Informacija

Dauguma nuorašų yra iš jutimo krypties?

Dauguma nuorašų yra iš jutimo krypties?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Man įdomu, ar dauguma nuorašų yra perrašyti iš 5'->3' grandinės? Nes aš susiduriu su daugybe posakių, tokių kaip „anti-sense transkriptai“. Ar kas nors galėtų padėti tai paaiškinti? Dėkoju.


Mano supratimu, jausmas ir priešiškumas yra kontekstinis. Jei žiūrite į geną iš 5'->3' (tai yra susitarimas), ši grandinė yra jutimo grandinė, o geno komplementas yra priešprasminė grandinė.

Tačiau toliau DNR gali būti genas ant „originalios“ priešprasminės grandinės, jei kalbate apie šį naują geną, yra naujas kontekstas ir dabar jis yra jutiminėje grandinėje (orientuota 5'->3'), ir tai yra anti-sensinės krypties papildymas.

Tikiuosi, kad tai aišku.


Skirtumas tarp jutiminių ir antisensinių DNR grandžių

DNR jutimo grandinė ir antisensinė grandinė
DNR molekulė turi dvigrandę struktūrą. Jis susideda iš dviejų sruogų. Remiantis grandine, kuri naudojama kaip mRNR formavimo arba transkripcijos šablonas, viena grandinė vadinama sensorine grandine, o kita – antisense grandine.

Jausminė sruogelė
1. Ši kryptis taip pat vadinama kodavimo grandine, plius grandine arba ne šablonine grandine.
2. Koduojanti grandinė yra tokia pati kaip mRNR, išskyrus tai, kad timinas DNR yra pakeistas Uracilu RNR.
3. Koduojančioje grandinėje yra kodonų.
8
Antisensinė sruogelė
1. Ši kryptis taip pat vadinama nekoduojančia grandine, atėmus sruogą arba šablono sruogą.
2. Ši grandinė veikia kaip mRNR sintezės šablonas. Todėl antisensinė grandinė papildo sensorinę grandinę ir mRNR (U RNR vietoje T).
3. Nekoduojančioje grandinėje yra antikodonų.

Tau gali patikti

11 komentarų

Mums patinka išgirsti U :) Palikite mums komentarą, kad pagerintumėte šią svetainę
Ačiū, kad apsilankėte.

Antprasminėje grandinėje 13-as nukleotidas turėtų būti citozinas. Apskritai, puiki viso proceso santrauka!


Fonas

Parazitas pirmuonis Plasmodium falciparum yra atsakinga už mirtiniausią žmonių maliarijos formą, dėl kurios kasmet miršta vienas milijonas žmonių. Klinikinius maliarijos simptomus sukelia intraeritrocitinės parazito stadijos, kurios dauginasi šeimininko raudonųjų kraujo kūnelių (RBC) viduje. Per pastaruosius dešimtmečius daugelis tyrimų buvo sutelkti į supratimą, kaip pasiekiamas genų reguliavimas Plasmodium. Leidinys P. falciparum 2002 m. buvo atlikta genomo seka [1], buvo atlikta transkripto analizė naudojant mikromatricas [2, 3], o pastaruoju metu – didelio našumo cDNR (RNR-Seq) sekos nustatymas [4𠄷]. Šios analizės leido nustatyti daugelio genų transkripto lygius, padėjo patobulinti pradinį genų modelį ir atskleidė griežtą genų ekspresijos reguliavimą per visą intraeritrocitinį vystymosi ciklą (IDC). P. falciparum. Nepaisant to, daugumos genų vis dar trūksta informacijos apie 5′ ir 3′ neišverstus regionus (UTR) ir antisensinės transkripcijos laipsnį.

Nekoduojančios RNR (ncRNR) transkripcija yra įprasta eukariotuose, pavyzdžiui, daugiau nei 90 % žmogaus genomo yra transkribuojama [8], tuo tarpu tik

1,5% jo koduoja baltymus. Atsižvelgiant į jų dydį ir transkripcijos kilmę, ncRNR paprastai vadinamos mažomis (𼈀 nt) arba ilgomis ncRNR (lncRNR, 𾈀 nt) ir introninėmis, geninėmis arba tarpgeninėmis ncRNR (transkribuotomis iš regionų tarp CDS). Be to, RNR, kurios papildo kitas endogenines RNR, vadinamos natūraliais antisensiniais transkriptais (NAT). Kai kurie NAT atsiranda dėl nepilno gretimų genų transkripcijos nutraukimo ir, atrodo, atspindi transkripcijos triukšmą. Kiti NAT yra labai konservuoti ir išreikšti vystymosi reguliuojamu būdu, su specifiniais audinių ekspresijos modeliais [9], o tai yra svarūs argumentai dėl jų reguliavimo vaidmens biologiniuose procesuose, tokiuose kaip genų ekspresija. Darbas keliuose organizmuose nustatė NAT reguliavimo vaidmenį per RNR trukdžių (RNAi) kelią, kuriame specifinė NAT grupė, vadinama mikroRNR, skatina po transkripcijos genų nutildymą. Šis kelias buvo aprašytas daugelyje organizmų, tačiau jo ypač nėra Saccharomyces cerevisiae ir P. falciparum[10, 11]. Tačiau net ir organizmuose, kuriuose nėra funkcinės RNRi mechanizmų, buvo įrodyta, kad NAT vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant genų ekspresiją [12] ir buvo aprašyta daug skirtingų mechanizmų, kuriais NAT gali reguliuoti genų ekspresiją nepriklausomai nuo RNRi. Transkripcijos lygiu NAT gali sukelti transkripcijos trukdžius dėl fizinių susidūrimų tarp transkribuojančių polimerazių [13]. Reguliavimas po transkripcijos gali vykti susidarant sensorinei antisensinei dupleksinei RNR. Paprastai stebimas NAT branduolinis susilaikymas, todėl duplekso susidarymas gali reguliuoti genų ekspresiją, išlaikant mRNR branduolyje. Nustatyta, kad citoplazmoje sensorinio-antisensinio duplekso susidarymas turi įtakos mRNR stabilumui ir transliacijos efektyvumui (apžvelgta [14]).

Nors dauguma paskelbtų transkriptų analizių P. falciparum neleidžia atskirti sensorinių ir antisensinių transkriptų, kai kuriuose tyrimuose buvo atlikta specifinė grandinės analizė ir nustatyta antisensinė transkripcija iš kelių genomo vietų [7, 15, 16]. Tačiau nebuvo atlikta išsami galimų sąsajų tarp sensorinės ir antisensinės RNR transkripto lygių analizė ir vis dar trūksta viso parazito IDC, apimančio net labai AT turtingus tarpgeninius regionus, specifinio transkripto profilio.

Naujausi RNA-Seq technologijos pažanga, ypač galimybė atlikti specifines grandinės analizes (apžvelgta [17]), polimerazės, galinčios amplifikuoti net labai AT turinčius regionus [18, 19], identifikavimas ir sekos padidėjimas. skaitymo ilgis, paskatino mus sujungti šiuos patobulinimus į vieną RNR-Seq protokolą ir nustatyti genomo pločio, sruogoms būdingą transkripcijos profilį P. falciparum.

Naudodami šį protokolą, sukūrėme specifinių sruogų RNR-Seq bibliotekas parazitams visame IDC, taip pat atskirai išgrynintoms branduolinėms ir citozolinėms RNR frakcijoms, dėl kurių buvo nustatyta beveik 90 milijardų nukleotidų. Mūsų duomenys rodo didelę antisensinę transkripciją 24% genų, antisensinių transkriptų vystymosi reguliavimą, stiprų antisensinės transkripcijos poslinkį link 3′ genų galo ir sudėtingą koreliacijos tarp sensorinio ir antisensinio transkripto lygių vaizdą. Be to, labai AT turtingų regionų aprėptis leido mums pirmą kartą nustatyti 3443 neseksualių kraujo stadijų genų poliadenilinimo vietas.


Ryžių mRNR ir mažų RNR ekspresijos atlasas

Visų išreikštų transkriptų identifikavimas sekvenuotame genome yra būtinas tiek genomo analizei, tiek sistemų biologijos tikslams įgyvendinti. Mes panaudojome transkripcijos profiliavimo technologiją, vadinamą „masiškai lygiagrečia parašo seka“, kad sukurtume išsamų ryžių išraiškos atlasą (Oryza sativa cv Nipponbare). Mes sekvenavome 46 971 553 mRNR nuorašus iš 22 bibliotekų ir 2 953 855 mažas RNR iš 3 bibliotekų. Duomenys rodo plačiai paplitusią transkripciją visame genome, įskaitant mažiausiai 25 500 anotuotų genų jutiminę ekspresiją ir beveik 9 000 anotuotų genų antisensinę ekspresiją. Papildomas ∼ 15 000 mRNR parašų rinkinys, susietas su nekontuotais genomo regionais. Dauguma mažų RNR duomenų buvo mažesnio gausumo trumpi trukdantys RNR, atitinkantys pasikartojančias sekas, tarpgeninius regionus ir genus. Tarp jų buvo nesunkiai pastebėta daugybė labai reguliuojamų mažų RNR grupių. Sukūrėme genomo naršyklę (//mpss.udel.edu/rice), skirtą viešai prieigai prie šios svarbios kultūros transkripcijos profiliavimo duomenų.


Nuorodos

Katayama S, Tomaru Y, Kasukawa T, Waki ​​K, Nakanishi M, Nakamura M, Nishida H, Yap CC, Suzuki M, Kawai J, Suzuki H, Carninci P, Hayashizaki Y, Wells C, Frith M, Ravasi T, Pang KC , Hallinan J, Mattick J, Hume DA, Lipovich L, Batalov S, Engström PG, Mizuno Y, Faghihi MA, Sandelin A, Chalk AM, Mottagui-Tabar S, Liang Z, Lenhard B: Antisense transkripcija žinduolių transkripte. Mokslas. 2005, 309: 1564-1566.

Beiter T, Reich E, Williams RW, Simon P: Antisense transkripcija: kritinis žvilgsnis į abi puses. Cell Mol Life Sci. 2008, 66: 94-112.

Ling MHT, Ban Y, Wen H, Wang SM, Ge SX: Išsaugota natūralių antisensinių transkriptų ekspresija žinduoliuose. BMC genomika. 2013, 14: 243-

Faghihi MA, Wahlestedt C: Natūralių antisensinių nuorašų reguliavimo vaidmenys. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009, 10: 637-643. 10.1038/nrm2738.

Tufarelli C, Stanley JA, Garrick D, Sharpe JA, Ayyub H, Wood WG, Higgs DR: Antisensinės RNR transkripcija, lemianti genų nutildymą ir metilinimą kaip nauja žmogaus genetinės ligos priežastis. Natas Genetas. 2003, 34: 157-165. 10.1038/ng1157.

Yu W, Gius D, Onyango P, Muldoon-Jacobs K, Karp J, Feinberg AP, Cui H: Epigenetinis naviko slopinimo geno p15 nutildymas naudojant jo antisensinę RNR. Gamta. 2008, 451: 202-206. 10.1038/gamta06468.

Faghihi MA, Zhang M, Huang J, Modarresi F, Van der Brug MP, Nalls MA, Cookson MR, St-Laurent G, Wahlestedt C: natūralaus antisensinio transkripto sukelto mikroRNR funkcijos slopinimo įrodymai. Genome Biol. 2010, 11: R56-10.1186/gb-2010-11-5-r56.

Uchida T, Rossignol F, Matthay MA, Mounier R, Couette S, Clottes E, Clerici C: Ilgalaikė hipoksija skirtingai reguliuoja hipoksijos sukeltą faktorių (HIF)-1alfa ir HIF-2alfa ekspresiją plaučių epitelio ląstelėse: natūralaus antisensinio HIF reikšmė 1alfa. J Biol Chem. 2004, 279: 14871-14878. 10.1074/jbc.M400461200.

Carlile M, Swan D, Jackson K, Preston-Fayers K, Ballester B, Flicek P, Werner A: selektyvus endo-siRNR generavimas iš Na / fosfato transporterio geno Slc34a1 pelių audiniuose. Nucleic Acids Res. 2009, 37: 2274-2282. 10.1093/nar/gkp088.

Chen J, Sun M, Hurst LD, Carmichael GG, Rowley JD: Žmogaus cis koduotų sensorinių antisensinių transkriptų koordinačių ekspresijos ir evoliucijos genomo mastu analizė. Tendencijos Genet. 2005, 21: 326-329. 10.1016/j.tig.2005.04.006.

Werner A, Carlile M, Swan D: Ką reguliuoja natūralūs antisensiniai nuorašai? RNR Biol. 2009, 6: 43-48. 10.4161/rna.6.1.7568.


Autoriai pareiškia, kad neturi interesų konflikto.

Papildoma informacija, VI papildoma lentelė, papildomi paveikslai S1-6

Nuorašo išraiškos lygiai, pasikliovimo intervalai ir diferencinė išraiška FDR

Pojūčių ir priešprasmių porų sąrašas ir jų išraiškos lygiai

Transkripcijos faktoriaus tikslas padidina skirtingai išreikštus genus tarp S ir Y

32 PHO kelio genai (Ogawa ir kt., 2000 Wykoff ir kt., 2007), įtraukti į mūsų duomenų rinkinį (suderinant Y ir S genomą ir su mažiausiai 20 zondų)

Augimo fenotipai arsenate, kuriame yra 184 Y/S segregantų genotipų terpės


REZULTATAI IR DISKUSIJA

Norėdami įvertinti atvirkštinės transkripcijos sukurtų artefaktų mastą, atlikome penkis (biologinius) standartinių atvirkštinės transkripcijos reakcijų, kuriose trūko ActD (ActD−), pakartojimus su RNR mėginiais iš mielių, auginamų turtingoje terpėje, ir analizavome cDNR taikinius hibridizuodami su plytelių masyvais. Jausminių transkriptų atveju hibridizacijos signalai sutapo tarp visų pakartojimų. Tačiau antisensinėse grandinėse, priešingose ​​išreikštiems genomo regionams, buvo užregistruoti dviejų tipų signalai. Vienoje klasėje signalo intensyvumas proporcingai atitiko jutimo atitikmenų intensyvumą (2 A paveikslas, viršutinis skydelis), be to, egzistavo didelis kintamumas tarp pakartojimų (2 B ir C paveikslai, viršutinis skydelis). Kitoje klasėje antisensiniai signalai buvo labai atkuriami visuose pakartojimuose ir nekoreliavo su jutimo grandinės ekspresijos lygiais (2 D paveikslas, viršutinis skydelis). Šie skirtumai leido manyti, kad pirmoji antisensinių signalų klasė gali būti artefaktai, kuriuos gali sukelti klaidinga antrosios grandinės sintezė atvirkštinės transkripcijos metu, kaip siūlo modeliai (1 pav.). Be raiškiosios medijos augimo, tą patį modelį matėme ir kelioms kitoms sąlygoms (duomenys nerodomi). Mes postulavome, kad tariamus artefaktus galima išspręsti naudojant ActD. Iš tiesų, trys atvirkštinės transkripcijos reakcijų pakartojimai, atlikti naudojant ActD (ActD+), pirmosios klasės, bet ne antrosios klasės antisensinių regionų ekspresijos signalai buvo žemiau fono (2 pav. A–D, apatinės plokštės). Be 2 paveiksle pateiktų pavyzdžių, visų genomo regionų profiliai yra prieinami internete (http://www.ebi.ac.uk/huber-srv/actinomycinD).

Genomo masto sensorinių ir antisensinių signalų analizė iš hibridizacijų, atliktų nesant (ActD−) arba esant (ActD+) ActD atvirkštinės transkripcijos metu. ( A ) Antisensinio signalo intensyvumo priklausomybė nuo jutimo išraiškos lygio. Raudonos kreivės rodo pritaikytus hibridizacijos signalus, naudojant išlyginamuosius sruogelius. ( B ) Signalo intensyvumo kitimas tarp jutiminių ir antisensinių grandinių (SD) biologinių replikacijų. ( C ) Du netikrų antisensinių nuorašų pavyzdžiai, kuriuos išsprendė ActD. ( D ) Du nuoseklių antisensinių nuorašų, kuriems ActD nepaveikė, pavyzdžiai. Abiejose plokštėse C ir D normalizuoti signalo intensyvumai rodomi zondams išilgai jų chromosomų padėties naudojant spalvų gradientą ( x - W ašis, Watson kryptis C, Crick kryptis). Viršutinis skydelis, penki ActD− pakartojimai ( y -axis, ActD−, 1–5) apatinis skydelis, trys ActD+ pakartojimai ( y -ašys, ActD+ 1–3). Visų genomo regionų profiliai yra prieinami internete. (www.ebi.ac.uk/huber-srv/actinomycinD).

Genomo masto sensorinių ir antisensinių signalų analizė iš hibridizacijų, atliktų nesant (ActD−) arba esant (ActD+) ActD atvirkštinės transkripcijos metu. ( A ) Antisensinio signalo intensyvumo priklausomybė nuo jutimo išraiškos lygio. Raudonos kreivės rodo pritaikytus hibridizacijos signalus, naudojant išlyginamuosius sruogelius. ( B ) Signalo intensyvumo kitimas tarp jutiminių ir antisensinių grandinių (SD) biologinių replikacijų. ( C ) Du netikrų antisensinių nuorašų pavyzdžiai, kuriuos išsprendė ActD. ( D ) Du nuoseklių antisensinių nuorašų, kuriems ActD nepaveikė, pavyzdžiai. Abiejose plokštėse C ir D normalizuoti signalo intensyvumai rodomi zondams išilgai jų chromosomų padėties naudojant spalvų gradientą ( x - W ašis, Watson kryptis C, Crick kryptis). Viršutinis skydelis, penki ActD− pakartojimai ( y -axis, ActD−, 1–5) apatinis skydelis, trys ActD+ pakartojimai ( y -ašys, ActD+ 1–3). Visų genominių regionų profilius galima rasti internete. (www.ebi.ac.uk/huber-srv/actinomycinD).

Viso genomo ekspresijos signalų su ActD arba be jo palyginimas visuose koduojančiuose genuose [kaip apibrėžta ORF Saccharomyces Genomo duomenų bazė (SGD, http://www.yeastgenome.org )] ir jų priešingi regionai patvirtino aiškinimą, kad ActD sumažina artefaktinį antisensinį signalą. Aptiktų antisensinių regionų skaičius, išreikštas aukščiau fone, sumažėjo nuo 1046 ActD− iki 325 ActD+. Be to, tik 25% (260/1046) atvejų, pastebėtų atliekant standartinę pirmosios krypties cDNR sintezę, vis dar aptinkami ActD+ (1 papildoma lentelė). Be to, atsižvelgiant į specifinį vaidmenį antrosios grandinės sintezėje, ActD neturėjo įtakos virš fone aptiktų jutiminių nuorašų skaičiui. Iš 5703 koduojančių genų (ORF) dauguma yra išreikšti virš fono abiem sąlygomis: 5214 ORF ActD+ ir 5186 ORF ActD−, be to, du genų sąrašai beveik visiškai sutampa (5172 ORF) (papildomas). 1 lentelė).

Galima naudoti plytelių klojimo masyvus de novo nuorašų identifikavimas ( 7 ). Todėl zondų hibridizacijos signalai buvo tiriami išilgai jų chromosomų padėties, neatsižvelgiant į ankstesnę anotaciją ir atskirai kiekvienai grandinei. Profiliai buvo suskirstyti į pastovaus hibridizacijos intensyvumo segmentus, naudojant segmentavimo algoritmą (7, 20). Išanalizavome ActD poveikį prasminiams ir antisensiniams nuorašams, apibrėžtiems segmentavimu (2 papildoma lentelė). Antisensiniai segmentai buvo apibrėžti remiantis trimis kriterijais: (i) segmentai yra išreikšti ir sutampa su anotuotais genais, esančiais priešingoje grandinėje, bet ne toje pačioje grandinėje, (ii) segmentų ilgis yra didesnis nei 48 bp ir (iii) jie yra greta segmentų su sumažintu hibridizacijos signalu iš abiejų pusių. Palyginimas rodo, kad ActD neturi kiekybinio poveikio pirmosios grandinės cDNR sintezei, nes yra sutapimas tarp jutimo segmentų ekspresijos lygių, išmatuotų ActD+ ir ActD− reakcijose (3 pav.). Tačiau pridėjus ActD, ekspresijos lygis žemiau fono sumažėja daugiau nei pusėje antisensinių segmentų: iš viso 553 antisensinių segmentų 347 duoda signalą virš fono tik ActD− ir 14 tik ActD+, o aptinkami 192 antisensiniai segmentai. abiem sąlygomis (3 papildoma lentelė). Todėl stebėtinai antisensinių segmentų skaičius, stebimas naudojant standartinį atvirkštinės transkripcijos protokolą, sumažėjo 64% (347/539), įtraukus ActD.

Segmentų išraiškos lygių sklaidos diagrama tarp masyvų, sugeneruotų su ActD ir be jo. Žali taškai, antisensiniai segmentai, aptikti virš fono ActD− mėginiuose Raudona linija, identiška išraiška abiem sąlygomis punktyrinės linijos, fono slenksčiai.

Segmentų išraiškos lygių sklaidos diagrama tarp masyvų, sugeneruotų su ActD ir be jo. Žali taškai, antisensiniai segmentai, aptikti virš fono ActD− mėginiuose Raudona linija, identiška išraiška abiem sąlygomis punktyrinės linijos, fono slenksčiai.

Trys nepriklausomos įrodymų linijos atitinka masyvo hibridizacijos rezultatus, gautus esant ActD. Pirmiausia palyginome savo masyvo hibridizacijos duomenis su griežtu antisensinių transkriptų rinkiniu, gautu atliekant viso ilgio cDNR seką (8). Nepaisant šių dviejų metodų papildomumo ir skirtingų eksperimentinių augimo sąlygų palyginimo (raiškiosios terpės ir minimalios terpės), buvo pasiektas geresnis ActD+ sutapimas nei ActD− duomenų rinkinys ( P vertė 1,6e-9, palyginti su 2,5e-6, Fišerio tikslus testas). Antra, įvertinome griežto skaičiavimo filtro poveikį numanomų antisensinių artefaktų pašalinimui iš hibridizacijos rezultatų. Šis filtras anksčiau buvo sukurtas siekiant pašalinti tariamus antisensinius artefaktus, reikalaujant, kad segmentai bent dalį jų ilgio turėtų didesnį ekspresijos signalą, nei matoma priešingoje grandinėje (7). Remiantis ActD− duomenimis, skaičiavimo filtras sumažino antisensinių segmentų skaičių 63 % (337/539). Priešingai, filtras turėjo tik nedidelį poveikį antisensinių segmentų skaičiui, aptiktam ActD+: iš 206 antisensinių segmentų tik 39 buvo išfiltruoti. Be to, palyginus antisensinius segmentus, aptiktus ActD− po filtravimo, ir antisensinius segmentus, aptiktus ActD+, rodomas geras (bet netobulas) atitikimas (158/250) (4 papildoma lentelė). ) . Kadangi skaičiavimo filtrai visada susiduria su klaidingų teigiamų ir klaidingai neigiamų rezultatų kompromiso dilema, eksperimentinis tobulinimas naudojant ActD yra naudingesnis. Tai aiškiai pasakytina apie antisensinį aptikimą, nes dauguma antisensinių nuorašų yra silpnai išreikšti (3 papildoma lentelė), todėl juos sunku atskirti nuo triukšmo. Pažymėtina, kad keli antisensiniai segmentai, išfiltruoti ActD− (48 segmentai, 4 pav. A oranžiniai taškai), aptinkami ActD+, o tai rodo, kad šie atvejai buvo klaidingai filtruoti (rankinis patikrinimas tai patvirtina). Be to, ActD+ taip pat išsprendžia dirbtinius antisensinius segmentus, kurie klaidingai praėjo skaičiavimo filtrą (44 segmentai, 4 A pav. žali taškai). Trečia, atlikome pusiau kiekybinę sruogoms būdingą RT-PGR analizę 10 antisensinių segmentų (4 B pav.): iš trijų antisensinių transkriptų, aptiktų tiek ActD+, tiek ActD− ( MBR1, EPL1, MRK1 ), visi trys davė signalą sruogoms būdingu RT-PCR. Priešingai, iš septynių antisensinių segmentų, aptiktų tik ActD− ( CYS4, EMP24, PNC1, MDH3, HAC1, TRR1, PFK1 ), visi septyni davė neigiamus rezultatus, atlikus specifinę RT-PGR.

Antisensinių nuorašų patvirtinimas. ( A ) ActD ir skaičiavimo filtravimo palyginimas. Antisensinių segmentų ekspresijos lygis reakcijose su (ActD+) ir be ActD (ActD−). ActD− duomenims rodomi tik tie antisensiniai segmentai, kurie praėjo skaičiavimo filtrą. Taškinės linijos žymi fono slenksčius. Mėlyni taškai, segmentai, bendri tarp ActD+ ir filtruotų ActD− oranžinių taškų, unikalūs ActD+ žaliiems taškams, unikalūs filtruotiems ActD−. Galimas šių segmentų sąrašas (4 papildoma lentelė). ( B ) Antisensinių transkriptų sruogoms būdinga RT-PGR. Trys antisensinės RNR, priešingos MRB1, EPL1 ir MRK1 gavo RT-PGR produktą. Septyni regionai, kuriuose numanomi antisensiniai artefaktai buvo aptikti masyvo analize, priešingai nei CYS4, EMP24, PNC1, MDH3, HAC1, TRR1 ir PFK1 negavo RT-PGR produkto. ACT1 prasmės RT-PGR reakcijos buvo naudojamos kaip kiekvienos atskiros RT-PGR – RT žymi RT reakcijos, kuriose atvirkštinė transkriptazė buvo praleista, kontrolė. gDNR rodo, kad PGR reakcijos su genomo DNR kaip šablonu reakcijos buvo atliktos trimis egzemplioriais.

Antisensinių nuorašų patvirtinimas. ( A ) ActD ir skaičiavimo filtravimo palyginimas. Antisensinių segmentų ekspresijos lygis reakcijose su (ActD+) ir be ActD (ActD−). ActD− duomenims rodomi tik tie antisensiniai segmentai, kurie praėjo skaičiavimo filtrą. Taškinės linijos žymi fono slenksčius. Mėlyni taškai, segmentai, bendri tarp ActD+ ir filtruotų ActD− oranžinių taškų, unikalūs ActD+ žaliiems taškams, unikalūs filtruotiems ActD−. Galimas šių segmentų sąrašas (4 papildoma lentelė). ( B ) Antisensinių transkriptų sruogoms būdinga RT-PGR. Trys antisensinės RNR, priešingos MRB1, EPL1 ir MRK1 gavo RT-PGR produktą. Septyni regionai, kuriuose numanomi antisensiniai artefaktai buvo aptikti masyvo analize, priešingai nei CYS4, EMP24, PNC1, MDH3, HAC1, TRR1 ir PFK1 negavo RT-PGR produkto. ACT1 prasmės RT-PGR reakcijos buvo naudojamos kaip kiekvienos atskiros RT-PGR – RT žymi RT reakcijos, kuriose atvirkštinė transkriptazė buvo praleista, vidinės kontrolės priemonės. gDNR rodo, kad PGR reakcijos su genomo DNR kaip šablonu reakcijos buvo atliktos trimis egzemplioriais.


Yra trys skirtingi šaltinių rinkiniai, skirti anotuoti genus ir transkriptus „Vega“. Jie rodomi kaip skirtingi takeliai ir turi skirtingas spalvų schemas.

  • Havanos pagrindiniai genai buvo išsamiai komentuoti, kad būtų galima nustatyti alternatyvius nuorašus, ir yra visoms rūšims. Jas komentavo Havanos grupė WTSI.
  • LoF genai parodyti sekos svyravimų pasekmes žmogaus nuorašų funkcinėms savybėms.

Kiekvieno iš šių rinkinių genai ir nuorašai klasifikuojami taip, kaip parodyta toliau.


Padėkos

Dėkojame profesoriui Jirong Huang ir jo studentui Fenhong Hu (Augalų fiziologijos ir ekologijos institutas, Šanchajaus biologijos mokslų institutai, CAS) už pagalbą atlikti Northern Blot analizę. Šį darbą parėmė Šanchajaus biologijos mokslų institutų, CAS (2010KIP203), Kinijos nacionalinio gamtos mokslų fondo (Grant 31000560) ir Kinijos mokslų akademijos (KSCX2-EW-Q-1-05) žinių inovacijų programa. TL. Autoriai dėkoja už paramą K.C. Wong Education Foundation, Honkongas į TL. Šį darbą taip pat palaikė Kinijos mokslų akademija (KSCX2-YW-N-094), Kinijos mokslo ir technologijų (2011CB100205) ir žemės ūkio (2011ZX08001-004 ir 2011ZX08009-002) ministerijos bei Nacionalinis gamtos mokslas. Kinijos fondas (30821004) BH.


Įjungimo-išjungimo jungiklis genų redagavimui

Per pastarąjį dešimtmetį CRISPR-Cas9 genų redagavimo sistema padarė revoliuciją genų inžinerijoje, leisdama mokslininkams atlikti tikslinius organizmų DNR pakeitimus. Nors sistema gali būti naudinga gydant įvairias ligas, CRISPR-Cas9 redagavimas apima DNR grandinių pjovimą, dėl kurio atsiranda nuolatinių ląstelės genetinės medžiagos pokyčių.

Dabar internete paskelbtame straipsnyje Ląstelė balandžio 9 d., mokslininkai aprašo naują genų redagavimo technologiją, pavadintą CRISPRoff, kuri leidžia tyrėjams labai specifiškai kontroliuoti genų ekspresiją, paliekant nepakitusią DNR seką. Sukurtas Whitehead instituto nario Jonathano Weissmano, Kalifornijos universiteto San Francisko docento Luke'o Gilberto, Weissman laboratorijos postdoc Jameso Nuñezo ir bendradarbių, metodas yra pakankamai stabilus, kad būtų paveldimas per šimtus ląstelių dalijimosi, ir taip pat yra visiškai grįžtamas.

„Svarbiausia istorija yra ta, kad dabar turime paprastą įrankį, galintį nutildyti didžiąją daugumą genų“, – sako Weissmanas, kuris taip pat yra MIT biologijos profesorius ir Howardo Hugheso medicinos instituto tyrėjas. „Mes galime tai padaryti keliems genams tuo pačiu metu nepažeisdami DNR, su dideliu homogeniškumu ir tokiu būdu, kurį galima pakeisti. Tai puiki priemonė genų ekspresijai kontroliuoti“.

Projektas buvo iš dalies finansuojamas iš 2017 m. Gynybos pažangių tyrimų projektų agentūros dotacijos, skirtos sukurti grįžtamąjį genų redaktorių. „Pasukus ketverius metus [nuo pradinės dotacijos] ir CRISPRoff pagaliau veikia taip, kaip buvo įsivaizduojama mokslinės fantastikos būdu“, – sako vienas iš vyresniųjų autorių Gilbertas. „Įdomu matyti, kad tai taip gerai veikia praktikoje.

Genų inžinerija 2.0

Klasikinėje CRISPR-Cas9 sistemoje naudojamas DNR pjaustantis baltymas, vadinamas Cas9, randamas bakterinėse imuninėse sistemose. Sistema gali būti nukreipta į konkrečius genus žmogaus ląstelėse, naudojant vieną kreipiamąją RNR, kur Cas9 baltymai sukuria nedidelius pertraukas DNR grandinėje. Tada esama kameros remonto technika užlopo skyles.

Kadangi šie metodai pakeičia pagrindinę DNR seką, jie yra nuolatiniai. Be to, jų priklausomybė nuo „vidinių“ korinio ryšio taisymo mechanizmų reiškia, kad sunku apriboti rezultatą iki vieno pageidaujamo pakeitimo. „Kad ir koks gražus būtų CRISPR-Cas9, jis pašalina natūralius ląstelių procesus, kurie yra sudėtingi ir daugialypiai“, – sako Weissman. „Labai sunku kontroliuoti rezultatus.

Čia mokslininkai pamatė galimybę sukurti kitokį genų redaktorių – tokį, kuris nekeičia pačių DNR sekų, bet pakeitė jų skaitymo būdą ląstelėje.

Toks modifikavimas yra tai, ką mokslininkai vadina „epigenetiniu“ – genai gali būti nutildyti arba aktyvuoti dėl cheminių DNR grandinės pokyčių. Ląstelių epigenetikos problemos yra atsakingos už daugelį žmonių ligų, tokių kaip Fragile X sindromas ir įvairios vėžio formos, ir gali būti perduodamos iš kartos į kartą.

Epigenetinis genų nutildymas dažnai vyksta metilinant – tam tikrose DNR grandinės vietose pridedant cheminių žymenų – dėl to DNR tampa neprieinama RNR polimerazei – fermentui, kuris nuskaito genetinę informaciją DNR sekoje į pasiuntinio RNR transkriptus, galiausiai gali būti baltymų planai.

Weissmanas ir bendradarbiai anksčiau buvo sukūrę du kitus epigenetinius redaktorius, pavadintus CRISPRi ir CRISPRa, tačiau abu jie buvo su įspėjimu. Kad jie veiktų ląstelėse, ląstelės turėjo nuolat ekspresuoti dirbtinius baltymus, kad išlaikytų pokyčius.

„Naudodami šią naują CRISPRoff technologiją galite [trumpai išreikšti baltymą] ir parašyti programą, kurią ląstelė įsimena ir neribotą laiką atlieka“, – sako Gilbertas. „Jis pakeičia žaidimą, todėl dabar jūs iš esmės rašote pakeitimą, kuris perduodamas dalijant ląsteles – tam tikrais būdais galime išmokti sukurti 2.0 CRISPR-Cas9 versiją, kuri yra saugesnė ir tokia pat efektyvi ir gali atlikti visus šiuos veiksmus. ir kiti dalykai“.

Jungiklio statyba

Norėdami sukurti epigenetinį redaktorių, galintį imituoti natūralų DNR metilinimą, mokslininkai sukūrė mažą baltymų mašiną, kuri, vadovaujama mažų RNR, gali priklijuoti metilo grupes į konkrečias grandinės vietas. Tada šie metilinti genai yra „nutildomi“ arba išjungiami, todėl jie vadinami CRISPRoff.

Kadangi šis metodas nekeičia DNR grandinės sekos, tyrėjai gali pakeisti slopinimo efektą naudodami fermentus, kurie pašalina metilo grupes – metodą jie pavadino CRISPRon.

Išbandę CRISPRoff skirtingomis sąlygomis, mokslininkai atrado keletą įdomių naujosios sistemos savybių. Viena vertus, jie galėjo taikyti šį metodą didžiajai daugumai žmogaus genomo genų – ir jis veikė ne tik pačius genus, bet ir kitus DNR regionus, kurie kontroliuoja genų ekspresiją, bet nekoduoja baltymų. „Tai buvo didžiulis šokas net mums, nes manėme, kad tai bus taikoma tik tam tikram genų pogrupiui“, - sako pirmasis autorius Nuñezas.

Be to, mokslininkams stebėtina, kad CRISPRoff netgi sugebėjo nutildyti genus, neturinčius didelių metilintų regionų, vadinamų CpG salomis, kurios anksčiau buvo manoma, kad tai buvo būtina bet kuriam DNR metilinimo mechanizmui.

„Prieš šį darbą buvo manoma, kad 30 procentų genų, neturinčių CpG salos, nebuvo kontroliuojami DNR metilinimo“, - sako Gilbertas. „Tačiau mūsų darbas aiškiai rodo, kad jums nereikia CpG salos, kad genai būtų išjungti metilinimo būdu. Man tai buvo didžiulė staigmena“.

CRISPRoff tyrimuose ir terapijoje

Siekdami ištirti CRISPRoff galimybes praktiškai pritaikyti, mokslininkai išbandė metodą sukeltose pluripotentinėse kamieninėse ląstelėse. Tai ląstelės, kurios gali virsti daugybe ląstelių tipų organizme, priklausomai nuo molekulių, su kuriomis jos susiduria, kokteilio, todėl yra galingi modeliai tiriant tam tikrų ląstelių tipų vystymąsi ir funkcijas.

Tyrėjai pasirinko geną, kad nutildytų kamienines ląsteles, o paskui paskatino jas virsti nervinėmis ląstelėmis, vadinamomis neuronais. Kai jie ieškojo to paties geno neuronuose, jie atrado, kad jis liko nutildytas 90 procentų ląstelių, o tai atskleidė, kad ląstelės išsaugo CRISPRoff sistemos epigenetinių modifikacijų atmintį net ir keičiant ląstelių tipą.

Jie taip pat pasirinko vieną geną, kurį naudos kaip pavyzdį, kaip CRISPRoff gali būti taikomas terapijoje: geną, koduojantį Tau baltymą, kuris yra susijęs su Alzheimerio liga. Išbandę metodą neuronuose, jie sugebėjo parodyti, kad naudojant CRISPRoff galima sumažinti Tau išraišką, nors ir ne visiškai. "Mes parodėme, kad tai yra perspektyvi strategija, skirta nutildyti Tau ir užkirsti kelią šio baltymo ekspresijai", - sako Weissmanas. „Taigi kyla klausimas, kaip tai pristatyti suaugusiam žmogui? Ir ar tikrai to pakaktų paveikti Alzheimerio ligą? Tai dideli atviri klausimai, ypač pastarieji.

Net jei CRISPRoff nesukelia Alzheimerio terapijos, yra daug kitų sąlygų, kurioms jis gali būti taikomas. Ir nors pristatymas į konkrečius audinius išlieka iššūkiu genų redagavimo technologijoms, tokioms kaip CRISPRoff, „mes parodėme, kad galite laikinai ją pristatyti kaip DNR arba kaip RNR – tą pačią technologiją, kuri yra Moderna ir BioNTech koronaviruso vakcinos pagrindas“, – sakė Weissman. sako.

Weissmanas, Gilbertas ir bendradarbiai entuziastingai džiaugiasi CRISPRoff potencialu tyrimams. „Kadangi dabar galime nutildyti bet kurią norimą genomo dalį, tai puiki priemonė tyrinėti genomo funkciją“, – sako Weissmanas.

Plus, having a reliable system to alter a cell’s epigenetics could help researchers learn the mechanisms by which epigenetic modifications are passed down through cell divisions. “I think our tool really allows us to begin to study the mechanism of heritability, especially epigenetic heritability, which is a huge question in the biomedical sciences,” Nuñez says.