We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Šiame straipsnyje (https://jcs.biologists.org/content/122/14/2351), ypač 1 ir 2 paveiksluose, parodyta GFP ir raudonos fluorescencijos išraiška tame pačiame audinyje, ir aš jaučiuosi kaip ta raudona. fluorescencija yra ten, kur yra išreikštas GFP (nors ir silpnesnis nei ten, kur GFP nėra), bet įdomu, kodėl ji nėra geltona? Paprastai, kai šios dvi yra ekspresuojamos tose pačiose ląstelėse (šiuo atveju GFP yra citoplazmoje, o raudona rodo membranos baltymą), pastebima geltona spalva, o ne tokia. Šiame straipsnyje jaučiuosi taip, lyg matau raudoną po žalia, jei tai prasminga…
Jei kas nors žino, ką tai reiškia, prašau patarti! Ačiū.
Šie vaizdai paprastai nėra daromi naudojant spalvotas kameras. Jie daromi naudojant pilkos spalvos kameras, naudojant filtrus, kurie leidžia sužadinimo bangos ilgiams pasiekti mėginį, o emisijos bangos ilgiai – į kamerą.
Norėdami vizualizuoti, šie juodai balti vaizdai dažnai perkeliami į raudoną arba žalią skaitmeninio vaizdo kanalą (televizoriai ir kompiuterių monitoriai sukuria spalvą maišydami skirtingą raudonos, žalios ir mėlynos šviesos kiekį: RGB). Jei kartu yra raudona ir žalia, kuri žmogaus akiai atrodo geltona, tačiau tai nereiškia, kad yra geltona šviesa: tai tik suvokimas.
Jei šiuose vaizduose nematote geltonos spalvos, taip yra todėl, kad raudona ir žalia spinduliuotė nebuvo toje pačioje vietoje.
Raudonai fluorescencinis baltymas eqFP611: taikymas tarpląstelinės lokalizacijos tyrimuose aukštesniuose augaluose
Iš esmės fluorescenciniai baltymai sukėlė revoliuciją molekulinių ląstelių biologijos tyrimuose. Lygiagretus šių baltymų taikymas dvigubo ar kelių žymėjimo eksperimentuose, tokiuose kaip tarpląstelinės lokalizacijos tyrimai, reikalauja nepersidengiančių emisijos spektrų, kad būtų galima vienareikšmiškai aptikti kiekvieną etiketę. Raudonajame spektro diapazone šiandien naudojamas beveik vien tik DsRed ir jo dariniai. Norint patikrinti raudonai fluorescencinio baltymo eqFP611 tinkamumą kaip alternatyvą aukštesniems augalams, buvo analizuojamas šio baltymo elgesys pagal ekspresiją, tarpląstelinį taikymą ir suderinamumą su GFP tabake.
Rezultatai
Laikinai išreikštas tabako protoplastuose, eqFP611 kaupėsi per naktį iki lygio, kurį lengva nustatyti fluorescencine mikroskopu. Natūralus baltymas buvo rastas branduolyje ir citozolyje ir nepastebėta jokio žalingo poveikio ląstelių gyvybingumui. Sujungus su N-galinėmis mitochondrijų ir peroksisominėmis nukreipimo sekomis, raudona fluorescencija buvo išskirtinai tik atitinkamose transfekuotų protoplastų organelėse. Bendrai ekspresuojant su GFP tose pačiose ląstelėse, galima lengvai atskirti eqFP611 ir GFP fluorescenciją, parodant eqFP611 potencialą atliekant dvigubo ženklinimo eksperimentus su GFP. Buvo sukurta plazmidžių serija, skirta eqFP611 ekspresijai augaluose ir vienu metu šio fluorescencinio baltymo ekspresijai kartu su GFP. Buvo sukurti transgeniniai tabako augalai, konstituciškai ekspresuojantys į mitochondrijas nukreiptą eqFP611. Raudonoji fluorescencija buvo stabiliai perduodama kitoms kartoms, todėl šie augalai yra patogus protoplastų, turinčių vidinį mitochondrijų žymeklį, šaltinis.
Išvada
Augaluose eqFP611 yra tinkamas fluorescencinis reporterio baltymas. Nemodifikuotas baltymas gali būti išreikštas lygiais, lengvai aptinkamais epifluorescencine mikroskopija, nepažeidžiant augalų ląstelių gyvybingumo. Jo tarpląstelinė lokalizacija gali būti manipuliuojama N-galo signalų sekomis. eqFP611 ir GFP yra visiškai suderinami atliekant dvigubo ženklinimo eksperimentus.
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G. Ward, W. W. ir Prasher, D. C. (1994) Green Fluorescent Protein as a marker for gen express. Mokslas 263, 802–805.
Prasher, D. C. (1995) Naudojant GFP šviesai pamatyti. Tendencijos Genet. 11, 320–323.
Heim, R., Prasher, D. C. ir Tsien, R. Y. (1994) Žalios spalvos fluorescencinio baltymo bangos ilgio mutacijos ir posttransliacinė autoksidacija. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV. 91, 12501–12504.
Heim, R., Cubitt, A. B. ir R. Y. Tsien (1995) Pagerinta žalioji fluorescencija. Gamta 373, 663–664.
Yang, F., Moss, L. G. ir Phillips, G. N. (1996) Žaliojo fluorescencinio baltymo molekulinė struktūra, Gamtos biotechnologija 14, 1246–1251.
Ormo, M., Cubitt, A. B., Kallio, K., Gross, L. A. Tsien, R. Y. ir Remington, S. J. (1996) Aequorea victoria žalio fluorescencinio baltymo kristalinė struktūra. Mokslas 273, 1392–1395.
Sanger, J. M., Danowski, B. A. ir Sanger, J. W. (2000) Fluorescenciniu būdu pažymėto alfa-aktinino mikroinjekcija į gyvas ląsteles. In: Methods in Molecular Biology: Developmental Biology Protocols (Redaktoriai: Tuan, R. S. ir Lo, C. W.), Humana Press Vol. III, 449–456.
Dabiri, G. A., Turnacioglu, K. K., Sanger, J. M. ir Sanger, J. W. (1997) Myofibrillogenesis vizualizuota gyvuose embrioniniuose kardiomiocituose. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 94, 9493–9498.
Doyle, T. ir Botstein, D. (1996) Mielių žievės aktino citoskeleto judėjimas in vivo. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 93, 3886–3891.
Ayoob, J. C., Turnacioglu, K. K., Mittal, B., Sanger, J. M. ir Sanger, J. W. (2000) „Targeting Of Titin Fragments Coupled to Green Fluorescent Proteins To Z-bands In Living Cardiomyocytes“. Cell Motil. Citoskeletas 45, 67–82.
Moores, S. L., Sabry, J. H. ir Spudich, J. A. (1996) Miozino dinamika gyvai Diktiostelis ląstelės. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 93, 443–446.
Gerisch, G., Albrecht, R., Heizer, C., Hodgkinson, S. ir Maniak, M. (1995) Stebėtas chemoattraktantų kontroliuojamas koronano kaupimasis priekiniame diktiostelio ląstelių krašte Curr. Biol. 5, 1280–1285 (1995).
Heim, R. ir Tsien, R. Y. (1996) Žalios spalvos fluorescencinio baltymo kūrimas siekiant pagerinti ryškumą, ilgesnius bangos ilgius ir fluorescencinės energijos perdavimą. Curr. Biol. 6, 178–182.
Matz, M. V., Fradkov, A. F., Labas, Y. A. ir kt. (1999) Fluorescentiniai baltymai iš nebioliuminescencinių Anthozoa rūšių. Gamtos biotechnologija 17, 969–973.
Lazarides, E. ir Burridge, K. (1975) Alfa-aktininas: raumenų struktūrinio baltymo imunofluorescencinė lokalizacija ne raumenų ląstelėse. Ląstelė 6, 289–298.
Zhukarev, V., Sanger, J. W., Sanger, J. M., Goldman, Y. ir Shuman, H. (1997) Rodamino faloidino prisijungimo prie raumenų pastovios būsenos fluorescencinės poliarizacijos analizė. Cell Motil. Cytoskel. 37, 363–377.
Dabiri, G. A., Ayoob, J. C., Turnacioglu, K. K. Sanger, J. M. ir Sanger, J. W. (1999) Green Fluorescent Proteins, linked with citoskeletal proteins, use of Green Fluorescent Proteins, linked to cytoskeletal proteins, to use of the Green Fluorescent Proteins linked to cytoskeletal proteins, to use of the miofibrillogenesis in live cells. Enzimologijos metodai 302, 171–186.
Weber, M., Moller, K., Welzeck, M. ir Schorr, J. (1995) Lipopolisacharido poveikis transfekcijos efektyvumui eukariotinėse ląstelėse. Biotechnikos 19, 930–940.
Turnacioglu, K. K., Sanger, J. W. ir Sanger, J. M. (1998) Monomerinio aktino įsijungimo vietos gyvose PtK2 ir REF-52 ląstelėse. Cell Motil. Cytoskel. 40, 59–70.
Dabiri, G. A., Turnacioglu, K. K., Ayoob, J. C., Sanger, J. M. ir Sanger, J. W. (1999) Pirminių raumenų ląstelių kultūrų transfekcijos su plazmidėmis, koduojančiomis GFP, susietą su viso ilgio ir sutrumpėjusiais raumenų baltymais. Ląstelių biologijos metodai 58, 239–260.
Sanger, J. M. ir Sanger, J. W. (2000) Citoskeleto baltymų surinkimas į audinių kultūros ląstelių skilimo vagas. Microscopy Res. Tech. 49, 190–201.
Pirminiai antikūnai kaip zondai
Tūkstančiai pirminių antikūnų yra komerciškai prieinami baltymų taikiniams, kurių istorija buvo tirta atliekant biologinius tyrimus. Išskyrus keletą labai populiarių tyrimų taikinių, šie pirminiai antikūnai siūlomi be aptinkamų žymenų, todėl reikalingas tam tikras antrinis (netiesioginis) aptikimo metodas. Nepaisant to, beveik bet kuris antikūnas gali būti paženklintas biotinu, HRP fermentu arba vienu iš kelių fluoroforų, jei reikia.
Priklausomai nuo naudojamo naudojimo, tiekiamas pirminis antikūnas turi būti skirtingo grynumo ir specifiškumo tipų. Kad būtų galima pavadinti tik kelis parametrus, antikūnai gali būti monokloniniai arba polikloniniai, tiekiami kaip antiserumas arba afinitetu išgrynintas tirpalas ir patvirtinti natūralių arba denatūruotų baltymų aptikimui.
Jei dominančiam antigenui antikūnų nėra, naujus antikūnus galima gaminti (išauginti) naudojant nusistovėjusius gyvūnų imunizavimo metodus paruoštomis antigeno formomis. Galimi įvairūs reagentai, padedantys gaminti ir išvalyti antikūnus, o įvairios įmonės specializuojasi antikūnų gamybos paslaugose.
Fotokonvertuojami fluorescenciniai baltymai: universalus įrankis zebrafish skeleto vaizdavimui
Andy Willaert, Medicininės genetikos centras, Biomolekulinės medicinos skyrius, Gento universiteto-universitetinė ligoninė, Medicinos tyrimų korpusas – MRB1, Entrance 34, Corneel Heymanslaan 10, B-9000 Gent, Belgija.
Medicininės genetikos centras, Biomolekulinės medicinos skyrius, Gento universitetinė ligoninė, Gentas, Belgija
Medicininės genetikos centras, Biomolekulinės medicinos skyrius, Gento universitetinė ligoninė, Gentas, Belgija
Medicininės genetikos centras, Biomolekulinės medicinos skyrius, Gento universitetinė ligoninė, Gentas, Belgija
Evoliucinės raidos biologija, Gento universiteto Biologijos katedra, Gentas, Belgija
Evoliucinės raidos biologija, Gento universiteto Biologijos katedra, Gentas, Belgija
Evoliucinės raidos biologija, Gento universiteto Biologijos katedra, Gentas, Belgija
Medicininės genetikos centras, Biomolekulinės medicinos skyrius, Gento universitetinė ligoninė, Gentas, Belgija
Medicininės genetikos centras, Biomolekulinės medicinos skyrius, Gento universitetinė ligoninė, Gentas, Belgija
Andy Willaert, Medicininės genetikos centras, Biomolekulinės medicinos skyrius, Gento universiteto-universitetinė ligoninė, Medicinos tyrimų korpusas – MRB1, Entrance 34, Corneel Heymanslaan 10, B-9000 Gent, Belgija.
Informacija apie finansavimą: Gento universitetas, stipendijų / apdovanojimų numeriai: BOFMET2015000401, BOF24J2015001401
Abstraktus
Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų zebrafish (Danio Rerio) tyrimai – tai konkrečių ląstelių populiacijų vizualizavimas arba manipuliavimas naudojant transgenines reporterių linijas. Šių transgeninių zebrafish, pasižyminčių specifine dažnai naudojamų fluoroforų, tokių kaip žalias fluorescencinis baltymas (GFP) arba mCherry, ekspresija ląstelėms ar audiniams, yra gana lengva naudojant šiuolaikinius metodus. Fluoroforai, turintys skirtingą emisijos bangos ilgį ir varomi skirtingų promotorių, gali būti stebimi vienu metu tame pačiame gyvūne. Fotokonvertuojami fluorescenciniai baltymai (pcFP) skiriasi nuo šių standartinių fluoroforų, nes jų spinduliuotės spektras pasikeičia veikiant UV šviesai, o šis procesas vadinamas fotokonversija. Čia pateikiami pcFP naudojimo vienkartiniam ir dvigubam fluorochromo vaizdavimui pranašumai ir universalumas atliekant zebrafinių skeleto tyrimus anksčiau sukurtoje osx:Kaede transgeninės linijos yra iliustruotos. Šioje eilutėje, Kaede, kuri yra išreikšta kontroliuojant steriksas, kitaip žinomas kaip sp7, promotorius, taip pažymėdamas nesubrendusius osteoblastus, gali pereiti nuo žalios į raudoną fluorescenciją, kai švitinamas UV šviesa. Pirma, šis tyrimas parodo tai osx:Kaede išraiškos modelis panašus į anksčiau aprašytą osx:nuGFP transgeninė linija tiek lervų, tiek suaugusiųjų stadijose, tokiu būdu patvirtinant šios linijos naudojimą nesubrendusių osteoblastų vaizdavimui. Išsamesni eksperimentai išryškina skirtingas programas osx:Kaede, pvz., linijos atsekimas ir jo naudojimas kartu su in vivo skeleto dažymas ir kiti transgeniniai fonai. Mineralinis dažymas kartu su osx:Kaede patvirtina nuo osteoblastų nepriklausomą notochordo mineralizaciją. Osteoblastų linijos atsekimas atskleidžia skleroblastų migraciją ir diferenciaciją pelekų regeneracijos metu. Galiausiai šis tyrimas rodo, kad sujungus du transgenikus, osx:Kaede ir osc:GFP, su panašiais emisijos bangos ilgiais galimas naudojant pcFP, pvz., Kaede.
Filialai
NanoBiofotonikos katedra, Max Planck Biofizinės chemijos institutas, Am Fassberg 11, Göttingen, 37077, Vokietija
Steffen J. Sahl, Stefan W. Hell ir Stefan Jakobs
Optinės nanoskopijos skyrius, Max Planck medicinos tyrimų institutas, Jahnstrasse 29, 69120, Heidelbergas, Vokietija
Vokietijos vėžio tyrimų centras (DKFZ), BioQuant, Im Neuenheimer Feld 267, 69120, Heidelbergas, Vokietija
Neurologijos skyrius, Getingeno universiteto medicinos fakultetas, Robert-Koch-Strasse 40, 37075, Göttingen, Vokietija
Taip pat galite ieškoti šio autoriaus PubMed Google Scholar
Taip pat galite ieškoti šio autoriaus PubMed Google Scholar
Taip pat galite ieškoti šio autoriaus PubMed Google Scholar
Įnašai
Visi trys autoriai vienodai prisidėjo prie visų keturių straipsnio rengimo aspektų (straipsnio duomenų tyrimo, svarbaus indėlio į turinio aptarimą, rašymą, rankraščio peržiūrą ir redagavimą prieš pateikiant).
Atitinkami autoriai
Metodai
Augalinės medžiagos ir augimo sąlygos
Populus klonai P. davidiana × bolleana (žinomas kaip Shanxin yang, prof. Zhang dovana [63], kilusi iš Heilongdziango provincijos Miškų ir aplinkos akademijos, Heilongjiang, Kinija), P. tremula × alba „INRA 717-1B4“ (prof. Z. Ye dovana iš Džordžijos universiteto, Džordžija, JAV, kilusi iš Prancūzijos nacionalinio žemės ūkio, maisto ir aplinkos tyrimų instituto, Prancūzija), P. alba × glandulosa „84 K“ (iš Pietų Korėjos pristatė Kinijos miškininkystės akademija, Pekinas, Kinija), P. euramericana „74/76“ (iš Italijos pristatė Kinijos miškininkystės akademija, Pekinas, Kinija), P. tomentosa „741“ (Hebėjaus žemės ūkio universitetas, Hebėjus, Kinija), P. tomentosa „B331“ (Pekino miškininkystės universitetas, Pekinas, Kinija), P. tomentosa „BJHR01“ (bendradarbiaujant išvesta Pekino žemės ūkio ir miškų mokslų akademijoje, Pekine, Kinijoje ir Pekino miškininkystės universitete, Pekine, Kinijoje), P. popularis „35–44“ (Kinijos miškininkystės akademija, Pekinas, Kinija), P. davidiana (prof. T. Jiang dovanėlė, Šiaurės rytų miškų universitetas, Heilongjiang, Kinija, kilusi iš Heilongdziango, Kinija), P. alba var. piramidės (prof. C. Xu dovana iš Pietvakarių universiteto, Čongčingas, Kinija, kilusi iš Sindziango, Kinija), P. trichocarpa (Nisqually-1, Šiaurės Amerika) iš pradžių buvo auginami Murashige & Skoog (MS) terpėje (Phytotech, M519), papildytos 3% sacharozės ir 0,6% agaro. Kloninis tuopų augalų dauginimas buvo atliktas, kaip aprašyta Wang ir kt. [68], o augalai buvo kultivuojami sterilioje MS terpėje 16 h/8 h dienos/nakties fotoperiodu 25 °C temperatūroje augimo kameroje. Po 3 augimo savaičių įsišakniję augalai buvo perkelti į dirvą ir auginami 16 h / 8 h dienos / nakties fotoperiodu 25 ° C temperatūroje klimato kameroje. Perkėlus į dirvą, augalai vieną savaitę buvo uždengti skaidriais dangteliais, kad būtų išvengta vandens pertekliaus iš lapų. Pradiniams eksperimentams, kurių metu buvo tikrinami tuopų klonai, tuopos augalai buvo auginami klimato kameroje mėnesį prieš infiltraciją. Eksperimentui, vertinančiam augalų amžiaus ir lapų amžiaus įtaką P. davidiana × bolleana Dėl trumpalaikio ekspresijos efektyvumo penkios 3 savaičių amžiaus in vitro kultivuotų augalų partijos buvo perkeltos į dirvą 3 dienų intervalu. Pirmajai augalų partijai dirvožemyje po 3–4 augimo savaičių sulaukus PI 14 amžiaus, agroinfiltracija buvo atlikta skirtingų PI 10, 11, 12, 13 vystymosi stadijų augalų LPI 4 lapams [39, 40]. 14, o ant lapų LPI 3–6 iš augalų PI 12. Vėlesniems eksperimentams, siekiant įvertinti AS koncentracijos, bakterijų augimo fazės, bakterijų ląstelių tankio, infiltracinės terpės ir trumpalaikės ekspresijos trukmės poveikį trumpalaikės ekspresijos efektyvumui, augalai buvo atlikti. auginami klimato kameroje 2 savaites, ty PI
Lapų švirkšto infiltracija
Agrobacterium tumefaciens padermė GV3101, A. tumefaciens EHA105 ir A. rhizogenes C58C1 buvo gauti iš laboratorijos ir A. tumefaciens padermės AGL1 ir LBA4404 buvo įsigyti iš Shanghai Weidi Biotechnology Co., Ltd. (Šanchajus, Kinija). Dieną prieš infiltraciją agrobakterijos su specifiniu dvejetainiu vektoriumi (S6 pav.), pradedant nuo vieno klono agaro plokštelėse, buvo auginamos skystoje LB terpėje per naktį 28 °C temperatūroje ant purtyklės. Kitą rytą nauja bakterijų kultūra buvo pradėta sėti į šviežią terpę senomis suspensijos kultūromis (santykis 1/50, t/t) dar 5–6 valandas iki OD.600
1. Tada kultūros buvo perkeltos į Eppendorf mėgintuvėlius ir centrifuguojamos 8000 laipsnių kampu g 2 min. kambario temperatūroje ir suspenduotas nurodytoje infiltracinėje terpėje [10 mM MgCl2, 5 mM MES-KOH (pH 5,6) ir 0,2 mM AS] [29] iki galutinio OD600
1 pradiniuose eksperimentuose. Vėlesniems eksperimentams agrobakterijų kultūros buvo suspenduotos modifikuotoje infiltracinėje terpėje [10 mM MgCl2, 5 mM MES-KOH (pH 5,6) ir 1,6 mM AS]. Eksperimentams, kuriuose vertinamas bakterijų kultūros augimo stadijų ir ląstelių koncentracijos poveikis trumpalaikiam ekspresijos efektyvumui, arba vienos nakties kultūra su OD.600 apie
2.0 buvo naudojamas tiesiogiai infiltracijai po to, kai buvo suspenduotas modifikuotoje infiltracinėje terpėje su galutiniu OD600 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 arba 2,0 arba atnaujinta kultūra buvo auginama iki galutinio OD600 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 arba 2,0 ir pakartotinai suspenduoti modifikuotoje infiltracinėje terpėje su tokiu pačiu OD kaip ir pradinė kultūra. Bakterijų suspensija prieš agroinfiltraciją buvo patalpinta tamsoje 1–2 valandoms kambario temperatūroje.
Augalai, naudojami švirkšto infiltracijai, buvo aprašyti aukščiau. Bakterijų suspensijos buvo prasiskverbtos į tuopos lapus per stomatą, prispaudžiant 1 ml švirkšto galą be adatos prie apatinės lapo pusės ir švelniai spaudžiant stūmoklį. Paprastai į vieną lapą buvo atliekamos kelios injekcijos, siekiant padidinti infiltruotas dalis. Infiltruota lapų sritis buvo apjuosta žymekliu, po to tuopos augalai buvo auginami klimato kameroje 5 dienas ir buvo naudojami genų ekspresijai įvertinti. Dviejų ar daugiau tikslinių genų koekspresijai vienodas tūris A. tumefaciens pakaba su OD600
1,0 infiltracijos terpėje buvo sumaišytas prieš infiltraciją.
LUC aktyvumo tyrimas
CaMV 35S:LUC vektorius (S6a pav.) buvo prof. Wang (Kinijos žemės ūkio universitetas, Pekinas, Kinija) dovana [69]. Bendras baltymas buvo išgautas iš infiltruoto lapų ploto, o 50 μl baltymų ekstrakto buvo panaudota ugniagesių luciferazės aktyvumui nustatyti naudojant Luciferase Assay Reagent (Promega) ir liuminescencinį skaitytuvą (Glo-Max®20/20 Promega) pagal gamintojo protokolas. Baltymų koncentracija buvo kiekybiškai įvertinta Bradfordo baltymų tyrimu. LUC aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal šviesos intensyvumą mikrogramui baltymo. Kiekvienas duomenų taškas reiškė mažiausiai aštuonias kopijas. Buvo atlikti trys nepriklausomi eksperimentai.
GUS dažymas
Lapai, kaliusas ir augalas, kurie buvo transformuoti su pCAMBIA2301-CaMV 35S:GUS-intro (S6b pav.) buvo nudažyti β-gliukuronidazės (GUS) aktyvumui, kaip aprašyta [70]. Į vidų buvo įdėtas augalinės kilmės intronas GUS kad būtų išvengta reporterio geno ekspresijos Agrobakterija.
Subląstelinė lokalizacija ir BiFC tyrimas
Keletas baltymų iš P. davidiana × bolleana buvo tiriami dėl jų tarpląstelinės lokalizacijos. Norėdami paruošti GFP pažymėtus vektorius, kodavimo sritys CBL1, MTP1, C4H, GT47C, MYB221, ir PrxQ buvo amplifikuoti atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandinine reakcija (RT-PCR), naudojant specifinius pradmenis, į kuriuos buvo įtraukti atitinkami restrikcijos fermentai (S1 lentelė), o po to klonuoti į dvejetainį vektorių pSuper1300-SUPER:GFP (S6c pav.). The A. tumefaciens GV3101 suspensija, turinti vieną iš šių vektorių, buvo infiltruota į LPI 4 lapus P. davidiana × bolleana augalai PI 11–12, naudodami švirkštą pagal optimalius eksperimentinius parametrus, aprašytus aukščiau skyriuje „Rezultatai“. Esant 5 dpi, infiltruoti lapai buvo atskirti, o GFP fluorescenciniai signalai buvo stebimi naudojant Nikon apverstą fluorescencinį mikroskopą TE2000-E, kai sužadinimo bangos ilgis buvo 488 nm, o emisijos bangos ilgis - 510 nm. Norint nustatyti tarpląstelinius skyrius, plazmos membrana buvo dažoma FM4-64 (20 mg/l, Invitrogen) 1 min., branduolys dažomas DAPI (1 mg/mL, Sigma) 10-20 min., ER buvo. nurodyta naudojant ER žymeklio sulietą baltymą HDEL-mCherry [71], o Golgi buvo nurodyta naudojant Golgi žymeklio sulietą baltymą NAG-mCherry [71]. FM4–64 fluorescencija buvo aptikta esant sužadinimui ties 543 nm ir spinduliuote 610 nm, o DAPI – su sužadinimu ties 358 nm ir emisija ties 461 nm. Sulietų baltymų HDEL-mCherry ir NAG-mCherry raudoni fluorescenciniai signalai buvo stebimi esant 543 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 610 nm emisijos bangos ilgiui. Chlorofilas buvo aptiktas jo autofluorescencija esant 488 nm sužadinimui ir 681 nm spinduliuotei.
BiFC tyrimui koduojanti sritis AtWRKY40 buvo amplifikuotas naudojant specifinius pradmenis (S1 lentelė) ir klonuotas į pSPYNE173 (NE) ir pSPYCEM (CE) vektorius (S6e pav.) [72]. YFP fluorescenciniai signalai buvo stebimi esant 488 nm sužadinimui ir 510 nm spinduliuotei. Branduolio vizualizacija su DAPI dažais buvo atlikta, kaip aprašyta aukščiau.
Padalintos luciferazės tyrimas
GV3101 Agrobakterijos nešantis konstrukcijas 35S:AtNRT3.1-Nluc, 35S:AtNRT2.1-Cluc, 35S:Nluc, ir 35S:Cluc (S6f pav.) padovanojo prof. Wang (Kinijos žemės ūkio universitetas, Pekinas, Kinija). Suskaidytos liuciferazės tyrimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta [73] su tam tikrais pakeitimais. Konkrečiai, transformuoti lapai buvo infiltruoti 2 mM liuciferinu, naudojant švirkštą be adatos esant 5 dpi, o po to palikti tamsoje 6 min., kad numalšintų fluorescenciją. Liuminescencijos intensyvumas buvo užfiksuotas silpno apšvietimo aušinamu CCD vaizdo aparatu (Lumazone PyLoN2048B, Roper Scientific), kurio ekspozicijos laikas buvo 5–10 min., kai fotoaparatas buvo atvėsintas iki –110 °C. Vaizdo gavimas buvo valdomas ir apdorotas Light Field programine įranga.
Western blot ir bendro imunoprecipitacijos tyrimai
Dėl Western blot infiltruoti lapai su A. tumefaciens GV3101 arba EHA105 nešiojimas Super:GFP-Vėliava (S6d pav.) buvo nuimti 5 dpi. Bendrų baltymų ekstrahavimas iš infiltruotų lapų dalių ir Western blot tyrimas buvo atliktas pagal Ticconi ir kt. [71]. Trumpai tariant, 10% SDS-PAGE buvo atskirta 15–30 μg baltymų. Anti-Flag (MBL) ir anti-Actin (Abmart) buvo naudojami kaip pirminiai antikūnai. Vaizdo gavimas buvo užfiksuotas CCD nuotolinio valdymo mokslo vaizdavimo sistema (LAS-4000, FUJIFILM). Bendro imunoprecipitacijos tyrimui, A. tumefaciens GV3101 talpykla Super:PtoUBC34s-Vėliava arba Super: PtoMYB221-Mano C (S6g pav.) buvo naudojamas infiltracijai. Bendras imunoprecipitacijos tyrimas buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [47].
FRET-FLIM tyrimas
PtoMYB221 ir PtoUBC34 sąveika buvo aprašyta ankstesniame tyrime [47]. Donoro vektorius pGreen0029-35S:YFP-PtoUBC34s ir receptoriaus vektorius pGreen0029-35S:PtoMYB221-RFP (S6h pav.) buvo kartu perkelti į tuopos lapus per Agrobakterija- tarpininkaujant švirkšto infiltracijai, kaip aprašyta aukščiau. FRET-FLIM buvo atliktas naudojant Olympus apverstą FV1200 mikroskopą, papildomai aprūpintą Picoquant picoHarp300 (Vokietija) valdikliu pagal aprašytą metodą [74]. YFP-PdbUBC34s buvo sužadintas esant 488 nm, naudojant pikosekundinį impulsinį diodinį lazerį, veikiantį 40 MHz pasikartojimo dažniu per objektyvą (40 × panardinimas į vandenį, NA 1.2). Išspinduliuota šviesa buvo surinkta į tą patį objektyvą ir filtruojama naudojant 520/35 nm pralaidumo filtrą. Tada fluorescencija buvo aptikta MPD SPAD detektoriumi. Buvo pasirinktas ir gautas vaizdų dominantis regionas, kai fotonų skaičius buvo iki 20 000 ar daugiau. „SymphoTime 64“ programinė įranga („PicoQuant“, Vokietija) buvo naudojama mažėjimo kreivėms vienam pikseliui apskaičiuoti ir pritaikyta mažėjimo modeliui. Bandymo deriniui su donoro YFP-PdbUBC34 ir receptoriumi PdbMYB221-RFP buvo pasirinktas dvigubas eksponentinis, o monoeksponentinis modelis buvo taikomas tik donoro YFP-PdbUBC34 kaip kontrolė.
Sandorių tyrimai
CaMV vektoriai 35S-GAL4DB-SUPRD ir CaMV 35S-GAL4-TATA-Ω-LUC-Nr buvo dovanos iš prof. Masaru Ohme-Takagi (Nacionalinis pažangiosios pramonės technologijų ir mokslo institutas, Tokijas, Japonija) [47], iš kurių regionai GAL4DB-SUPRD ir GAL4-TATA-Ω buvo amplifikuoti pradmenimis (S1 lentelė) ir klonuoti atitinkamai į dvejetainius pGreenII 62-SK ir pGreenII 0800-LUC vektorius (S6i pav.), gaminant efektoriaus vektorių ir reporterio vektorių. Išraiškos kasetė Renilla luciferazė (RLuc) taip pat buvo įtraukta į pGreenII 0800-LUC vektorių, kuri tarnauja kaip vidinė kontrolė. Operacijų tyrimai buvo atlikti naudojant Dual-Luciferase Reporter Assay System (#E1980, Promega) pagal gamintojo protokolą. Kiekvienos transformacijos LUC ekspresijos reikšmės buvo normalizuotos į RLuc vertes. Kiekvienas duomenų taškas reiškia mažiausiai aštuonias kopijas. Buvo atlikti trys nepriklausomi eksperimentai.
Antrinių sienų indukcija
Trijų pagrindinių SCW biosintezės aktyvatorių kodavimo sritys, būtent VNS07/WND6A, VNS09 / WND2A, ir MYB020, buvo sustiprinti iš P. davidiana × bolleana cDNR su pradmenimis (S1 lentelė) ir klonuota į dvejetainį vektorių pGreenII 62-SK (S6i pav.), kad būtų išvengta trumpalaikės per didelės ekspresijos tuopos lapuose. Vektorius pGreenII 62-SK buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Laikinai transformuoti lapai buvo nudažyti baziniu fuksinu esant 10 dpi ir konfokaliniu mikroskopu stebimi antrinis sienelių nusodinimas, kaip aprašyta anksčiau [75].
Stabiliai transformuotos tuopos generavimas
Įsiskverbę lapai su Agrobakterija GV3101, turintis dvejetainę plazmidę pSuper1300-Super:GFP (S6c pav.) su atsparumu higromicinui arba CaMV35S:GUS-intro (S6b pav.), turintys atsparumą kanamicinui, buvo nuimti iš augalų 9 dpi dažniu. Šie lapai buvo kruopščiai nuplauti po tekančiu vandeniu iš čiaupo, 10 minučių sterilizuoti 2% natrio hipochlorito tirpalu, papildytu 0,01% Tween 20, ir tris kartus nuplauti steriliu vandeniu. Infiltruota lapų dalis, pažymėta įsiskverbimo metu, buvo supjaustyta į gabalus atsargiai, kad būtų išvengta vidurinio šonkaulio. Transformuoti augalai buvo regeneruoti per kalio sukeltą netiesioginę organogenezę. Pirma, kalio indukcija buvo atlikta naudojant MS terpę, papildytą 1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l NAA, 0,2 mg/l 6-BA, 0,01 mg/l TDZ, 0,1 g/l Tim, 0,1 g. /L Cefo ir 4,5 mg/l higromicino (GFP transformantams) arba 50 mg/l kanamicino (GUS transformantams) 25 °C temperatūroje tamsoje 3–4 savaites. Tada kauliukai buvo perkelti į šaudymo terpę [MS terpė, papildyta 0,1 mg/l NAA, 0,2 mg/l 6-BA, 0,01 mg/l TDZ, 0,1 g/l Tim, 0,1 g/l Cefo ir 4,5 mg/ L higromicinas (GFP transformantams) arba 50 mg/l kanamicino (GUS transformantams)] ir kultivuojamas 25 °C temperatūroje su 16 h šviesos/8 h šviesos/tamsos ciklu. Šie kauliukai buvo subkultūrinami ant šviežios šaudymo terpės kas 2 savaites, kol susiformavo ūgliai. Ūgliai buvo iškirpti maždaug 1,0 cm žemyn nuo viršūnės galo ir kultivuojami ant šaknų terpės (MS terpė, papildyta 0,1 mg/l NAA, 0,1 g/l Tim, 0,1 g/l Cefo ir 4,5 mg/l higromicinu (GFP transformantams). ) arba 50 mg/l kanamicino (GUS transformantams)) 25 °C temperatūroje ir 16 h šviesos/8 h šviesos/tamsos ciklais. GFP teigiami kauliukai buvo patikrinti naudojant DFP-1 dvigubo fluorescencinio baltymo žibintuvėlį (Night Sea, JAV), prieš perduodant juos ūglių regeneracijai. Calli pristatė su GUS buvo nudažyti GUS po to, kai buvo iškirpti regeneruoti ūgliai. Įsišaknijimo regenerantai, kuriuose šaknys atsirado per 5–10 dienų po perkėlimo į įsišaknijimo terpę, buvo tikrinami dėl reporterių GFP arba GUS ekspresijos. Transformacija per tiesioginę organogenezę buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [63].
GFP fluorescenciniai signalai transformuotame kaliuse ir nepažeistuose augaluose, ekspresuojančiuose GFP reporterį, buvo stebimi naudojant DFP-1 dvigubo fluorescencinio baltymo žibintuvėlį (Night Sea, JAV). Augalinės medžiagos buvo apšviestos RB-Royal Blue (400–460 nm) ir stebimos bei nufotografuotos per geltoną filtrą.
Mikroskopija
Tuopos lapai LPI 4, išskyrus lapus LPI 3 iš P. trichocarpa, buvo naudojami vidinei lapų struktūrai tirti. Skersinės lapų dalys buvo paruoštos taip, kaip aprašyta anksčiau [76]. Penkių mikrometrų storio pjūviai buvo supjaustyti mikrotomu (Leica RM2265, Vokietija), nudažyti toluidino mėlynuoju O (TBO), kaip aprašyta anksčiau [68], ir stebimi naudojant Leica DM 5500 B šviesos mikroskopą (Leica, Vokietija).
Diskusija
Nors šiuo metu žalios spalvos fluorescencinės GECI yra veiksmingiausios neuronų signalizacijos in vivo vizualizavimo priemonės, tikimės, kad vieną dieną raudonai fluorescenciniai GECI jie bus nereikalingi dėl būdingų pranašumų, susijusių su ilgesnio bangos ilgio fluorescencija. Audinių pralaidumas didėja didėjant bangos ilgiui, todėl raudonai fluorescuojantys GECI leis neuronų aktyvumą pavaizduoti giliau į smegenų audinį, nei tai įmanoma naudojant žaliai fluorescencinius GECI, darant prielaidą, kad visos kitos savybės yra lygiavertės [24, 30]. Be to, raudonai fluorescencinės GECI leidžia atlikti kelių parametrų vaizdą kartu su žaliais fluorescenciniais indikatoriais ir palengvina vienalaikį vaizdą bei optinį aktyvavimą, kai jie naudojami kartu su mėlyna šviesa įjungiamomis optogenetinėmis pavaromis, tokiomis kaip ChR2 [42]. Tačiau, kaip plačiai pripažįstama [13, 19, 22, 24], raudonieji GECI šiuo metu turi daug apribojimų, palyginti su labiausiai optimizuotais žaliais GECI (ty GCaMP6) [17]. Šie apribojimai apima sumažėjusį jautrumą RCaMP variantams ir sudėtingą fotofiziką bei lizosomų kaupimąsi R-GECO variantams. Kadangi ir žalios, ir raudonos GECI yra analogiškos konstrukcijos ir turi identiškus Ca 2+ surišimo domenus, šios nepageidaujamos savybės yra susijusios su RFP pastoliais, naudojamais raudoniesiems GECI generuoti.
Norėdami įveikti apribojimus, susijusius su dabartiniais RFP pastoliais, atkreipėme dėmesį į eqFP578 išvestą monomerinių RFP (ty mKate ir jo darinių) liniją [7, 8, 9], kurios, išreiškiamos, suteikia ryškią ir tolygiai paskirstytą fluorescenciją. transgeninių pelių neuronuose [31]. Naudodami pusiau racionalų dizainą ir nukreiptą evoliuciją, sukūrėme naują raudonai fluorescencinį Ca 2+ indikatorių K-GECO1, pagrįstą mKate variantu FusionRed [9]. Tikėjomės, kad K-GECO1 išsaugos palankias savybes, susijusias su pradiniu šablono RFP. Mes nustatėme, kad šis lūkestis iš esmės yra teisingas, nes nepastebėjome lizosomų agregacijos disocijuotuose žiurkių neuronuose, zebrafish neuronuose ar fiksuotame pelių smegenų audinyje, ekspresuojančiame K-GECO1. Kai kurios fluorescencinės taškinės struktūros buvo pastebėtos atliekant funkcinį vaizdą in vivo.
Kitas išskirtinis K-GECO1 bruožas yra ckkap peptido naudojimas kaip CaM surišimo partneris Ca 2+ surišimo motyvui. Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis [23, 35], ckkap / CaM motyvas davė mažesnį matomą Kd Ca 2+ ir greitesnei kinetikai (palyginti su RS20/CaM), o tariamas Hillo koeficientas artimas 1. Šios charakteristikos turėtų leisti jautriau aptikti Ca 2+ dinamiką fiziologiniuose diapazonuose, kaip matyti iš didelio K-GECO1 fluorescencinio atsako. vieno veikimo potencialo amplitudė. Kai Hill koeficientas yra artimas 1, K-GECO1 turėtų užtikrinti tiesiškesnį Ca 2+ atsaką po kelių dirgiklių.
K-GECO1 rentgeno kristalų struktūra rodo, kad indikatorius turi savarankišką fluorescencijos moduliavimo mechanizmą, panašų į siūlomą R-GECO1 [22, 29]. Skirtingai nuo GCaMP, kuriame fluorescencijos moduliavimo mechanizmas priklauso nuo sąveikos su CaM liekana [43] (2l pav.), K-GECO1 Ca 2+ surištą būseną greičiausiai stabilizuoja vandenilinis ryšys tarp fenolatinės grupės chromoforo ir linkerio1 liekanos Asn32 (2i pav.). Dėl to cpFusionRed baltymas K-GECO1 yra potencialiai naudingas šablonas kaip signalo perdavimo domenas, kuris turi būti derinamas su kitais surišimo domenais, kad būtų sukurti nauji raudonos spalvos fluorescencinių indikatorių tipai. The crystal structure also reveals that the ckkap/CaM motif in K-GECO1 has a reversed binding orientation for CaM compared with the RS20/CaM binding patterns in R-GECO1, RCaMP, and GCaMP6 (Fig. 2e–h). These results indicate that the GCaMP-like design is versatile enough to tolerate different peptide conformations and CaM orientations, and that exploring a wider range of CaM binding partners is likely to lead to GECIs with new and improved properties.
First-generation red GECIs, including mApple-based R-GECO1 and mRuby-based RCaMP1h, have been optimized using a neuron screening platform [24, 44], resulting in jRGECO1a and jRCaMP1a/b with greatly improved in vivo performance for detection of action potentials. Although K-GECO1 is a first-generation red GECI, it already provides performance that, by some criteria, is comparable to second-generation red GECIs. Specifically, K-GECO1 has a fluorescent response to single action potentials that is similar to that of jRGECO1a (and superior to jRCaMP1a/b) and faster dissociation kinetics than either jRGECO1a or jRCaMP1a/b. However, by other criteria, K-GECO1 will require further optimization to match the performance of second-generation red GECIs. For example, K-GECO1 does not provide the same level of in vivo sensitivity as the highly optimized jRGECO1a. In addition, K-GECO1 showed some blue-light-dependent photoactivation during in vitro characterization, though less so than R-GECO1. The photoactivation of K-GECO1 was not detectable under the illumination condition in our characterizations in cultured dissociated neurons (Additional file 5: Figure S3c) or in iPSC-CMs (Fig. 4c), suggesting that it is more suitable than R-GECO1 for use with blue/cyan-excitable optogenetic actuators. Nevertheless, the occurrence (or absence) of photoactivation will depend on the specific illumination conditions, and so appropriate controls (i.e., blue-light illumination of tissue expressing K-GECO1 but no optogenetic actuator) must be performed. Future efforts to screen K-GECO variants in neuronal cells, as was done for R-GECO1 and RCaMP1h [24], could lead to the discovery of improved variants with higher levels of expression in neurons, Kds tuned to the range of neuronal cytoplasmic Ca 2+ concentrations, increased cooperativity of Ca 2+ binding to improve single action potential detection, diminished lysosomal accumulation, and minimum blue-light activation.
Programos
Single or multiple promoter reporter monitoring studies
Live-cell monitoring of promoter reporters
Additional product information
Please see the product's Certificate of Analysis for information about storage conditions, product components, and technical specifications. Please see the Kit Components List to determine kit components. Certificates of Analysis and Kit Components Lists are located under the Documents tab.
Takara Bio USA, Inc.
Jungtinės Valstijos / Kanada: +1.800.662.2566 & Bull Azijos ir Ramiojo vandenyno: +1.650.919.7300 & Bull Europa: +33.(0)1.3904.6880 & Bull Japonija: +81.(0)77.565.6999
TIK TYRIMO NAUDOJIMAS. NĖRA NAUDOTI DIAGNOSTIJOS PROCEDŪROMS. &kopija 2021 Takara Bio Inc. Visos teisės saugomos. Visi prekių ženklai priklauso „Takara Bio Inc.“ arba jos filialui (-ėms) JAV ir (arba) kitose šalyse arba atitinkamiems jų savininkams. Tam tikri prekių ženklai gali būti registruoti ne visose jurisdikcijose. Papildomą informaciją apie produktą, intelektinę nuosavybę ir ribotą naudojimą rasite adresu takarabio.com.
„Takara Bio Europe“ priklauso „Takara Bio Group“ – pirmaujančiai gyvosios gamtos mokslų bendrovei, kuri yra įsipareigojusi gerinti žmonių būklę pasitelkdama biotechnologijas. Per savo prekės ženklus „Takara“, „Clontech“ ir „Cellartis“ mūsų misija yra kurti aukštos kokybės naujoviškus įrankius ir paslaugas, kad būtų paspartintas atradimas.
Green Fluorescent Protein Quantification in Microplates
The assessment of gene expression is an important tool in molecular and cellular biology. Several methods have been developed, but most cannot provide real-time information concerning expression. Here we report the quantitation of cellular extracts from cells expressing the gene for green fluorescent protein (GFP) using the FL600 Fluorescent Microplate Reader in order to demonstrate the feasibility of GFP to assess "real-time" gene expression.
Įvadas
The assessment of gene expression has become one of the most utilized tools in molecular and cellular biology today. The expression of transiently and/or permanently transfected cloned DNA sequences allows the investigator to determine the transcriptional activity of promoters. Unfortunately, in most instances the natural product of the promoter cannot be assayed in a quantitative manner. In the past, the promoter was joined to a reporter gene which encoded for a protein with unique enzymatic activity, such as ß-galactosidase or chloramphenicol acetyltransferase, that could be assayed easily. The level of gene activity would then be monitored as a function of that enzymatic activity. These assays, while easy to perform and generally quite quantitative, suffer from their inability to be measured in "real time". In these assays it was generally necessary to make cell lysates and perform the reaction at some later time on the lysates. The Achilles&rsquo heel of these experiments is the stability of the enzyme throughout storage and during the actual assay. Recently, the use of inherently fluorescent proteins, such as green fluorescent protein (GFP), has been described as a means to assess gene expression and transfection efficiency.
Green fluorescent protein (GFP) from the jellyfish Aequorea victoria is a 27-kDalton monomer protein consisting of 238 amino acids which is naturally fluorescent (1). Its role is to transduce, by energy transfer, the blue chemiluminescence of another protein, aequorin, into green fluorescent light (10). The wild type green fluorescent protein (wtGFP) has an absorbance/excitation peak at 395 nm with a minor peak at 475 nm (UV to blue light), and has a peak emission at 508 nm, with a shoulder at 540 nm (green light). The crystal structure of the protein suggests a closely packed b-can enclosing a a-helix (9). The chemical structure necessary for fluorescence has been determined and the data suggest a hexapeptide that contains a cyclic-tripeptide moiety, serine, dehydro-tyrosine, glycine, which is covalently linked through the protein&rsquos peptide backbone (2). The exact mechanism of formation of this unique structure is unknown, but it takes place post-translationally and requires molecular oxygen (6). Interestingly, the hexapeptide is contained within the a-helix portion of the protein suggesting that the b-can provides the means to exclude solvents and molecular oxygen, which tend to quench fluorescent signal (9). Unlike other bioluminescent reporters, which require additional proteins, substrates, or cofactors to emit light, GFP is inherently fluorescent and its fluorescence is not species-specific.
As shown in Table 1, several mutations have been made to the wild type protein (wtGFP) to improve one or more characteristics of the protein. The most widely used variants are the red-shifted GFPs. These mutants have a single excitation peak around 488 nm rather than the primary excitation peak and minor peak found in the wild type protein (Table 2). These variants do however, have the same emission spectra as wild type protein. EGFP, also known as GFPmut 1:23, has two mutations in the chromophore region (Table 1) and is reported to have a single, red-shifted excitation peak at 488 nm and fluoresces with greater intensity than wild type protein (3). The GFP-S65T mutant, with the Serine at position 65 mutated to a Threonine, also has a single red shifted excitation peak, fluoresces more intensely than wild type, and has an added advantage of acquiring fluorescence approximately four times faster than wild-type GFP (4).
Several mutants have been optimized for expression in bacterial cells. For example, GFPuv, which has been optimized to fluoresce when excited with ultra violet (UV) light contains three amino acid substitutions, none of which alter the chromophore sequence. These substitutions alter protein folding and chromophore formation. When expressed in E. coli GFPuv is more soluble than the wtGFP, which is primarily found in inclusion bodies in a nonfluorescent insoluble form. Also, five rarely used Arg codons from the wild type gene have been replaced by codons preferred in E. coli in order to increase expression efficiency. This protein does have a propensity to dimerize, which forms as a result of hydrophobic interactions and results in a four-fold reduction in absorbance at 470 nm and an increase in absorption at 395 nm. Despite the changes, the excitation and emission maxima remain the same as wild type. The Stemmer mutant is quite similar to the GFPuv, with the exception of the Arg codon changes.
Mutations have also been used to create blue emission GFP variants. The Y66H variant has a histidine residue at position 66 instead of a tyrosine. This results in excitation and emission maxima of 382 and 459 nm respectively. Other improvements on the blue emitting proteins have been made to improve their brightness. For example EBFP also contains amino acid changes at positions 64, 65, and 145 that improve brightness and resulting in an excitation and emission maxima of 380 and 440 respectively.
Other substitutions have been made to improve protein folding and chromophore formation. Besides the obvious amino acid substitutions previously described many different silent mutations have been made to the wild type sequence. Clontech has made over 150 sequence substitutions to the native DNA sequence in order to change codon usage to reflect the intended host&rsquos codon bias. Upstream sequences flanking the coding region have also been converted to a Kozak consensus translation initiation site in order to increase translation initiation efficiency.
Expression of GFP as a transgene has opened many exciting new windows of investigation in cell, developmental, and molecular biology. Fluorescent GFPs have been expressed in bacteria (1, 3) yeast (11), slime mold (12), plants (13), drosophilia (14), and mammalian cells (17). GFPs can function as a protein tag, tolerating either an N- or a C-terminus fusion to a broad variety of proteins, many of which have been shown to maintain native function (18). The enormous flexibility of these proteins as a noninvasive real-time marker in living cells allows for numerous applications. Here we describe several experiments demonstrating the use of fluorescence to quantitate various Green Fluorescent Proteins (GFPs) using the FL600 microplate fluorescence reader.
Table 1. GFP mutants and their amino acid substitutions
# These mutants also contain over 150 silent base mutations that correspond to human codon-usage preferences. & Upstream sequences flanking the coding region have been converted to a Kozak consensus translation initiation site. @ Five rarely used Arg codons from the wild type gene have been replaced by codons preferred in E. coli in order to increase expression efficiency.
Medžiagos ir metodai
The 96 well clear microplates, catalogue number CFCP N96, were purchased from Biosearch, (Bedford, MA). Purified recombinant proteins for wtGFP, EGFP, GFP-S65T, and GFPuv were purchased from Clontech. Partially purified extracts containing recombinant wtGFP protein, as well as the EGFP, Y66H, and Stemmer mutant proteins were a generous gift of Daniel González (Rutgers, New Brunswick, NJ). A series of dilutions of each protein extract were made using Tris-EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) as the diluent. Fluorescent determinations were made using an FL600 Fluorescence Microplate reader (BioTek Instruments, Winooski, Vermont) with KC4 data reduction software on an external PC controlling reader function and data capture (BioTek Instruments, Winooski, VT). Filter sets varied depending on the variant of GFP used. Determinations of wtGFP were made using a 400 nm, 30 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter. Stemmer, mutant and GFPuv were read using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter. The red-shifted mutants EGFP and GFP-S65T were determined using a 485 nm, 20 nm bandpass excitation filter and a 530 nm, 25 nm bandpass emission filter,while the "blue" emitting mutant, Y66H, was investigated using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter with a 460 nm, 40 nm bandpass emission filter. Table 2 indicates the excitation and emission maxima of several of the proteins used. Protein concentrations for each GFP variant were determined using absorbance at appropriate wavelength ( l max) and the concentration calculated using the reported extinction coefficients (e) for each variant (15, 16).
Table 2. Excitation and emission data of GFP variants
@ Note that both excitation peak wavelengths are indicated.
Rezultatai
Concentration curves were made using several GFP variants and the fluorescence determined. In all cases a linear correlation to concentration was observed. The fluorescence of partially purified wtGFP protein was measured from 0 to 140 ng. Determination of total protein content by the method of Lowry indicates that wtGFP represents 3% of the total protein. As demonstrated in Figure 1, using an excitation wavelength of 400 nm and an emission wavelength of 508 a linear response was observed (r 2 =0.998). In terms of detection limits as little as 5 ng per well of wtGFP can be detected. Using purified recombinant wtGFP obtained commercially, similar results were obtained in regards to linearity and detection limits.
When the fluorescence of the red-shifted proteins was determined, a linear relationship between concentration and fluorescence was also observed for either EGFP or GFP-S65T (Figure 2). With the fluorescein filter set, the increase in the extinction coefficient (Table 2) for EGFP results in a brighter fluorescence than with the wild-type protein. This may account for the lower detection limit of 1 ng per well we observed with this protein (data not shown). Quantitation of EGFP in extracts using a calibration curve determined by linear regression can be used with a high degree of confidence (r 2 = 0.998).
As demonstrated in Figure 3, the Stemmer mutant and GFPuv can utilize the same filter set. As with all the other GFP variants examined both proteins demonstrate a linear relationship between concentration and fluorescence signal (Figure 3). The detection limit of the Stemmer mutant was determined to be 2.5 ng (data not shown). These data are in close agreement with the extinction coefficient data that indicates that the Stemmer mutant is half as bright as the EGFP variant. Although they are optimized for excitation using UV light and in these experiments were excited at 360 nm, they can be quantitated very well with the same filter set as wtGFP, which utilized a 400 nm excitation filter.
The fluorescence from a serial dilution of the GFP-Y66H protein extract was performed. Although the Y66H blue emitting mutant sample was not pure enough to quantitate protein content using absorbance, there was sufficient protein to detect a fluorescent signal. With dilution of the protein extract, a linear relationship between dilution and fluorescence was observed (Figure 4).
As demonstrated in Figure 5 using the appropriate filter set is important in order to maximize the signal. Use of the red-shifted mutants such as EGFP allows the use of the traditional "fluorescein" filter set (485 nm excitation, 530 nm emission). When filters that maximize the signal with wtGFP (400 nm excitation and 508 nm emission) are used to detect EGFP, the signal returned is greatly diminished, despite having the same sensitivity setting. Unfortunately, filter overlap precludes the use of the 485 nm excitation filter with a 508 nm emission filter. Wild-type GFP, as previously described has a primary excitation centered at 395 nm with a shoulder located at 485 nm. With the traditional "fluorescein" filter set than a loss of fluorescent signal is observed as compared to the result when a 400 nm excitation and 508 nm emission is used. Due to the secondary excitation peak at 370 nm with wtGFP, the degree of loss is alleviated somewhat as compared to EGFP, which only has a single excitation peak. In the case of GFPuv, which has been optimized for excitation with UV light, the loss of fluorescent signal is much more profound when the "fluorescein" filter set is used (data not shown).
Figure 1. Concentration curve using partially purified wtGFP protein. Dilutions of wtGFP protein were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 400 nm, 30 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 175.
A
B
Figure 2. Concentration curves of red-shifted GFP proteins. Dilutions of (A) EGFP or (B) GFP-S65T proteins were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 485 nm, 20 nm bandpass excitation filter and a 530 nm, 25 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 135.
A
B
Figure 3. Concentration curves using partially purified Stemmer mutant GFP and rGFPuv proteins. Dilutions of partially purified Stemmer-mutant GFP protein (A) or rGFPuv protein (B) were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 140.
Figure 4. Concentration curve using partially purified GFP-Y66H mutant protein. Dilutions of mutant GFP-Y66H protein were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 460 nm, 45 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 150.
A
B
Figure 5. Loss of signal when using alternative filter sets. Dilutions of (A) EGFP protein or (B) wtGFP were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using either a 485 nm, 20 nm bandpass excitation, 530 nm, 25 nm bandpass emission filter set or a 400 nm, 30 nm bandpass excitation, 508 nm, 20 nm bandpass emission filter set. For EGFP and wtGFP determinations using either filter set, a sensitivity setting of 170 was used.
Diskusija
The utility of green fluorescent proteins has become increasingly obvious. Detection only requires the addition of near UV to blue light and is not limited by the availability of substrates, therefore providing information concerning gene expression and cellular localization in real time. Also GFPs do not interfere with cell growth in a wide variety of organisms and as such, are a convenient indicator of transformation. In this application note we describe the direct quantitation of several different mutant forms of GFP using fluorescence.
Because GFPs are actually proteins rather than small fluorescent molecules, the physical properties of GFPs as peptides must be taken into account. Despite being a peptide, GFP is resistant to denaturation. GFP, with a Tm=70°C, is quite resistant to heat denaturation once formed. In vivo it appears that the formation of GFP is somewhat temperature sensitive. In yeast GFP fluorescence is reported to be maximal at 15°C and decreases to about 25% of maximal when the incubation temperature is raised to 37°C (7). It has been demonstrated that mutations that increase efficiency of protein folding, as with EGFP and GFPuv, suppress the sensitivity of fluorescence to growth incubation temperature (3). In regards to redox status, GFP needs to be in an oxidized state in order to fluoresce, as the formation of the cyclic tripeptide chromophore requires molecular oxygen (6). Strong reducing agents, such as 5 mM Na2S2O4 or 2 mM FeSO4 convert GFP into a nonfluorescent moiety. Fortunately, weaker reducing agents such as, 2% ß-mercaptoethanol, 10 mM dithiotheitol (DTT), 10 mM glutathione, or 10 mM L-cysteine, do not seem to affect the fluorescence of GFP (16). Strong oxidizing agents such as 1% H2O2 will also abolish fluorescence as will complete denaturation. GFP is quite resistant to pH changes. For example, wtGFP is fluorescent over a very broad pH range (pH 5.5-12) with rapid loss of fluorescence with pH levels either above or below this range. The red-shifted mutants have been reported to have a narrower range of pH stability and exhibit fluorescence between pH 7.0 and 11.5.
In regards to fluorescence, GFP offers some advantages that one would not expect from proteins. Unlike many proteins, activity is not lost and fluorescence is maintained after fixation with either glutaraldehyde or formaldehyde. Most importantly, GFP and its most of its variants are reported to be quite resistant to photobleaching. Chaotropic agents such as 8M urea, and low concentrations of detergents (1% SDS) also do not effect fluorescence of the protein.
There are several issues that have to be kept in mind when using GFP as a reporter molecule. Expression of exogenous proteins in organisms can lead to solubility problems. Wild-type GFP, like many other proteins when expressed in bacteria, is primarily found in inclusion bodies in an insoluble form and is nonfluorescent. Mutations that increase protein folding and translation efficiency have been found to eliminate many of the solubility problems. Pavyzdžiui, E. coli expressing GFPuv, with its mutations to improve protein folding and chromophore formation, are reported to be 18 times brighter than bacteria expressing wtGFP mostly due to increased protein solubility. In regards to the use of GFP as a means to measure transcription, the rate of chromophore formation and the apparent stability of wtGFP may preclude the use of GFP as a reporter to monitor rapid changes. Chromophore formation takes place post-translationally and requires molecular oxygen. Cells, bacteria in particular, grown in anaerobic conditions will be refractory to GFP fluorescence. Likewise if very rapid changes in transcription rates are being investigated, the lag between protein production and chromophore formation may preclude the use of GFP. Similarly, GFP proteins once produced are quite stable and resistant to degradation, again reducing their utility as a reporter for rapid changes. Another important point to consider in regards to using GFP as quantitative reporters is the lack of signal amplification. The signal associated with GFP does not have any enzymatic activity associated with it, therefore there is no opportunity for amplification as would be the case for reporters such as b-galactosidase, luciferase, or alkaline phosphatase.
Another problem associated with GFP fluorescence is background autofluoresence. Most autofluoresence in mammalian cells is due to the presence of the flavins FAD and FMN. These compounds have excitation and emission maxima of 450 nm and 515 nm respectively and tend to cause problems primarily with the red-shifted variants. Likewise, NADH, another commonly found cellular cofactor, has an excitation of 365 nm and an emission of 445 nm and may result in background fluorescence when wtGFP fluorescence is quantitated. If background autofluorescence is a problem, it may be necessary to tailor the GFP mutant to the type of autofluorescence encountered. It has been estimated that cytoplasmic concentration must be 1.0 µM in order for the wtGFP signal to be twice that generated from autofluorescence. Red-shifted variants, because they are brighter, have a lower threshold of 100-200 nM (16).
Although most experiments using GFP are performed using either fluorescence microscopy or flow cytometry, these data presented in this application note, demonstrate the utility of direct measurement of GFP using a fluorescence microplate reader. Microscopy can provide information on the number of cells expressing GFP, but is quite subjective in regards to quantitation. Flow cytometry can provide quantitative information, but throughput is quite limited. Determination of fluorescence using a microplate fluorometer allows quantitative information as well as high throughput.
Other Related Application Notes Excitation and Emission of Green Fluorescent Protein
Nuorodos
(1) Chalfie, M., Y. Tu, G.Euskirchen, W. Ward, D. Prasher (1994) Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science 263:802-805.
(2) Cody, C. D. Prasher, W. Westler, F. Prendergast, W. Ward (1993) Chemical Structure of the Hexapeptide Chromophore of the Aequorea Green-Fluorescent Protein, Biochemistry, 32:1212-1218.
(3) Cormack, B.P. R. Valdivia, and S. Falkow. (1996) FACS-optimized Mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP) Gene, 173:33-38.
(4) Heim, R., A.B. Cubitt, and R.Y. Tslen, . (1995) Improved Green Fluorescence, Nature, 373:663-664.
(5) Delagrave, S. R.E. Hawtin, C.M. Silva, M.M. Yang, and D.C. Youvan. (1995) Red-shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescent Protein, Bio/Technology, 13:151-154.
(6) Heim, R. D.C. Prasher, and R.Y. Tsien (1994) Wavelength Mutations and Posttranslational Autoxidation of Green Fluorescent Protein, Proc. Natl, Acad. Sci, USA 91:12501-12504.
(7) Lim, C.R., Y. Kimata, M. Oka, K. Nomaguchi, and K. Kohno (1995) Thermosensitivity of Green Fluorescent Protein Fluorescence Utilized to Reveal Novel Nuclear-like Compartments in a Nucleoporin Nsp1. J. Biochemistry, 118:13-17.
(8) Cubitt, A., R. Heim, S. Adams, A. Boyd, L. Gross, R. and R. Tsien (1995) Understanding, improving and Using Green Fluorescent Proteins. Trends in Biochemical Sciences, 20:448-455.
(9) Yang, F., L.G. Moss, G.N. Phillips (1996) The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein. Nature Biotechnology 14:1246-1251.
(10) Ward, W. in Photochemical and Photobiological Reviews, K. Smith Ed. 1979, Plenum NY. P. 1-57.
(11) Kahana, J., B. Schapp, and P. Silver (1995) Kinetics of Spindle Pole Body Separation in Budding Yeast. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 92:9707-9711.
(12) Moores, S., J. Sabry, and J. Spudich (1996) Myosin Dynamics in Live Dictyostelium Cells. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 93:443-446.
(13) Epel, B., H. Padgett, M. Heinlein, and R. Beachy (1996) Plant Virus Movement Protein Dynamics Probed with a GFP-protein Fusion. Gene. 173:75-79.
(14) Wang, S., and T. Hazelrigg (1994) Implications for bcd mRNA Localization from Spatial Distribution of exu Protein in Drosophila Oogenesis. Gamta. 369:400-403.
(15) Gonzalez, D. Personal communication.
(16) Living Colors User Manual Clontech Laboratories Inc. Palo Alto CA.
(17) Crameri, A. E.A. Whitehorn, E. Tate, and W.P.C. Stemmer (1996) Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling. Nature Biotechnology 14:448-455.
(18) Stearns, T. (1995) The Green Revolution. Current Biology. 5:262-264.