both dopamine and calcium are required for LTP due to the need for activation of multiple kinases.

Colocalization of Dopamine Terminals and Receptors

There are two conflicting hypotheses on the relationship between the extracellular concentration of dopamine and the activation of dopamine receptors [92]: either dopamine concentration exhibits a spatial gradient and preferentially activates receptors near terminals, or dopamine concentration does not exhibit a spatial gradient and activates receptors homogenously through volume transmission. The latter hypothesis is supported by the microscopic anatomy of dopamine receptors and terminals [78], [93]. On the other hand, voltammetry experiments coupled with modeling demonstrate a spatial gradient of dopamine concentration, suggesting that nearby low affinity receptors (e.g. D1R) are activated preferentially [66], [94], [95]. Therefore the next set of simulations evaluates the extent to which an extracellular microdomain in dopamine would produce an intracellular microdomain of D1R activated second messengers.

To approximate the spatio-temporal profile of dopamine observed in voltammetry experiments [66], dopamine diffusion was decreased by a factor of 3. This approach avoided the need for dopamine uptake via the dopamine transporter and subsequent degradation, which was beyond the scope of the current paper that focuses on post-synaptic mechanisms. The quantity of dopamine released at the spine was adjusted so that dopamine concentration at the release site remained the same, which yielded no change in PKA activity when PKA, D1R and adenylate cyclase were colocalized with the dopamine terminals in the spine. The effect of the resulting dopamine spatial gradient was evaluated by measuring the change in PKA activity when PKA, D1R and adenylate cyclase were colocalized in the dendrite, but 3 µm from the dopamine terminals.

Simulations show that the dopamine spatial gradient ( Fig. 8B1 inset) leads to a small but significant decrease in amplitude of cAMP concentration (p =𠂠.0012) and phosphoThr34 DARPP-32 (p =𠂠.046), compared to no dopamine gradient ( Fig. 8 ). In contrast, the time of the peak cAMP concentration ( Fig. 8A1 ), phosphoThr34 DARPP-32 ( Fig. 8B1 ) and phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 8C1 ) were not altered. This small change in intracellular signaling molecules caused by the dopamine spatial gradient suggests that small distances between receptor and terminal may not be important, especially if the intracellular molecules do not exhibit a spatial gradient. This idea was further evaluated with the next simulation, in which spatial gradients of intracellular signaling molecules were evaluated in a longer dendrite.

A spatial gradient of dopamine decreases (A) cAMP and PKA activity as measured by (B) phosphoThr34 DARPP-32 and (C) phosphoSer845 GluA1, but no delay in time course. A1, B1 and C1 show the time course of a single simulation, A2 show mean and stdev (n =𠂤) of cAMP averaged between 50 and 200 s B2 and C2 show mean and stdev (n =𠂤) of phosphoThr34 DARPP-32 averaged between 50 and 350 s, and phosphoSer845 GluA1 averaged between 50 and 300 s, respectively. The inset of B1 shows the gradient in dopamine concentration from the PSD to the dendrite. Traces are the average of four simulations.

Microdomains and Spatial Specificity

The effect of close proximity between dopamine terminals and receptors can only be important when accompanied by mechanisms for limiting the spread of intracellular signaling molecules. Spatial specificity of intracellular signaling is critical for information processing, in particular for a neuron to discriminate between different patterns of input. To evaluate if spatial specificity of dopamine signaling would propagate to downstream targets, we performed simulations using a longer dendrite with an average spine density of 1/µm, as experimentally measured [86]. These simulations use the slow dopamine diffusion which produces a gradient in dopamine to ensure that only the dopamine receptors at one end are activated.

Fig. 9A shows that dopamine stimulation of one end of the dendrite produces a spatial gradient in cAMP concentration, reaching � nM at the stimulated end, and decaying to basal concentration within 13 µm of the stimulation site. The spatial profile of cAMP is well described by a single spatial decay constant of 4.69ଐ.14 µm ( Fig. 9B ). This gradient does not propagate to PKA activity, as measured by phosphoThr34 DARPP-32 activity ( Fig. 9C ), or phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 9E ). The lack of intracellular gradient of PKA activity supports the ineffectiveness of extracellular gradients in dopamine. This result further suggests that PKA anchoring is not sufficient by itself to produce PKA microdomains, in part because when PKA is activated, the catalytic subunit diffuses.

(A) cAMP concentration versus time and distance from dopamine release site. (B) cAMP concentration, averaged from 50 to 150 sec, is well fit by single exponential decay. (C) phosphoThr34 DARPP-32 concentration versus time and distance from dopamine release site exhibits minimal spatial gradient. (D) Concentration of phosphoThr34 DARPP-32, averaged between 100 and 250 sec, exhibits a spatial gradient when diffusion of all DARPP-32 forms is zero (red), or diffusion of PKA bound DARPP-32 is zero (blue). Blocking the phosphoThr75-PKA interaction does not change the gradient that appears when diffusion of all DARPP-32 forms is zero (black). All three cases overlap and have the same decay space constant thus, they are difficult to distinguish in the figure. The inset shows the fits alone, which also overlap. (E) Percent of GluA1 phosphorylated on Ser845, averaged between 100 and 250 sec, versus distance from dopamine release site. (F) Percent of GluA1 phosphorylated on Ser845, averaged between 100 and 250 sec, exhibits a spatial gradient when diffusion of the DARPP-32 forms is zero (red), or diffusion of PKA bound DARPP-32 is zero (blue). Blocking the phosphoThr75-PKA interaction does not change the gradient that appears when diffusion of all DARPP-32 forms is zero (black).

The decay length of a molecule's concentration gradient is governed not only by its diffusion constant but also by its inactivation rate [17], [96]. Though PKA is inactivated by the large quantity (� µM) of phosphoThr75 DARPP-32, this inactivation is reversible, similar to calcium binding to calcium buffers [97]. In addition, diffusion of phosphoThr34 DARPP-32 could obscure the gradient of PKA activity. Therefore, to evaluate the role of DARPP-32, simulations were repeated with diffusion constants for various forms of DARPP-32 set to zero.

Fig. 9D and 9F show that a gradient in phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 is observed in the absence of diffusion of any form of DARPP-32 (red traces). The gradient has a spatial decay constant of 14.7ଘ.5 µm for phosphoThr34 DARPP-32, which does not differ significantly from the spatial decay constant of 16.1넒.2 µm for phosphoSer845 GluA1 (P =𠂠.84). To demonstrate that DARPP-32 acts similar to calcium buffers in spreading PKA activity, simulations were repeated with diffusion for only the PKA-bound forms set to zero (both the PKA-DARPP-32 complex and the inhibited PKA-phosphoThr75 DARPP-32 complex), but diffusion of phosphoThr34 DARPP-32 enabled. Fig. 9D and 9E show that a gradient in phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 are observed in these conditions (blue traces). More importantly, the spatial decay constants of the gradient do not differ between these two cases (P =𠂠.8 for phosphoThr34 DARPP-32 and P =𠂠.4 for phosphoSer845 GluA1). As a further demonstration that PKA binding to phosphoThr75 DARPP-32 does not act as an inactivation mechanism, simulations were repeated with this reaction blocked, in the absence of DARPP-32 diffusion. Fig. 9D and 9F (black traces) show that blocking this reaction does not decrease the gradient, and thus the reaction does not act as an inactivation mechanism at this spatial scale.


Metodai

Neuronal culture preparation

Hippocampal neurons dissociated from Wistar rats (P0–P2) were plated on polyorhitine/matrigel pre-coated MEA at a concentration of 8 × 10 5 cells/cm 2 and maintained in a neuron medium as previously described [9]. After 48 h, 5 μM cytosine-β- D-arabinofuranoside (Ara-C) was added to the culture medium in order to block glial cell proliferation. Neuronal cultures were kept in an incubator providing a controlled level of CO2 (5%), temperature (37°C) and moisture (95%).

Electrical recordings and electrode stimulation

Multi electrode array (MEA) recordings were carried out with a MEA60 system (Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany). Stimulations and recordings were carried out after 21–35 days in vitro. Synchronous network bursting was induced by 30 min. treatment with GABAA receptor antagonists, gabazine (20 μM). In some experiments, blockers of the ERK1/2 pathway (50 μM PD98059 and 20 μM U0126) were used. These drugs were pre-incubated before application of gabazine for 45 min. The voltage pulse was bipolar with a duration of 200 μsec. For a given culture, the same amplitude was used as before, during and after GabT. The pattern of stimulation consisted of a train of 40 bipolar pulses separated by an inter-pulse interval of 4s and applied to a bar of six neighbouring electrodes.

Duomenų analizė

Acquired data were analyzed using MATLAB (The Mathworks, Inc.) as previously described [10, 19]. The network firing rate (NFR) is defined as the sum of all electrodes firing rates (i.e. the number of all spikes recorded in the network for each bin). The total number of spikes as a function of the distance d was fitted by the exponential function from which λ was obtained (inset Fig. 1G).

Quantitative RT-PCR

RNA (250 ng) was reverse transcribed using SuperScript II reverse transcriptase and random hexamer (Invitrogen, Milan, Italy). Real-time PCR was performed using iQ SYBR Green supermix (Biorad, Milan, Italy) and the iQ5 LightCycler. Gene specific primers were designed using Beacon Designer (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA). The thermal cycling conditions comprised 3 min at 95°C, and 40 cycles of 10 seconds for denaturation at 95°C and 45 sec for annealing and extension at 58°C. The expression level of the target mRNA was normalized to the relative ratio of the expression of Gapdh mRNR. The forward primer for Gapdh was 5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3', the reverse primer was 5'-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3'. Fold changes calculations were made between treated and untreated samples at each time point using the 2 -ΔΔKT metodas. The forward primer for Egr1 was 5'-AAGGGGAGCCGAGCGAAC-3', the reverse primer was 5'-GAAGAGGTTGGAGGGTTGGTC-3' forward primer for Egr2 was 5'-CTGCCTGACAGCCTCTACCC-3', reverse primer was 5'-ATGCCATCTCCAGCCACTCC-3' forward primer for Egr3 was 5'-ACTCGGTAGCCCATTACACTCAG-3', reverse primer was 5'-GTAGGTCACGGTCTTGTTGCC-3' forward primer for Nr4a1 was 5'-GGTAGTGTGCGAGAAGGATTGC-3', reverse primer was 5'-GGCTGGTTGCTGGTGTTCC-3' forward primer for Arc was 5'-AGACTTCGGCTCCATGACTCAG-3', reverse primer was 5'-GGGACGGTGCTGGTGCTG-3' forward primer for Homer1a was 5'-GTGTCCACAGAAGCCAGAGAGGG-3', reverse primer was 5'-CTTGTAGAGGACCCAGCTTCAGT-3' forward primer for Bdnf was 5'-CGATTAGGTGGCTTCATAGGAGAC-3', reverse primer was 5'-GAAACAGAACGAACAGAAACAGAGG-3'.

Žiūrėti video įrašą: Kaip maistas, kurį valgome, veikia mūsų smegenis Mia Nacamulli (Lapkritis 2024).