Informacija

Ar GroEL ir GroES ekspresija eritrocituose būtų potencialiai veiksminga pjautuvinių ląstelių ligos terapija?

Ar GroEL ir GroES ekspresija eritrocituose būtų potencialiai veiksminga pjautuvinių ląstelių ligos terapija?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ar GroEL ir GroES ekspresija eritrocituose būtų potencialiai veiksminga pjautuvinių ląstelių ligos gydymo strategija? Kodėl ar kodėl ne?


  1. GroEL ir GroES yra daugiaproteininiai chaperonino kompleksai: ne taip lengva išreikšti negimdiniu būdu
  2. Eritrocitai neturi branduolio: brandžiuose eritrocituose negalite nieko stabiliai išreikšti.
  3. Jei jūsų tikslas yra atlikti stabilią genų ekspresiją (tam reikėtų genomo integracijos), geresnis būdas yra atlikti genų terapiją: kultivuoti hematopoetines kamienines ląsteles, ištaisyti mutaciją homologine rekombinacija. Įdėkite ląsteles atgal į kaulų čiulpus.

Hidrofobiškumas: senovės su pažeidimais susijęs molekulinis modelis, kuris inicijuoja įgimtą imuninį atsaką

Šiuo metu manoma, kad imuninį atsaką inicijuoja su patogenais susiję molekuliniai modeliai arba iš audinių gaunami pavojaus / pavojaus signalai. Čia mes siūlome, kad šios dvi molekulių grupės nebūtų tarpusavyje nesuderinamos. Daugelis iš jų gali būti evoliuciškai senovinės įspėjimo sistemos dalis, kurioje hidrofobinės biologinių molekulių dalys, kai yra veikiamos, veikia kaip universalūs su pažeidimais susiję molekuliniai modeliai, inicijuojantys atstatymą, pertvarkymą ir imunitetą.


Genetinės inžinerijos taikymas kuriant bioterapiją

Genų inžinerijos pažanga padarė didelę įtaką bioterapijos pramonei ir suformavo daugelį šiandien naudojamų metodų ir strategijų tiek biologinei gamybai, tiek terapiniam planavimui. Produkcijos išeiga ir kokybė buvo pagerinta manipuliuojant genų, dalyvaujančių ląstelių išlikime, metabolizme, sekrecijoje ir glikozilinimo procesuose, ekspresija, be kita ko, o naujausi genų terapijos klinikinių tyrimų proveržiai rodo didelį pažadą ateičiai. Čia apžvelgiame dabartines šioje srityje naudojamas genomo redagavimo priemones ir išnagrinėjame pagrindines mikrobų ir žinduolių šeimininkų bioprodukcijos tyrimų sritis, taip pat pažangą genų ir ląstelių terapijoje.

Metodai

Apibendriname genų redagavimo metodus, naudojamus tiek prokariotų, tiek eukariotų pagrindu pagamintai bioprodukcijai, ir pateikiame trumpą klinikinių genų terapijos metodų apžvalgą.

Rezultatai

Nors ankstyvoji genų inžinerijos pažanga sukūrė idealias prokariotines ląsteles-šeimininkes bioprodukcijai, programuojamų nukleazių atsiradimas labai išplėtė eukariotinių šeimininkų naudingumą glikoproteinų gamybai, suteikdamas galimybę tiksliau kontroliuoti šias ląstelių gamyklas. Tos pačios priemonės taip pat suteikė naujų galimybių kurti genų terapija pagrįstą terapiją, kai šiuo metu atliekami keli klinikiniai tyrimai.

Išvada

Genų inžinerija pakeitė bioterapinį kraštovaizdį ir sukūrė naujus bioprodukcijos ir terapinio dizaino būdus.


Abstraktus- Kaip ląstelė reaguoja į stresą, yra pagrindinė širdies ir kraujagyslių biologijos problema. Įvairūs fiziologiniai įtempiai (pvz., karštis, hemodinamika, mutantiniai baltymai ir oksidacinis pažeidimas) sukelia daugybę ląstelių pokyčių, kurie galiausiai paveikia baltymų struktūras ir funkcijas. Ląstelės iš skirtingų filų inicijuoja įvykių kaskadą, įtraukiančių esminius baltymus, molekulinius chaperonus, priimant sprendimus dėl pažeistų baltymų atkūrimo arba skaidymo kaip gynybos strategijos, užtikrinančios išlikimą. Sukaupti įrodymai rodo, kad molekuliniai chaperonai, tokie kaip streso baltymų (HSP) šilumos šoko šeima, aktyviai dalyvauja daugybėje ląstelių procesų, įskaitant citoprotekciją. Visur esančios HSP šeimos universalumą dar labiau padidina streso sukeliami reguliavimo tinklai tiek transkripcijos, tiek potranskripcijos lygiu. Šioje apžvalgoje aptariame HSP chaperonų reguliavimą ir funkciją bei jų klinikinę reikšmę tokiomis sąlygomis kaip širdies hipertrofija, kraujagyslių sienelės pažeidimas, širdies chirurgija, išeminis išankstinis kondicionavimas, senėjimas ir, tikėtina, genų, koduojančių susitraukiančius baltymus ir jonų kanalus, mutacijos. .

Fiziologinis stresas, pradedant miokardo išemija ir baigiant genetinėmis mutacijomis, sukelia ligas, kai baltymų pažeidimas ir netinkamai susilankstytos baltymų struktūros yra bendras vardiklis. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kaip ląstelė reaguoja? Ląstelių homeostazės atkūrimui naudojami keli endogeniniai keliai, tačiau vienas gerai apibūdintas mechanizmas, apimantis baltymų lankstymą, yra streso baltymų arba HSP šilumos šoko šeima. 10 11 Įžvalgą apie mechanizmus, kuriais grindžiama HSP funkcija, suteikia 2 pagrindinės įrodymų linijos: (1) norint teisingai sulankstyti daug baltymų ląstelėje, reikia baltymų sulankstymo mechanizmų, molekulinių šaperonų, 12 13 ir (2) HSP chaperonai yra denatūruoti. baltymų arba skatina jų skaidymą po karščio šoko. 14 15

Genetiniai tyrimai pateikia įtikinamų įrodymų įvairiose grupėse, kad per didelė streso baltymų ekspresija yra galinga citoprotezės priemonė net ir nepažeistoje širdyje. 10 16 17 18 Panašiai biocheminiai tyrimai parodė, kad Hsc70 chaperonas padidina produktyvų bendros CFTR ΔF508 mutacijos sulankstymą. Tai rodo fiziologinį HSP chaperono vaidmenį sergant žmonių ligomis. 19 20 Skirtingi mechanizmai, gaminantys nenormalius arba netinkamai susilanksčiusius ląstelių baltymus, susilieja į bendrą kelią, todėl padidėja citoprotekcinių streso baltymų kiekis, kuris sumažina arba neutralizuoja žalingą ūminio ar lėtinio streso poveikį.

Šioje apžvalgoje apibendriname dabartines žinias apie atskirų chaperonų (pvz., Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27 ir αB-kristalino) reguliavimą ir funkciją širdies ir kraujagyslių sistemoje. Be jų nusistovėjusio vaidmens ląstelių išgyvenime (nekrozei ir apoptozei), pabrėšime naujus įrodymus apie chaperono funkcijas fiziologinėje adaptacijoje širdies hipertrofijos, išeminio išankstinio kondicionavimo, kraujagyslių sienelės pažeidimo, oksidacinio streso ir senėjimo metu. Nors šiuo metu galime tik spėlioti apie jų vaidmenį sergant konkrečiomis širdies ligomis, aptarsime daug galimų galimybių nustatyti, ar HSP chaperonai daro poveikį natūraliai ligų, atsirandančių dėl širdies susitraukimo aparato mutacijų, arba atlieka tiesioginį fiziologinį vaidmenį. pvz., hipertrofinė kardiomiopatija) ir jonų kanalai (pvz., ilgo QT sindromas) žmonėms.

Apibrėžimai ir nomenklatūra

Kas yra streso „šilumos šoko“ baltymai?

Terminas „šilumos šoko“ baltymas yra klaidingas įvardijimas, tačiau jis tebėra rimto Ritossos atradimo palikimas 21 , kad karščio šokas sukėlė seilių liaukų ląstelių chromosomų pūsles. Drosophila. Šilumos stresas (≈5 ° viršija normalią augimo temperatūrą) padidina greitą daugiagenės baltymų šeimos, iš pradžių vadinamų šilumos šoko baltymais, sintezę, 22 kurie yra atsako, dažnai vadinamo šilumos šoko atsaku, rezultatas. 10 21 Ankstesnis submirtinis šilumos stresas laikinai padidina ląstelės gebėjimą atlaikyti kitaip mirtiną vėlesnį karščio iššūkį. Šis reiškinys arba termotolerancija atliko pagrindinį vaidmenį pradedant daugybę tyrimų tiek in vitro, tiek in vivo eksperimentiniuose modeliuose, kuriuose buvo nustatytas panašus ryšys tarp atsako į šilumos šoką ir apsaugos nuo imituojamos hipoksijos ar išemijos. Iš tiesų, įvairūs stresai, įskaitant sunkiuosius metalus, aminorūgščių analogus, uždegimą ir oksidacinį / išeminį stresą, sukelia HSP genų ekspresiją. Todėl pirmenybė teikiama sąvokoms „streso baltymai“ arba „šilumos šoko streso baltymų šeima“, nors daugelis šių baltymų atlieka esmines funkcijas netemptomis sąlygomis. 13

Streso baltymai priklauso kelių genų šeimoms, kurių molekulinis dydis svyruoja nuo 10 iki 150 kDa ir yra randamas visuose pagrindiniuose ląstelių skyriuose. Įvairių molekulinių dydžių streso baltymus įprasta pavadinti taip: Hsp27, Hsp70 ir Hsp90, o karščio šoko baltymų genai žymimi taip: hsp27, hsp70 ir hsp90. 23 Skirtumas tarp konstituciškai išreikštų (pvz., Hsc70 ir Hsp90β) arba giminingų HSP šeimos narių ir jų indukuojamų izoformų (atitinkamai Hsp70 ir Hsp90α) yra savavališkas, nes kaupiami įrodymai fiziologiškai svarbiose in vivo sistemose dabar rodo, kad tokie ryšiai. priklauso nuo ląstelių ir audinių apribotos ekspresijos.

Šilumos ir išeminio streso pasekmės ląstelėse yra panašios

Kaip ir eksperimentinė išemija / reperfuzija, šilumos šokas yra stresas, kuris sutrikdo daugybę medžiagų apykaitos procesų ir ląstelių struktūrų ir kuris baigiasi ląstelių mirtimi, kai viršijama kritinė riba. 10 24 25 Tiek karščio stresas, tiek išemija daro didelę žalą citoskeletui, įskaitant siūliško tarpinio gijų tinklo žlugimą į didelius perinuklearinius agregatus, citoplazminio tinklo pertvarkymą, aktino turinčių skaidulų perkėlimą aplink branduolį, mikrotubulių ir mitozinis velenas. 26 27 Mitochondrijų patinimas, mitochondrijų praradimas ir oksidacinio fosforilinimo atsijungimas yra panašiai bendri šilumos šoko ir ankstyvo grįžtamojo išeminio pažeidimo bruožai. 28 29 30

Būdinga tai, kad bendra baltymų sintezė yra slopinama po didelio karščio dėl inicijavimo faktorių, tokių kaip eIF2α, fosforilinimo, kuris sutrikdo ribosomų surinkimą ir inaktyvuoja dangtelį surišančius baltymus. 31 32 33 Priešingai, HSP genai yra efektyviai ekspresuojami po karščio, iš dalies dėl to, kad keliuose indukuojamuose (pvz., hsp70) genuose nėra intronų. Be to, mRNR splaisingo pokyčiai ir karščio sukeltas mRNR stabilizavimas yra adaptyvūs mechanizmai, naudojami efektyviai išversti streso baltymus, kurie per kelias minutes po fiziologinio streso tokiomis sąlygomis gali pasiekti 15–25 % viso intracelulinio baltymo. 10 34 Atsitiktinai keli citozoliniai chaperonai persikelia į branduolį, 35 kur šilumos sukeltas DNR chromatino surinkimo slopinimas atskleidžia nukleazėms jautrią konformaciją, kuri yra patognomoninis šilumos ir išemijos sukeltos apoptozės požymis. 36 Mažiau dramatiški pokyčiai pastebimi integraliuose membranos baltymuose, lipidų dvisluoksnyje ir ląstelių paviršiaus morfologijoje. Po kenksmingų dirgiklių nutraukimo greitai ir efektyviai degraduoja Hsp mRNR. 37 38 39

Kaip minėta anksčiau, ankstesnis subletalinis karščio stresas arba „hiperterminis išankstinis kondicionavimas“ labai susilpnina visus šilumos sukeltus ląstelių pokyčius iki vėlesnio didelio karščio. Be to, išankstinis apdorojimas šiluma sukuria „kryžminę toleranciją“ įvairių tipų fiziologiniam stresui. Pavyzdžiui, nepažeistos išeminės širdies apsauga po pirminio terminio apdorojimo gali trukti nuo kelių valandų iki dienų. 40 41 Įžvalgos, gautos iš fiziologinių Hsp ekspresijos vaidmenų reaguojant į šilumos šoką, prisidėjo prie dabartinių minčių apie chaperono funkcijas patologinėse būsenose, dėl kurių gali atsirasti nenormalus baltymų sulankstymas.

Visų pirma dėmesys buvo sutelktas į HSP chaperonų indukciją ir galimus taisymo mechanizmus, susijusius su išemijos / reperfuzijos pažeidimo mažinimu. 1 paveikslas schematiškai apibendrina daugelį šių sąvokų ir iliustruoja daugybę gerai atpažįstamų mechanizmų, susijusių su išeminiu miokardo pažeidimu, įskaitant oksidacinį stresą / pažeidimą, kalcio perteklių ir aktyvuotas proteazes, proteolitinių ir lizosomų fermentų išsiskyrimą, citoskeleto pokyčius ir komplemento aktyvavimą.

Įvairūs fiziologiniai įtempiai sukelia HSP genų ekspresiją per bendrą mechanizmą

Greita streso baltymų ekspresijos indukcija pasiekiama naudojant transkripcijos aktyvavimo ir pirmenybinio vertimo mechanizmus. 10 42 HSF (HSF1–HSF4) reguliuoja indukuojamą HSP sintezę vystymosi, augimo ir adaptacijos metu. 42 43 44 Tuo tarpu esminiai vienos kopijos genai koduoja HSF Saccharomyces cerevisiae ir DrosophilaViščiukams, augalams, pelėms ir žmonėms buvo nustatyti 45 46 daugybiniai HSF. 47 48 49 50 51 Pelėje buvo nustatyti du HSF (HSF1 ir HSF2, koduojantys atitinkamai 75 ir 72 kDa baltymus). 49 Nei HSF1, nei HSF2 nėra indukuojami šiluma, tačiau HSF1 yra hiperfosforilinamas ras- priklausomas MAPK pošeimių narių (ERK1, JNK/SAPK ir p38 proteinkinazės) būdas fiziologinio streso metu. 52 53 Neįtemptomis sąlygomis stuburinio HSF1 DNR surišimo aktyvumas ir transkripcijos aktyvumas yra griežtai neigiamai kontroliuojami (apžvelgta 44 nuorodoje 44 ). Tačiau tebėra prieštaringa, ar chaperono Hsp70 slopinimas, serino liekanų konstitucinio fosforilinimo sekvestracija ar nežinomi slopinamieji reguliatoriai yra pagrindiniai mechanizmai, kuriais grindžiamas streso sukeltas aktyvavimas ir greitas HSF1 deaktyvavimas. 43 54 55 56

Ankstesni tyrimai parodė, kad reaguojant tiek į šilumą, tiek į imituojamą išemiją, HSF1 aktyvinimo mechanizmas (-ai) yra panašus (-i), jei ne identiškas, miogeninėse ląstelėse 57 ir kad tarpląstelinio ATP išeikvojimas vaidina svarbų vaidmenį skatinant HSF1-DNR prisijungimą. veikla. 58 Manoma, kad sergant ligomis HSF1 aktyvacijos induktoriai, tokie kaip oksiduotas MTL ir reaktyvūs azoto tarpiniai produktai, padidina baltymų pažeidimą, dėl kurio padidėja HSP geno ekspresijos reguliavimas. 59 60 61 Tačiau transkripcijos HSF1 kelio aktyvacija nereikalauja naujos baltymų sintezės, nes jau buvęs transaktyvatorius (HSF1) yra neaktyvus nepatemptoje būsenoje. 43 56 57 Fiziologiniai įtempiai, tokie kaip karštis ir išemija, skatina HSF1 monomerus oligomerizuotis kaip homotrimeriai, kurie vėliau prisijungia prie sekai būdingo motyvo, šilumos šoko elemento, visų streso indukuojamų HSP genų promotoriuje 62 63 (1I pav. iki 1K). Neseniai sukūrėme Hsf1 geno išmušimo modelį ir in vitro tyrimuose parodėme esminį šio reguliavimo kelio reikalavimą ląstelių gynybai ir termotolerancijai. 36 Be to, streso baltymų ekspresija buvo susijusi su naviko ląstelių išgyvenimo 64 skatinimu ir išeminės širdies apsauga. 16 17 18

Streso baltymų perteklius padidina išeminės širdies fiziologinio atsigavimo greitį

Didelėje literatūroje aprašoma Hsp70 indukcija dėl išemijos, 57 65 66 galimas Hsp70 vaidmuo išeminiam išankstiniam kondicionavimui 40 67 ir atvirkštinė koreliacija tarp Hsp70 ekspresijos, sukeltos išeminio ar terminio kondicionavimo, ir infarkto dydžio gyvūnų modeliuose. 41 68 69 70 Be to, priverstinė Hsp70 ekspresija perteikia citoprotekcinį poveikį kultivuotose ląstelėse, įskaitant širdies miocitus, kuriems buvo atlikta imituojama išemija. 71 72 Konkrečiai, per didelė pagrindinio 70 kDa šilumos šoko baltymo (Hsp70) ekspresija transgeninėse pelėse pagerina miokardo funkciją, 16 17 18 išsaugo metabolinį funkcinį atsigavimą, 18 ir sumažina infarkto dydį 73 po išemijos/reperfuzijos. Be Hsp70, Hsp27 ir αB-kristalinas gali apsaugoti pirminius kardiomiocitus nuo išeminių pažeidimų. 74 Nors tikslūs mechanizmai nėra pakankamai suprantami, manoma, kad streso baltymai tarpininkauja širdies apsaugai per savo biologines molekulinių chaperonų funkcijas.

Streso baltymai gali veikti kaip molekuliniai chaperonai

Molekuliniai chaperonai, tokie kaip Hsp70 ir αB-kristalinas, yra baltymai, kurie palengvina kitų baltymų lankstymą, surinkimą ir išardymą, bet nėra galutinio produkto dalis. 75 Kadangi daugeliui baltymų sulankstyti reikia chaperonų, šie baltymai yra esminiai komponentai paskutinėje pagrindinės molekulinės biologijos dogmos stadijoje: DNR↔RNR → polipeptidas → sulankstytas baltymas. 11 75 In vitro chaperonai apsaugo nuo kitų baltymų agregacijos streso sąlygomis ir skatina denatūruotų baltymų substratų arba fermentų (pvz., citrato sintazės, β-galaktozidazės ar luciferazės) fermentinio aktyvumo atkūrimą pašalinus stresą. 11 13 76

2 paveiksle schematiškai parodytas chaperono Hsc70 reakcijos ciklas, palyginti su neseniai identifikuotais kochaperonais ir molekuliniais substratais ląstelėje. Pavyzdžiui, chaperonas Hsp40 atlieka pagrindinę katalizinę funkciją įkeldamas tikslinius substratus į Hsc70 surišimo / atpalaidavimo ciklą. 77 Nors šių funkcijų mechanizmai vis dar atsiranda, pagrindinės molekulinių chaperonų funkcijos yra (1) laikinai surišti ir atidėti besiformuojančių polipeptidinių grandinių sulankstymą, kol bus baigta sintezė, (2) išlaikyti polipeptidines grandines tinkamoje konformacijoje, tinkančioje translokacijai. per organelių membranas, (3) užkirsti kelią agregacijai dėl intramolekulinių ar tarpmolekulinių sąveikų, (4) aktyviai išardyti klatrinu padengtas pūsleles, (5) išlaikyti steroidų aporeceptorių kompleksus kompetentingose ​​ligandų būsenose (Hsp90 ir kochaperonas) ir (6) padėti skaidyti toksines medžiagas. metabolitai, skatindami ubikvinaciją ir proteasomų lizę 78 (1L–1P pav.).

Molekulinių chaperonų atvejis sergant širdies ligomis

Plačiai paplitęs klinikinis susidomėjimas biologinėmis molekulinių chaperonų funkcijomis apima įvairias žmogaus patologijas, pradedant nuo degeneracinių būklių, tokių kaip Alzheimerio liga, prionai, amiloidozė, kataraktos formavimasis, pjautuvinių ląstelių liga, cistinė fibrozė ir įvairios širdies ligos, įskaitant miokardo išemiją. Ankstyvieji įvykiai, atkuriantys savalaikį išeminio miokardo tekėjimą tromboliziniais vaistais, tiesiogine angioplastika arba spontaniškai suskaidžius krešulį, yra būtini siekiant pagerinti miokardo išgelbėjimą ir sumažinti sergamumą bei mirtingumą. 79 80 Nepaisant to, pasikartojanti išemija dėl nestabilios plokštelės plyšimo arba stazinio širdies nepakankamumo gali apsunkinti klinikinę ūminio miokardo infarkto eigą. Nekomplikuoto ūminio miokardo infarkto atveju fiziologinis atsigavimas ląstelių lygmeniu prasideda per kelias minutes, bet gali trukti kelias savaites ar mėnesius, kol miokardo atstatymas bus baigtas. Taigi, endogeniniai apsauginiai mechanizmai turi klinikinę reikšmę mažinant išeminės širdies ligos poveikį.

HSP reguliavimo kelio ir chaperonų biocheminė veikla miokardo išemijos metu

Ankstesniame darbe, kurio buvo imtasi siekiant apibrėžti artimiausią HSF aktyvacijos stimulą, mes pastebėjome, kad sunki tarpląstelinė acidozė (pH 6, 7) buvo nepakankama, kad sukeltų HSF1 DNR prisijungimą kultivuotose miogeninėse ląstelėse, veikiamose imituojamos išemijos, jei buvo išsaugotos ATP atsargos. 58 Priešingai, stiprus ATP išeikvojimas (65 %) paskatino HSF1 prisijungimą prie DNR, net jei pH buvo palaikomas normos ribose. 58 Nepažeistoje išeminėje širdyje 15 minučių išemija, sukelianti grįžtamąjį sužalojimą, yra susijusi su panašiu didelės energijos ATP atsargų sumažėjimu (65 %), o mirtinas sužalojimas randamas užsitęsus išemijai (>40 minučių) ir >90 % išeikvojimui. daug energijos naudojančių baseinų. 81 The Km silpnas galvijų Hsc70 ATPazės aktyvumas yra nuo 1 iki 2 μmol/L, 3 dydžiais mažesnis už intracelulinio adenino nukleotidų telkinių milimolinę koncentraciją.75 Todėl mažai tikėtina, kad nuo ATP priklausomas HSF1 reguliavimo kelio aktyvavimas ir molekulinių chaperonų biocheminės savybės bus neigiamai paveiktos trumpalaikės išemijos ar grįžtamojo miokardo išeminio pažeidimo laikotarpiais.

Principo įrodymas, rodantis Hsp70 kardioprotekcinį poveikį transgeniniams gyvūnams, kuriems buvo išemija / reperfuzija, rodo, kad farmakologiniai arba genetiniai metodai, skirti padidinti streso baltymų ekspresiją pacientų, kuriems gresia ūminis išeminis reiškinys, miokarde, gali apriboti išeminį pažeidimą. 82 Tačiau reikia papildomų pagrindinių žinių apie (1) jų ryšį su kitais endogeniniais keliais, susijusiais su miokardo apsauga nuo oksidacinio streso ir (arba) pažeidimo, (2) funkcinį specifiškumą tarp HSP daugiagenės šeimos narių chaperonų ir (3) šio poveikio indėlį. kelias ūminės išemijos ir kitų fiziologinių būsenų, sukeliančių šilumos šoko atsaką, metu prieš klinikinį taikymą.

Streso baltymai ir antioksidaciniai būdai širdies apsaugai

Nuo 1970-ųjų gydytojai ir tyrėjai iškėlė hipotezę, kad laisvųjų radikalų gaudytojai gali pagerinti oksidacinę žalą išemijos / reperfuzijos metu. 83 Modelių sistemose nuo transgeninių Drosophila pelėms per didelė katalazės, superoksido dismutazės arba glutationo peroksidazės ekspresija paprastai apsaugo nuo oksidacinio streso. 84 85 86 Oksidacinis stresas, atsirandantis dėl išemijos / reperfuzijos, taip pat vaidina pagrindinį vaidmenį pažeidžiant gyvybiškai svarbius organus, tokius kaip smegenys, inkstai ir širdis. Manoma, kad ROS prisideda prie skilvelių disfunkcijos arba „miokardo apsvaiginimo“, aritmijų ir progresuojančio ląstelių pažeidimo arba mirties po išeminio sužalojimo (1 pav.). 87 88 89 90

Buvo pranešta apie prieštaringus rezultatus bandant tiekti antioksidantus miokardo išemijos / reperfuzijos metu ir po jos. 91 92 Egzogeniniai antioksidantai, kurie apsiriboja intersticinėmis erdvėmis, gali turėti ribotą gebėjimą apsaugoti tarpląstelinius baltymus nuo ROS. Pavyzdžiui, laisvasis hidroksilo radikalas (·OH), kuris, kaip manoma, yra pagrindinis oksidacinio pažeidimo veiksnys, taip stipriai reaguoja su tipišku substratu, kad jo pusinės eliminacijos laikas 37 °C temperatūroje yra 7 × 10–10 sekundžių. 93 Taigi sunku įsivaizduoti, kad fiziologiškai įmanomų koncentracijų egzogeninių antioksidantų skyrimas gali veiksmingai užkirsti kelią ·OH sukeltam makromolekuliniam pažeidimui. Potencialiai veiksmingesnė strategija gali būti fiziologinis ·OH gamybos sumažinimas. Iš tiesų, pernelyg didelė HSP šeimos narių išraiška gali būti vienas iš tokių būdų. Keletas tyrimų pranešė, kad apsaugant nuo miokardo išemijos, streso baltymų lygio reguliavimas koreliuoja su katalazės fermentinio aktyvumo padidėjimu, o tai rodo galimą šių endogeninių kelių sąveiką su oksidaciniu stresu. 40 94 95 Svarbus neatsakytas klausimas yra tai, ar streso baltymų, kaip molekulinių chaperonų, funkcijos papildo unikalias antioksidacinių fermentų funkcijas, apsaugančias nuo oksidacinio streso / žalos..

Citozolio/branduolinių skyrių molekuliniai chaperonai

Lentelėje parodytos pagrindinės HSP klasės, tarpląsteliniai skyriai, numatomos jų funkcijos ir galima reikšmė širdies ir kraujagyslių biologijoje.

Hsp70 palydovai

Hsp70 šeimos nariai yra plačiausiai ištirta ir gausiausia eukariotinių ląstelių grupė. 96 Citozolyje Hsp70 prisijungia prie besiformuojančių polipeptidų prieš jiems išsilaisvinant iš ribosomos. 97 Visi Hsp70 chaperono klasės nariai turi du skirtingus domenus: labai konservuotą N-galo ATPazės domeną ir labiau skirtingą C-galinį domeną, kuris jungiasi su trumpais hidrofobiniais tikslinių substratų peptidais 98 99 (2A pav.). Hsp70 chaperono funkcijai reikalingas N-galo ATPazės domenas, kuris, įdomu, yra panašus į triušio skeleto raumenų aktiną, nepaisant nedidelio sekos panašumo. 100

Šie Hsp70 struktūros / funkciniai santykiai greičiausiai suteikia in vivo chaperono aktyvumą širdies apsaugai. Šiuo atžvilgiu beveik nieko nežinoma apie konstitucinį Hsc70 chaperoną, kuris turi >80% sekos homologiją su Hsp70. Tikėtina, kad nedidelis konstitucinio Hsc70 reguliavimas gali paskatinti didelę kardioprotekcinę naudą. Tačiau HSP reguliavimas, viršijantis kritinę ribą, gali turėti žalingų pasekmių ląstelėms. 101 Neseniai buvo pranešta, kad skirtingos funkcijos tarp Hsp70 narių egzistuoja regionuose, esančiuose už peptidų surišimo domeno, o tai rodo papildomą chaperono funkcijų sudėtingumo lygį in vivo . 102

Hsp90 palydovai

2 paveiksle parodyta, kad chaperonas Hsp90 yra reakcijos ciklo, apimančio chaperono Hsc70 kompleksą ir naujai susintetintus baltymus, komponentas. Be to, Hsp90 šeimos nariai Hsp90α ir Hsp90β, kurie sudaro 1–2 % visų tirpių citoplazmos baltymų, turi geriausiai in vivo apibūdintus funkcinius ryšius su tiksliniais baltymais, steroidinių hormonų receptoriais. 103 Hsp90 su chaperono partneriais Hsp70 ir Hsp56 tiesiogiai jungiasi, stabilizuoja ir palaiko neaktyvioje konformacijoje aporeceptorių kompleksą. Ligando prisijungimas (pvz., estrogenas) prie aporeceptorių komplekso sukelia ATP hidrolizę Hsp90, kuris atsiskiria nuo „aktyvuoto“ receptoriaus, kuris dabar gali prisijungti prie sekos specifinio atpažinimo motyvo ir sukelti tikslinių genų transkripciją. 104 Be to, padidėjęs Hsp90 ekspresijos lygis destabilizuoja estrogenų receptorių / estrogenų reaguojančio elemento kompleksą ir sumažina į estrogenus reaguojančio tikslinio geno ekspresiją, o tai rodo reguliavimo grįžtamojo ryšio kilpą. 105

Hsp90 chaperono funkcijas tarpininkauja signalo perdavimo keliai, apimantys įvairias tirozino ir serino-treonino tipų baltymų kinazes, kazeino kinazę II, hemo reguliuojamą eIF-2α ir daugybę kitų ląstelių baltymų, tokių kaip kalmodulinas, aktinas ir tubulinas. (peržiūrėta 106 106 nuorodoje). Galiausiai, Hsp90 palydovai Saccharomyces cerevisiae yra būtini išgyvenimui bet kokiomis sąlygomis, palaikydami jų svarbų fiziologinį vaidmenį žemesniuosiuose eukariotuose. 107

Širdies ir kraujagyslių biologijoje ypač svarbūs citozoliniai palydovai

Skirtingai nuo visur esančių Hsp70 ir Hsp90 atitikmenų, specifiniai mažų MW HSP nariai (HO-1 arba Hsp32, Hsp27, αB-kristalinas ir Hsp20 chaperonai) pasižymi ribota audinių ekspresija, o tai rodo galimas specializuotas širdies ir kraujagyslių sistemos savybes.

Indukuojamas HO (Hsp32)

H O yra greitį ribojantis fermentas, skaidantis hemą į biliverdiną (stiprų antioksidantą), molekulinę geležį ir anglies monoksidą. Trys susiję vienos kopijos genai koduoja HO izoformas: HO-1, HO-2 ir HO-3. 108 109 110 HO-1 yra bona fide 32 kDa streso baltymas (Hsp32), kurį sukelia įvairūs fiziologiniai įtempiai, įskaitant hipoksiją, išemiją/reperfuziją, heminą, vandenilio peroksidą ir keletą sunkiųjų metalų (seleno, arsenito, kobalto, kadmio). , ir alavo jonai). 108 109 110 Indukuojamas Hsp32 (HO-1), plačiausiai išreikšta izoforma, yra miokardo ląstelėse. 111

Hsp32, kaip ir indukuojama NO sintazės forma, tarpininkauja nuo guanililciklazės priklausomo trombocitų slopinimo ir VSMC vazodilatacijos. 112 113 114 Tačiau fiziologiškai svarbios hemodinaminės jėgos (šlyties įtempis ir ciklinė deformacija) sukelia HO-1 mRNR ekspresiją, bet ne indukuojamą NO sintazės ekspresiją, o tai rodo šio streso atsako kelio specifiškumą fiziologiniams signalams. 115 Endogeniškai išsiskiriantis arba eksogeniškai vartojamas NO sukelia 3–6 kartus Hsp32 (HO-1) geno ekspresijos ir CO gamybos padidėjimą VSMC 116 116 panašiai, inhibitorius alavo protoporfirinas-IX apsaugo nuo trombocitų agregacijos indukuodamas HO-1 geną. ekspresija ir CO gamyba aortos VSMC. 115 Žiurkių VSMC gydymas angiotenzinu II sumažina Hsp32 (HO-1) mRNR ekspresiją priklausomai nuo kalcio. 117 Tačiau angiotenzino II sukelta hipertenzija padidina Hsp32 (HO-1) mRNR ekspresiją žiurkės aortoje, o tai rodo, kad hemodinamikos faktoriai įtakoja svarbiausią in vivo. 118

Keli reguliavimo būdai yra susiję su Hsp32 geno ekspresijos indukcija, ypač HSF1 ir hipoksijos sukeliamu transkripcijos faktoriaus-1 keliai. 119 120 121 122 Nors tiesioginių įrodymų apie Hsp32 chaperono funkciją trūksta, jo per didelė ekspresija kelių tipų ląstelėse apsaugo nuo oksidacinio streso / žalos. 123 124 125 Atitinkamai, tyrimai, skirti nustatyti tikslius sunkiųjų metalų, hipoksijos ir oksidacinio streso stimuliuojamus reguliavimo būdus, galėtų suteikti naujos informacijos apie biologinį Hsp32 (HO-1) vaidmenį moduliuojant oksidacinį stresą / žalą išemijos / reperfuzijos metu, kraujagyslių tonusą. (pvz., hipertenzija) ir trombocitų agregacijos ir (arba) VSMC proliferacijos slopinimas po balioninės angioplastijos.

Hsp25/27 Chaperone

Po to, kai buvo atrastas aktino polimerizacijos inhibitorius, buvo įrodyta, kad 126 chaperonas Hsp 25/27 (Hsp25 pelėms ir Hsp27 žmonėms) vaidina svarbų vaidmenį aktino gijų dinamikoje įvairių tipų ląstelėse. Fiziologiniai dirgikliai (oksidacinis stresas, citokinai ir augimo faktoriai) smarkiai padidina žmogaus Hsp27 fosforilinimą Ser15, Ser78 ir Ser83 liekanose, o tai būtina įgytai tolerancijai. 127 128 129 Hsp25/27 fosforilinimą katalizuoja MAPK (p38-MAPK, JNK arba SAPK) ir ERK. 130 Perfuzuotoje suaugusiojo širdyje tiek p38-MAPK, tiek JNK / SAPK aktyvuojami po išemijos / reperfuzijos. 131 Atsakant į gydymą ROS, p38-MAPK aktyvinimas padidina MAPKAP kinazės 2 aktyvumą, kuris fosforilina Hsp27. 132

Žmogaus endotelio ląstelėse kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus sukeltos p38-MAPK aktyvacijos slopinimas panaikina Hsp27 fosforilinimą, aktino polimerizaciją ir ląstelių migraciją, o tai rodo galimą ryšį tarp Hsp27 ir angiogenezės. 133 Kartu turimi įrodymai rodo, kad p38-MAPK yra streso sukeliamo Hsp25/27 fosforilinimo aktyvatorius, ir šis kelias yra p38-MAPK poveikio gijinio aktino reorganizacijai, streso skaidulų kaupimuisi ir vinkulino įdarbinimui pagrindas. židinio sukibimo vietose. 134 Toliau bus svarbu nustatyti, ar Hsp25/27, reaguodamas į hemodinamines jėgas arba kraujagyslės sienelės pažeidimą, atlieka vazoprotekcinius veiksmus. Tačiau tiesioginei analizei greičiausiai reikės Hsp27 geno išjungimo modelio.

ΑB-Crystallin Chaperone (Hsp22)

Nors Hsp27 aptinkamas endotelio ląstelėse, VSMC ir kardiomiocituose, αB-kristalino chaperonas ekspresuojamas tik kardiomiocituose. 135 Tiek Hsp27, tiek αB-kristalinas yra struktūriškai susiję bona fide HSP, turintys chaperono aktyvumą in vitro, tačiau, skirtingai nei Hsp70, nėra ATP surišantys baltymai. 136 137 138 139 Padidėjęs susidomėjimas αB-kristalino baltymo (Hsp22), pagrindinio struktūrinio akies lęšio baltymo, reguliavimu ir funkcija yra susijęs su jo audinių ribota ekspresija dryžuotose miogeninėse linijose, turinčiose didelį oksidacinį pajėgumą, pavyzdžiui, širdyje. ir I tipo griaučių raumenų skaidulų. 140 Nelęšiniuose audiniuose αB-kristalino pogimdyminė ekspresija padidėja ir pasiekia aukščiausią lygį suaugusio žmogaus širdyje (≈1–3 % viso tirpaus baltymo), po to seka skeleto raumenys ir inkstai. 140 Ankstesni imunohistocheminiai tyrimai lokalizavo didžiausią αB-kristalino ekspresiją suaugusiųjų širdies laidumo skaidulose. 141 Šiuo metu nežinoma, ar αB-kristalino ekspresijos pasikeitimas gali sukelti laidumo sistemos sutrikimų, tačiau kyla intriguojanti galimybė.

Nors αB-kristalino ekspresija buvo lokalizuota citoskeleto Z juostose, panašiai kaip desminas ir aktinas, 142 naujausi tyrimai rodo, kad ši sąveika yra daug trumpesnė ir dinamiškesnė, atsižvelgiant į tarpląstelinius taikinius, atsižvelgiant į fiziologines sąlygas. Nestimuliuojamų širdies miocitų biocheminiai tyrimai rodo, kad αB-kristalinas yra labai tirpus ir išlieka citozolinėje frakcijoje karštyje arba išemija sukelia greitą αB-kristalino perkėlimą į netirpias citoskeleto / branduolines frakcijas, agregaciją ir specifinę sąveiką Z juostose (Referencezeze). 142 ir IJ Benjamin, neskelbti duomenys, 1998). Fiziologinė reikšmė tiek αB-kristalino, tiek Hsp25/27 tendencijai formuoti didelius heterooligomerinius kompleksus (500–800 kDa) tiek in vivo, tiek in vitro po fiziologinių įtempių išlieka paslaptis. 143 144 Nors αB-kristalino chaperonas užtikrina citoprotekciją kardiomiocitams, 74 αB-kristalino funkcijos modifikacijų, tokių kaip fosforilinimas, glikacija ir deacetilinimas, reguliavimo mechanizmai laukia tiesioginės širdies ir kraujagyslių sistemos analizės.

Streso baltymai ir dryžuotų raumenų vystymasis ir diferenciacija

Padidėjusi mažo MW HSP chaperono ekspresija buvo aprašyta laikotarpiais, susijusiais su padidėjusia baltymų sinteze, baltymų degradacija ir ląstelių reorganizacija, tokiais kaip miogeninė diferenciacija ir embriogenezė. 145 Dėl audinių apribotos αB-kristalino ekspresijos skeleto raumenų miogenezės metu gali prireikti pagrindinių spiralės-kilpos-spiralės transkripcijos faktorių MyoD šeimos, kuri suriša esminį E-box stipriklį, esantį αB-kristalino promotoriuje. 146 147 Neseniai pranešėme, kad αB-kristalino, bet ne Hsp27, ekspresija yra tiesiogiai susijusi su oksidacinio metabolizmo padidėjimu skeleto raumenyse po lėtinės nervų stimuliacijos. 148 Tačiau fiziologinis Hsp27 ekspresijos reguliavimo vaidmuo, kuris vyksta prieš ankstyvą pelių embrioninių kamieninių ląstelių diferenciaciją, dar turi būti nustatytas miogeninėse linijose. 149

Daug mažiau žinoma apie reguliavimo mechanizmus, susijusius su αB-kristalino ribota ekspresija širdies miocituose. αB-kristalinas yra gausiai ekspresuojamas ankstyvame širdies vystyme, pradedant nuo 8.5 embriono dienos, o tai rodo, kad jis yra struktūrinis baltymas arba kaip molekulinis chaperonas stabilizuojant miofiberą. 150 Kadangi širdyje nėra į Myo-d panašių faktorių, širdies branduolio ekstraktų surišimo tyrimai in vitro parodė, kad prieš srovę stimuliuojantis faktorius yra transkripcijos aktyvus E-box elemente ir serumo atsako faktorius atvirkštinėje CArG dėžutėje. αB-kristalino promotorius. 151 Iki šiol in vivo vystymosi tyrimas atskleidė, kad αB-kristalino ekspresija neturi įtakos skeleto raumenyse. myf5 nulinės pelės arba d-HAND nulinių pelių širdys 9.0 embriono dieną (I.J. Benjamin, nepaskelbti duomenys, 1998). 152 153

Kiti citozoliniai/branduoliniai chaperonai

Keletas kitų HSP, esančių citozoliniame / branduoliniame skyriuje, gali būti suinteresuoti širdies ir kraujagyslių biologija. Pavyzdžiui, citozolinis 20 kDa baltymas p20 yra gausiai ekspresuojamas širdyje, skeleto ir lygiuosiuose raumenyse ir kartu su chaperonais αB-kristalinu ir Hsp27. 154 155 Nors p20 ekspresijos nesukelia nei karščio, nei cheminio streso, jame yra homologinis C-galo „α-kristalino domenas“, kurį dalijasi visi mažų MW HSP nariai. 138 VSMC p20 yra ir cAMP, ir cGMP baltymų kinazių substratas, o tai rodo postuluojamų funkcijų reguliavimo vaidmenį palaikant fiziologinį kraujagyslių tonusą ir prisitaikant prie kraujagyslių sienelės pažeidimo. 156

Ketvirtasis mažų HSP narys (be Hsp27, αB-kristalino ir p20), miotoninės distrofijos baltymo kinazę surišantis baltymas susieja ir padidina distrofijos baltymų kinazės aktyvumą ir apsaugo nuo karščio sukeltos denatūracijos in vitro . 157 Miotoninės distrofijos baltymų kinazė, skirtingai nei Hsp27 ar αB-kristalinas, yra sureguliuota pacientų, sergančių miotonine distrofija, skeleto raumenyse, o tai rodo, kad šis naujas baltymas gali būti susijęs su šios ligos patogeneze. 157

Hsp110 šeimos nariai turi chaperono ir citoprotekcines funkcijas, nors išsami informacija apie jų santykinę ekspresiją miokardo ląstelėse ir regioninį pasiskirstymą širdies ir kraujagyslių sistemoje laukia tolesnio apibūdinimo. 158 papildomi Hsp110 šeimos nariai yra Hsp105, Apg-1 ir Osp94. 159 160 161 Didelis susidomėjimas žinduolių mielių Hsp104 homologo identifikavimu, kuris, užuot užkirtęs kelią baltymų agregacijai, iš naujo ištirpina netirpius baltymų agregatus. 162

Mitochondrijų Hsp70 Chaperone sistema

Visi organizmai turi nuo ATP priklausomus baltymų lankstymo ir surinkimo organelėse mechanizmus. 11 13 Baltymų perkėlimui per mitochondrijų membraną reikalingas mitochondrijų chaperonas Hsp70 matricoje, kur baigiamas susilankstymas į gimtąją būseną 13 (žr. 1 pav.).

Mitochondrijų chaperonino sistema

Be į Hsp70 panašių chaperonų, mitochondrijų chaperoninai Hsp60 ir Hsp10 sudaro atskirą sistemą, kuri suteikia atskirtą aplinką baltymų pogrupiui sulankstyti in vivo . 163 Šie 7 narių žiedai yra išdėstyti kaip cilindrinės struktūros, kurių centrinėje ertmėje vyksta nuo ATP priklausomas baltymų lankstymas. 164 In vitro tyrimų duomenys rodo, kad Hsp70 chaperonai ir chaperonino sistemos veikia bendradarbiaujant eukariotų baltymų sulankstymui ir surinkimui (apžvelgta 13 nuorodoje 13 ).

Citozolinė chaperonino sistema

TRIC chaperoninas laikomas funkciniu chaperonino Hsp60/Hsp10 ekvivalentu eukariotų citozolyje. TRiC kompleksas, kurį sudaro 8 arba 9 narių dvigubi žiedai, kurių subvienetai yra ≈55–65 kDa, reikalingas aktino ir tubulino sulankstymui in vivo . 165 Chaperonin TRiC reikalingi papildomi komponentai, tokie kaip Hsp40, kuris stimuliuoja Hsc70 ATPazę, kad baltymai susilankstytų citozolyje 77 166 (žr. 2 pav.). Turimi įrodymai rodo, kad TRiC chaperoninas veikia paskutinėse sulankstymo stadijose, kai transliuojamas ribotas skaičius polipeptido domenų. 13

Pasekmės

Mitochondrijų chaperonus ir chaperoninus tik nežymiai sukelia fiziologinis stresas kardiomiocituose ir širdyje. 167 Tačiau mitochondrijų Hsp70 chaperonų ir chaperoninų išsidėstymas pagrindinėse ROS gamybos vietose galėtų papildyti tiek fermentinius, tiek neenziminius gynybos mechanizmus, siekiant sumažinti oksidacinį pažeidimą ir padidinti fiziologinio atsigavimo greitį po išeminio pažeidimo. 168 169 Šiuo metu nežinoma, ar per didelė mitochondrijų Hsp75 chaperono ar chaperonino ekspresija gali užtikrinti lygiavertę ar geresnę apsaugą nuo išeminio pažeidimo. Kitas svarbus klausimas yra susijęs su tuo, ar sutampančios Hsp70 chaperonų ir Hsp60 arba TRIC / Hsp40 chaperonino sistemų funkcijos yra suderintos de novo baltymų sulankstymui ir galimai cito apsaugai širdies ligų patogenezės metu.

Molekuliniai chaperonai ER

Gliukozės reguliuojami baltymai

ER chaperonų analizė gali būti ypač svarbi klinikai, nes ER funkcija skaido arba atkuria baltymus, pažeistus po miokardo išemijos arba po to, kai mutantiniai baltymai (pvz., CFTR arba tiroglobulinas) nesugeba tinkamai susilankstyti. 11 170 171 Anoksija, gliukozės badas ir kalcio jonoforai sukelia Ca 2+ surišančios gliukozės reguliuojamos streso baltymų klasės Grp170, Grp94 ir Grp78/BiP narius. 11 172 Buvo pranešta apie kintamus Grp78 baltymo ekspresijos pokyčius po išemijos.173 174 Nors „kaltė dėl susiejimo“ su citozoliniais chaperonais yra numanomas chaperono Grp funkcijos vaidmuo baltymų stebėjime ir kokybės kontrolėje, reikia atlikti daugiau jų ekspresijos tyrimų esant patofiziologinėms būsenoms, susijusioms su nenormalių baltymų ekspresija, potransliaciniu glikozilinimu ir sekrecija. ER-Golgi kelias.

Hsp47 palydovai

47 kDa kolageną surišantis glikoproteinas Hsp47 yra serpino (serino proteazės inhibitorių) superšeimos narys ir yra labai sukeltas karščio streso arba patofiziologinių būsenų (pvz., kepenų fibrozės), susijusių su padidėjusia kolageno sinteze. 175 Hsp47 yra ER ir turi C-galo Arg-Asp-Glu-Leu ER sulaikymo signalą. 176 Hsp47 laikinai jungiasi su I–IV tipo kolagenu ir aistringai prie denatūruotų kolageno substratų, todėl jo vaidmuo apdorojant ir transportuojant prokolageną atrodo tvirtai nustatytas. 177 Būsimuose tyrimuose dabar turi būti nagrinėjama tikėtina biologinė ir klinikinė Hsp47 ekspresijos svarba patofiziologinių būklių, tokių kaip miokardo infarktas, idiopatinė ir hipertrofinė kardiomiopatija ir hipertenzija, kai išryškėja miokardo fibrozė, atsiradimo ir progresavimo metu. 178

Dabartiniai iššūkiai ir ateities kryptys

Išeminės širdies fiziologinis atsigavimas prasideda per kelias minutes, tačiau ląstelių išemijos atstatymo greitis, kuris gali trukti kelias dienas ar savaites, yra labai svarbus siekiant sumažinti vėlesnį sergamumą ir mirtingumą nuo širdies ir kraujagyslių sistemos ligų. Idėja, kad streso baltymai gali pagreitinti grįžtamojo miokardo pažeidimo fiziologinį atsigavimą, yra pagrįsta eksperimentiniais įrodymais, rodančiais, kad keli artimi „signalai“ gali suaktyvinti šilumos šoko atsaką ir taip sukelti endogeninius apsauginius Hsps mechanizmus. Pagrindiniai klinikiniai reiškiniai, tokie kaip nestabili krūtinės angina, pasikartojantis okliuzija po trombolizinio gydymo ir ūmus lėtinės krūtinės anginos paūmėjimas, yra galimi fiziologiniai citoprotekcinių streso baltymų induktoriai. Kitas logiškas žingsnis būtų apsvarstyti galimybę, kad susiję daugiagenių streso baltymų šeimos nariai suteiks panašią arba papildomą funkcinę naudą. Kadangi išemija ir kiti fiziologiniai sutrikimai sutrikdo normalius tarpląstelinių baltymų struktūros ir funkcijų santykius, būsimi tyrimai turi nustatyti, ar molekuliniai chaperonai, atskirai arba kartu, palengvina išeminę žalą, pagreitindami fiziologinį miokardo ląstelės atsigavimą nepažeistame organizme.

Eksperimentiniai streso baltymų tyrimo modeliai

Transgeniniai Hsp70 ekspresijos (funkcijos padidėjimo) modeliai ir hsf1-nepakankamos pelės (funkcijos praradimas) ir tolesnis jų apibūdinimas pradeda šviesti jų fiziologinius vaidmenis in vivo. 16 17 18 36 Viena įdomi tokių pastangų kryptis galėtų paskatinti integruotus požiūrius į ištisų sistemų arba reguliavimo tinklų fiziologinius vaidmenis genetiškai modifikuotuose žmonių ligų gyvūnų modeliuose. Tačiau nereikėtų ignoruoti turimų žinių apie fiziologinius tyrimus su didesniais už peles gyvūnais. Tyrimai, skirti nustatyti HSP ekspresijos vaidmenį svaiginant miokardą, naudojant sąmoningus gyvūnus, galėtų pateisinti transgeninių žiurkių ir triušių modelių kūrimą. Galimi tokių strategijų apribojimai apima žymiai didesnes išlaidas, susijusias su ilgesniu nėštumo laikotarpiu, ilgesniu lytinės brandos laikotarpiu ir mažesniu tokių didesnių rūšių vados dydžiu. Tačiau tyrėjai, turintys patirties molekulinės biologijos ir molekulinės fiziologijos srityse, įgyvendinantys bendradarbiavimo projektus, padidina sėkmės tikimybę, kartu išvengdami pastangų dubliavimo.

Ar streso sukelta HSP genų ekspresija turi įtakos infarkto dydžiui, aritmogenezei ir miokardo remodeliavimui po ūminio miokardo infarkto?

Ankstesni tyrimai parodė, kad išankstinis apdorojimas (24 valandas) su karščio stresu sumažina laisvųjų radikalų išsiskyrimą izoliuotoje žiurkės širdyje 95 ir sumažina aritmijų skaičių, kuris yra pagrindinis funkcinis išemijos / reperfuzijos pažeidimo požymis (apžvelgta 92 nuorodoje 92 ). Kartu šie tyrimai koreliuoja galimą šių apsauginių būdų sąveiką, tačiau jų nepakanka priežasties ir pasekmės ryšiui nustatyti. Pelės HSF1 genų išmušimo modelio sukūrimas suteikia galingą eksperimentinį metodą, leidžiantį nustatyti, ar streso sukeltos HSP sintezės trūkumas fiziologinių perturbacijų, tokių kaip miokardo išemija, metu turi įtakos traumos po infarkto baigčiai ir nepažeisto organizmo atstatymo mechanizmams. Tokių tyrimų rezultatai gali padėti nustatyti priežastinį ryšį, išsiaiškinti galimus mechanizmus, kuriais HSP sintezė yra susijusi su miokardo išemija, ir įvertinti streso baltymų dalyvavimą ankstyvojo ir vėlyvojo išeminio kondicionavimo metu. Savalaikis kelių išmušimo modelių, šiuo metu kuriamų laboratorijose visame pasaulyje, apibūdinimas turėtų ir toliau skatinti vaisingą tyrėjų bendradarbiavimą. 179 Tolesnė pažanga turėtų paspartinti naujų žinių srautą į susijusias sritis, tokias kaip posticheminė reaktyvioji ir reparacinė fibrozė, uždegimas po reperfuzijos, 181 ir miokardo svaiginimas. 89 182

Streso baltymų ekspresija ir išeminio išankstinio kondicionavimo mechanizmai

Išeminis išankstinis kondicionavimas yra galingiausias eksperimentinis manevras, kuris atkartojamai apsaugo širdį nuo vėlesnio išeminio poveikio. 183 Tačiau egzistuoja ginčai dėl tikslaus streso baltymų vaidmens šiame gerai apibūdintame reiškinyje. 184 Keli mechanizmai, susiję su proteinkinaze C, adenozino receptoriais ir jų ryšiu su signalo perdavimo keliais, buvo susiję su išeminiu išankstiniu kondicionavimu. 185 Pakankamai įrodymų rodo, kad trūksta koreliacijos tarp streso sukeliamos ekspresijos (pvz., Hsp70) ir ankstyvo išankstinio kondicionavimo, kuris yra trumpalaikis ir trunka nuo 1 iki 3 valandų, priklausomai nuo modelio ir rūšies. 186

Ar mažai tikėtina, kad „Chaperone“ streso baltymų šeima turės fiziologinės reikšmės ankstyvam pasiruošimui?

Mūsų nuomone, šios srities tyrimai buvo per anksti atmesti arba nepakankamai atkreiptas dėmesys į galimą mažų MW Hsps, tokių kaip αB-kristalinas ir Hsp27, svarbą. Panašu, kad šie prižiūrėtojai yra kandidatai į „pirmąją gynybos liniją“ nuo nemirtino streso. Šiuo metu nežinoma, ar mažų MW Hsps oligomerizacija prisideda prie mechaninio stabilumo ar spėjamo citoskeleto vaidmens išeminėje širdies miocitų apsaugoje. 187 188 Tiek αB-kristalino, tiek Hsp27 geno išmušimo modeliai, kurie šiuo metu kuriami, galėtų tiesiogiai išspręsti šią hipotezę.

Panašiai reikalingi tyrimai, siekiant išsiaiškinti ryšį tarp vėlyvojo išankstinio kondicionavimo ir streso baltymų ekspresijos. Praėjus 24 valandoms po pradinio išeminio streso, keli tyrimai parodė, kad padidėjo Hsp60 ir Hsp70 sintezė triušiams, 41 Hsp70 kiaulėms, 182 ir mangano-SOD šunims 189 190 ir uždelsta išeminė tolerancija arba vėlyvas išankstinis kondicionavimas. Todėl esminis klausimas yra tai, ar yra tiesioginis ryšys tarp streso baltymų ekspresijos ir vėlyvojo išankstinio kondicionavimo. 191 192 193 Taip pat reikalingas išsamesnis individualaus Hsp vaidmens kardioprotekcijoje įvertinimas. Bandant nustatyti kardioprotekcinio ATP jautraus kalio kanalo mechanizmą naudojant inhibitorius, nustatyta, kad trūksta koreliacijos su streso baltymo Hsp70 ekspresija. 194 Tačiau metodai, kuriuose naudojami specifiniai inhibitoriai, yra nepakankami specifiškumui nustatyti bet kokiu tikrumo laipsniu, išskyrus tiriamus baltymus. 195

Molekuliniai chaperonai ir ląstelių mirties keliai

Streso baltymai yra idealūs kandidatai atlikti pagrindinius reguliavimo vaidmenis ląstelių išgyvenimo ir mirties keliuose, įskaitant DNR pažeidimus ir baltymų sintezę, atstatymą ir skaidymą. Manevrai, kurie padidina Hsp70 ekspresiją po šilumos šoko, natrio butirato poveikio ir konstitucinės ar reguliuojamos per didelės ekspresijos, slopina apoptozę įvairių tipų ląstelėse. 196 197 198 Proto-onkogenas c-Mano C stiprina šilumos šoko sukeltą apoptozę 199 200, priešingai, Bcl-2 ekspresija padidina termotolerancijos sukeltą ląstelių išgyvenimą. 201 Audinių specifinė Hsp70-2 ekspresija apsaugo nuo apoptozės tam tikrose mitozinėse ląstelėse per mechanizmą, apimantį ląstelių ciklo kontrolę. 202 Hsp70 chaperono funkcija reguliuojant apoptozę gali būti signalo perdavimo lygiu, nes ji buvo susijusi su streso suaktyvintu kinazės keliu. 203

Naujausi tyrimai mūsų laboratorijoje naudojant hsf1- nepakankamos kultivuotos ląstelės nustatė streso sukeltų Hsps vaidmenį paverčiant ląsteles termotolerantiškas karščio sukeltai apoptozei. 36 Šiame tyrime pateikiamas genetinis modelis, skirtas ištirti galimus tarpusavio ryšius tarp streso sukeliamo Hsps ir mechanizmų, susijusių su ląstelių išgyvenimu ir (arba) ląstelių mirties keliais. Subletalinis šilumos stresas apsaugo mitochondrijas nuo oksidacinio streso ir apsaugo nuo ląstelių mirties dėl apoptozės. 204 Atsižvelgiant į jų strategines vietas visose pagrindinėse organelėse, kyla pagunda spėlioti, kad keli Hsps gali kovoti su oksidaciniu stresu / žala, perlenkdami pažeistus ląstelių mirties kelio represorius arba užkirsdami kelią jų skilimui. Arba slopinti savižudybės aktyvatorių, tokių kaip citochromas, išsiskyrimą c gali atsirasti sąveikaujant su mitochondrijų chaperonais ir chaperoninais (1 pav.).

Be to, kelių naujausių tyrimų rezultatai rodo, kad mažas MW Hsp25/27 yra susijęs su ląstelių išgyvenimo keliais, susijusiais su ląstelių diferenciacija ir oksidaciniu stresu / žala. Ankstesni tyrimai parodė, kad pernelyg didelė Hsp25/27, kaip ir antiapopotinio baltymo Bcl-2, ekspresija padidina antioksidanto glutationo kiekį ir atsparumą Fas/APO-1 sukeltai apoptozei, nors ar tai vyksta tiesiogiai, lieka neaišku. 205 Pelės embrioninių kamieninių ląstelių pašalinimas iš ląstelių ciklo skatina Hsp25/27 mRNR reguliavimą, kurį lydi Hsp25/27 baltymo fosforilinimo sumažėjimas ir oligomerizacijos padidėjimas. 149 Antisensinis Hsp25/27 redukcija pakeičia šiuos pokyčius pailgindamas ląstelių ciklą, sumažindamas glutationo kiekį ir pagreitindamas apoptozę. Kartu šie provokuojantys atradimai rodo, kad miokardo ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos metu Hsp25/27 chaperonas ir kiti gali sumažinti oksidacinį stresą / žalą ir užkirsti kelią apoptozei per naują nuo redokso priklausomą mechanizmą. 206

Ar streso sukeliama HSP genų ekspresija turi įtakos natūraliai lėtinių širdies ir kraujagyslių ligų, įskaitant senėjimą, istorijai?

Daugybė tyrimų koreliavo Hsp ekspresijos indukciją ir slėgio perkrovą dėl aortos juostos, ūminės hipertenzijos, vazoaktyvių medžiagų poveikio arba kairiojo skilvelio hipertrofijos ir augimo faktoriaus ekspresijos kelių tipų ląstelėse. 207 208 209 Pranešama, kad senėjimo proceso metu graužikų miokarde sumažėja HSP genų ekspresija ir HSF1 DNR surišimo aktyvumas. 210 Daugėja įrodymų, kad oksidacinis stresas / žala gali būti pagrindinis senėjimo proceso priežastinis veiksnys. 211 Oksidacinio streso lygis ir audinių jautrumas eksperimentiniu būdu sukeltam oksidaciniam stresui, atrodo, didėja senėjimo proceso metu. Ar padidėjęs molekulinės oksidacinės žalos kiekis, pastebėtas senėjimo proceso metu, yra priežastiniu ryšiu susijęs su sumažėjusiu HSF1 aktyvumu ir, netiesiogiai, Hsp geno ekspresija, šiuo metu nežinoma. Transgeninių ir genų išmušimo modelių prieinamumas leis būsimiems tyrimams nustatyti streso sukeltos šilumos šoko geno ekspresijos vaidmenį normalaus senėjimo ar fiziologinio prisitaikymo prie su liga susijusio (-ių) širdies rizikos faktoriaus (-ių) metu.

Molekuliniai chaperonai sergant širdies ligomis, kuriuos sukelia mutantinių baltymų ekspresija

Padidėjęs netinkamai sulankstytų arba denatūruotų baltymų kiekis, taip pat nenormalių baltymų mikroinjekcija yra stiprūs HSP geno ekspresijos induktoriai. 14 59 Naujausi tyrimai, rodantys, kad Hsc70 chaperonas netiesiogiai sąveikauja su CFTR, turinčiu bendrą ΔF508 sulankstymo mutaciją, patvirtina šią bendrą supratimą apie jų biologinį vaidmenį sergant žmonių ligomis. 20

Chaperonų biologijos požiūriu širdies ligos, atsirandančios dėl genų, koduojančių kontraktilinio aparato komponentus arba jonų kanalų baltymus, mutacijų, iš esmės yra nenormalių baltymų problemos. Kelios sarkomerinių baltymų mutacijos buvo susijusios su šeiminės hipertrofinės kardiomiopatijos patogeneze, įskaitant miozino sunkiąsias ir lengvas grandines, troponino I ir T subvienetus, mioziną surišantį baltymą C ir tropomioziną (6 6 nuoroda ir apžvelgta 7 nuorodoje 7 ). Nors chaperonas Hsp27 vaidina svarbų vaidmenį aktino polimerizacijoje, o chaperoninas TRIC dalyvauja aktino ir tubulino lankstymo procese, fiziologinis chaperono ir chaperonino sistemų vaidmuo sulankstydamas ir surenkant sarkomerines struktūras normaliomis sąlygomis arba sergant ligomis išlieka paslaptis. Manoma, kad chaperonai gali paveikti mutantinių sarkomerinių baltymų atstatymą arba skaidymą, o tai galiausiai turi įtakos struktūros ir funkcijos santykiams bei ligos fenotipui. 212 Pirmiausia reikia atlikti in vitro analizę, siekiant nustatyti, ar chaperono funkcija gali turėti įtakos produktyviam baltymų lankstymui, kurį sukelia atitinkamos mutacijos, kurias galima patvirtinti atitinkamais gyvūnų modeliais. 18 213

Molekuliniai chaperonai kraujagyslių biologijoje

Yra daug galimybių išskaidyti chaperono funkcijas biologiškai aktyvių peptidų ir baltymų sintezės ir sekrecijos, ląstelių proliferacijos, tarpląstelinio signalizacijos ir citoskeleto pertvarkymo metu. Tokių tyrimų rezultatai gali nustatyti specifinius HSP baltymų taikinius ir įvairių ląstelių tipų specifiškumą skatinant kraujagysles apsauginį estrogeno poveikį. 214 215 Esminiai Hsp90 ir kochaperonų vaidmenys steroidų receptorių biologijoje rodo, kad HSP chaperonai atlieka kliniškai reikšmingą vaidmenį pakeičiamosios hormonų terapijos veiksmuose moterims po menopauzės. 216 217 Epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad premenopauzinio amžiaus moterų apsauginė nauda nuo koronarinės širdies ligos išnyksta po menopauzės. 218 219 220 Galimas apsauginis estrogeno poveikis siejamas su jo antioksidacinėmis ir kraujagysles apsaugančiomis savybėmis, kraujo lipidų ir lipoproteinų kiekio mažinimu ir tiesioginiu poveikiu kraujagyslės sienelėms. 221 Bus svarbu apibrėžti, ar streso sukelta Hsp ekspresija genetiškai modifikuotose pelėse turi įtakos kraujagyslių atsakui į sužalojimą gyvūnų patinų ir patelių. 215

Molekulinis chaperonas ir imunologinės ligos

Skirtingai nuo nusistovėjusių citoprotekcinių vaidmenų, tam tikri streso baltymai buvo susiję su širdies ir kraujagyslių ligų patogeneze. Pavyzdžiui, padidėjęs antikūnų prieš žinduolių Hsp60 bakterinį homologą serume buvo įrodytas pacientams, sergantiems kardiomiopatija ir diabetu, besimptomiams asmenims, sergantiems miego arterijos stenoze, ir ateroskleroziniais pažeidimais triušiams ir žmonėms (apžvelgta 222 222 nuorodoje). Viena hipotezė yra ta, kad autoimuninė liga atsiranda dėl kryžminio imunogeninių peptidų, gaunamų iš bakterijų ir mitochondrijų chaperonų ir Hsp60 (chaperonino) ir atpažįstami aktyvuotų γ / δ T limfocitų, kryžminio reaktyvumo. 223 224 Humoriniai imuniniai atsakai ir seropozityvūs žymenys prieš pirmuonių parazitų Hsp70 šeimą (ypač ER Grp78 ir Hsc70) Trypanosoma cruzi buvo susiję su Chagas ligos, 224A, dažniausia stazinio širdies nepakankamumo priežastimi Lotynų Amerikoje, patogeneze (žr. lentelę). Nors šiems koreliaciniams tyrimams būdingi apribojimai, būsimi tyrimai, skirti nustatyti priežastinį ryšį, gali atverti galimybes sukurti vakcinas ar kitus naujus gydymo ir profilaktikos gydymo būdus.

Galimi molekulinių chaperonų terapiniai pritaikymai

Strategijos, galinčios padidinti fiziologinio atsigavimo greitį po apsvaiginimo po infarkto ir skilvelių disfunkcijos, išlieka svarbiais tikslais gydant pacientus, sergančius ūminiu miokardo infarktu. Kadangi manevrai naudojant audinių arba viso kūno hipertermiją yra sudėtingi ir nepraktiški sąmoningiems žmonėms, farmakologinės strategijos, padidinančios streso baltymų ekspresiją izoterminei apsaugai, gali būti naudingos prieš išeminį širdies, inkstų ir smegenų pažeidimą. Vienas iš galimų būdų yra proteasomų inhibitoriai, kurie laikinai padidina išsiskleidusių baltymų kiekį ląstelėse. 225 Alternatyvūs metodai gali apimti mažų molekulių ir peptidų kūrimą 226 226A, kurie imituoja chaperonų poveikį in vivo ir turi terapinės naudos.

Perspektyvos

Streso baltymų vaidmuo širdies apsaugai buvo pripažintas viena iš svarbiausių ateities išeminės širdies ligos tyrimų krypčių. 227 Kadangi paveiktų asmenų skaičius yra toks didelis, terapinė intervencija, kuri prisideda prie nedidelio sergamumo ir mirštamumo po miokardo infarkto pokyčio, gali turėti didelį poveikį bendriems klinikiniams rezultatams. Galimybės spręsti citoprotekcinių chaperonų fiziologinius vaidmenis sergant širdies ligomis turi būti išplėstos, įtraukiant tikėtiną jų vaidmenį sergant lėtinėmis ligomis (ateroskleroze, hipertenzija, diabetu, genetiniais sutrikimais ir širdies vožtuvų liga), kurios susilieja bendrais būdais ir sukelia širdies nepakankamumą ir. staigi mirtis. Mokslininkų grupių strateginiai aljansai galėtų sukurti naujas kryptis ir paspartinti pažangą šioje perspektyvioje srityje, kuri galiausiai galėtų sėkmingai išnaudoti endogeninius būdus, siekiant pagerinti fiziologinę sveikatą ir sumažinti fiziologinį susidėvėjimą, susijusį su širdies ir kraujagyslių ligomis.

Pasirinktos santrumpos ir akronimai

CFTR=cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatorius
ER=endoplazminis Tinklelis
ERK=ekstraląsteliniu būdu reaguojanti kinazė
Grp=su gliukoze susijęs baltymas
HO=hemo oksigenazė
Hsc=šilumos šokas giminingas
HSF=šilumos šoko transkripcijos faktorius
HSP=šilumos šoko streso baltymų šeima
Hsp=šilumos šoko baltymas
JNK=c-Jun N-galo kinazė
MAPK=mitogeno aktyvuota proteinkinazė
MAPKAP=MAPK aktyvuota proteinkinazė
MW=molekulinė masė
ROS=reaktyviosios deguonies rūšys
SAPK=Streso aktyvuota proteinkinazė
TRIC=TCP-1 žiedo kompleksas
VSMC=kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelė

Figūra 1. Pagrindinių patofiziologinių signalų, aktyvinančių HSP sintezę (vertikalios ištisinės linijos kairėje) ir galimų HSP funkcijų (vertikalios ištisinės linijos dešinėje), santrauka. Ląstelių pažeidimas pasireiškia padidėjusia ROS gamyba, redokso aktyvios geležies prieinamumu, membranų lipidų peroksidacija ir baltymų pažeidimu. 92 Ekstraląsteliniai ROS (A) šaltiniai gali būti endotelio ląstelės, VSMC ir net miocitai aplinkiniuose audiniuose, molekulinio deguonies (B) elektronų pernešimas į mitochondrijas gali būti pagrindinis tarpląstelinis ROS generavimo šaltinis.Intraląstelinis laisvas kalcio (C), kuris per 10 minučių po reperfuzijos padidėja 10 kartų, 228 229 buvo susijęs su proteazių (D) aktyvavimu, kurios, savo ruožtu, gali prisidėti prie intracelulinio miokardo pažeidimo. 230 231 232 Citoskeleto (E) pažeidimas yra ankstyvas išeminio pažeidimo įvykis, sukeliantis skilvelių disfunkciją arba „miokardo apsvaigimą“, kai pažeidimas yra grįžtamas. 87 Miokardo pažeidimas taip pat gali atsirasti dėl kelių mechanizmų pritraukimo polimorfonukleariniams leukocitams (PMN) į išeminę teritoriją ir iš deguonies gaunamų laisvųjų radikalų (A), citotoksinių lizosomų fermentų (F), ekstraląstelinių proteazių (G) ir komplemento išsiskyrimo. aktyvinimas (H) (peržiūrėtas 233 nuorodoje). Manoma, kad įvairūs fiziologiniai signalai suaktyvina streso sukeliamą HSF1 (I), kuris jungiasi prie sekai specifinio šilumos šoko elemento (HSE) (J), esančio visų HSP (K) promotoriuose. Nors tikslus Hsp70 sukeltos išeminės apsaugos mechanizmas yra menkai suprantamas, jis plačiai priskiriamas biologinėms „molekulinių chaperonų“ savybėms, kurios, kaip siūloma, padeda surinkti arba atkurti naujai susintetintus ar pažeistus baltymus. 11 234 235 Fiziologiniu požiūriu potencialios molekulinių chaperonų funkcijos išeminėje širdyje yra šios: naujai susintetintų polipeptidų, būtinų palaikyti oksidacinį metabolizmą po miocitų pažeidimo (L), baltymų lankstymas, mitochondrijų apsauga nuo ROS ir citokinų, tokių kaip TNFα 204 236. ir naujai susintetintų baltymų perkėlimas organelių taisymo metu (M), kritinių struktūrinių baltymų atstatymas po išemijos sukeltų citoskeleto pakitimų (N), 237 membraninių pūslelių perdirbimas (Hsc70) (O), galimų toksiškų šalutinių produktų transportavimas proteasomų skaidymui. (P), 78 238 239 priešuždegiminių citokinų, tokių kaip pro-interleukinas-1β (Q), slopinimas, 204 236 240 NADPH oksidazės slopinimas ir oksidacinis sprogimas dėl šilumos šoko atsako (R), 241 apsauga naudojant NO gamybą nuo indukuojamos sintezės. HSP ekspresijos (S), 61 242 243 244 245 246 apoptozės prevencija per mitochondrijų chaperoną Hsp60 surišant citochromą c ir (arba) Hsp70 surišimas su citozoliniais taikiniais (T), 36 204 jonų kanalo atstatymas (U), kolageno sintezė Hsp47 chaperonu, skirta reparacinei fibrozei (V), 180 ir imuninės sistemos sukelto išeminio pažeidimo moduliavimas (W). 241

2 pav. Siūloma chaperono Hsc70 komplekso reakcijos ciklo schema, sulankstant hipotetinį substratą ląstelėje. Pradedant nuo paveikslo apačios, chaperonas Hsc70 (A) susideda iš N-galo ATPazės ir C-galo domeno, skirto surišti tikslinį substratą. Hsp40 (B), eukariotinis DnaJ homologas, pirmiausia suriša nesuskleistus baltymus (UP) (C), o paskui jungiasi su Hsc70.ADP, arba jungiasi su Hsc70.ADP.UP kompleksu (D), kurio aktyvumas yra mažas. nuolaida UP. Numatyti keli skirtingi Hsc70.ADP.UP komplekso likimai, kurių kiekvienas priklauso nuo Hsp40 pakeitimo skirtingais pagalbiniais partneriais, konkrečiai, Hip (su Hsc70 sąveikaujantis baltymas), Hop (Hsc70/Hsp90 organizuojantis baltymas) ir Hap. (Hsc70 papildomas baltymas). 166 247 248 Išsilaisvinus Hsp40, Hip prisijungia prie Hsc70 (E) ATPazės domeno, stimuliuoja jo aktyvumą, o tada lieka surištas, kad stabilizuotų ADP-Hsc70 substrato kompleksą, o tai rodo, kad jis gali vaidinti vaidmenį pernešant substratus. ląstelėse (F). 166 Hop tarnauja kaip fizinis ryšys tarp Hsc70 ir Hsp90 (G), tikriausiai siekiant palengvinti UP perdavimą tarp šių chaperonų. Nesvarbu, ar Hop keičia Hsc70 ATPazės aktyvumą, ar ne, yra prieštaringa. 249 Hup funkcija, kuri skatina UP išsiskyrimą iš Hsc70 (H) ir Hsc70 oligomerus paverčia monomerais (I), dar turi būti nustatyta. Energija, perduota iš ATP hidrolizės, greitį ribojančio eukariotų chaperono ciklo žingsnio, naudojama nuosekliais ciklais, siekiant padėti sulankstyti ir užkirsti kelią agregacijai bei skilimui. Šiuo tikslu du susiję baltymai, BAG-1 (neparodyta) ir Hap (J), kurie jungiasi prie Hsc70 ATPazės domeno, taip pat slopina Hsp70 prisijungimą prie nesuskleisto baltymo substrato in vitro, o tai rodo, kad šie baltymai gali atlikti svarbų vaidmenį palaikant kokybės kontrolė, nukreipiant neproduktyvią sąveiką į degradaciją 250 (iliustraciją maloniai pateikė LE Hightower, Konektikuto universitetas, Storrs).

1 lentelė. Pagrindinės širdies ir kraujagyslių biologijos HSP klasės

mHsp75 rodo mitochondrijų Hsp75 HIF-1, hipoksijos sukeliamą transkripcijos faktorių 1 ir MKBP, miotoninės distrofijos baltymų kinazę.

Dr Benjamin buvo remiamas Amerikos medicinos tyrimų fondo, Nacionalinių sveikatos institutų ir Amerikos širdies asociacijos įsteigto tyrėjo apdovanojimo. Dėkojame R. S. Williamsui, R. Meidellui, A. Davisui, P. Thomasui ir R. Sohalui už jų kritiškas pastabas apie mūsų rankraštį.


Abstraktus- Kaip ląstelė reaguoja į stresą, yra pagrindinė širdies ir kraujagyslių biologijos problema. Įvairūs fiziologiniai įtempiai (pvz., karštis, hemodinamika, mutantiniai baltymai ir oksidacinis pažeidimas) sukelia daugybę ląstelių pokyčių, kurie galiausiai paveikia baltymų struktūras ir funkcijas. Ląstelės iš skirtingų filų inicijuoja įvykių kaskadą, įtraukiančių esminius baltymus, molekulinius chaperonus, priimant sprendimus dėl pažeistų baltymų atkūrimo arba skaidymo kaip gynybos strategijos, užtikrinančios išlikimą. Sukaupti įrodymai rodo, kad molekuliniai chaperonai, tokie kaip streso baltymų (HSP) šilumos šoko šeima, aktyviai dalyvauja daugybėje ląstelių procesų, įskaitant citoprotekciją. Visur esančios HSP šeimos universalumą dar labiau padidina streso sukeliami reguliavimo tinklai tiek transkripcijos, tiek potranskripcijos lygiu. Šioje apžvalgoje aptariame HSP chaperonų reguliavimą ir funkciją bei jų klinikinę reikšmę tokiomis sąlygomis kaip širdies hipertrofija, kraujagyslių sienelės pažeidimas, širdies chirurgija, išeminis išankstinis kondicionavimas, senėjimas ir, tikėtina, genų, koduojančių susitraukiančius baltymus ir jonų kanalus, mutacijos. .

Fiziologinis stresas, pradedant miokardo išemija ir baigiant genetinėmis mutacijomis, sukelia ligas, kai baltymų pažeidimas ir netinkamai susilankstytos baltymų struktūros yra bendras vardiklis. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kaip ląstelė reaguoja? Ląstelių homeostazės atkūrimui naudojami keli endogeniniai keliai, tačiau vienas gerai apibūdintas mechanizmas, apimantis baltymų lankstymą, yra streso baltymų arba HSP šilumos šoko šeima. 10 11 Įžvalgą apie mechanizmus, kuriais grindžiama HSP funkcija, suteikia 2 pagrindinės įrodymų linijos: (1) norint teisingai sulankstyti daug baltymų ląstelėje, reikia baltymų sulankstymo mechanizmų, molekulinių šaperonų, 12 13 ir (2) HSP chaperonai yra denatūruoti. baltymų arba skatina jų skaidymą po karščio šoko. 14 15

Genetiniai tyrimai pateikia įtikinamų įrodymų įvairiose grupėse, kad per didelė streso baltymų ekspresija yra galinga citoprotezės priemonė net ir nepažeistoje širdyje. 10 16 17 18 Panašiai biocheminiai tyrimai parodė, kad Hsc70 chaperonas padidina produktyvų bendros CFTR ΔF508 mutacijos sulankstymą. Tai rodo fiziologinį HSP chaperono vaidmenį sergant žmonių ligomis. 19 20 Skirtingi mechanizmai, gaminantys nenormalius arba netinkamai susilanksčiusius ląstelių baltymus, susilieja į bendrą kelią, todėl padidėja citoprotekcinių streso baltymų kiekis, kuris sumažina arba neutralizuoja žalingą ūminio ar lėtinio streso poveikį.

Šioje apžvalgoje apibendriname dabartines žinias apie atskirų chaperonų (pvz., Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp47, Hsp27 ir αB-kristalino) reguliavimą ir funkciją širdies ir kraujagyslių sistemoje. Be jų nusistovėjusio vaidmens ląstelių išgyvenime (nekrozei ir apoptozei), pabrėšime naujus įrodymus apie chaperono funkcijas fiziologinėje adaptacijoje širdies hipertrofijos, išeminio išankstinio kondicionavimo, kraujagyslių sienelės pažeidimo, oksidacinio streso ir senėjimo metu. Nors šiuo metu galime tik spėlioti apie jų vaidmenį sergant konkrečiomis širdies ligomis, aptarsime daug galimų galimybių nustatyti, ar HSP chaperonai daro poveikį natūraliai ligų, atsirandančių dėl širdies susitraukimo aparato mutacijų, arba atlieka tiesioginį fiziologinį vaidmenį. pvz., hipertrofinė kardiomiopatija) ir jonų kanalai (pvz., ilgo QT sindromas) žmonėms.

Apibrėžimai ir nomenklatūra

Kas yra streso „šilumos šoko“ baltymai?

Terminas „šilumos šoko“ baltymas yra klaidingas įvardijimas, tačiau jis tebėra rimto Ritossos atradimo palikimas 21 , kad karščio šokas sukėlė seilių liaukų ląstelių chromosomų pūsles. Drosophila. Šilumos stresas (≈5 ° viršija normalią augimo temperatūrą) padidina greitą daugiagenės baltymų šeimos, iš pradžių vadinamų šilumos šoko baltymais, sintezę, 22 kurie yra atsako, dažnai vadinamo šilumos šoko atsaku, rezultatas. 10 21 Ankstesnis submirtinis šilumos stresas laikinai padidina ląstelės gebėjimą atlaikyti kitaip mirtiną vėlesnį karščio iššūkį. Šis reiškinys arba termotolerancija atliko pagrindinį vaidmenį pradedant daugybę tyrimų tiek in vitro, tiek in vivo eksperimentiniuose modeliuose, kuriuose buvo nustatytas panašus ryšys tarp atsako į šilumos šoką ir apsaugos nuo imituojamos hipoksijos ar išemijos. Iš tiesų, įvairūs stresai, įskaitant sunkiuosius metalus, aminorūgščių analogus, uždegimą ir oksidacinį / išeminį stresą, sukelia HSP genų ekspresiją. Todėl pirmenybė teikiama sąvokoms „streso baltymai“ arba „šilumos šoko streso baltymų šeima“, nors daugelis šių baltymų atlieka esmines funkcijas netemptomis sąlygomis. 13

Streso baltymai priklauso kelių genų šeimoms, kurių molekulinis dydis svyruoja nuo 10 iki 150 kDa ir yra randamas visuose pagrindiniuose ląstelių skyriuose. Įvairių molekulinių dydžių streso baltymus įprasta pavadinti taip: Hsp27, Hsp70 ir Hsp90, o karščio šoko baltymų genai žymimi taip: hsp27, hsp70 ir hsp90. 23 Skirtumas tarp konstituciškai išreikštų (pvz., Hsc70 ir Hsp90β) arba giminingų HSP šeimos narių ir jų indukuojamų izoformų (atitinkamai Hsp70 ir Hsp90α) yra savavališkas, nes kaupiami įrodymai fiziologiškai svarbiose in vivo sistemose dabar rodo, kad tokie ryšiai. priklauso nuo ląstelių ir audinių apribotos ekspresijos.

Šilumos ir išeminio streso pasekmės ląstelėse yra panašios

Kaip ir eksperimentinė išemija / reperfuzija, šilumos šokas yra stresas, kuris sutrikdo daugybę medžiagų apykaitos procesų ir ląstelių struktūrų ir kuris baigiasi ląstelių mirtimi, kai viršijama kritinė riba. 10 24 25 Tiek karščio stresas, tiek išemija daro didelę žalą citoskeletui, įskaitant siūliško tarpinio gijų tinklo žlugimą į didelius perinuklearinius agregatus, citoplazminio tinklo pertvarkymą, aktino turinčių skaidulų perkėlimą aplink branduolį, mikrotubulių ir mitozinis velenas. 26 27 Mitochondrijų patinimas, mitochondrijų praradimas ir oksidacinio fosforilinimo atsijungimas yra panašiai bendri šilumos šoko ir ankstyvo grįžtamojo išeminio pažeidimo bruožai. 28 29 30

Būdinga tai, kad bendra baltymų sintezė yra slopinama po didelio karščio dėl inicijavimo faktorių, tokių kaip eIF2α, fosforilinimo, kuris sutrikdo ribosomų surinkimą ir inaktyvuoja dangtelį surišančius baltymus. 31 32 33 Priešingai, HSP genai yra efektyviai ekspresuojami po karščio, iš dalies dėl to, kad keliuose indukuojamuose (pvz., hsp70) genuose nėra intronų. Be to, mRNR splaisingo pokyčiai ir karščio sukeltas mRNR stabilizavimas yra adaptyvūs mechanizmai, naudojami efektyviai išversti streso baltymus, kurie per kelias minutes po fiziologinio streso tokiomis sąlygomis gali pasiekti 15–25 % viso intracelulinio baltymo. 10 34 Atsitiktinai keli citozoliniai chaperonai persikelia į branduolį, 35 kur šilumos sukeltas DNR chromatino surinkimo slopinimas atskleidžia nukleazėms jautrią konformaciją, kuri yra patognomoninis šilumos ir išemijos sukeltos apoptozės požymis. 36 Mažiau dramatiški pokyčiai pastebimi integraliuose membranos baltymuose, lipidų dvisluoksnyje ir ląstelių paviršiaus morfologijoje. Po kenksmingų dirgiklių nutraukimo greitai ir efektyviai degraduoja Hsp mRNR. 37 38 39

Kaip minėta anksčiau, ankstesnis subletalinis karščio stresas arba „hiperterminis išankstinis kondicionavimas“ labai susilpnina visus šilumos sukeltus ląstelių pokyčius iki vėlesnio didelio karščio. Be to, išankstinis apdorojimas šiluma sukuria „kryžminę toleranciją“ įvairių tipų fiziologiniam stresui. Pavyzdžiui, nepažeistos išeminės širdies apsauga po pirminio terminio apdorojimo gali trukti nuo kelių valandų iki dienų. 40 41 Įžvalgos, gautos iš fiziologinių Hsp ekspresijos vaidmenų reaguojant į šilumos šoką, prisidėjo prie dabartinių minčių apie chaperono funkcijas patologinėse būsenose, dėl kurių gali atsirasti nenormalus baltymų sulankstymas.

Visų pirma dėmesys buvo sutelktas į HSP chaperonų indukciją ir galimus taisymo mechanizmus, susijusius su išemijos / reperfuzijos pažeidimo mažinimu. 1 paveikslas schematiškai apibendrina daugelį šių sąvokų ir iliustruoja daugybę gerai atpažįstamų mechanizmų, susijusių su išeminiu miokardo pažeidimu, įskaitant oksidacinį stresą / pažeidimą, kalcio perteklių ir aktyvuotas proteazes, proteolitinių ir lizosomų fermentų išsiskyrimą, citoskeleto pokyčius ir komplemento aktyvavimą.

Įvairūs fiziologiniai įtempiai sukelia HSP genų ekspresiją per bendrą mechanizmą

Greita streso baltymų ekspresijos indukcija pasiekiama naudojant transkripcijos aktyvavimo ir pirmenybinio vertimo mechanizmus. 10 42 HSF (HSF1–HSF4) reguliuoja indukuojamą HSP sintezę vystymosi, augimo ir adaptacijos metu. 42 43 44 Tuo tarpu esminiai vienos kopijos genai koduoja HSF Saccharomyces cerevisiae ir DrosophilaViščiukams, augalams, pelėms ir žmonėms buvo nustatyti 45 46 daugybiniai HSF. 47 48 49 50 51 Pelėje buvo nustatyti du HSF (HSF1 ir HSF2, koduojantys atitinkamai 75 ir 72 kDa baltymus). 49 Nei HSF1, nei HSF2 nėra indukuojami šiluma, tačiau HSF1 yra hiperfosforilinamas ras- priklausomas MAPK pošeimių narių (ERK1, JNK/SAPK ir p38 proteinkinazės) būdas fiziologinio streso metu. 52 53 Neįtemptomis sąlygomis stuburinio HSF1 DNR surišimo aktyvumas ir transkripcijos aktyvumas yra griežtai neigiamai kontroliuojami (apžvelgta 44 nuorodoje 44 ). Tačiau tebėra prieštaringa, ar chaperono Hsp70 slopinimas, serino liekanų konstitucinio fosforilinimo sekvestracija ar nežinomi slopinamieji reguliatoriai yra pagrindiniai mechanizmai, kuriais grindžiamas streso sukeltas aktyvavimas ir greitas HSF1 deaktyvavimas. 43 54 55 56

Ankstesni tyrimai parodė, kad reaguojant tiek į šilumą, tiek į imituojamą išemiją, HSF1 aktyvinimo mechanizmas (-ai) yra panašus (-i), jei ne identiškas, miogeninėse ląstelėse 57 ir kad tarpląstelinio ATP išeikvojimas vaidina svarbų vaidmenį skatinant HSF1-DNR prisijungimą. veikla. 58 Manoma, kad sergant ligomis HSF1 aktyvacijos induktoriai, tokie kaip oksiduotas MTL ir reaktyvūs azoto tarpiniai produktai, padidina baltymų pažeidimą, dėl kurio padidėja HSP geno ekspresijos reguliavimas. 59 60 61 Tačiau transkripcijos HSF1 kelio aktyvacija nereikalauja naujos baltymų sintezės, nes jau buvęs transaktyvatorius (HSF1) yra neaktyvus nepatemptoje būsenoje. 43 56 57 Fiziologiniai įtempiai, tokie kaip karštis ir išemija, skatina HSF1 monomerus oligomerizuotis kaip homotrimeriai, kurie vėliau prisijungia prie sekai būdingo motyvo, šilumos šoko elemento, visų streso indukuojamų HSP genų promotoriuje 62 63 (1I pav. iki 1K). Neseniai sukūrėme Hsf1 geno išmušimo modelį ir in vitro tyrimuose parodėme esminį šio reguliavimo kelio reikalavimą ląstelių gynybai ir termotolerancijai. 36 Be to, streso baltymų ekspresija buvo susijusi su naviko ląstelių išgyvenimo 64 skatinimu ir išeminės širdies apsauga. 16 17 18

Streso baltymų perteklius padidina išeminės širdies fiziologinio atsigavimo greitį

Didelėje literatūroje aprašoma Hsp70 indukcija dėl išemijos, 57 65 66 galimas Hsp70 vaidmuo išeminiam išankstiniam kondicionavimui 40 67 ir atvirkštinė koreliacija tarp Hsp70 ekspresijos, sukeltos išeminio ar terminio kondicionavimo, ir infarkto dydžio gyvūnų modeliuose. 41 68 69 70 Be to, priverstinė Hsp70 ekspresija perteikia citoprotekcinį poveikį kultivuotose ląstelėse, įskaitant širdies miocitus, kuriems buvo atlikta imituojama išemija. 71 72 Konkrečiai, per didelė pagrindinio 70 kDa šilumos šoko baltymo (Hsp70) ekspresija transgeninėse pelėse pagerina miokardo funkciją, 16 17 18 išsaugo metabolinį funkcinį atsigavimą, 18 ir sumažina infarkto dydį 73 po išemijos/reperfuzijos. Be Hsp70, Hsp27 ir αB-kristalinas gali apsaugoti pirminius kardiomiocitus nuo išeminių pažeidimų. 74 Nors tikslūs mechanizmai nėra pakankamai suprantami, manoma, kad streso baltymai tarpininkauja širdies apsaugai per savo biologines molekulinių chaperonų funkcijas.

Streso baltymai gali veikti kaip molekuliniai chaperonai

Molekuliniai chaperonai, tokie kaip Hsp70 ir αB-kristalinas, yra baltymai, kurie palengvina kitų baltymų lankstymą, surinkimą ir išardymą, bet nėra galutinio produkto dalis. 75 Kadangi daugeliui baltymų sulankstyti reikia chaperonų, šie baltymai yra esminiai komponentai paskutinėje pagrindinės molekulinės biologijos dogmos stadijoje: DNR↔RNR → polipeptidas → sulankstytas baltymas. 11 75 In vitro chaperonai apsaugo nuo kitų baltymų agregacijos streso sąlygomis ir skatina denatūruotų baltymų substratų arba fermentų (pvz., citrato sintazės, β-galaktozidazės ar luciferazės) fermentinio aktyvumo atkūrimą pašalinus stresą. 11 13 76

2 paveiksle schematiškai parodytas chaperono Hsc70 reakcijos ciklas, palyginti su neseniai identifikuotais kochaperonais ir molekuliniais substratais ląstelėje. Pavyzdžiui, chaperonas Hsp40 atlieka pagrindinę katalizinę funkciją įkeldamas tikslinius substratus į Hsc70 surišimo / atpalaidavimo ciklą. 77 Nors šių funkcijų mechanizmai vis dar atsiranda, pagrindinės molekulinių chaperonų funkcijos yra (1) laikinai surišti ir atidėti besiformuojančių polipeptidinių grandinių sulankstymą, kol bus baigta sintezė, (2) išlaikyti polipeptidines grandines tinkamoje konformacijoje, tinkančioje translokacijai. per organelių membranas, (3) užkirsti kelią agregacijai dėl intramolekulinių ar tarpmolekulinių sąveikų, (4) aktyviai išardyti klatrinu padengtas pūsleles, (5) išlaikyti steroidų aporeceptorių kompleksus kompetentingose ​​ligandų būsenose (Hsp90 ir kochaperonas) ir (6) padėti skaidyti toksines medžiagas. metabolitai, skatindami ubikvinaciją ir proteasomų lizę 78 (1L–1P pav.).

Molekulinių chaperonų atvejis sergant širdies ligomis

Plačiai paplitęs klinikinis susidomėjimas biologinėmis molekulinių chaperonų funkcijomis apima įvairias žmogaus patologijas, pradedant nuo degeneracinių būklių, tokių kaip Alzheimerio liga, prionai, amiloidozė, kataraktos formavimasis, pjautuvinių ląstelių liga, cistinė fibrozė ir įvairios širdies ligos, įskaitant miokardo išemiją. Ankstyvieji įvykiai, atkuriantys savalaikį išeminio miokardo tekėjimą tromboliziniais vaistais, tiesiogine angioplastika arba spontaniškai suskaidžius krešulį, yra būtini siekiant pagerinti miokardo išgelbėjimą ir sumažinti sergamumą bei mirtingumą. 79 80 Nepaisant to, pasikartojanti išemija dėl nestabilios plokštelės plyšimo arba stazinio širdies nepakankamumo gali apsunkinti klinikinę ūminio miokardo infarkto eigą. Nekomplikuoto ūminio miokardo infarkto atveju fiziologinis atsigavimas ląstelių lygmeniu prasideda per kelias minutes, bet gali trukti kelias savaites ar mėnesius, kol miokardo atstatymas bus baigtas. Taigi, endogeniniai apsauginiai mechanizmai turi klinikinę reikšmę mažinant išeminės širdies ligos poveikį.

HSP reguliavimo kelio ir chaperonų biocheminė veikla miokardo išemijos metu

Ankstesniame darbe, kurio buvo imtasi siekiant apibrėžti artimiausią HSF aktyvacijos stimulą, mes pastebėjome, kad sunki tarpląstelinė acidozė (pH 6, 7) buvo nepakankama, kad sukeltų HSF1 DNR prisijungimą kultivuotose miogeninėse ląstelėse, veikiamose imituojamos išemijos, jei buvo išsaugotos ATP atsargos. 58 Priešingai, stiprus ATP išeikvojimas (65 %) paskatino HSF1 prisijungimą prie DNR, net jei pH buvo palaikomas normos ribose. 58 Nepažeistoje išeminėje širdyje 15 minučių išemija, sukelianti grįžtamąjį sužalojimą, yra susijusi su panašiu didelės energijos ATP atsargų sumažėjimu (65 %), o mirtinas sužalojimas randamas užsitęsus išemijai (>40 minučių) ir >90 % išeikvojimui. daug energijos naudojančių baseinų. 81 The Km silpnas galvijų Hsc70 ATPazės aktyvumas yra nuo 1 iki 2 μmol/L, 3 dydžiais mažesnis už intracelulinio adenino nukleotidų telkinių milimolinę koncentraciją. 75 Todėl mažai tikėtina, kad nuo ATP priklausomas HSF1 reguliavimo kelio aktyvavimas ir molekulinių chaperonų biocheminės savybės bus neigiamai paveiktos trumpalaikės išemijos ar grįžtamojo miokardo išeminio pažeidimo laikotarpiais.

Principo įrodymas, rodantis Hsp70 kardioprotekcinį poveikį transgeniniams gyvūnams, kuriems buvo išemija / reperfuzija, rodo, kad farmakologiniai arba genetiniai metodai, skirti padidinti streso baltymų ekspresiją pacientų, kuriems gresia ūminis išeminis reiškinys, miokarde, gali apriboti išeminį pažeidimą. 82 Tačiau reikia papildomų pagrindinių žinių apie (1) jų ryšį su kitais endogeniniais keliais, susijusiais su miokardo apsauga nuo oksidacinio streso ir (arba) pažeidimo, (2) funkcinį specifiškumą tarp HSP daugiagenės šeimos narių chaperonų ir (3) šio poveikio indėlį. kelias ūminės išemijos ir kitų fiziologinių būsenų, sukeliančių šilumos šoko atsaką, metu prieš klinikinį taikymą.

Streso baltymai ir antioksidaciniai būdai širdies apsaugai

Nuo 1970-ųjų gydytojai ir tyrėjai iškėlė hipotezę, kad laisvųjų radikalų gaudytojai gali pagerinti oksidacinę žalą išemijos / reperfuzijos metu. 83 Modelių sistemose nuo transgeninių Drosophila pelėms per didelė katalazės, superoksido dismutazės arba glutationo peroksidazės ekspresija paprastai apsaugo nuo oksidacinio streso. 84 85 86 Oksidacinis stresas, atsirandantis dėl išemijos / reperfuzijos, taip pat vaidina pagrindinį vaidmenį pažeidžiant gyvybiškai svarbius organus, tokius kaip smegenys, inkstai ir širdis. Manoma, kad ROS prisideda prie skilvelių disfunkcijos arba „miokardo apsvaiginimo“, aritmijų ir progresuojančio ląstelių pažeidimo arba mirties po išeminio sužalojimo (1 pav.). 87 88 89 90

Buvo pranešta apie prieštaringus rezultatus bandant tiekti antioksidantus miokardo išemijos / reperfuzijos metu ir po jos. 91 92 Egzogeniniai antioksidantai, kurie apsiriboja intersticinėmis erdvėmis, gali turėti ribotą gebėjimą apsaugoti tarpląstelinius baltymus nuo ROS. Pavyzdžiui, laisvasis hidroksilo radikalas (·OH), kuris, kaip manoma, yra pagrindinis oksidacinio pažeidimo veiksnys, taip stipriai reaguoja su tipišku substratu, kad jo pusinės eliminacijos laikas 37 °C temperatūroje yra 7 × 10–10 sekundžių. 93 Taigi sunku įsivaizduoti, kad fiziologiškai įmanomų koncentracijų egzogeninių antioksidantų skyrimas gali veiksmingai užkirsti kelią ·OH sukeltam makromolekuliniam pažeidimui. Potencialiai veiksmingesnė strategija gali būti fiziologinis ·OH gamybos sumažinimas. Iš tiesų, pernelyg didelė HSP šeimos narių išraiška gali būti vienas iš tokių būdų. Keletas tyrimų pranešė, kad apsaugant nuo miokardo išemijos, streso baltymų lygio reguliavimas koreliuoja su katalazės fermentinio aktyvumo padidėjimu, o tai rodo galimą šių endogeninių kelių sąveiką su oksidaciniu stresu. 40 94 95 Svarbus neatsakytas klausimas yra tai, ar streso baltymų, kaip molekulinių chaperonų, funkcijos papildo unikalias antioksidacinių fermentų funkcijas, apsaugančias nuo oksidacinio streso / žalos..

Citozolio/branduolinių skyrių molekuliniai chaperonai

Lentelėje parodytos pagrindinės HSP klasės, tarpląsteliniai skyriai, numatomos jų funkcijos ir galima reikšmė širdies ir kraujagyslių biologijoje.

Hsp70 palydovai

Hsp70 šeimos nariai yra plačiausiai ištirta ir gausiausia eukariotinių ląstelių grupė. 96 Citozolyje Hsp70 prisijungia prie besiformuojančių polipeptidų prieš jiems išsilaisvinant iš ribosomos. 97 Visi Hsp70 chaperono klasės nariai turi du skirtingus domenus: labai konservuotą N-galo ATPazės domeną ir labiau skirtingą C-galinį domeną, kuris jungiasi su trumpais hidrofobiniais tikslinių substratų peptidais 98 99 (2A pav.). Hsp70 chaperono funkcijai reikalingas N-galo ATPazės domenas, kuris, įdomu, yra panašus į triušio skeleto raumenų aktiną, nepaisant nedidelio sekos panašumo. 100

Šie Hsp70 struktūros / funkciniai santykiai greičiausiai suteikia in vivo chaperono aktyvumą širdies apsaugai. Šiuo atžvilgiu beveik nieko nežinoma apie konstitucinį Hsc70 chaperoną, kuris turi >80% sekos homologiją su Hsp70. Tikėtina, kad nedidelis konstitucinio Hsc70 reguliavimas gali paskatinti didelę kardioprotekcinę naudą. Tačiau HSP reguliavimas, viršijantis kritinę ribą, gali turėti žalingų pasekmių ląstelėms. 101 Neseniai buvo pranešta, kad skirtingos funkcijos tarp Hsp70 narių egzistuoja regionuose, esančiuose už peptidų surišimo domeno, o tai rodo papildomą chaperono funkcijų sudėtingumo lygį in vivo . 102

Hsp90 palydovai

2 paveiksle parodyta, kad chaperonas Hsp90 yra reakcijos ciklo, apimančio chaperono Hsc70 kompleksą ir naujai susintetintus baltymus, komponentas. Be to, Hsp90 šeimos nariai Hsp90α ir Hsp90β, kurie sudaro 1–2 % visų tirpių citoplazmos baltymų, turi geriausiai in vivo apibūdintus funkcinius ryšius su tiksliniais baltymais, steroidinių hormonų receptoriais. 103 Hsp90 su chaperono partneriais Hsp70 ir Hsp56 tiesiogiai jungiasi, stabilizuoja ir palaiko neaktyvioje konformacijoje aporeceptorių kompleksą. Ligando prisijungimas (pvz., estrogenas) prie aporeceptorių komplekso sukelia ATP hidrolizę Hsp90, kuris atsiskiria nuo „aktyvuoto“ receptoriaus, kuris dabar gali prisijungti prie sekos specifinio atpažinimo motyvo ir sukelti tikslinių genų transkripciją. 104 Be to, padidėjęs Hsp90 ekspresijos lygis destabilizuoja estrogenų receptorių / estrogenų reaguojančio elemento kompleksą ir sumažina į estrogenus reaguojančio tikslinio geno ekspresiją, o tai rodo reguliavimo grįžtamojo ryšio kilpą. 105

Hsp90 chaperono funkcijas tarpininkauja signalo perdavimo keliai, apimantys įvairias tirozino ir serino-treonino tipų baltymų kinazes, kazeino kinazę II, hemo reguliuojamą eIF-2α ir daugybę kitų ląstelių baltymų, tokių kaip kalmodulinas, aktinas ir tubulinas. (peržiūrėta 106 106 nuorodoje). Galiausiai, Hsp90 palydovai Saccharomyces cerevisiae yra būtini išgyvenimui bet kokiomis sąlygomis, palaikydami jų svarbų fiziologinį vaidmenį žemesniuosiuose eukariotuose. 107

Širdies ir kraujagyslių biologijoje ypač svarbūs citozoliniai palydovai

Skirtingai nuo visur esančių Hsp70 ir Hsp90 atitikmenų, specifiniai mažų MW HSP nariai (HO-1 arba Hsp32, Hsp27, αB-kristalinas ir Hsp20 chaperonai) pasižymi ribota audinių ekspresija, o tai rodo galimas specializuotas širdies ir kraujagyslių sistemos savybes.

Indukuojamas HO (Hsp32)

H O yra greitį ribojantis fermentas, skaidantis hemą į biliverdiną (stiprų antioksidantą), molekulinę geležį ir anglies monoksidą. Trys susiję vienos kopijos genai koduoja HO izoformas: HO-1, HO-2 ir HO-3. 108 109 110 HO-1 yra bona fide 32 kDa streso baltymas (Hsp32), kurį sukelia įvairūs fiziologiniai įtempiai, įskaitant hipoksiją, išemiją/reperfuziją, heminą, vandenilio peroksidą ir keletą sunkiųjų metalų (seleno, arsenito, kobalto, kadmio). , ir alavo jonai). 108 109 110 Indukuojamas Hsp32 (HO-1), plačiausiai išreikšta izoforma, yra miokardo ląstelėse. 111

Hsp32, kaip ir indukuojama NO sintazės forma, tarpininkauja nuo guanililciklazės priklausomo trombocitų slopinimo ir VSMC vazodilatacijos. 112 113 114 Tačiau fiziologiškai svarbios hemodinaminės jėgos (šlyties įtempis ir ciklinė deformacija) sukelia HO-1 mRNR ekspresiją, bet ne indukuojamą NO sintazės ekspresiją, o tai rodo šio streso atsako kelio specifiškumą fiziologiniams signalams. 115 Endogeniškai išsiskiriantis arba eksogeniškai vartojamas NO sukelia 3–6 kartus Hsp32 (HO-1) geno ekspresijos ir CO gamybos padidėjimą VSMC 116 116 panašiai, inhibitorius alavo protoporfirinas-IX apsaugo nuo trombocitų agregacijos indukuodamas HO-1 geną. ekspresija ir CO gamyba aortos VSMC. 115 Žiurkių VSMC gydymas angiotenzinu II sumažina Hsp32 (HO-1) mRNR ekspresiją priklausomai nuo kalcio. 117 Tačiau angiotenzino II sukelta hipertenzija padidina Hsp32 (HO-1) mRNR ekspresiją žiurkės aortoje, o tai rodo, kad hemodinamikos faktoriai įtakoja svarbiausią in vivo. 118

Keli reguliavimo būdai yra susiję su Hsp32 geno ekspresijos indukcija, ypač HSF1 ir hipoksijos sukeliamu transkripcijos faktoriaus-1 keliai. 119 120 121 122 Nors tiesioginių įrodymų apie Hsp32 chaperono funkciją trūksta, jo per didelė ekspresija kelių tipų ląstelėse apsaugo nuo oksidacinio streso / žalos. 123 124 125 Atitinkamai, tyrimai, skirti nustatyti tikslius sunkiųjų metalų, hipoksijos ir oksidacinio streso stimuliuojamus reguliavimo būdus, galėtų suteikti naujos informacijos apie biologinį Hsp32 (HO-1) vaidmenį moduliuojant oksidacinį stresą / žalą išemijos / reperfuzijos metu, kraujagyslių tonusą. (pvz., hipertenzija) ir trombocitų agregacijos ir (arba) VSMC proliferacijos slopinimas po balioninės angioplastijos.

Hsp25/27 Chaperone

Po to, kai buvo atrastas aktino polimerizacijos inhibitorius, buvo įrodyta, kad 126 chaperonas Hsp 25/27 (Hsp25 pelėms ir Hsp27 žmonėms) vaidina svarbų vaidmenį aktino gijų dinamikoje įvairių tipų ląstelėse. Fiziologiniai dirgikliai (oksidacinis stresas, citokinai ir augimo faktoriai) smarkiai padidina žmogaus Hsp27 fosforilinimą Ser15, Ser78 ir Ser83 liekanose, o tai būtina įgytai tolerancijai. 127 128 129 Hsp25/27 fosforilinimą katalizuoja MAPK (p38-MAPK, JNK arba SAPK) ir ERK. 130 Perfuzuotoje suaugusiojo širdyje tiek p38-MAPK, tiek JNK / SAPK aktyvuojami po išemijos / reperfuzijos. 131 Atsakant į gydymą ROS, p38-MAPK aktyvinimas padidina MAPKAP kinazės 2 aktyvumą, kuris fosforilina Hsp27. 132

Žmogaus endotelio ląstelėse kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus sukeltos p38-MAPK aktyvacijos slopinimas panaikina Hsp27 fosforilinimą, aktino polimerizaciją ir ląstelių migraciją, o tai rodo galimą ryšį tarp Hsp27 ir angiogenezės. 133 Kartu turimi įrodymai rodo, kad p38-MAPK yra streso sukeliamo Hsp25/27 fosforilinimo aktyvatorius, ir šis kelias yra p38-MAPK poveikio gijinio aktino reorganizacijai, streso skaidulų kaupimuisi ir vinkulino įdarbinimui pagrindas. židinio sukibimo vietose. 134 Toliau bus svarbu nustatyti, ar Hsp25/27, reaguodamas į hemodinamines jėgas arba kraujagyslės sienelės pažeidimą, atlieka vazoprotekcinius veiksmus. Tačiau tiesioginei analizei greičiausiai reikės Hsp27 geno išjungimo modelio.

ΑB-Crystallin Chaperone (Hsp22)

Nors Hsp27 aptinkamas endotelio ląstelėse, VSMC ir kardiomiocituose, αB-kristalino chaperonas ekspresuojamas tik kardiomiocituose. 135 Tiek Hsp27, tiek αB-kristalinas yra struktūriškai susiję bona fide HSP, turintys chaperono aktyvumą in vitro, tačiau, skirtingai nei Hsp70, nėra ATP surišantys baltymai. 136 137 138 139 Padidėjęs susidomėjimas αB-kristalino baltymo (Hsp22), pagrindinio struktūrinio akies lęšio baltymo, reguliavimu ir funkcija yra susijęs su jo audinių ribota ekspresija dryžuotose miogeninėse linijose, turinčiose didelį oksidacinį pajėgumą, pavyzdžiui, širdyje. ir I tipo griaučių raumenų skaidulų. 140 Nelęšiniuose audiniuose αB-kristalino pogimdyminė ekspresija padidėja ir pasiekia aukščiausią lygį suaugusio žmogaus širdyje (≈1–3 % viso tirpaus baltymo), po to seka skeleto raumenys ir inkstai. 140 Ankstesni imunohistocheminiai tyrimai lokalizavo didžiausią αB-kristalino ekspresiją suaugusiųjų širdies laidumo skaidulose. 141 Šiuo metu nežinoma, ar αB-kristalino ekspresijos pasikeitimas gali sukelti laidumo sistemos sutrikimų, tačiau kyla intriguojanti galimybė.

Nors αB-kristalino ekspresija buvo lokalizuota citoskeleto Z juostose, panašiai kaip desminas ir aktinas, 142 naujausi tyrimai rodo, kad ši sąveika yra daug trumpesnė ir dinamiškesnė, atsižvelgiant į tarpląstelinius taikinius, atsižvelgiant į fiziologines sąlygas. Nestimuliuojamų širdies miocitų biocheminiai tyrimai rodo, kad αB-kristalinas yra labai tirpus ir išlieka citozolinėje frakcijoje karštyje arba išemija sukelia greitą αB-kristalino perkėlimą į netirpias citoskeleto / branduolines frakcijas, agregaciją ir specifinę sąveiką Z juostose (Referencezeze). 142 ir IJ Benjamin, neskelbti duomenys, 1998). Fiziologinė reikšmė tiek αB-kristalino, tiek Hsp25/27 tendencijai formuoti didelius heterooligomerinius kompleksus (500–800 kDa) tiek in vivo, tiek in vitro po fiziologinių įtempių išlieka paslaptis. 143 144 Nors αB-kristalino chaperonas užtikrina citoprotekciją kardiomiocitams, 74 αB-kristalino funkcijos modifikacijų, tokių kaip fosforilinimas, glikacija ir deacetilinimas, reguliavimo mechanizmai laukia tiesioginės širdies ir kraujagyslių sistemos analizės.

Streso baltymai ir dryžuotų raumenų vystymasis ir diferenciacija

Padidėjusi mažo MW HSP chaperono ekspresija buvo aprašyta laikotarpiais, susijusiais su padidėjusia baltymų sinteze, baltymų degradacija ir ląstelių reorganizacija, tokiais kaip miogeninė diferenciacija ir embriogenezė. 145 Dėl audinių apribotos αB-kristalino ekspresijos skeleto raumenų miogenezės metu gali prireikti pagrindinių spiralės-kilpos-spiralės transkripcijos faktorių MyoD šeimos, kuri suriša esminį E-box stipriklį, esantį αB-kristalino promotoriuje. 146 147 Neseniai pranešėme, kad αB-kristalino, bet ne Hsp27, ekspresija yra tiesiogiai susijusi su oksidacinio metabolizmo padidėjimu skeleto raumenyse po lėtinės nervų stimuliacijos. 148 Tačiau fiziologinis Hsp27 ekspresijos reguliavimo vaidmuo, kuris vyksta prieš ankstyvą pelių embrioninių kamieninių ląstelių diferenciaciją, dar turi būti nustatytas miogeninėse linijose. 149

Daug mažiau žinoma apie reguliavimo mechanizmus, susijusius su αB-kristalino ribota ekspresija širdies miocituose. αB-kristalinas yra gausiai ekspresuojamas ankstyvame širdies vystyme, pradedant nuo 8.5 embriono dienos, o tai rodo, kad jis yra struktūrinis baltymas arba kaip molekulinis chaperonas stabilizuojant miofiberą. 150 Kadangi širdyje nėra į Myo-d panašių faktorių, širdies branduolio ekstraktų surišimo tyrimai in vitro parodė, kad prieš srovę stimuliuojantis faktorius yra transkripcijos aktyvus E-box elemente ir serumo atsako faktorius atvirkštinėje CArG dėžutėje. αB-kristalino promotorius. 151 Iki šiol in vivo vystymosi tyrimas atskleidė, kad αB-kristalino ekspresija neturi įtakos skeleto raumenyse. myf5 nulinės pelės arba d-HAND nulinių pelių širdys 9.0 embriono dieną (I.J. Benjamin, nepaskelbti duomenys, 1998). 152 153

Kiti citozoliniai/branduoliniai chaperonai

Keletas kitų HSP, esančių citozoliniame / branduoliniame skyriuje, gali būti suinteresuoti širdies ir kraujagyslių biologija. Pavyzdžiui, citozolinis 20 kDa baltymas p20 yra gausiai ekspresuojamas širdyje, skeleto ir lygiuosiuose raumenyse ir kartu su chaperonais αB-kristalinu ir Hsp27. 154 155 Nors p20 ekspresijos nesukelia nei karščio, nei cheminio streso, jame yra homologinis C-galo „α-kristalino domenas“, kurį dalijasi visi mažų MW HSP nariai. 138 VSMC p20 yra ir cAMP, ir cGMP baltymų kinazių substratas, o tai rodo postuluojamų funkcijų reguliavimo vaidmenį palaikant fiziologinį kraujagyslių tonusą ir prisitaikant prie kraujagyslių sienelės pažeidimo. 156

Ketvirtasis mažų HSP narys (be Hsp27, αB-kristalino ir p20), miotoninės distrofijos baltymo kinazę surišantis baltymas susieja ir padidina distrofijos baltymų kinazės aktyvumą ir apsaugo nuo karščio sukeltos denatūracijos in vitro . 157 Miotoninės distrofijos baltymų kinazė, skirtingai nei Hsp27 ar αB-kristalinas, yra sureguliuota pacientų, sergančių miotonine distrofija, skeleto raumenyse, o tai rodo, kad šis naujas baltymas gali būti susijęs su šios ligos patogeneze. 157

Hsp110 šeimos nariai turi chaperono ir citoprotekcines funkcijas, nors išsami informacija apie jų santykinę ekspresiją miokardo ląstelėse ir regioninį pasiskirstymą širdies ir kraujagyslių sistemoje laukia tolesnio apibūdinimo. 158 papildomi Hsp110 šeimos nariai yra Hsp105, Apg-1 ir Osp94. 159 160 161 Didelis susidomėjimas žinduolių mielių Hsp104 homologo identifikavimu, kuris, užuot užkirtęs kelią baltymų agregacijai, iš naujo ištirpina netirpius baltymų agregatus. 162

Mitochondrijų Hsp70 Chaperone sistema

Visi organizmai turi nuo ATP priklausomus baltymų lankstymo ir surinkimo organelėse mechanizmus. 11 13 Baltymų perkėlimui per mitochondrijų membraną reikalingas mitochondrijų chaperonas Hsp70 matricoje, kur baigiamas susilankstymas į gimtąją būseną 13 (žr. 1 pav.).

Mitochondrijų chaperonino sistema

Be į Hsp70 panašių chaperonų, mitochondrijų chaperoninai Hsp60 ir Hsp10 sudaro atskirą sistemą, kuri suteikia atskirtą aplinką baltymų pogrupiui sulankstyti in vivo . 163 Šie 7 narių žiedai yra išdėstyti kaip cilindrinės struktūros, kurių centrinėje ertmėje vyksta nuo ATP priklausomas baltymų lankstymas. 164 In vitro tyrimų duomenys rodo, kad Hsp70 chaperonai ir chaperonino sistemos veikia bendradarbiaujant eukariotų baltymų sulankstymui ir surinkimui (apžvelgta 13 nuorodoje 13 ).

Citozolinė chaperonino sistema

TRIC chaperoninas laikomas funkciniu chaperonino Hsp60/Hsp10 ekvivalentu eukariotų citozolyje. TRiC kompleksas, kurį sudaro 8 arba 9 narių dvigubi žiedai, kurių subvienetai yra ≈55–65 kDa, reikalingas aktino ir tubulino sulankstymui in vivo . 165 Chaperonin TRiC reikalingi papildomi komponentai, tokie kaip Hsp40, kuris stimuliuoja Hsc70 ATPazę, kad baltymai susilankstytų citozolyje 77 166 (žr. 2 pav.). Turimi įrodymai rodo, kad TRiC chaperoninas veikia paskutinėse sulankstymo stadijose, kai transliuojamas ribotas skaičius polipeptido domenų. 13

Pasekmės

Mitochondrijų chaperonus ir chaperoninus tik nežymiai sukelia fiziologinis stresas kardiomiocituose ir širdyje. 167 Tačiau mitochondrijų Hsp70 chaperonų ir chaperoninų išsidėstymas pagrindinėse ROS gamybos vietose galėtų papildyti tiek fermentinius, tiek neenziminius gynybos mechanizmus, siekiant sumažinti oksidacinį pažeidimą ir padidinti fiziologinio atsigavimo greitį po išeminio pažeidimo. 168 169 Šiuo metu nežinoma, ar per didelė mitochondrijų Hsp75 chaperono ar chaperonino ekspresija gali užtikrinti lygiavertę ar geresnę apsaugą nuo išeminio pažeidimo. Kitas svarbus klausimas yra susijęs su tuo, ar sutampančios Hsp70 chaperonų ir Hsp60 arba TRIC / Hsp40 chaperonino sistemų funkcijos yra suderintos de novo baltymų sulankstymui ir galimai cito apsaugai širdies ligų patogenezės metu.

Molekuliniai chaperonai ER

Gliukozės reguliuojami baltymai

ER chaperonų analizė gali būti ypač svarbi klinikai, nes ER funkcija skaido arba atkuria baltymus, pažeistus po miokardo išemijos arba po to, kai mutantiniai baltymai (pvz., CFTR arba tiroglobulinas) nesugeba tinkamai susilankstyti. 11 170 171 Anoksija, gliukozės badas ir kalcio jonoforai sukelia Ca 2+ surišančios gliukozės reguliuojamos streso baltymų klasės Grp170, Grp94 ir Grp78/BiP narius. 11 172 Buvo pranešta apie kintamus Grp78 baltymo ekspresijos pokyčius po išemijos. 173 174 Nors „kaltė dėl susiejimo“ su citozoliniais chaperonais yra numanomas chaperono Grp funkcijos vaidmuo baltymų stebėjime ir kokybės kontrolėje, reikia atlikti daugiau jų ekspresijos tyrimų esant patofiziologinėms būsenoms, susijusioms su nenormalių baltymų ekspresija, potransliaciniu glikozilinimu ir sekrecija. ER-Golgi kelias.

Hsp47 palydovai

47 kDa kolageną surišantis glikoproteinas Hsp47 yra serpino (serino proteazės inhibitorių) superšeimos narys ir yra labai sukeltas karščio streso arba patofiziologinių būsenų (pvz., kepenų fibrozės), susijusių su padidėjusia kolageno sinteze. 175 Hsp47 yra ER ir turi C-galo Arg-Asp-Glu-Leu ER sulaikymo signalą. 176 Hsp47 laikinai jungiasi su I–IV tipo kolagenu ir aistringai prie denatūruotų kolageno substratų, todėl jo vaidmuo apdorojant ir transportuojant prokolageną atrodo tvirtai nustatytas. 177 Būsimuose tyrimuose dabar turi būti nagrinėjama tikėtina biologinė ir klinikinė Hsp47 ekspresijos svarba patofiziologinių būklių, tokių kaip miokardo infarktas, idiopatinė ir hipertrofinė kardiomiopatija ir hipertenzija, kai išryškėja miokardo fibrozė, atsiradimo ir progresavimo metu. 178

Dabartiniai iššūkiai ir ateities kryptys

Išeminės širdies fiziologinis atsigavimas prasideda per kelias minutes, tačiau ląstelių išemijos atstatymo greitis, kuris gali trukti kelias dienas ar savaites, yra labai svarbus siekiant sumažinti vėlesnį sergamumą ir mirtingumą nuo širdies ir kraujagyslių sistemos ligų. Idėja, kad streso baltymai gali pagreitinti grįžtamojo miokardo pažeidimo fiziologinį atsigavimą, yra pagrįsta eksperimentiniais įrodymais, rodančiais, kad keli artimi „signalai“ gali suaktyvinti šilumos šoko atsaką ir taip sukelti endogeninius apsauginius Hsps mechanizmus. Pagrindiniai klinikiniai reiškiniai, tokie kaip nestabili krūtinės angina, pasikartojantis okliuzija po trombolizinio gydymo ir ūmus lėtinės krūtinės anginos paūmėjimas, yra galimi fiziologiniai citoprotekcinių streso baltymų induktoriai. Kitas logiškas žingsnis būtų apsvarstyti galimybę, kad susiję daugiagenių streso baltymų šeimos nariai suteiks panašią arba papildomą funkcinę naudą. Kadangi išemija ir kiti fiziologiniai sutrikimai sutrikdo normalius tarpląstelinių baltymų struktūros ir funkcijų santykius, būsimi tyrimai turi nustatyti, ar molekuliniai chaperonai, atskirai arba kartu, palengvina išeminę žalą, pagreitindami fiziologinį miokardo ląstelės atsigavimą nepažeistame organizme.

Eksperimentiniai streso baltymų tyrimo modeliai

Transgeniniai Hsp70 ekspresijos (funkcijos padidėjimo) modeliai ir hsf1-nepakankamos pelės (funkcijos praradimas) ir tolesnis jų apibūdinimas pradeda šviesti jų fiziologinius vaidmenis in vivo. 16 17 18 36 Viena įdomi tokių pastangų kryptis galėtų paskatinti integruotus požiūrius į ištisų sistemų arba reguliavimo tinklų fiziologinius vaidmenis genetiškai modifikuotuose žmonių ligų gyvūnų modeliuose. Tačiau nereikėtų ignoruoti turimų žinių apie fiziologinius tyrimus su didesniais už peles gyvūnais. Tyrimai, skirti nustatyti HSP ekspresijos vaidmenį svaiginant miokardą, naudojant sąmoningus gyvūnus, galėtų pateisinti transgeninių žiurkių ir triušių modelių kūrimą. Galimi tokių strategijų apribojimai apima žymiai didesnes išlaidas, susijusias su ilgesniu nėštumo laikotarpiu, ilgesniu lytinės brandos laikotarpiu ir mažesniu tokių didesnių rūšių vados dydžiu. Tačiau tyrėjai, turintys patirties molekulinės biologijos ir molekulinės fiziologijos srityse, įgyvendinantys bendradarbiavimo projektus, padidina sėkmės tikimybę, kartu išvengdami pastangų dubliavimo.

Ar streso sukelta HSP genų ekspresija turi įtakos infarkto dydžiui, aritmogenezei ir miokardo remodeliavimui po ūminio miokardo infarkto?

Ankstesni tyrimai parodė, kad išankstinis apdorojimas (24 valandas) su karščio stresu sumažina laisvųjų radikalų išsiskyrimą izoliuotoje žiurkės širdyje 95 ir sumažina aritmijų skaičių, kuris yra pagrindinis funkcinis išemijos / reperfuzijos pažeidimo požymis (apžvelgta 92 nuorodoje 92 ). Kartu šie tyrimai koreliuoja galimą šių apsauginių būdų sąveiką, tačiau jų nepakanka priežasties ir pasekmės ryšiui nustatyti. Pelės HSF1 genų išmušimo modelio sukūrimas suteikia galingą eksperimentinį metodą, leidžiantį nustatyti, ar streso sukeltos HSP sintezės trūkumas fiziologinių perturbacijų, tokių kaip miokardo išemija, metu turi įtakos traumos po infarkto baigčiai ir nepažeisto organizmo atstatymo mechanizmams. Tokių tyrimų rezultatai gali padėti nustatyti priežastinį ryšį, išsiaiškinti galimus mechanizmus, kuriais HSP sintezė yra susijusi su miokardo išemija, ir įvertinti streso baltymų dalyvavimą ankstyvojo ir vėlyvojo išeminio kondicionavimo metu. Savalaikis kelių išmušimo modelių, šiuo metu kuriamų laboratorijose visame pasaulyje, apibūdinimas turėtų ir toliau skatinti vaisingą tyrėjų bendradarbiavimą. 179 Tolesnė pažanga turėtų paspartinti naujų žinių srautą į susijusias sritis, tokias kaip posticheminė reaktyvioji ir reparacinė fibrozė, uždegimas po reperfuzijos, 181 ir miokardo svaiginimas. 89 182

Streso baltymų ekspresija ir išeminio išankstinio kondicionavimo mechanizmai

Išeminis išankstinis kondicionavimas yra galingiausias eksperimentinis manevras, kuris atkartojamai apsaugo širdį nuo vėlesnio išeminio poveikio. 183 Tačiau egzistuoja ginčai dėl tikslaus streso baltymų vaidmens šiame gerai apibūdintame reiškinyje. 184 Keli mechanizmai, susiję su proteinkinaze C, adenozino receptoriais ir jų ryšiu su signalo perdavimo keliais, buvo susiję su išeminiu išankstiniu kondicionavimu. 185 Pakankamai įrodymų rodo, kad trūksta koreliacijos tarp streso sukeliamos ekspresijos (pvz., Hsp70) ir ankstyvo išankstinio kondicionavimo, kuris yra trumpalaikis ir trunka nuo 1 iki 3 valandų, priklausomai nuo modelio ir rūšies. 186

Ar mažai tikėtina, kad „Chaperone“ streso baltymų šeima turės fiziologinės reikšmės ankstyvam pasiruošimui?

Mūsų nuomone, šios srities tyrimai buvo per anksti atmesti arba nepakankamai atkreiptas dėmesys į galimą mažų MW Hsps, tokių kaip αB-kristalinas ir Hsp27, svarbą. Panašu, kad šie prižiūrėtojai yra kandidatai į „pirmąją gynybos liniją“ nuo nemirtino streso. Šiuo metu nežinoma, ar mažų MW Hsps oligomerizacija prisideda prie mechaninio stabilumo ar spėjamo citoskeleto vaidmens išeminėje širdies miocitų apsaugoje. 187 188 Tiek αB-kristalino, tiek Hsp27 geno išmušimo modeliai, kurie šiuo metu kuriami, galėtų tiesiogiai išspręsti šią hipotezę.

Panašiai reikalingi tyrimai, siekiant išsiaiškinti ryšį tarp vėlyvojo išankstinio kondicionavimo ir streso baltymų ekspresijos. Praėjus 24 valandoms po pradinio išeminio streso, keli tyrimai parodė, kad padidėjo Hsp60 ir Hsp70 sintezė triušiams, 41 Hsp70 kiaulėms, 182 ir mangano-SOD šunims 189 190 ir uždelsta išeminė tolerancija arba vėlyvas išankstinis kondicionavimas. Todėl esminis klausimas yra tai, ar yra tiesioginis ryšys tarp streso baltymų ekspresijos ir vėlyvojo išankstinio kondicionavimo. 191 192 193 Taip pat reikalingas išsamesnis individualaus Hsp vaidmens kardioprotekcijoje įvertinimas. Bandant nustatyti kardioprotekcinio ATP jautraus kalio kanalo mechanizmą naudojant inhibitorius, nustatyta, kad trūksta koreliacijos su streso baltymo Hsp70 ekspresija. 194 Tačiau metodai, kuriuose naudojami specifiniai inhibitoriai, yra nepakankami specifiškumui nustatyti bet kokiu tikrumo laipsniu, išskyrus tiriamus baltymus. 195

Molekuliniai chaperonai ir ląstelių mirties keliai

Streso baltymai yra idealūs kandidatai atlikti pagrindinius reguliavimo vaidmenis ląstelių išgyvenimo ir mirties keliuose, įskaitant DNR pažeidimus ir baltymų sintezę, atstatymą ir skaidymą. Manevrai, kurie padidina Hsp70 ekspresiją po šilumos šoko, natrio butirato poveikio ir konstitucinės ar reguliuojamos per didelės ekspresijos, slopina apoptozę įvairių tipų ląstelėse. 196 197 198 Proto-onkogenas c-Mano C stiprina šilumos šoko sukeltą apoptozę 199 200, priešingai, Bcl-2 ekspresija padidina termotolerancijos sukeltą ląstelių išgyvenimą. 201 Audinių specifinė Hsp70-2 ekspresija apsaugo nuo apoptozės tam tikrose mitozinėse ląstelėse per mechanizmą, apimantį ląstelių ciklo kontrolę. 202 Hsp70 chaperono funkcija reguliuojant apoptozę gali būti signalo perdavimo lygiu, nes ji buvo susijusi su streso suaktyvintu kinazės keliu. 203

Naujausi tyrimai mūsų laboratorijoje naudojant hsf1- nepakankamos kultivuotos ląstelės nustatė streso sukeltų Hsps vaidmenį paverčiant ląsteles termotolerantiškas karščio sukeltai apoptozei. 36 Šiame tyrime pateikiamas genetinis modelis, skirtas ištirti galimus tarpusavio ryšius tarp streso sukeliamo Hsps ir mechanizmų, susijusių su ląstelių išgyvenimu ir (arba) ląstelių mirties keliais. Subletalinis šilumos stresas apsaugo mitochondrijas nuo oksidacinio streso ir apsaugo nuo ląstelių mirties dėl apoptozės. 204 Atsižvelgiant į jų strategines vietas visose pagrindinėse organelėse, kyla pagunda spėlioti, kad keli Hsps gali kovoti su oksidaciniu stresu / žala, perlenkdami pažeistus ląstelių mirties kelio represorius arba užkirsdami kelią jų skilimui. Arba slopinti savižudybės aktyvatorių, tokių kaip citochromas, išsiskyrimą c gali atsirasti sąveikaujant su mitochondrijų chaperonais ir chaperoninais (1 pav.).

Be to, kelių naujausių tyrimų rezultatai rodo, kad mažas MW Hsp25/27 yra susijęs su ląstelių išgyvenimo keliais, susijusiais su ląstelių diferenciacija ir oksidaciniu stresu / žala. Ankstesni tyrimai parodė, kad pernelyg didelė Hsp25/27, kaip ir antiapopotinio baltymo Bcl-2, ekspresija padidina antioksidanto glutationo kiekį ir atsparumą Fas/APO-1 sukeltai apoptozei, nors ar tai vyksta tiesiogiai, lieka neaišku. 205 Pelės embrioninių kamieninių ląstelių pašalinimas iš ląstelių ciklo skatina Hsp25/27 mRNR reguliavimą, kurį lydi Hsp25/27 baltymo fosforilinimo sumažėjimas ir oligomerizacijos padidėjimas. 149 Antisensinis Hsp25/27 redukcija pakeičia šiuos pokyčius pailgindamas ląstelių ciklą, sumažindamas glutationo kiekį ir pagreitindamas apoptozę. Kartu šie provokuojantys atradimai rodo, kad miokardo ląstelių proliferacijos ir diferenciacijos metu Hsp25/27 chaperonas ir kiti gali sumažinti oksidacinį stresą / žalą ir užkirsti kelią apoptozei per naują nuo redokso priklausomą mechanizmą. 206

Ar streso sukeliama HSP genų ekspresija turi įtakos natūraliai lėtinių širdies ir kraujagyslių ligų, įskaitant senėjimą, istorijai?

Daugybė tyrimų koreliavo Hsp ekspresijos indukciją ir slėgio perkrovą dėl aortos juostos, ūminės hipertenzijos, vazoaktyvių medžiagų poveikio arba kairiojo skilvelio hipertrofijos ir augimo faktoriaus ekspresijos kelių tipų ląstelėse. 207 208 209 Pranešama, kad senėjimo proceso metu graužikų miokarde sumažėja HSP genų ekspresija ir HSF1 DNR surišimo aktyvumas. 210 Daugėja įrodymų, kad oksidacinis stresas / žala gali būti pagrindinis senėjimo proceso priežastinis veiksnys. 211 Oksidacinio streso lygis ir audinių jautrumas eksperimentiniu būdu sukeltam oksidaciniam stresui, atrodo, didėja senėjimo proceso metu. Ar padidėjęs molekulinės oksidacinės žalos kiekis, pastebėtas senėjimo proceso metu, yra priežastiniu ryšiu susijęs su sumažėjusiu HSF1 aktyvumu ir, netiesiogiai, Hsp geno ekspresija, šiuo metu nežinoma. Transgeninių ir genų išmušimo modelių prieinamumas leis būsimiems tyrimams nustatyti streso sukeltos šilumos šoko geno ekspresijos vaidmenį normalaus senėjimo ar fiziologinio prisitaikymo prie su liga susijusio (-ių) širdies rizikos faktoriaus (-ių) metu.

Molekuliniai chaperonai sergant širdies ligomis, kuriuos sukelia mutantinių baltymų ekspresija

Padidėjęs netinkamai sulankstytų arba denatūruotų baltymų kiekis, taip pat nenormalių baltymų mikroinjekcija yra stiprūs HSP geno ekspresijos induktoriai. 14 59 Naujausi tyrimai, rodantys, kad Hsc70 chaperonas netiesiogiai sąveikauja su CFTR, turinčiu bendrą ΔF508 sulankstymo mutaciją, patvirtina šią bendrą supratimą apie jų biologinį vaidmenį sergant žmonių ligomis. 20

Chaperonų biologijos požiūriu širdies ligos, atsirandančios dėl genų, koduojančių kontraktilinio aparato komponentus arba jonų kanalų baltymus, mutacijų, iš esmės yra nenormalių baltymų problemos. Kelios sarkomerinių baltymų mutacijos buvo susijusios su šeiminės hipertrofinės kardiomiopatijos patogeneze, įskaitant miozino sunkiąsias ir lengvas grandines, troponino I ir T subvienetus, mioziną surišantį baltymą C ir tropomioziną (6 6 nuoroda ir apžvelgta 7 nuorodoje 7 ). Nors chaperonas Hsp27 vaidina svarbų vaidmenį aktino polimerizacijoje, o chaperoninas TRIC dalyvauja aktino ir tubulino lankstymo procese, fiziologinis chaperono ir chaperonino sistemų vaidmuo sulankstydamas ir surenkant sarkomerines struktūras normaliomis sąlygomis arba sergant ligomis išlieka paslaptis. Manoma, kad chaperonai gali paveikti mutantinių sarkomerinių baltymų atstatymą arba skaidymą, o tai galiausiai turi įtakos struktūros ir funkcijos santykiams bei ligos fenotipui. 212 Pirmiausia reikia atlikti in vitro analizę, siekiant nustatyti, ar chaperono funkcija gali turėti įtakos produktyviam baltymų lankstymui, kurį sukelia atitinkamos mutacijos, kurias galima patvirtinti atitinkamais gyvūnų modeliais. 18 213

Molekuliniai chaperonai kraujagyslių biologijoje

Yra daug galimybių išskaidyti chaperono funkcijas biologiškai aktyvių peptidų ir baltymų sintezės ir sekrecijos, ląstelių proliferacijos, tarpląstelinio signalizacijos ir citoskeleto pertvarkymo metu. Tokių tyrimų rezultatai gali nustatyti specifinius HSP baltymų taikinius ir įvairių ląstelių tipų specifiškumą skatinant kraujagysles apsauginį estrogeno poveikį. 214 215 Esminiai Hsp90 ir kochaperonų vaidmenys steroidų receptorių biologijoje rodo, kad HSP chaperonai atlieka kliniškai reikšmingą vaidmenį pakeičiamosios hormonų terapijos veiksmuose moterims po menopauzės. 216 217 Epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad premenopauzinio amžiaus moterų apsauginė nauda nuo koronarinės širdies ligos išnyksta po menopauzės. 218 219 220 Galimas apsauginis estrogeno poveikis siejamas su jo antioksidacinėmis ir kraujagysles apsaugančiomis savybėmis, kraujo lipidų ir lipoproteinų kiekio mažinimu ir tiesioginiu poveikiu kraujagyslės sienelėms. 221 Bus svarbu apibrėžti, ar streso sukelta Hsp ekspresija genetiškai modifikuotose pelėse turi įtakos kraujagyslių atsakui į sužalojimą gyvūnų patinų ir patelių. 215

Molekulinis chaperonas ir imunologinės ligos

Skirtingai nuo nusistovėjusių citoprotekcinių vaidmenų, tam tikri streso baltymai buvo susiję su širdies ir kraujagyslių ligų patogeneze. Pavyzdžiui, padidėjęs antikūnų prieš žinduolių Hsp60 bakterinį homologą serume buvo įrodytas pacientams, sergantiems kardiomiopatija ir diabetu, besimptomiams asmenims, sergantiems miego arterijos stenoze, ir ateroskleroziniais pažeidimais triušiams ir žmonėms (apžvelgta 222 222 nuorodoje). Viena hipotezė yra ta, kad autoimuninė liga atsiranda dėl kryžminio imunogeninių peptidų, gaunamų iš bakterijų ir mitochondrijų chaperonų ir Hsp60 (chaperonino) ir atpažįstami aktyvuotų γ / δ T limfocitų, kryžminio reaktyvumo. 223 224 Humoriniai imuniniai atsakai ir seropozityvūs žymenys prieš pirmuonių parazitų Hsp70 šeimą (ypač ER Grp78 ir Hsc70) Trypanosoma cruzi buvo susiję su Chagas ligos, 224A, dažniausia stazinio širdies nepakankamumo priežastimi Lotynų Amerikoje, patogeneze (žr. lentelę). Nors šiems koreliaciniams tyrimams būdingi apribojimai, būsimi tyrimai, skirti nustatyti priežastinį ryšį, gali atverti galimybes sukurti vakcinas ar kitus naujus gydymo ir profilaktikos gydymo būdus.

Galimi molekulinių chaperonų terapiniai pritaikymai

Strategijos, galinčios padidinti fiziologinio atsigavimo greitį po apsvaiginimo po infarkto ir skilvelių disfunkcijos, išlieka svarbiais tikslais gydant pacientus, sergančius ūminiu miokardo infarktu. Kadangi manevrai naudojant audinių arba viso kūno hipertermiją yra sudėtingi ir nepraktiški sąmoningiems žmonėms, farmakologinės strategijos, padidinančios streso baltymų ekspresiją izoterminei apsaugai, gali būti naudingos prieš išeminį širdies, inkstų ir smegenų pažeidimą. Vienas iš galimų būdų yra proteasomų inhibitoriai, kurie laikinai padidina išsiskleidusių baltymų kiekį ląstelėse. 225 Alternatyvūs metodai gali apimti mažų molekulių ir peptidų kūrimą 226 226A, kurie imituoja chaperonų poveikį in vivo ir turi terapinės naudos.

Perspektyvos

Streso baltymų vaidmuo širdies apsaugai buvo pripažintas viena iš svarbiausių ateities išeminės širdies ligos tyrimų krypčių.227 Kadangi paveiktų asmenų skaičius yra toks didelis, terapinė intervencija, kuri prisideda prie nedidelio sergamumo ir mirštamumo po miokardo infarkto pokyčio, gali turėti didelį poveikį bendriems klinikiniams rezultatams. Galimybės spręsti citoprotekcinių chaperonų fiziologinius vaidmenis sergant širdies ligomis turi būti išplėstos, įtraukiant tikėtiną jų vaidmenį sergant lėtinėmis ligomis (ateroskleroze, hipertenzija, diabetu, genetiniais sutrikimais ir širdies vožtuvų liga), kurios susilieja bendrais būdais ir sukelia širdies nepakankamumą ir. staigi mirtis. Mokslininkų grupių strateginiai aljansai galėtų sukurti naujas kryptis ir paspartinti pažangą šioje perspektyvioje srityje, kuri galiausiai galėtų sėkmingai išnaudoti endogeninius būdus, siekiant pagerinti fiziologinę sveikatą ir sumažinti fiziologinį susidėvėjimą, susijusį su širdies ir kraujagyslių ligomis.

Pasirinktos santrumpos ir akronimai

CFTR=cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatorius
ER=endoplazminis Tinklelis
ERK=ekstraląsteliniu būdu reaguojanti kinazė
Grp=su gliukoze susijęs baltymas
HO=hemo oksigenazė
Hsc=šilumos šokas giminingas
HSF=šilumos šoko transkripcijos faktorius
HSP=šilumos šoko streso baltymų šeima
Hsp=šilumos šoko baltymas
JNK=c-Jun N-galo kinazė
MAPK=mitogeno aktyvuota proteinkinazė
MAPKAP=MAPK aktyvuota proteinkinazė
MW=molekulinė masė
ROS=reaktyviosios deguonies rūšys
SAPK=Streso aktyvuota proteinkinazė
TRIC=TCP-1 žiedo kompleksas
VSMC=kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelė

Figūra 1. Pagrindinių patofiziologinių signalų, aktyvinančių HSP sintezę (vertikalios ištisinės linijos kairėje) ir galimų HSP funkcijų (vertikalios ištisinės linijos dešinėje), santrauka. Ląstelių pažeidimas pasireiškia padidėjusia ROS gamyba, redokso aktyvios geležies prieinamumu, membranų lipidų peroksidacija ir baltymų pažeidimu. 92 Ekstraląsteliniai ROS (A) šaltiniai gali būti endotelio ląstelės, VSMC ir net miocitai aplinkiniuose audiniuose, molekulinio deguonies (B) elektronų pernešimas į mitochondrijas gali būti pagrindinis tarpląstelinis ROS generavimo šaltinis. Intraląstelinis laisvas kalcio (C), kuris per 10 minučių po reperfuzijos padidėja 10 kartų, 228 229 buvo susijęs su proteazių (D) aktyvavimu, kurios, savo ruožtu, gali prisidėti prie intracelulinio miokardo pažeidimo. 230 231 232 Citoskeleto (E) pažeidimas yra ankstyvas išeminio pažeidimo įvykis, sukeliantis skilvelių disfunkciją arba „miokardo apsvaigimą“, kai pažeidimas yra grįžtamas. 87 Miokardo pažeidimas taip pat gali atsirasti dėl kelių mechanizmų pritraukimo polimorfonukleariniams leukocitams (PMN) į išeminę teritoriją ir iš deguonies gaunamų laisvųjų radikalų (A), citotoksinių lizosomų fermentų (F), ekstraląstelinių proteazių (G) ir komplemento išsiskyrimo. aktyvinimas (H) (peržiūrėtas 233 nuorodoje). Manoma, kad įvairūs fiziologiniai signalai suaktyvina streso sukeliamą HSF1 (I), kuris jungiasi prie sekai specifinio šilumos šoko elemento (HSE) (J), esančio visų HSP (K) promotoriuose. Nors tikslus Hsp70 sukeltos išeminės apsaugos mechanizmas yra menkai suprantamas, jis plačiai priskiriamas biologinėms „molekulinių chaperonų“ savybėms, kurios, kaip siūloma, padeda surinkti arba atkurti naujai susintetintus ar pažeistus baltymus. 11 234 235 Fiziologiniu požiūriu potencialios molekulinių chaperonų funkcijos išeminėje širdyje yra šios: naujai susintetintų polipeptidų, būtinų palaikyti oksidacinį metabolizmą po miocitų pažeidimo (L), baltymų lankstymas, mitochondrijų apsauga nuo ROS ir citokinų, tokių kaip TNFα 204 236. ir naujai susintetintų baltymų perkėlimas organelių taisymo metu (M), kritinių struktūrinių baltymų atstatymas po išemijos sukeltų citoskeleto pakitimų (N), 237 membraninių pūslelių perdirbimas (Hsc70) (O), galimų toksiškų šalutinių produktų transportavimas proteasomų skaidymui. (P), 78 238 239 priešuždegiminių citokinų, tokių kaip pro-interleukinas-1β (Q), slopinimas, 204 236 240 NADPH oksidazės slopinimas ir oksidacinis sprogimas dėl šilumos šoko atsako (R), 241 apsauga naudojant NO gamybą nuo indukuojamos sintezės. HSP ekspresijos (S), 61 242 243 244 245 246 apoptozės prevencija per mitochondrijų chaperoną Hsp60 surišant citochromą c ir (arba) Hsp70 surišimas su citozoliniais taikiniais (T), 36 204 jonų kanalo atstatymas (U), kolageno sintezė Hsp47 chaperonu, skirta reparacinei fibrozei (V), 180 ir imuninės sistemos sukelto išeminio pažeidimo moduliavimas (W). 241

2 pav. Siūloma chaperono Hsc70 komplekso reakcijos ciklo schema, sulankstant hipotetinį substratą ląstelėje. Pradedant nuo paveikslo apačios, chaperonas Hsc70 (A) susideda iš N-galo ATPazės ir C-galo domeno, skirto surišti tikslinį substratą. Hsp40 (B), eukariotinis DnaJ homologas, pirmiausia suriša nesuskleistus baltymus (UP) (C), o paskui jungiasi su Hsc70.ADP, arba jungiasi su Hsc70.ADP.UP kompleksu (D), kurio aktyvumas yra mažas. nuolaida UP. Numatyti keli skirtingi Hsc70.ADP.UP komplekso likimai, kurių kiekvienas priklauso nuo Hsp40 pakeitimo skirtingais pagalbiniais partneriais, konkrečiai, Hip (su Hsc70 sąveikaujantis baltymas), Hop (Hsc70/Hsp90 organizuojantis baltymas) ir Hap. (Hsc70 papildomas baltymas). 166 247 248 Išsilaisvinus Hsp40, Hip prisijungia prie Hsc70 (E) ATPazės domeno, stimuliuoja jo aktyvumą, o tada lieka surištas, kad stabilizuotų ADP-Hsc70 substrato kompleksą, o tai rodo, kad jis gali vaidinti vaidmenį pernešant substratus. ląstelėse (F). 166 Hop tarnauja kaip fizinis ryšys tarp Hsc70 ir Hsp90 (G), tikriausiai siekiant palengvinti UP perdavimą tarp šių chaperonų. Nesvarbu, ar Hop keičia Hsc70 ATPazės aktyvumą, ar ne, yra prieštaringa. 249 Hup funkcija, kuri skatina UP išsiskyrimą iš Hsc70 (H) ir Hsc70 oligomerus paverčia monomerais (I), dar turi būti nustatyta. Energija, perduota iš ATP hidrolizės, greitį ribojančio eukariotų chaperono ciklo žingsnio, naudojama nuosekliais ciklais, siekiant padėti sulankstyti ir užkirsti kelią agregacijai bei skilimui. Šiuo tikslu du susiję baltymai, BAG-1 (neparodyta) ir Hap (J), kurie jungiasi prie Hsc70 ATPazės domeno, taip pat slopina Hsp70 prisijungimą prie nesuskleisto baltymo substrato in vitro, o tai rodo, kad šie baltymai gali atlikti svarbų vaidmenį palaikant kokybės kontrolė, nukreipiant neproduktyvią sąveiką į degradaciją 250 (iliustraciją maloniai pateikė LE Hightower, Konektikuto universitetas, Storrs).

1 lentelė. Pagrindinės širdies ir kraujagyslių biologijos HSP klasės

mHsp75 rodo mitochondrijų Hsp75 HIF-1, hipoksijos sukeliamą transkripcijos faktorių 1 ir MKBP, miotoninės distrofijos baltymų kinazę.

Dr Benjamin buvo remiamas Amerikos medicinos tyrimų fondo, Nacionalinių sveikatos institutų ir Amerikos širdies asociacijos įsteigto tyrėjo apdovanojimo. Dėkojame R. S. Williamsui, R. Meidellui, A. Davisui, P. Thomasui ir R. Sohalui už jų kritiškas pastabas apie mūsų rankraštį.


Publikacijos

Pastaraisiais metais labai pagerėjo baltymų projektavimo metodika. Nepaisant to, daugumai metodų reikalingas ekspertų įsikišimas, o tai riboja platų jų taikymą. Priešingai, PROSS algoritmas, skirtas pagerinti baltymų stabilumą ir heterologinius ekspresijos lygius, buvo sėkmingai pritaikytas daugeliui sudėtingų fermentų ir jungiamųjų baltymų. Čia mes lyginame PROSS taikymą kaip atskirą įrankį baltymų mokslininkams, neturintiems arba ribotos modeliavimo patirties. Dvylika laboratorijų iš Baltymų gamybos ir gryninimo partnerystės Europoje (P4EU) užginčijo PROSS algoritmą su 14 nesusijusių baltymų taikinių be PROSS kūrėjų paramos. Kiekvienam taikiniui buvo įvertinta iki šešių dizainų, susijusių su ekspresijos lygiais, o kai kuriais atvejais - dėl terminio stabilumo ir aktyvumo. Devyniuose taikiniuose projektuose buvo padidėjęs heterologinės ekspresijos lygis arba prokariotinėse, ir (arba) eukariotinėse ekspresijos sistemose eksperimentinėmis sąlygomis, kurios buvo pritaikytos kiekvienam tiksliniam baltymui. Be to, devyniuose iš dešimties išbandytų taikinių pastebėjome padidėjusį šiluminį stabilumą. Dviejuose geriausiuose pavyzdžiuose, žmogaus kamieninių ląstelių faktoriaus (hSCF) ir žmogaus kadherino tipo domeno (CLD12) iš RET receptoriaus, laukinio tipo baltymai nebuvo ekspresuojami kaip tirpūs baltymai E. coli, tačiau PROSS modeliai pasižymėjo aukštu ekspresijos lygiu. atitinkamai E. coli ir HEK293 ląstelėse ir pagerino terminį stabilumą. Darome išvadą, kad PROSS gali pagerinti stabilumą ir išraiškingumą įvairiais atvejais, o patobulinimui paprastai reikia specifinių taikinio išraiškos sąlygų. Šis tyrimas parodo bendruomenės pastangų, siekiant ištirti naujų metodų bendrumą, stipriąsias puses ir rekomenduoja būsimų tyrimų sritis, kad būtų galima tobulinti praktiškai naudingus baltymų mokslo algoritmus.

Daugelio baltymų šeimų funkcinėse vietose dominuoja įvairūs stuburo regionai, kuriems trūksta antrinės struktūros (kilpų), bet kurie stabiliai susilanksto į savo funkciškai kompetentingą būseną. Nepaisant to, struktūrinių kilpų regionų projektavimas nuo nulio, ypač funkcinėse vietose, susidūrė su dideliais sunkumais. Todėl sukūrėme metodą, vadinamą AbDesign, norėdami išnaudoti natūralų daugelio baltymų šeimų moduliškumą ir skaičiavimo būdu surinkti daugybę naujų stuburų, derindami natūraliai atsirandančius modulinius fragmentus. Ši strategija davė didelių, atomiškai tikslių ir labai efektyvių baltymų, įskaitant antikūnus ir fermentus, turinčius dešimtis bet kurio natūralaus baltymo mutacijų. Kombinatorinė stuburo ir konformacijos erdvė, kurią AbDesign gali pasiekti net ir nedidelio dydžio homologų šeimai, gali viršyti įvairovę visame PBP, suteikdama sub-Ångstrom lygį kontroliuojant aktyvių vietų grupių padėties nustatymą, reikalingą norint gauti labai aktyvūs baltymai. Šiame rankraštyje aprašoma, kaip įdiegti dujotiekį naudojant kodą, kuris yra laisvai prieinamas https://github.com/Fleishman-Lab/AbDesign_for_enzymes.

Mūsų gebėjimas kurti naują ar patobulintą biomolekulinę veiklą priklauso nuo baltymų sekos ir funkcijų santykių supratimo. Tačiau didelis daugumos baltymų dydis ir sudėtingumas užgožia šiuos ryšius, o baltymų optimizavimo metodai ir toliau remiasi daug pastangų reikalaujančiomis eksperimentinėmis iteracijomis. Pastaruoju metu gilesnis baltymų stabilumo slenksčio poveikio ir biomolekulinės epistazės vaidmenų supratimas paskatino sukurti hibridinius metodus, kurie derina filogenetinę analizę su atomistinio dizaino skaičiavimais. Šie metodai leidžia patikimai ir net vienu žingsniu optimizuoti baltymų stabilumą, ekspresyvumą ir aktyvumą baltymuose, kurie buvo laikomi už skaičiavimo projektavimo ribų. Be to, protėvių sekos rekonstrukcija suteikia įžvalgų apie trūkstamas grandis fermentų ir rišiklių, kurie gali būti naudojami baltymų projektavimui, raidoje. Derinant filogenetinius ir atomistinius skaičiavimus, pagaliau pasiekiamas ilgalaikis bendrųjų skaičiavimo metodų, kurie gali būti visuotinai taikomi baltymams tirti ir optimizuoti, tikslas.

Daugelis žmogaus patogenų naudoja šeimininko ląstelės paviršiaus receptorius, kad pritvirtintų ir įsiveržtų į ląsteles. Dažnai šeimininko ir patogeno sąveikos afinitetas yra mažas, todėl atsiranda galimybė blokuoti invaziją naudojant tirpią, didelio afiniteto šeimininko baltymo imitaciją. Plasmodium falciparum retikulocitus surišančio baltymo homologas 5 (RH5) yra jaudinantis kandidatas imituoti: jis yra labai konservuotas ir vidutinio afiniteto prisijungia prie žmogaus receptoriaus bazigino (K).
D ≥1 μM) yra esminis šio maliarijos parazito invazijos eritrocitų etapas. Mes panaudojome gilų mutacinį tirpaus žmogaus bazigo fragmento nuskaitymą, kad sistemingai apibūdintume taškines mutacijas, kurios padidina bazigino afinitetą RH5, o tada panaudojome Rosetta, kad sukurtume variantą afinitetą didinančių mutacijų sekos erdvėje. Gautas septynių mutacijų dizainas parodė 1900 kartų didesnį afinitetą (K
D maždaug 1 nM) RH5 su labai lėtu surišimo greičiu (0,23 val
−1) ir sumažino veiksmingą Plasmodium augimą slopinančią koncentraciją bent 10 kartų, palyginti su žmogaus bazine. Šis dizainas yra palankus atspirties taškas inžineriniams patobulinimams, kurie gali būti būtini norint pasiekti terapiškai veiksmingą augimo slopinimą.

Manoma, kad ŽIV-1 metastabilaus apvalkalo glikoproteino (Env) stabilizavimas pagerina plačiai neutralizuojančių antikūnų indukciją. Mes pagerinome ŽIV-1 apvalkalo glikoproteino BG505SOSIP.664 gp140 ekspresijos išeigą ir stabilumą, taikydami anksčiau aprašytą automatizuotą seką ir struktūra valdomą skaičiavimo termostabilizavimo metodą PROSS. Tai sujungia sekos išsaugojimo informaciją su skaičiuojamu mutantų stabilizavimo įvertinimu, tokiu būdu pasinaudojant dideliu natūralių sekos skirtumu, esančiu ŽIV-1 Env. PROSS naudojamas kuriant tris gp140 variantus su 17–45 mutacijomis, palyginti su tėvų konstrukcija. Eksperimentiškai pastebėta, kad vieno iš konstrukcijų derlius pagerėjo keturis kartus, o termostabilumas padidėjo 4 ° C. Be to, sukurti imunogenai turi panašų antigeniškumo profilį kaip natūralios lanksčios laukinio tipo jungties versijos BG505SOSIP.664 gp140 (NFL Wt) su pagrindiniais epitopais, nukreiptais plačiais neutralizuojančiais antikūnais. PROSS pašalina daug pastangų reikalaujantį daugelio variantų stabilumo ir funkcionalumo patikros procesą, pateikdamas metodo principo įrodymą, skirtą stabilizuoti ir pagerinti derlių, nepakenkiant naujos kartos kompleksinių, labai glikozilintų vakcinų kandidatų antigeniškumui.

Antikūnai, sukurti moksliniams tyrimams ir klinikiniams tikslams, gali turėti neoptimalų stabilumą, ekspresyvumą arba afinitetą. Esamos optimizavimo strategijos sutelktos į paviršiaus mutacijas, o natūralus afinitetas taip pat sukelia mutacijas antikūnų šerdyje, tuo pačiu pagerindamas stabilumą ir afinitetą. Norėdami sistemingai nustatyti antikūno kintamo fragmento (Fv) mutacijos toleranciją, atlikome mielių rodymą ir antilizocimo antikūnui pritaikėme gilų mutacijų nuskaitymą ir nustatėme, kad daugelis afinitetą didinančių mutacijų susitelkė kintamoje lengvosios ir sunkiosios grandinės sąsajoje, antikūnų šerdyje. „Rosetta“ dizainas apjungė sustiprinančias mutacijas, todėl buvo sukurtas dešimt kartų didesnis afinitetas ir žymiai pagerintas stabilumas. Kad šis metodas būtų plačiai prieinamas, sukūrėme AbLIFT – automatinį žiniatinklio serverį, kuris kuria daugiataškes branduolių mutacijas, kad pagerintų kontaktus tarp specifinių Fv lengvųjų ir sunkiųjų grandinių (http://AbLIFT.weizmann.ac.il). AbLIFT taikėme dviem nesusijusiems antikūnams, nukreiptiems į žmogaus antigenus VEGF ir QSOX1. Stebėtina, kad dizainai pagerino stabilumą, giminingumą ir išraiškos našumą. Rezultatai yra principo įrodymas, kaip apeiti daug pastangų reikalaujančius antikūnų inžinerijos ciklus naudojant automatinį skaičiavimo afinitetą ir stabilumo dizainą.

Membranos-baltymų dizainas yra įdomi ir vis sėkmingesnė mokslinių tyrimų sritis, kuri atvedė į orientyrus, įskaitant stabilių ir tikslių membranoje integruotų baltymų, pagrįstų suvyniotos ritės motyvais, kūrimą. Tačiau topologiškai sudėtingesnių baltymų, tokių kaip dauguma receptorių, kanalų ir transporterių, projektavimas reikalauja energijos funkcijos, kuri subalansuotų vidinių baltymų kontaktų ir baltymų ir membranų sąveiką. Naujausi vandenyje tirpių visų atomų energijos funkcijų pažanga padidino struktūros numatymo etalonų tikslumą. Tačiau plazmos membrana nustato skirtingus fizinius baltymų tirpinimo apribojimus. Norėdami suprasti šiuos apribojimus, neseniai sukūrėme didelio našumo eksperimentinį ekraną, vadinamą dsTβL, ir padarėme išvadą apie kiekvienos aminorūgšties tariamą įterpimo energiją dešimtyse bakterijų plazmos membranos pozicijų. Čia mes išreiškiame šiuos profilius kaip lipofiliškumo energijos terminus Rosetta ir parodome, kad naujoji energijos funkcija lenkia ankstesnes modeliavimo ir projektavimo etalonus. „Rosetta ab initio“ modeliavimas, pradedant nuo išplėstos grandinės, apibendrina du trečdalius eksperimentiškai nustatytų membraną apimančių homo-oligomerų struktūrų, kurių vidutinis kvadratinis nuokrypis yra <2,5Å pagal penkis geriausius prognozuojamus modelius (galima rasti internete: http:// tmhop.weizmann.ac.il). Be to, dviejuose sekos projektavimo etalonuose energijos funkcija pagerina stabilizuojančių taškinių mutacijų atskyrimą ir apibendrina natūralias žinomos struktūros membranos ir baltymų sekas, taip rekomenduodama šią naują energijos funkciją membranos ir baltymų modeliavimui ir projektavimui.

Antikūnų struktūros prognozavimo metodai priklauso nuo sekos homologijos su eksperimentiškai nustatytomis struktūromis. Gauti modeliai gali būti tikslūs, bet dažnai stereochemiškai įtempti, o tai riboja jų naudingumą modeliuojant ir projektuojant darbo eigą. Pristatome AbPredict 2 žiniatinklio serverį, kuris, užuot naudojęs sekos homologiją, atlieka Monte Karlo žemos energijos stuburo konformacijų derinių paiešką, kad gautų tikslias ir neįtemptas antikūnų struktūras.

Baltymų sulankstymas iki funkcinės konformacijos yra gyvybiškai svarbus. Nors 75% proteomo sudaro kelių domenų baltymai, mūsų žinios apie lankstymą pirmiausia buvo pagrįstos tyrimais, atliktais su vieno domeno ir greitai sulankstomais baltymais. Nepaisant to, pastaraisiais metais buvo vis labiau tiriamas sulankstomų peizažų, kuriuos demonstruoja kelių domenų baltymai, sudėtingumas. Mes tiriame trijų domenų baltymo adenilato kinazę iš E. coli (AK), kuri, kaip įrodyta, susilanksto keliais keliais, apimančiais keletą tarpinių būsenų. Mes naudojame baltymų projektavimo metodą, kad galėtume manipuliuoti AK sulankstomu kraštovaizdžiu, ir vienos molekulės FRET spektroskopiją, kad ištirtume poveikį lankstymo procesui. Nustatyta, kad mutacijos, įvestos į baltymo NMP surišimo (NMPbind) domeną, turi netikėtą poveikį lankstymo kraštovaizdžiui. Taigi, nors stabilizuojančios mutacijos NMPbind domeno šerdyje išlaiko pagrindinius laukinio tipo AK sulankstymo kelius, destabilizuojanti mutacija sąsajoje tarp NMPbind ir CORE domenų sukelia reikšmingą srauto tarp sulankstymo takų pasiskirstymą. Mūsų rezultatai rodo išskirtinį AK sulankstomo kraštovaizdžio plastiškumą ir atskleidžia, kaip specifinės pirminės struktūros mutacijos paverčiamos sulankstymo dinamikos pokyčiais. Šiame darbe pristatytas metodikų derinys turėtų būti naudingas norint gilinti mūsų supratimą apie kelių domenų baltymų lankstymo procesą.

Pernelyg išreikštų baltymų apibūdinimas yra būtinas norint įvertinti jų kokybę ir suteikti informacijos pakartotiniam perprojektavimui ir optimizavimui. Šis procesas paprastai atliekamas po valymo procedūrų, kurioms reikia didelių laiko ir darbo sąnaudų. Todėl rekombinantinių baltymų kokybės įvertinimas be išankstinio gryninimo suteikia didelį pranašumą.Čia pateikiame natūralų masės spektrometrijos metodą, leidžiantį apibūdinti per daug pagamintus baltymus tiesiai iš auginimo terpės. Iš karto atskleidžiamos tokios savybės kaip tirpumas, molekulinė masė, lankstymas, surinkimo būsena, bendra struktūra, modifikacijos po transliacijos ir prisijungimas prie atitinkamų biomolekulių. Mes parodome metodo pritaikomumą išskiriamų rekombinantinių baltymų iš eukariotinių sistemų, tokių kaip mielės, vabzdžiai ir žmogaus ląstelės, apibūdinimui. Šis metodas, kurį galima lengvai išplėsti į didelio našumo analizę, žymiai sutrumpina laiko tarpą tarp baltymų gamybos ir apibūdinimo ir yra ypač tinkamas apibūdinti inžinerijos būdu sukurtus ir mutavusius baltymus bei optimizuoti pernelyg išreikštų baltymų derlių ir kokybę.

Visų organizmų baltymų tinklus sudaro homologinės sąveikaujančios poros. Šiuose tinkluose kai kurie baltymai yra specifiniai, sąveikaujantys su vienu ar keliais surišimo partneriais, o kiti yra daugiaspecifiniai ir suriša daugybę taikinių. Mes aprašome algoritmą, kuris prasideda nuo sąveikaujančios poros ir sukuria daugybę naujų porų su įvairiomis stuburo konformacijomis rišimosi vietoje, taip pat naujomis surišimo orientacijomis ir sekomis. Taikant didelio afiniteto bakterijų porai, algoritmas sukuria 18 naujų, kurių giminingumas nuo piko- iki mikromolinių. Trys poros pasižymi 3–5 laipsnio specifiškumu, palyginti su laukiniu tipu, o kitos yra daugiaspecifinės ir kartu sudaro baltymų sąveikos tinklą. Kristalografinė analizė patvirtina projektavimo tikslumą, įskaitant naujus stuburus ir polinę sąveiką. Iš anksto organizuoti polinės sąveikos tinklai yra atsakingi už didelį specifiškumą, taip apibrėžiant projektavimo principus, kurie gali būti taikomi programuojant norimo giminingumo ir specifiškumo sintetinius korinio sąveikos tinklus.

Fotorespiracija grąžina ribuliozės-1,5-bisfosfato karboksilazės/oksigenazės (Rubisco) deguonies produktą, 2-fosfoglikolatą, atgal į Kalvino ciklą. Tačiau natūralus fotokvėpavimas riboja žemės ūkio produktyvumą, nes išsklaido energiją ir išskiria CO2. Anksčiau buvo pasiūlyta keletas fotorespiracijos aplinkkelių, tačiau apsiribojo esamais fermentais ir keliais, išskiriančiais CO2. Čia mes panaudojame fermentų ir medžiagų apykaitos inžinerijos galią, kad sukurtume sintetinius kelius, kurie aplenkia fotokvėpavimą be CO2 išsiskyrimo. Apibrėždami konkrečias reakcijos taisykles, mes sistemingai nustatėme perspektyvius būdus, kurie asimiliuoja 2-fosfoglikolatą į Calvin ciklą neprarandant anglies. Toliau sukūrėme kinetinį-stechiometrinį modelį, kuris rodo, kad nustatyti sintetiniai šuntai gali padidinti anglies fiksavimo greitį fiziologiniame švitinimo ir CO2 diapazone, net jei dauguma jų fermentų veikia dešimtadaliu Rubisco maksimalaus karboksilinimo aktyvumo. Glikolato redukcija į glikolaldehidą yra būtina kai kuriems sintetiniams šuntams, tačiau žinoma, kad tai nėra natūraliai. Todėl mes panaudojome skaičiavimo dizainą ir nukreiptą evoliuciją, kad nustatytų šią veiklą dviejose nuosekliose reakcijose. Acetil-CoA sintetazė buvo sukurta siekiant didesnio stabilumo ir glikolilo-CoA sintezės. Propionil-CoA reduktazė buvo sukurta siekiant didesnio selektyvumo glikolil-CoA ir naudoti NADPH, o ne NAD (+), taip skatinant redukciją, o ne oksidaciją. Tada sukurtas glikolato redukcijos modulis buvo sujungtas su kondensacija ir glikolaldehido asimiliacija iki ribulozės 1, 5-bisfosfato, tokiu būdu įrodant anglį tausojančio fotorespiracijos kelio principą.

Esminis fermentų aktyvumo pagerėjimas reikalauja kelių mutacijų erdvinėse proksimalinėse aktyviosios vietos vietose. Tačiau tokios mutacijos dažnai turi nenuspėjamą epistatinį (nepridėjusį) poveikį veiklai. Čia aprašome FuncLib, automatinį metodą, skirtą daugiataškių mutacijų projektavimui fermentų aktyviose vietose, naudojant filogenetinę analizę ir Rosetta projektavimo skaičiavimus. FuncLib pritaikėme dviem nesusijusiems fermentams – fosfotriesterazei ir acetil-CoA sintetazei. Visi dizainai buvo aktyvūs, o daugumoje jų veiklos profiliai labai skyrėsi nuo laukinio tipo ir vienas nuo kito. Kelios dešimtys konstrukcijų su tik 3–6 aktyviosios vietos mutacijomis parodė 10–4000 kartų didesnį efektyvumą naudojant įvairius alternatyvius substratus, įskaitant toksiškų organofosfatų nervinių medžiagų somano ir ciklosarino hidrolizę ir butirilo-CoA sintezę. FuncLib yra įdiegtas kaip žiniatinklio serveris (http://FuncLib.weizmann.ac.il), jis apeina pasikartojančius, didelio našumo eksperimentinius ekranus ir atveria kelią kurti labai efektyvius ir įvairius katalizinius repertuarus.

Galingas metodas energetiniam aminorūgščių ryšiui nustatyti yra dvigubo mutanto ciklo analizė. Taikant šį metodą, dvi liekanos mutuojamos atskirai ir kartu ir nustatomas mutacijų energetinis poveikis. Dvigubos mutacijos poveikio nukrypimas nuo pavienių mutacijų poveikių sumos rodo, kad dvi liekanos sąveikauja tiesiogiai arba netiesiogiai. Čia parodome, kad dvigubo mutanto ciklo analizė naudojant natūralią masės spektrometriją gali būti atliekama sąveikai su neapdorotais Escherichia coli ląstelių ekstraktais, taip pašalinant baltymų gryninimo poreikį ir sukuriant surišimo izotermas. Mūsų rezultatai rodo, kad tarpmolekulinių vandenilio jungčių stiprumui įtakos neturi perpildytos sąlygos ląstelių lizatuose.

Anti-angliavandenių monokloniniai antikūnai (mAb) yra daug žadantys kaip vėžio gydymo ir diagnostikos priemonės. Tačiau jų specifiškumas gali būti įvairus, o išsamus apibūdinimas yra problemiškas, nes antikūnų ir glikanų kompleksus sunku kristalizuotis. Čia mes sukūrėme apibendrinamą metodą, kuriame naudojami didelio našumo metodai, skirti apibūdinti tokių mAb struktūrą ir specifiškumą, ir pritaikėme jį mAb TKH2, sukurto prieš su naviku susijusį angliavandenių antigeną sialil-Tn (STn). mAb specifiškumas buvo apibrėžtas tariamomis KD reikšmėmis, nustatytomis kiekybiniu glikano mikrogardelių atranka. Pagrindinės liekanos antikūnų sujungimo vietoje buvo identifikuotos taikant į vietą nukreiptą mutagenezę, o glikano ir antigeno kontaktinis paviršius buvo apibrėžtas naudojant soties perdavimo skirtumo BMR (STD-BMR). Tada šios savybės buvo naudojamos kaip metrika, leidžianti pasirinkti optimalų antikūnų-glikano komplekso 3D modelį iš tūkstančių tikėtinų variantų, sukurtų naudojant automatinį prijungimą ir molekulinės dinamikos modeliavimą. STn specifiškumas buvo toliau patvirtintas skaičiuojant pasirinkto antikūno 3D modelio patikrinimą prieš žmogaus sialil-Tn-glikomą. Šis skaičiavimo-eksperimentinis metodas leistų racionaliai sukurti stiprius antikūnus, nukreiptus į angliavandenius.

Automatinis fermentų, pasižyminčių laukinio tipo katalizinėmis savybėmis, projektavimas buvo senas, bet sunkiai pasiekiamas tikslas. Čia pateikiame bendrą, automatizuotą fermentų projektavimo metodą naudojant kombinatorinį pagrindo surinkimą. Pradedant nuo homologinių, tačiau struktūriškai skirtingų fermentų struktūrų rinkinio, šis metodas surenka naujus stuburo derinius ir naudoja Rosetta aminorūgščių sekai optimizuoti, kartu išsaugant pagrindines katalizines liekanas. Šį metodą taikome dviem nesusijusioms fermentų šeimoms su TIM statinės raukšlėmis, glikozidų hidrolazės 10 (GH10) ksilanazėmis ir fosfotriesterazės tipo laktonazėmis (PLL), atitinkamai suprojektuojant 43 ir 34 baltymus. Dvidešimt vienas GH10 ir septyni PLL dizainai yra aktyvūs, įskaitant dizainus, gautus iš šablonų su <25% sekos tapatumu. Be to, šiose šeimose keturi dizainai yra tokie pat aktyvūs kaip natūralūs fermentai. Atominis tikslumas didelio aktyvumo GH10 konstrukcijoje dar patvirtintas kristalografine analize. Taigi, kombinatorinio stuburo surinkimas ir dizainas gali būti naudojami stabiliems, aktyviems ir struktūriškai įvairiems fermentams, kurių selektyvumas ar aktyvumas pasikeitė, generuoti.

Baltymai vis dažniau naudojami fundamentiniuose ir taikomuosiuose biomedicinos tyrimuose. Tačiau daugelis baltymų yra tik nežymiai stabilūs ir gali būti išreikšti ribotais kiekiais, o tai trukdo tyrimams ir pritaikymui. Tyrimai atskleidė termodinaminius, ląstelinius ir evoliucinius principus ir mechanizmus, kuriais grindžiamas ribinis stabilumas. Augant šiam supratimui, skaičiavimo stabilumo projektavimo metodai per pastaruosius du dešimtmečius tobulėjo, pradedant nuo metodų, kurie selektyviai nagrinėjo tik kai kuriuos ribinio stabilumo aspektus. Dabartiniai metodai yra bendresni ir, derinant filogenetinę analizę su atominiu dizainu, parodė drastišką tirpumo, terminio stabilumo ir atsparumo agregacijai pagerėjimą, išlaikant pagrindinį baltymo molekulinį aktyvumą. Stabilumo dizainas atveria kelią racionaliai patobulintų fermentų, terapinių priemonių ir vakcinų inžinerijai bei baltymų projektavimo metodikos taikymui dideliems baltymams ir molekulinei veiklai, kuri praeityje pasirodė sudėtinga.

GroE chaperonino sistemą Escherichia coli sudaro GroEL ir GroES ir palengvina nuo ATP priklausomą baltymų sulankstymą in vivo ir in vitro Baltymai, kurių sekos ir struktūros labai panašios, gali skirtis priklausomai nuo GroEL, kad būtų veiksmingai sulankstytas. Vienas iš galimų, bet nepatvirtintų GroEL priklausomybės šaltinių yra nusivylimas, kai ne visos sąveikos natūralioje būsenoje yra optimizuotos energetiškai, taip sustiprinant lėtą lankstymą ir netinkamą sulankstymą. Čia kaip modelio sistemą pasirinkome sustiprintą žalią fluorescencinį baltymą ir atlikome jam atsitiktinę mutagenezę, o po to buvo tikrinami variantai, kurių in vivo sulankstomi ekranai padidino arba sumažino GroEL priklausomybę. Mes patvirtinome pakitusią šių variantų GroEL priklausomybę su lankstymo in vitro tyrimais. Stebėtina, kad mutacijos pozicijose, kurios, kaip prognozuojama, bus labai nusivylusios, koreliuoja su sumažėjusia GroEL priklausomybe. Atvirkščiai, buvo nustatyta, kad mutacijos pozicijose, kuriose yra mažas nusivylimas, koreliuoja su padidėjusia GroEL priklausomybe. Tolesnis šios išvados patvirtinimas buvo gautas parodžius, kad sustiprinto žalio fluorescencinio baltymo varianto, sukurto skaičiavimo būdu, siekiant sumažinti nusivylimą, sulankstymas iš tikrųjų mažiau priklauso nuo GroEL. Mūsų rezultatai rodo, kad vietinio nusivylimo pokyčiai taip pat turi įtakos pasiskirstymui in vivo tarp spontaniško ir chaperonino sukelto sulankstymo. Taigi minimaliai nusivylusių sekų dizainas gali sumažinti priklausomybę nuo chaperonino ir pagerinti baltymų ekspresijos lygį.

Natūralūs baltymai turi susilankstyti į stabilią konformaciją ir atlikti savo molekulinę funkciją. Iki šiol skaičiavimo projektavimas sėkmingai gamina stabilius ir atomiškai tikslius baltymus, naudojant vadinamąsias „idealias“ raukšles, kuriose gausu reguliarių antrinių struktūrų ir beveik nėra kilpų ir destabilizuojančių elementų, tokių kaip ertmės. Tačiau molekulinės funkcijos, tokios kaip surišimas ir katalizė, dažnai reikalauja neidealių savybių, įskaitant dideles ir netaisyklingas kilpas ir palaidotus polinės sąveikos tinklus, kurie išliko sudėtingi sulenkimo projektavimui. Per penkis projektavimo / eksperimento ciklus išmokome stabilių ir funkcinių antikūnų kintamų fragmentų (Fvs) projektavimo principų. Tiksliau, mes (i) naudojome sekos projektavimo apribojimus, gautus iš antikūnų kelių sekų derinimo, ir (ii) kurdami stuburą išlaikėme stabilizuojančią sąveiką, pastebėtą natūraliuose antikūnuose tarp komplementarumą lemiančių regionų (CDR) 1 ir 2 kilpų. Suprojektuoti Fv surišo savo ligandus su midnanomoliniais afinitetais ir buvo tokie pat stabilūs kaip natūralūs antikūnai, nepaisant to, kad žinduolių antikūnų gemalo linijose buvo >30 mutacijų. Be to, kristalografinė analizė parodė atominį tikslumą visoje sistemoje ir keturiuose iš šešių CDR vienoje konstrukcijoje ir atominį tikslumą visame Fv kitame. Mūsų išmokti principai yra bendri ir gali būti naudojami kuriant kitas neidealias raukšles, sukuriančias stabilius, specifinius ir tikslius antikūnus ir fermentus.

Nors stiprūs monokloniniai antikūnai prieš riciną buvo pradėti gaminti bėgant metams, klausimas, ar didėjantis antikūnų afinitetas leidžia geriau neutralizuoti toksinus, dar nebuvo iki galo išspręstas. Šio tyrimo tikslas buvo apibūdinti antikūnų afiniteto indėlį į antikūno ricino neutralizavimo potencialą. Buvo išskirtas monokloninis cHD23 antikūnas, nukreiptas į toksino B subvienetą ir trukdantis jo prisijungimui prie membraninių receptorių. Siekiant sukurti antikūnų klonus, turinčius geresnį afinitetą ricinui, buvo sukurta scFv-fago ekrano biblioteka, kurioje yra mutavusios cHD23 kintamų regionų versijos, ir išskirti klonai su geresniu ricino surišimu. Šių mutantų struktūrinis modeliavimas rodo, kad įterptos mutacijos gali padidinti antikūnų konformacinį lankstumą, taip pagerinant jo gebėjimą surišti riciną. Nors buvo nustatyta, kad atrinktuose klonuose pagerėjo ricino neutralizacija, koreliacija tarp K-D verčių ir stiprumo buvo tik nedidelė (r = 0,55). Tačiau yra teigiama koreliacija (r = 0,84) tarp afiniteto subrendusių klonų nenormalumo verčių (k(off)) ir jų gebėjimo neutralizuoti riciną. Kadangi ląstelių membranose yra nepaprastai daug galimų paviršinių ricino surišimo vietų, manoma, kad antikūnai su pagerintomis išjungimo greičio reikšmėmis labai efektyviai blokuoja toksino gebėjimą prisijungti prie tikslinių receptorių. Šiuo metu antikūnais pagrįsta terapija yra veiksmingiausias apsinuodijimo ricinu gydymas, todėl tikimasi, kad šio tyrimo rezultatai suteiks naudingos informacijos ir galimą strategiją, kaip sukurti patobulintą antikūnais pagrįstą toksino terapiją.

Allosterinis reguliavimas yra gyvų ląstelių gebėjimo pajusti maistinių medžiagų ir signalinių molekulių koncentracijos pokyčius pagrindas, tačiau gebėjimas apskaičiuoti allosterinį reguliavimą į neallosterinius baltymus buvo sunkus. Allosterinės vietos dizainą apsunkina reikalavimas koduoti to paties baltymo aktyvių ir neaktyvių konformacijų santykinį stabilumą, kai yra ir nėra ligando ir efektoriaus. Norėdami išspręsti šį iššūkį, mes panaudojome Rosetta, kad sukurtume lanksčios sunkiosios grandinės komplementarumą lemiančios 3 srities (HCDR3) stuburą, o geometrinį derinimą ir sekos optimizavimą patalpinome Zn2+ koordinavimo vietą į fluoresceiną jungiantį antikūną. Numatėme, kad dėl HCDR3 lankstumo fluoresceiną surišanti kišenė bus tinkamai sukonfigūruota tik naudojant Zn2+. Mes nustatėme, kad Zn2+ reguliavimas buvo grįžtamas ir jautrus dvivalenčių jonų tapatybei, todėl sumažėjo antikūnų stabilumas ir fluoresceino surišimo afinitetas. Fluoresceinas prisijungė daug didesniu afinitetu, kai yra Zn2+, nei jo nesant, o fluoresceino afiniteto padidėjimą beveik visiškai lėmė greitesnis fluoresceino greitis, o tai rodo, kad Zn2+ iš anksto organizavo antikūną fluoresceino surišimui. Mutacijų analizė parodė ypatingą Zn2+ reguliavimo jautrumą atominėms detalėms metalo koordinavimo vietoje ir aplink ją. Sukurtas antikūnas galėtų padėti ištirti, kaip allosterinis reguliavimas išsivystė iš neallosterinių surišančių baltymų, ir siūlo būdą, kaip sukurti molekulinius jutiklius aplinkos ir biomedicinos tikslams.

Norint padidinti iš pradžių žemą fermento katalizinį efektyvumą naudojant naują tikslinį substratą maždaug dviem dydžiais, gali prireikti tik kelių mutagenezės ir atrankos ar atrankos raundų. Tačiau vėlesni optimizavimo etapai linkę duoti mažėjantį pagerėjimo laipsnį (mažėjančią grąžą), o tai galiausiai lemia optimizavimo plokščiakalnį. Mes siekėme optimizuoti bakterinės fosfotriesterazės (PTE) katalizinį efektyvumą prieš V tipo nervus paralyžiuojančias medžiagas. Anksčiau mes pagerinome laukinio tipo PTE katalizinį efektyvumą prieš nervus paralyžiuojančią medžiagą VX 500 kartų iki katalizinio efektyvumo (k(kat)/KM) 5 x 10(6)M(-1) min(-1). ). Tačiau veiksmingai in vivo detoksikacijai reikia fermento, kurio katalizinis efektyvumas būtų > 10(7) M-1 min(-1). Čia, po aštuonių papildomų nukreiptos evoliucijos etapų ir stabilizuoto varianto skaičiavimo, sukūrėme PTE variantus, kurie detoksikuoja VX su ak(cat)/KM >= 5 x 10(7)M(-1) min(-1) ir Rusijos VX (RVX) su ak(kat)/KM >= 10(7) M-1 min(-1). Šie paskutiniai 10 kartų patobulinimai užtruko daugiausiai laiko ir daugiausiai pastangų, nes daugumoje bibliotekų patobulinimai buvo nedideli arba jų nebuvo. Besivystančio fermento stabilizavimas ir aktyvumo su skirtingais substratais išvengimas leido mums pasiekti tolesnių patobulinimų už optimizavimo plokščiakalnio ribų ir sukurti PTE variantus, kurie apskritai buvo patobulinti > 5000 kartų naudojant VX ir > 17 000 kartų naudojant RVX. Gauti variantai taip pat labai efektyviai hidrolizuoja G tipo nervus paralyžiuojančias medžiagas (GA, GB esant k(kat)/KM > 5 x 10(7) M-1 min(-1)) ir todėl gali būti plataus spektro nervų sistemos kandidatai. agento profilaktika ir gydymas po ekspozicijos naudojant mažas fermentų dozes.

Baltymų šerdies perpakavimas yra standartinis baltymų modeliavimo programinės įrangos testas. Neseniai atliktas šešių skirtingų modeliavimo programinės įrangos paketų tyrimas parodė, kad jie sėkmingiau prognozuoja šerdies šoninės grandinės konformacijas, palyginti su paviršiaus likučiais. Visa išbandyta modeliavimo programinė įranga turi daugiakomponentes energijos funkcijas, paprastai apimančias indėlį iš solvatacijos, elektrostatikos, vandenilio jungimo ir Lennard-Jones sąveikos, be statistinių terminų, pagrįstų stebimomis baltymų struktūromis. Ištyrėme, kokiu mastu supaprastinta energijos funkcija, apimanti tik stereocheminius suvaržymus ir atstumias kietosios sferos sąveikas, gali teisingai perpakuoti baltymų šerdis. Vieno likučio ir kolektyvinio perpakavimo atveju kietosios sferos modelis tiksliai apibendrina pastebėtas Ile, Leu, Phe, Thr, Trp, Tyr ir Val šoninės grandinės konformacijas. Šis rezultatas rodo, kad nėra alternatyvių, steriškai leidžiamų šerdies likučių šoninės grandinės konformacijų. Analizuojant tą patį baltymų branduolių rinkinį naudojant Rosetta programinės įrangos rinkinį, paaiškėjo, kad kietosios sferos modelis ir Rosetta vienodai gerai veikia su Ile, Leu, Phe, Thr ir Val, kietosios sferos modelis veikia geriau su Trp, o Tyr ir Rosetta veikia geriau. ant Ser. Darome išvadą, kad didelis baltymų šerdies numatymo tikslumas, gautas naudojant baltymų modeliavimo programinę įrangą ir mūsų supaprastintą kietosios sferos metodą, atspindi didelį baltymų šerdies tankį ir sterinio atstūmimo dominavimą.

Daugelis perspektyvių vakcinų nuo patogeninių virusų, bakterijų ir parazitų yra nestabilios ir negali būti pigiai pagamintos klinikiniam naudojimui. Pavyzdžiui, Plasmodium falciparum retikulocitus surišančio baltymo homologas 5 (PfRH5) yra būtinas eritrocitų invazijai, yra labai konservuotas tarp lauko izoliatų ir sukelia antikūnus, kurie neutralizuoja in vitro ir apsaugo gyvūnų modelį, todėl jis yra pagrindinis maliarijos vakcinos kandidatas.Tačiau funkcinis RH5 yra išreikštas tik eukariotinėse sistemose ir pasižymi vidutiniu temperatūros toleravimu, ribodamas jo naudingumą karštose ir mažas pajamas gaunančiose šalyse, kuriose vyrauja maliarija. Dabartiniai imunogeno stabilizavimo metodai apima kartotinį racionalaus arba pusiau nuoseklaus dizaino taikymą, atsitiktinę mutagenezę ir biocheminį apibūdinimą. Paprastai kiekvienas optimizavimo etapas šiek tiek pagerina stabilumą, todėl reikia kelių raundų. Priešingai, mes sukūrėme vieno žingsnio projektavimo strategiją, naudodami filogenetinę analizę ir Rosetta atomistinius skaičiavimus, kad sukurtume PfRH5 variantus su patobulintu įpakavimu ir paviršiaus poliškumu. Norėdami parodyti šio metodo tvirtumą, išbandėme tris PfRH5 dizainus, kurie visi parodė geresnį stabilumą, palyginti su laukiniu tipu. Geriausias, turintis 18 mutacijų, palyginti su PfRH5, išreikštas sulankstytu pavidalu bakterijose, esant >gt1 mg baltymo viename kultūros litre, ir pasižymintis 10–15 laipsnių C didesne šilumos tolerancija nei laukinio tipo, taip pat išlaikant ligandų surišimą ir imunogenines savybes, kurių negalima išskirti. iš laukinio tipo, įrodantis savo, kaip imunogeno, vertę būsimos kartos vakcinoms nuo maliarijos kraujo stadijos. Manome, kad ši efektyvi skaičiavimo stabilumo projektavimo metodika taip pat bus naudojama siekiant pagerinti kitų nepalankių vakcinų kandidatų iš naujų patogenų biofizines savybes.

Dabartiniai antikūnų struktūros prognozavimo metodai priklauso nuo sekos homologijos su žinomomis struktūromis. Nors ši strategija dažnai suteikia tikslių prognozių, modeliai gali būti stereochemiškai įtempti. Čia pateikiame visiškai automatizuotą algoritmą, vadinamą AbPredict, kuris nepaiso sekos homologijos, o vietoj to naudoja Monte Karlo žemos energijos konformacijų, sukurtų iš stuburo segmentų ir standžių kūno orientacijų, atsirandančių antikūnų molekulinėse struktūrose, paiešką. Mes nustatome atvejus, kai „AbPredict“ parenka tikslius kilpos šablonus, kurių sekos tapatumas yra tik 10%, o didžiausios sekos tapatybės šablonas iš esmės skiriasi nuo užklausos konformacijos. Atitinkamai, kai kuriais atvejais, apie kuriuos pranešta neseniai atliktame antikūnų modeliavimo vertinimo etalone, AbPredict modeliai buvo tikslesni nei bet kurio dalyvio modeliai, o modelių stereocheminė kokybė buvo nuolat aukšta. Be to, dviem aklais atvejais, kuriuos mums pateikė kristalografai prieš nustatydami struktūrą, šis metodas pasiekė <1,5 Ångstrom bendrą pagrindo tikslumą. Tikslus neįtemptų antikūnų struktūrų modeliavimas leis sukurti ir sukurti patobulintus rišiklius biomedicininiams tyrimams tiesiogiai iš sekos.

Membranos ir baltymų sąveikos energetika lemia baltymų topologiją ir struktūrą: hidrofobiškumas skatina spiralinių segmentų įterpimą į membraną, o teigiami krūviai orientuoja baltymą membranos plokštumos atžvilgiu pagal teigiamos vidaus taisyklę. Tačiau iki šiol šių indėlių kiekybinis įvertinimas buvo sunkus, o tai neleido sistemingai analizuoti membranos ir baltymų topologijos energetinio pagrindo. Neseniai sukūrėme dsT beta L metodą, kuriame naudojamas gilus sekvenavimas ir segmentų, įterptų į bakterijų plazmos membraną, atranka in vitro, siekiant nustatyti kiekvienos membranoje esančios aminorūgšties liekanos įterpimo energijos profilius, ir kiekybiškai įvertinamas hidrofobiškumo ir teigiamo poveikio įterpimas. – vidinė taisyklė. Čia pateikiame topologijos numatymo algoritmą, vadinamą TopGraph, kuris yra pagrįstas sekos paieška, kad būtų nustatyta minimali dsT beta L įterpimo energija. Vidutinė įterpimo energija, priskirta ankstesnėmis eksperimentinėmis skalėmis, buvo teigiama (nepalanki), o TopGraph priskirtas vidurkis nepertekliniame rinkinyje yra -6,9 kcal/mol. Kiekybiškai įvertindami hidrofobiškumo ir teigiamos vidaus taisyklės indėlį, taip pat pastebėjome, kad maždaug pusėje didelių membraninių baltymų poliniai segmentai įterpiami į membraną, kad citoplazmoje būtų daugiau teigiamų krūvių, o tai rodo šių dviejų energijos indėlių sąveiką. Kadangi membranoje įterptos polinės liekanos yra labai svarbios substrato surišimui ir konformaciniams pokyčiams, rezultatai rodo teigiamą vidaus taisyklę nustatant membranos ir baltymų funkcinių vietų architektūrą. Ši įžvalga gali padėti numatyti membraninių baltymų struktūrą, inžineriją ir projektavimą. „TopGraph“ galima rasti internete (topgraph.weizmann.ac.il).

Mes, baltymų inžinieriai, evoliuciją vertiname dviprasmiškai: viena vertus, evoliucija mus įkvepia daugybės biomolekulinių rišiklių, jutiklių ir katalizatorių pavyzdžių, kita vertus, šie pavyzdžiai retai kada yra gerai pritaikyti mūsų turimoms inžinerinėms užduotims. Todėl baltymų inžinieriai, siekdami sukurti naujas funkcijas, pakeitė natūralius baltymus taškais ir fragmentų mainais. Priešprieša tokioms projektavimo pastangoms, kurios dabar vykdomos vis sėkmingiau, yra visiškai atsisakyti gamtos teikiamų pradinių medžiagų ir kurti naujas baltymų funkcijas nuo nulio naudojant de novo molekulinį modeliavimą ir dizainą. Nors abiem kryptimis padaryta didelė pažanga, kai kurios baltymų projektavimo sritys vis dar nepasiekiamos. Šiuo tikslu mes pasisakome už šių dviejų strategijų sintezę: naudodamiesi projektiniais skaičiavimais, kad rekombinuotų ir optimizuotų natūralių baltymų fragmentus, galime sukurti stabilias ir dar neatrinktas struktūras, taip suteikdami prieigą prie išplėstinio konformacijų ir konformacijų repertuaro. norimas funkcijas. Siūlome, kad būsimi metodai, jungiantys filogenetinę analizę, struktūros ir sekos bioinformatiką bei atomistinį modeliavimą, gali būti sėkmingi, kai vienas iš šių metodų nepavyko.

Esant heterologinei perdėtai ekspresijai, daugelis baltymų susilanksto arba agreguojasi, todėl gaunamas mažas funkcinis derlius. Žmogaus acetilcholinesterazė (hAChE), fermentas, tarpininkaujantis sinapsiniam perdavimui, yra tipiškas žmogaus baltymo atvejis, dėl kurio reikia žinduolių sistemų funkcinei ekspresijai gauti. Sukūrėme skaičiavimo strategiją ir sukūrėme AChE variantą, turintį 51 mutaciją, kuri pagerino šerdies sandarumą, paviršiaus poliškumą ir pagrindo standumą. Šis variantas buvo išreikštas panašiai kaip 2000 kartų didesnis lygis E. coli, palyginti su laukinio tipo hAChE, ir pasižymėjo 20 laipsnių C didesniu termostabilumu, nepakeitus fermentinių savybių arba aktyviosios vietos konfigūracijos, kaip nustatyta kristalografija. Norėdami parodyti platų naudingumą, mes panašiai sukūrėme keturis kitus žmogaus ir bakterijų baltymus. Išbandę daugiausia tris vieno baltymo modelius, gavome didesnį stabilumą ir (arba) didesnę tirpaus ir aktyvaus baltymo išeigą E. coli. Mūsų algoritmas reikalauja tik 3D struktūros ir kelių dešimčių natūraliai pasitaikančių homologų sekų. Jį galima rasti adresu http://pross.weizmann.ac.il.

Per pastarąjį dešimtmetį mokslininkai padarė įdomią pažangą kurdami baltymų raukšles tik kompiuteryje ir sėkmingai sintezuodami jas laboratorijoje (1–5). Šie dizainerio baltymai eksperimente turėjo tokią pačią struktūrą kaip ir modelyje ir buvo labai stabilūs, tačiau jiems trūko svarbių struktūrinių savybių, matomų baltymų sąsajose ir fermentų aktyviose vietose. Dviejuose pranešimuose šio numerio 680 ir 687 puslapiuose Boyken ir kt. (6) ir Jacobs et al. (7) naudokite Rosetta biomolekulinio modeliavimo programinę įrangą, kad sukurtumėte baltymus, turinčius kai kurias iš šių savybių. Eksperimentai rodo, kad šios naujos konstrukcijos išlaiko didelį konstrukcijos tikslumą ir stabilumą.

Spiralę formuojančių segmentų įterpimas į membraną ir jų susiejimas lemia visų plazmos membranos baltymų struktūrą, funkciją ir ekspresijos lygius. Tačiau sistemingas ir patikimas membranos ir baltymų energijos kiekybinis įvertinimas buvo sudėtingas. Sukūrėme gilų mutacijų nuskaitymo metodą, skirtą stebėti šimtų taškinių mutacijų poveikį spiralės įterpimui ir savęs susijungimui bakterijų vidinėje membranoje. Tyrimas kiekybiškai įvertina visų natūralių aminorūgščių įterpimo energiją 27 padėtyse per membraną, atskleidžiant, kad biologinių membranų hidrofobiškumas yra žymiai didesnis nei įvertinta. Toliau kiekybiškai įvertiname teigiamo krūvio liekanų indėlį į membranos ir baltymų įterpimą citoplazmos ir membranos sąsajoje ir atskleidžiame didelius ir nenumatytus šių likučių skirtumus. Galiausiai, mes gauname išsamius mutacinius kraštovaizdžius glikoforino A ir ErbB2 onkogeno membranų srityse ir nustatome, kad įterpimas ir savęs asociacija yra stipriai susieti receptorių homodimeruose.

Išskirtas disulfido katalizatorius Quiescin sulfhidrilo oksidazė-1 (QSOX1) veikia tarpląstelinės matricos organizaciją ir yra pernelyg išreikštas įvairiose adenokarcinomose ir susijusiose stromose. Ekstraląstelinio žmogaus QSOX1 slopinimas monokloniniu antikūnu sumažino naviko ląstelių migraciją ląstelių bendros kultūros modelyje ir todėl gali turėti terapinį potencialą. Tačiau QSOX1 monokloninio antikūno rūšies specifiškumas buvo nesėkmė vertinant jo, kaip antimetastazinio agento, naudingumą in vivo, dažną antikūnų terapijos pramonės problemą. Todėl mes panaudojome struktūriškai vadovaujamą inžineriją, kad padidintume antikūnų rūšies specifiškumą, pagerindami jo afinitetą pelės QSOX1 atžvilgiu bent keturiomis eilėmis. Atnaujinto varianto kristalinė struktūra, sudaryta komplekse su pelės antigenu, atskleidė, kad antikūnas pasiekia dviejų rūšių taikymą, pakeisdamas sunkiųjų ir lengvųjų grandinių kontaktus, taip pat stambius aromatinius junginius pakeičiant lanksčiomis šoninėmis grandinėmis ir įvairiapusiais vandens tilteliais. sąveikos. Tuo pačiu metu mes pagaminome pakaitinį antikūną, nukreiptą į pelę QSOX1, kuris turi naują QSOX1 slopinimo režimą. Šis trijų QSOX1 slopinančių antikūnų rinkinys yra suderinamas su įvairiais pelių modeliais, skirtais ikiklinikiniams tyrimams ir biotechnologinėms reikmėms. Šiame tyrime pateikiame įžvalgų apie kryžminio reaktyvumo struktūrinius blokus ir nustatome sėkmingo antikūnų projektavimo ir pertvarkymo gaires.

Baltymų funkcijos skaičiavimas padarė didelę pažangą, sukuriant naujus fermentus, rišiklius, inhibitorius ir nanomedžiagas, kurių anksčiau gamtoje nebuvo matyti. Tačiau galimybė sukurti naujus baltymų pagrindus, kurie yra būtini norint kontroliuoti visus polipeptido laisvės laipsnius, tebėra svarbus iššūkis. Dauguma ankstesnių bandymų sukurti naujus stuburus apskaičiavo pagrindinę grandinę nuo nulio. Vietoj to, čia aprašome kombinatorinį stuburo ir sekos optimizavimo algoritmą, vadinamą AbDesign, kuris panaudoja daugybę antikūnų sekų ir eksperimentiškai nustatytų molekulinių struktūrų, kad sukurtų naujus antikūnų modelius, pritvirtintų juos prie tikslinių paviršių ir optimizuotų jų seką bei stuburo konformaciją, kad būtų užtikrintas didelis kiekis. stabilumas ir surišimo afinitetas. Naudojome algoritmą, kad sukurtume antikūnų dizainus, nukreiptus į tuos pačius molekulinius paviršius kaip ir devyni natūralūs, didelio afiniteto antikūnai, penkiais atvejais sąsajos sekos tapatumas yra didesnis nei 30%, o keturiais iš jų stuburo konformacija antikūnus rišančio paviršiaus šerdyje yra per 1 angstremo vidurinį kvadratinį nuokrypį nuo natūralių antikūnų. Dizainai apibendrina natūraliuose kompleksuose pastebėtus poliarinės sąveikos tinklus, o aminorūgščių šoninės grandinės standumas suprojektuotame rišamajame paviršiuje, kuris greičiausiai yra svarbus afinitetui ir specifiškumui, yra didelis, palyginti su ankstesniais projektavimo tyrimais. Suprojektuotuose anti-lizocimo antikūnuose sąsajos periferijoje esantys komplementarumą lemiantys regionai (CDR), tokie kaip L1 ir H2, pasižymi didesne stuburo konformacijos įvairove nei sąsajos šerdyje esantys CDR, ir padidina surišimo paviršiaus plotą, palyginti su natūralus antikūnas, galintis sustiprinti afinitetą ir specifiškumą.

Fonas: Bacteroides cellulosolvens celiuliozės cohesin-dockerin tipai yra priešingi. Rezultatai: Kombinuoti vienišo kohesino kristalografiniai ir skaičiavimo metodai davė struktūrinį kohesino ir dokerino komplekso modelį, kuris buvo patikrintas eksperimentiškai. Išvada: Dockerin dvigubo surišimo režimas nėra išskirtinis fermentų integracijai į celiuliozes, jis taip pat apibūdina ląstelių paviršiaus pritvirtinimą. Reikšmė: Šis kombinuotas metodas suteikia platformą, leidžiančią generuoti patikrinamas hipotezes apie didelio afiniteto kohesino ir dokerino sąveiką. Cohesin ir Dockerin sąveika organizuoja vieno iš sudėtingiausių gamtos daugiafermentinių kompleksų, celiuliozės, surinkimą. Celiuliozės gaminamos tik anaerobinių mikrobų ir tarpininkauja labai efektyviai augalų struktūrinių polisacharidų, tokių kaip celiuliozė ir hemiceliuliozė, hidrolizei. Kanoniniame celiuliozės surinkimo modelyje fermentų I tipo dokerino moduliai jungiasi su pakartotiniais pirminio pastolių I tipo kohesino moduliais. Kiekviename I tipo dokerine yra dvi labai konservuotos kohezino surišimo vietos, kurios suteikia daugiafermentiniam kompleksui ketvirtinio lankstumo. Pastoliai taip pat turi II tipo dokeriną, kuris pritvirtina visą kompleksą prie ląstelės paviršiaus, surišdamas II tipo inkaravimo pastolių kohesinus. Tačiau Bacteroides cellulosolvens kohesino-dokerino tipų organizavimas yra atvirkštinis, todėl II tipo kohesino-dokerino poros integruoja fermentus į pirminį pastolį, o I tipo moduliai tarpininkauja celiuliozės prijungimui prie tvirtinimo pastolių. Čia pateikiame I tipo kohesino kristalinę struktūrą iš B. cellulosolvens, tvirtinančio pastolius ScaB iki 1,84 angstremo skiriamosios gebos. Struktūra primena kitus I tipo kohesinus, o numanoma dokerino surišimo vieta, kurios centras yra 3, 5 ir 6 -sruogose, greičiausiai bus konservuota kituose B. cellulosolvens I tipo kohezinuose. Kombinuoti skaičiavimo modeliavimo, mutagenezės ir afinitetu pagrįsti surišimo tyrimai atskleidė panašius vandenilio jungčių tinklus tarp numanomų Ser/Asp atpažinimo likučių dokerine 11/12 ir 45/46 padėtyse, o tai rodo, kad dvigubo surišimo režimas nėra išskirtinis fermentų integravimas į pirmines celiuliozes, bet taip pat gali apibūdinti policeliuliozės surinkimą ir ląstelių paviršiaus pritvirtinimą. Šis bendras metodas gali suteikti vertingos struktūrinės informacijos apie kohesino ir dokerino sąsają, o ne galutinę kristalų struktūrą.

Autoimuninio reguliatoriaus (AIRE) genas yra labai svarbus nustatant centrinę imunologinę toleranciją ir užkertant kelią autoimunitei. AIRE mutacijos sukelia retą autosominę-recesinę ligą – 1 tipo autoimuninį poliendokrininį sindromą (APS-1), pasižymintį kelių organų autoimunitetu. Mes nustatėme kelis atvejus ir šeimas su monoalelinėmis mutacijomis pirmajame AIRE augalo homeodomeno (PHD1) cinko piršte, kuris po dominuojančio paveldėjimo, kuriam paprastai būdingas vėlesnis pasireiškimas, švelnesni fenotipai ir sumažėjęs įsiskverbimas, palyginti su klasikiniu APS-1. Šios missense PHD1 mutacijos dominuojančiai neigiamai slopino laukinio tipo AIRE skatinamą genų ekspresiją, skirtingai nei CARD arba sutrumpinti AIRE mutantai, kuriems trūko tokio dominuojančio pajėgumo. Exome masyvo analizė atskleidė, kad PHD1 dominuojantys mutantai buvo rasta gana dažnai (>0,0008) mišriose populiacijose. Mūsų rezultatai suteikia supratimo apie AIRE molekulinį poveikį ir parodo, kad ligas sukeliančios mutacijos AIRE lokuse yra dažnesnės, nei buvo įvertinta anksčiau, ir sukelia įvairesnių autoimuninių fenotipų.

Vykdydamos savo veiklą, biologinės makromolekulės subalansuoja įvairius fizinius požymius, tokius kaip stabilumas, sąveikos afinitetas ir selektyvumas. Tai, kaip tokie dažnai priešingi bruožai yra užkoduoti makromolekulinėje sistemoje, yra labai svarbūs mūsų supratimui apie evoliucijos procesus ir gebėjimą kurti naujas molekules su norimomis funkcijomis. Pateikiame modeliavimo modeliavimo apribojimo sistemą, kad būtų subalansuotos skirtingos fizinės savybės. Kiekvienas požymis yra vaizduojamas norimos būsenos pusiausvyros trupmeniniu užimtumu, palyginti su jo alternatyvomis, pradedant nuo jokio iki visiško užimtumo, o skirtingi bruožai sujungiami naudojant Būlio operatorius, kad būtų sukurta „neaiškios“ logikos kalba, skirta koduoti bet kokį požymių derinį. Kitame darbe pristatėme naują kombinatorinį pagrindo projektavimo algoritmą AbDesign, kuriame neaiškios logikos sistema buvo naudojama optimizuoti baltymų stuburus ir sekas tiek stabilumui, tiek surišimo afinitetui antikūnų projektavimo modeliavime. Dabar mes išplečiame šią sistemą ir nustatome, kad neaiškios logikos projektavimo modeliavimas atkuria gamtoje matomus sekos ir struktūros projektavimo principus, kurie yra išskirtinio specifiškumo ir, kita vertus, daugiaspecifiškumo pagrindas. Neaiškios logikos kalba yra plačiai taikoma ir gali padėti apibrėžti natūralių biomolekulinių sistemų toleruojamų ir naudingų mutacijų erdvę ir sukurti dirbtines molekules, kurios koduoja sudėtingas charakteristikas. (C) 2014 MRC Molekulinės biologijos laboratorija. Išleido Elsevier Ltd.


Nuorodos

Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R. & amp Farokhzad, O. C. Vėžio nanomedicina: pažanga, iššūkiai ir galimybės. Nat. Kunigas Vėžys 17, 20 (2016).

Chen, H., Zhang, W., Zhu, G., Xie, J. ir Chen, X. Permąstyti vėžio nanotheranostiką. Nat. Kunigas Mater. 2, 17024 (2017).

Douglas, S. M., Bachelet, I. & Church, G. M. Loginis nanorobotas, skirtas tiksliniam molekulinių naudingųjų krovinių transportavimui. Mokslas 335, 831–834 (2012).

Anselmo, A. C. & Mitragotri, S. Nanodalelės klinikoje: atnaujinimas. Bioeng. Vertimas Med. 4, e10143 (2019).

Zhao, Z., Ukidve, A., Kim, J. & Mitragotri, S. Tikslinės strategijos audinių specifinių vaistų pristatymui. Ląstelė 181, 151–167 (2020).

Cheng, Z., Al Zaki, A., Hui, J. Z., Muzykantov, V. R. & Tsourkas, A. Daugiafunkcinės nanodalelės: taikymo ir vaizdo gavimo galimybių pridėjimo kaina ir nauda. Mokslas 338, 903 (2012).

Datta, L. P., Manchineella, S. ir Govindaraju, T. Biomolekulių kilmės biomedžiagos. Biomedžiagos 230, 119633 (2020).

Liu, K., Jiang, X. & Hunziker, P. Angliavandenių pagrindu sukurtos amfifilinės nano tiekimo sistemos vėžio terapijai. Nano skalė 8, 16091–16156 (2016).

Habibi, N., Kamaly, N., Memic, A. ir Shafiee, H. Savarankiškai surinktos peptidų pagrindu pagamintos nanostruktūros: išmaniosios nanomedžiagos, skirtos tiksliniam vaistų tiekimui. Nano Šiandien 11, 41–60 (2016).

Kakkar, A., Traverso, G., Farokhzad, O. C., Weissleder, R. & amp Langer, R. Makromolekulinio sudėtingumo raida vaistų tiekimo sistemose. Nat. Chem. 1, 63 (2017).

Seeman, N. C. & Sleiman, H. F. DNR nanotechnologija. Nat. kun. Mater. 3, 17068 (2018).

Lammers, T. ir kt. Vėžio nanomedicina: ar tai yra mūsų tikslas? Nat. kun. Mater. 1, 16069 (2016).

Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J. & Corrie, S. R. Nanodalelių pagrindu pagaminti vaistai: iki šiol FDA patvirtintų medžiagų ir klinikinių tyrimų apžvalga. Pharm. Res. 33, 2373–2387 (2016).

Hanahan, D. & Weinberg, R. A. Vėžio požymiai: kita karta. Ląstelė 144, 646–674 (2011).

Valkenburg, K. C., de Groot, A. E. & Pienta, K. J. Nukreipimas į naviko stromą siekiant pagerinti vėžio terapiją. Nat. Kunigas Clin. Oncol. 15, 366–381 (2018).

Ji, T. ir kt.Transformuojami peptidų nanonešikliai, skirti greitam vaistų išsiskyrimui ir veiksmingai vėžio terapijai aktyvinant su vėžiu susijusį fibroblastą. Angew. Chem. Tarpt. Red. 55, 1050–1055 (2016).

Han, X. ir kt. Kasos desmoplazijos panaikinimas perauklėjant žvaigždžių ląsteles naviko mikroaplinkos aktyvuota nanosistema. Nat. Komun. 9, 3390 (2018).

Li, S. ir kt. Naviko infarkto terapijos ir chemoterapijos derinys kartu su doksorubicinu ir trombinu, kapsuliuotu į naviką nukreiptose nanodalelėse. Nat. Biomed. inž. 4, 732–742 (2020).

Metselaar, J. M. & Lammers, T. Nanomedicinos klinikinio vertimo iššūkiai. Narkotikų Deliv. Vertimas Res. 10, 721–725 (2020).

Nel, A. E. ir kt. Suprasti biofizikinę ir cheminę sąveiką nano ir biologinėje sąsajoje. Nat. Mater. 8, 543–557 (2009).

Cai, R. ir Chen, C. Karūna ir skeptras: vainikinio baltymo vaidmuo nanomedicinoje. Adv. Mater. 31, 1805740 (2019).

Banerjee, I., Pangule, R. C. & Kane, R. S. Antifouling coatings: naujausi pokyčiai projektuojant paviršius, kurie neleidžia užsiteršti baltymais, bakterijomis ir jūrų organizmais. Adv. Mater. 23, 690–718 (2011).

Chelmowski, R. ir kt. Peptidų pagrindu pagaminti SAM, kurie priešinasi baltymų adsorbcijai. J. Am. Chem. Soc. 130, 14952–14953 (2008).

Tonigold, M. ir kt. Išankstinė antikūnų adsorbcija leidžia nukreipti nanonešiklius, nepaisant biomolekulinės vainiko. Nat. Nanotechnologija. 13, 862–869 (2018).

Hamad-Schifferli, K. Baltymų vainikėlių naujų savybių panaudojimas: atsirandantys pritaikymai nanomedicinoje. Nanomedicina 10, 1663–1674 (2015).

Setten, R. L., Rossi, J. J. & Han, S.-P. RNRi pagrįstos terapijos dabartinė būklė ir ateities kryptys. Nat. Drug Discov. 18, 421–446 (2019).

Zhang, Z. ir kt. Į smegenis nukreiptas vaistų tiekimas, manipuliuojant baltymų vainiko funkcijomis. Nat. Komun. 10, 3561 (2019).

Mirshafiee, V., Kim, R., Park, S., Mahmoudi, M. & Kraft, M. L. Baltymų išankstinio dangos poveikis baltymų vainiko kompozicijai ir nanodalelių įsisavinimui ląstelėse. Biomedžiagos 75, 295–304 (2016).

Owens, D. E. ir Peppas, N. A. Opsonizacija, biologinis pasiskirstymas ir polimerinių nanodalelių farmakokinetika. Tarpt. J. Pharm. 307, 93–102 (2006).

Zhang, P., Sun, F., Liu, S. & Jiang, S. Anti-PEG antikūnai klinikoje: dabartinės problemos ir ne tik PEGilinimas. J. Kontrolė. Rel. 244, 184–193 (2016).

Hu, C.-M. J. ir kt. Eritrocitų membranomis užmaskuotos polimerinės nanodalelės kaip biomimetinė tiekimo platforma. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 108, 10980 (2011).

Rodriguez, P. L. ir kt. Minimalūs „savarankiški“ peptidai, kurie slopina fagocitų klirensą ir pagerina nanodalelių tiekimą. Mokslas 339, 971 (2013).

Kim, J. ir kt. Į receptorius nukreiptų vaistų nanonešėjų dengimas kartu su antifagocitinėmis dalimis padidina specifinį audinių įsisavinimą, palyginti su nespecifiniu fagocitiniu klirensu. Biomedžiagos 147, 14–25 (2017).

Kang, T. ir kt. Nanodalelės, padengtos neutrofilų membranomis, gali veiksmingai gydyti vėžio metastazes. ACS nano 11, 1397–1411 (2017).

Cheng, Q. ir kt. Atrankinio organo taikymo (SORT) nanodalelės, skirtos specifiniam audinių mRNR tiekimui ir CRISPR-Cas geno redagavimui. Nat. Nanotechnologija. 15, 313–320 (2020).

Blanco, E., Shen, H. ir Ferrari, M. Nanodalelių projektavimo principai siekiant įveikti biologines kliūtis vaistų tiekimui. Nat. Biotechnol. 33, 941 (2015).

Nichols, J. W. & Bae, Y. H. EPR: įrodymai ir klaidingumas. J. Kontrolė. Rel. 190, 451–464 (2014).

Nakamura, H., Jun, F. ir Maeda, H. Naujos kartos makromolekulinių vaistų kūrimas remiantis EPR efektu: iššūkiai ir spąstai. Eksperto nuomonė. Narkotikų Deliv. 12, 53–64 (2015).

Wilhelm, S. ir kt. Nanodalelių patekimo į navikus analizė. Nat. kun. Mater. 1, 16014 (2016).

Li, S. ir kt. Nanodalelių sukeltas vietinis su naviku susijusių trombocitų išeikvojimas sutrikdo kraujagyslių barjerus ir padidina vaistų kaupimąsi navikuose. Nat. Biomed. inž. 1, 667–679 (2017).

Milleris, M. A. ir kt. Terapinio nanomedicinos veiksmingumo numatymas naudojant magnetinio rezonanso vaizdavimo nanodaleles. Sci. Vertimas Med. 7, 314ra183 (2015).

Shah, S., Liu, Y., Hu, W. & Gao, J. Nuo dalelių formos priklausomos dinamikos modeliavimas nanomedicinoje. J. Nanosci. Nanotechnologija. 11, 919–928 (2011).

Liang, Q. ir kt. Iš naviko ląstelių gautų mikrodalelių minkštumas reguliuoja jų vaistų pristatymo efektyvumą. Nat. Biomed. inž. 3, 729–740 (2019).

Palomba, R. ir kt. Biomimetiniai nešikliai, imituojantys leukocitų plazmos membraną, kad padidintų naviko kraujagyslių pralaidumą. Sci. Rep. 6, 34422 (2016).

Sindhwani, S. ir kt. Nanodalelių patekimas į kietus navikus. Nat. Mater. 19, 566–575 (2020).

Liu, X., Jiang, J. & Meng, H. Transcitozė – veiksminga nukreipimo strategija, kuri papildo „EPR efektą“, skirtą kasos vėžio nanovaistų pristatymui. Teranostika 9, 8018–8025 (2019).

Pandit, S., Dutta, D. & Nie, S. Aktyvi transcitozė ir naujos vėžio nanomedicinos galimybės. Nat. Mater. 19, 478–480 (2020).

Guo, Y. ir kt. Eritrocitų membrana apgaubtos polimerinės nanodalelės kaip nanovakcina, skirta priešnavikiniam imunitetui nuo melanomos sukelti. ACS nano 9, 6918–6933 (2015).

Xu, J. ir kt. Pakeitus naviko kamieną per burną nukreiptomis nanodalelėmis, pasiekiamas veiksmingas gaubtinės žarnos vėžio gydymas. Biomedžiagos 216, 119247 (2019).

Shields, C. W. ir kt. Ląstelinės kuprinės makrofagų imunoterapijai. Sci. Adv. 6, eaaz6579 (2020).

Ngambenjawong, C., Gustafson, H. H. & Pun, S. H. Su naviku susijusių makrofagų (TAM) terapijos pažanga. Adv. Narkotikų Deliv. Rev. 114, 206–221 (2017).

Dowdy, S. F. Ląstelių barjerų įveikimas RNR terapijai. Nat. Biotechnol. 35, 222–229 (2017).

Thambi, T., Phan, V. H. G. & Lee, D. S. Stimuliams jautrūs injekciniai hidrogeliai, kurių pagrindą sudaro polisacharidai, ir jų pritaikymas biomedicinoje. Macromol. Greitoji bendrija. 37, 1881–1896 (2016).

Lin, N., Huang, J. ir Dufresne, A. Polisacharidinių nanokristalų paruošimas, savybės ir taikymas pažangiose funkcinėse nanomedžiagose: apžvalga. Nano skalė 4, 3274–3294 (2012).

Hu, H. ir kt. Į redoksą reaguojantys polikationo funkcionalizuoti medvilnės celiuliozės nanokristalai efektyviam vėžio gydymui. ACS App. Mater. Sąsajos 7, 8942–8951 (2015).

Swierczewska, M., Han, H. S., Kim, K., Park, J. H. & Lee, S. Polisacharidų pagrindu pagamintos nanodalelės, skirtos terapinei nanomedicinai. Adv. Narkotikų Deliv. Rev. 99, 70–84 (2016).

Butt, A. M. ir kt. Doksorubicino ir siRNR kodinis pristatymas naudojant chitozanu dengtus pH reaguojančius mišrius micelinius polipleksus, kad būtų pagerinta vėžio terapija keliems vaistams atspariems navikams. Mol. Pharm. 13, 4179–4190 (2016).

Shi, G.-N. ir kt. Sustiprintas priešnavikinis imunitetas, nukreipiant į dendritines ląsteles su naviko ląstelių lizatu pakrauta chitozano nanodalelių vakcina. Biomedžiagos 113, 191–202 (2017).

Thambi, T. ir kt. Biologiškai redukuojamos karboksimetildekstrano nanodalelės, skirtos į naviką nukreiptam vaistui tiekti. Adv. Sveikatos c. Mater. 3, 1829–1838 (2014).

Han, H. S. ir kt. Biologiškai redukuojamos kryžminės hialurono rūgšties nanodalelės, skirtos į naviką nukreiptam vaistui tiekti. Biomakromolekulės 16, 447–456 (2015).

Wang, X. ir kt. Amfifilinis karboksimetilchitozano-kvercetino konjugatas, turintis P-gp slopinančių savybių, skirtas paklitakselio tiekimui per burną. Biomedžiagos 35, 7654–7665 (2014).

Schmidt, K. T. ir kt. NLG207 (anksčiau CRLX101) nanodalelių surišto ir išleisto kamptotecino matavimas žmogaus plazmoje. J. Pharm. Biomed. Anal. 181, 113073 (2020).

Choi, K. Y. ir kt. Universali RNR trukdžių nanoplatforma, skirta sisteminiam RNR tiekimui. ACS nano 8, 4559–4570 (2014).

Lallana, E. ir kt. Chitozano / hialurono rūgšties nanodalelės: racionalus RNR pristatymo dizainas. Mol. Pharm. 14, 2422–2436 (2017).

Kim, T. ir kt. Nanodalelių rašto daugiasluoksnės chitozano kapsulės, skirtos oligonukleotidų įvedimui per burną. ACS Biomater. Sci. inž. 4, 4163–4173 (2018).

Wu, L. ir kt. Apžvalga apie fukoidano vystymąsi priešnavikinėje veikloje: pažanga ir iššūkiai. Angliavandeniai. Polym. 154, 96–111 (2016).

Shamay, Y. ir kt. P-selektinas yra nanoterapinis pristatymo tikslas naviko mikroaplinkoje. Sci. Vertimas Med. 8, 345ra87 (2016).

Juenet, M. ir kt. Trombolitinė terapija, pagrįsta fukoidanu funkcionalizuotomis polimero nanodalelėmis, nukreiptomis į P-selektiną. Biomedžiagos 156, 204–216 (2018).

Otterlei, M. ir kt. Citokinų gamybos indukcija iš žmogaus monocitų, stimuliuojamų alginatu. J. Imunother. 10, 286–291 (1991).

Jani, M. S., Veetil, A. T. & Krishnan, Y. Tiksli imunomoduliacija sintetinių nukleino rūgščių technologijomis. Nat. kun. Mater. 4, 451–458 (2019).

Zhao, Y. ir kt. Nanogamyba, pagrįsta DNR nanotechnologijomis. Nano Šiandien 26, 123–148 (2019).

Seeman, N. C. Nukleino rūgščių sandūros ir gardelės. J. Theor. Biol. 99, 237–247 (1982).

Guo, P., Zhang, C., Chen, C., Garver, K. ir Trottier, M. Fago phi29 pRNR sąveika su RNR, kad susidarytų heksamerinis kompleksas viruso DNR transportavimui. Mol. Ląstelė 2, 149–155 (1998).

Guo, P. Besiformuojanti RNR nanotechnologijų sritis. Nat. Nanotechnologija. 5, 833–842 (2010).

Xu, C. ir kt. Palankus biologinis pasiskirstymas, specifinis taikymas ir sąlyginis endosominis RNR nanodalelių pabėgimas vėžio terapijoje. Cancer Lett. 414, 57–70 (2018).

Jasinski, D., Haque, F., Binzel, D. W. ir Guo, P. Naujos RNR nanotechnologijos srities pažanga. ACS nano 11, 1142–1164 (2017).

Watts, J. K., Deleavey, G. F. ir Damha, M. J. Chemiškai modifikuota siRNR: įrankiai ir programos. Narkotikų diskas. Šiandien 13, 842–855 (2008).

Piao, X., Xia, X., Mao, J. & Bong, D. Peptidų ligavimas ir RNR skilimas per abiotinio šablono sąsają. J. Am. Chem. Soc. 137, 3751–3754 (2015).

Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A. & Seeman, N. C. Dviejų dimensijų DNR kristalų projektavimas ir savaiminis surinkimas. Gamta 394, 539–544 (1998).

Rothmund, P. W. DNR lankstymas, siekiant sukurti nanoskalės formas ir raštus. Gamta 440, 297–302 (2006).

Wei, B., Dai, M. & Yin, P. Sudėtingos formos, savarankiškai surinktos iš vienos grandinės DNR plytelių. Gamta 485, 623–626 (2012).

Ali, M. M. ir kt. Riedėjimo rato stiprinimas: universalus cheminės biologijos, medžiagų mokslo ir medicinos įrankis. Chem. Soc. Rev. 43, 3324–3341 (2014).

Wang, C., Sun, W., Wright, G., Wang, A. Z. & amp Gu, Z. Uždegimo sukelta vėžio imunoterapija, naudojant užprogramuotą CpG ir anti-PD1 antikūnų pristatymą. Adv. Mater. 28, 8912–8920 (2016).

Ramezani, H. & amp Dietz, H. Statybos mašinos su DNR molekulėmis. Nat. Kunigas Genet. 21, 5–26 (2020).

Wang, P., Ko, S. H., Tian, ​​C., Hao, C. & amp Mao, C. RNR-DNR hibridinis origami: ilgos RNR vienos grandinės sulankstymas į sudėtingas nanostruktūras, naudojant trumpas DNR pagalbines grandines. Chem. Komun. 49, 5462–5464 (2013).

Zhou, J. & Rossi, J. Aptamers kaip tikslinės terapijos: dabartinis potencialas ir iššūkiai. Nat. Drug Discov. 16, 181–202 (2017).

Li, L. ir kt. Nukleino rūgščių aptameriai molekulinei diagnostikai ir terapijai: pažanga ir perspektyvos. Angew. Chem. Tarpt. Red. https://doi.org/10.1002/anie.202003563 (2020).

Ren, K. ir kt. DNR dvigubo užrakto ir rakto strategija, skirta specifiniam ląstelių potipiui siRNR pristatyti. Nat. Komun. 7, 13580 (2016).

Ma, W. ir kt. Išmanusis DNR nanorobotas su in vitro sustiprintu baltymų lizosominiu HER2 skaidymu. Nano Lett. 19, 4505–4517 (2019).

Jiang, D. ir kt. Daugiarankės tetraedrinės DNR nanostruktūros, skirtos nukreipti į naviką, dvigubo modalumo in vivo vaizdavimui. ACS App. Mater. Sąsajos 8, 4378–4384 (2016).

Lee, H. ir kt. Molekuliškai surinktos nukleorūgščių nanodalelės, skirtos tiksliniam siRNR tiekimui in vivo. Nat. Nanotechnologija. 7, 389–393 (2012).

Zhang, Q. ir kt. DNR origami kaip in vivo vaistų tiekimo priemonė vėžio gydymui. ACS nano 8, 6633–6643 (2014).

Yang, Y. ir kt. G-kvadruplekso pagrindu pagaminti nanoskalės koordinavimo polimerai, skirti moduliuoti naviko hipoksiją ir pasiekti branduolinį vaistų tiekimą, kad būtų pagerinta fotodinaminė terapija. Nano Lett. 18, 6867–6875 (2018).

Veetil, A. T. ir kt. Į ląsteles nukreipiamos DNR nanokapsulės, skirtos erdviniam laiko tarpsniui išlaisvinti narvuose esančias bioaktyvias mažas molekules. Nat. Nanotechnologija. 12, 1183–1189 (2017).

Bujold, K. E., Hsu, J. C. C. & Sleiman, H. F. Optimizuoti DNR „nanolagaminai“, skirti siRNR inkapsuliavimui ir sąlyginiam išleidimui. J. Am. Chem. Soc. 138, 14030–14038 (2016).

Ranallo, S., Prevost-Tremblay, C., Idili, A., Vallee-Belisle, A. & Ricci, F. Antikūnais veikiamas nukleino rūgščių išsiskyrimas naudojant DNR nanomašiną. Nat. Komun. 8, 15150 (2017).

Amir, Y. ir kt. Universalus skaičiavimas naudojant DNR origami robotus gyvame gyvūne. Nat. Nanotechnologija. 9, 353–357 (2014).

Arnon, S. ir kt. Minties valdomi nanoskalės robotai gyvame šeimininke. PLoS ONE 11, e0161227 (2016).

Li, S. ir kt. DNR nanorobotas veikia kaip vėžio gydymo priemonė, reaguodama į molekulinį trigerį in vivo. Nat. Biotechnol. 36, 258–264 (2018).

Ma, P. Q., Huang, Q., Li, H. D., Yin, B. C. & amp Ye, B. C. Daugiamašinis ryšio tinklas, imituojantis adaptyvųjį imuninį atsaką. J. Am. Chem. Soc. 142, 3851–3861 (2020).

Kobori, S., Nomura, Y. & amp Yokobayashi, Y. Savarankiška RNR nanomašina, varoma metastabilios struktūros. Nucleic Acids Res. 47, 6007–6014 (2019).

Agrahari, V. ir kt. Pažangūs mikro-/nanorobotai kaip vaistų ir ląstelių nešiklio prietaisai, skirti biomedicinos terapijos pažangai: perspektyvios plėtros galimybės ir transliacijos iššūkiai. Biomedžiagos 260, 120163 (2020).

Wu, Z., Chen, Y., Mukasa, D., Pak, O. S. & Gao, W. Medicininiai mikro/nanorobotai sudėtingose ​​​​terpėse. Chem. Soc. Rev. 49, 8088–8112 (2020).

Hong, E. ir kt. Struktūra ir sudėtis apibrėžia nukleorūgščių nanodalelių imuninį atpažinimą. Nano Lett. 18, 4309–4321 (2018).

Pardi, N., Hogan, M. J., Porter, F. W. & Weissman, D. mRNR vakcinos – nauja vakcinologijos era. Nat. Drug Discov. 17, 261–279 (2018).

Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S. & amp DeRosa, F. MRNR vakcinų pažadas: biotechnologijų ir pramonės perspektyva. NPJ vakcinos 5, 11 (2020).

Jeyanathan, M. ir kt. Imunologiniai aspektai, susiję su COVID-19 vakcinos strategijomis. Nat. Rev. Immunol. 20, 615–632 (2020).

Keller, A. & Linko, V. DNR nanostruktūrų iššūkiai ir perspektyvos biomedicinoje. Angew. Chem. Tarpt. Red. 59, 15818–15833 (2020).

Afonin, K. A. ir kt. RNR trukdžių su RNR-RNR, RNR-DNR ir DNR-RNR nanodalelėmis paleidimas. ACS nano 9, 251–259 (2015).

Guo, S. ir kt. Nuo dydžio, formos ir sekos priklausomas RNR nanodalelių imunogeniškumas. Mol. Ten. Nukleino rūgštys 9, 399–408 (2017).

Halman, J. R. ir kt. Funkciškai tarpusavyje susijusios formos keičiančios nanodalelės su valdomomis savybėmis. Nucleic Acids Res. 45, 2210–2220 (2017).

Guo, S. ir kt. Itin termiškai stabilios RNR nanodalelės, skirtos paklitakselio tirpinimui ir didelio našumo įkrovimui krūties vėžio gydymui. Nat. Komun. 11, 972 (2020).

Hyde, J. L. ir kt. Viruso RNR struktūrinis elementas pakeičia šeimininko nesąžiningos RNR atpažinimą. Mokslas 343, 783–787 (2014).

Rackley, L. ir kt. RNR skaidulos kaip optimizuoti nanokarkasai siRNR koordinavimui ir sumažintam imunologiniam atpažinimui. Adv. Funkcija. Mater. 28, 1805959 (2018).

Liu, J. ir kt. Pritaikyta DNR nanoplatforma, skirta sinergetinei RNRi / chemoterapijai daugeliui vaistų atsparių navikų. Angew. Chem. Tarpt. Red. 57, 15486–15490 (2018).

Surana, S., Shenoy, A. R. & Krishnan, Y. DNR nanoįrenginių projektavimas, suderinamas su aukštesniųjų organizmų imunine sistema. Nat. Nanotechnologija. 10, 741–747 (2015).

Johnsonas, M. B. ir kt. Programuojami nukleino rūgščių daugiakampiai su kontroliuojamomis neuroimunomoduliacinėmis savybėmis nuspėjamajam QSAR modeliavimui. Mažas 13, 1701255 (2017).

Yamankurt, G. ir kt. Nanomedicinos dizaino erdvės tyrinėjimas naudojant didelio našumo patikrą ir mašininį mokymąsi. Nat. Biomed. inž. 3, 318–327 (2019).

Kroll, A. V. ir kt. Biomimetinės nanodalelių vakcinos vėžio gydymui. Adv. Biosyst. 3, 1800219 (2019).

Klinman, D. M. CpG oligodeoksinukleotidų imunoterapinis naudojimas. Nat. Rev. Immunol. 4, 249–258 (2004).

Khisamutdinovas, E. F. ir kt. Įgimto imuniteto imunomoduliacijos stiprinimas keičiant formą tarp RNR trikampių, kvadratinių ir penkiakampių nanodalelių. Nucleic Acids Res. 42, 9996–10004 (2014).

Liu, X. ir kt. DNR nanostruktūros platforma, skirta kryptingam sintetinių vakcinų surinkimui. Nano Lett. 12, 4254–4259 (2012).

Li, J. ir kt. Savarankiškai surinktos daugiavalentės DNR nanostruktūros, skirtos neinvaziniam imunostimuliuojančių CpG oligonukleotidų tiekimui į ląstelę. ACS nano 5, 8783–8789 (2011).

Goldberg, M. S. Vėžio imunoterapijos tobulinimas naudojant nanotechnologijas. Nat. Kunigas Vėžys 19, 587–602 (2019).

Wang, S. ir kt. Racionali vakcinacija su sferinėmis nukleino rūgštimis. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 116, 10473–10481 (2019).

Umeki, Y. ir kt. Stipraus priešnavikinio imuniteto sukėlimas ilgalaikiu katijoninio antigeno išsiskyrimu iš DNR hidrogelio, turinčio adjuvantinį aktyvumą. Adv. Funkcija. Mater. 25, 5758–5767 (2015).

Zhu, G. ir kt. DNR ir RNR nanokapsulių susipynimas, užpildytas naviko neoantigenais, kaip sinergetinės nanovakcinos vėžio imunoterapijai. Nat. Komun. 8, 1482 (2017).

Santulli-Marotto, S., Nair, S. K., Rusconi, C., Sullenger, B. & Gilboa, E. Daugiavalenčiai RNR aptameriai, kurie slopina CTLA-4 ir stiprina naviko imunitetą. Cancer Res. 63, 7483–7489 (2003).

Devaraj, SGT, Rao, LGL, Zu, Y., Chang, J. & Iyer, SP DNR aptameris prieš užprogramuotą ląstelių mirtį-1 (anti-PD1-apt) sukelia stiprų anti-leukeminį aktyvumą in vitro ir in vivo humanizuotas NSG pelės su mieloidinės leukemijos ksenografais. Kraujas 130, 1373 (2017).

Praetorius, F. ir kt. Biotechnologinė masinė DNR origami gamyba. Gamta 552, 84–87 (2017).

Li, M. ir kt. RNR nanostruktūrų gamyba in vivo per užprogramuotą vienos grandinės RNR lankstymą. Nat. Komun. 9, 2196 (2018).

Bae, W., Kocabey, S. ir Liedl, T. DNR nanostruktūros in vitro, in vivo ir ant membranų. Nano Šiandien 26, 98–107 (2019).

Gerling, T., Kube, M., Kick, B. & Dietz, H. Sequence-programable kovalentinis suprojektuotų DNR mazgų ryšys. Sci. Adv. 4, eaau1157 (2018).

Anastassacos, F. M., Zhao, Z., Zeng, Y. & amp Shih, W. M. Glutaraldehido kryžminis susiejimas iš oligolizinų, dengiančių DNR origami, labai sumažina jautrumą nukleazės skilimui. J. Am. Chem. Soc. 142, 3311–3315 (2020).

Kim, Y. ir Yin, P. DNR nanostruktūrų biologiškai suderinamo stabilumo didinimas naudojant dendritinius oligonukleotidus ir plytų motyvus. Angew. Chem. Tarpt. Red. 59, 700–703 (2020).

Perrault, S. D. ir Shih, W. M. 3D DNR nano oktaedro lipidų membrana. Metodai Mol. Biol. 1500, 165–184 (2017).

Wiraja, C. ir kt. Pagrindo nukleorūgštys kaip programuojamas nešiklis transderminiam vaistų tiekimui. Nat. Komun. 10, 1147 (2019).

Benson, E. ir kt. Daugiakampių tinklų DNR atvaizdavimas nanoskalėje. Gamta 523, 441–444 (2015).

Veneziano, R. ir kt. Dizainerių nanoskalės DNR rinkiniai, programuojami iš viršaus į apačią. Mokslas 352, 1534 (2016).

De Santis, E. & Ryadnov, M. G. Peptidų savaiminis surinkimas nanomedžiagoms: senas naujas vaikas ant bloko. Chem. Soc. Rev. 44, 8288–8300 (2015).

Qin, H., Ding, Y., Mujeeb, A., Zhao, Y. & Nie, G. Naviko mikroaplinkos nukreipimas ir reaguojančios peptidų pagrindu pagamintos nanoformulacijos, skirtos geresnei naviko terapijai. Mol. Pharm. 92, 219–231 (2017).

Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I. ir Stephenson, R. J. Naujausi savarankiškai surinktų peptidų pasiekimai: įtaka tiksliniam vaistų tiekimui ir vakcinų inžinerijai. Adv. Narkotikų Deliv. Rev. 110-111, 169–187 (2017).

Qi, G.-B., Gao, Y.-J., Wang, L. & Wang, H. Savarankiškai surinktos peptidų pagrindu pagamintos nanomedžiagos, skirtos biomedicininiam vaizdavimui ir terapijai. Adv. Mater. 30, 1703444 (2018).

Liang, C. ir kt. Fermentų padedamas peptidų lankstymas, surinkimas ir priešvėžinės savybės. Nano skalė 9, 11987–11993 (2017).

Beesley, J. L. ir kt. Modifikuoti savarankiškai surinktus peptidinius narvus, kad būtų galima kontroliuoti internalizavimą į žinduolių ląsteles. Nano Lett. 18, 5933–5937 (2018).

Ueda, M. ir kt. Užsandarinti didelio formato santykio tuščiaviduriai nanovamzdeliai, apimantys vaistą nuo vėžio: torpedos formos peptidinės nanokapsulės. ACS nano 13, 305–312 (2019).

Wyatt, L. C. ir kt. pHLIP šeimos peptidai, skirti tiksliniam tarpląsteliniam ir ekstraląsteliniam krovinių molekulių pristatymui į navikus. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 115, E2811–E2818 (2018).

Zhang, D. ir kt. Nanopluoštų susidarymas in situ iš purpurino18-peptido konjugatų ir surinkimo sukeltas sulaikymo efektas naviko vietose. Adv. Mater. 27, 6125–6130 (2015).

Dimatteo, R., Darling, N. J. & Segura, T. In situ formuojant injekcinius hidrogelius, skirtus vaistų tiekimui ir žaizdų taisymui. Adv. Mater. 127, 167–184 (2018).

Li, J. ir kt. Nauja savaime susirenkančio karboanhidrazės inhibitoriaus galia: trumpi peptidiniai nanopluoštai įkvepia hipoksinio vėžio terapiją. Sci. Adv. 5, eaax0937 (2019).

Mann, A. P. ir kt. Peptidas, skirtas tiksliniam, sisteminiam vaizdinių ir gydomųjų junginių tiekimui į ūmius smegenų sužalojimus. Nat. Komun. 7, 11980 (2016).

Zhang, C. ir kt. Peptidų pagrindu pagamintos daugiafunkcinės nanomedžiagos naviko vaizdavimui ir gydymui. Adv. Funkcija. Mater. 28, 1804492 (2018).

Zhang, G.ir kt. Tiekimo sistema, skirta kaulų formavimo paviršiams palengvinti RNAi pagrįstą anabolinę terapiją. Nat. Med. 18, 307–314 (2012).

Field, L. D., Delehanty, J. B., Chen, Y. & amp Medintz, I. L. Peptidai, skirti konkrečiai nukreipti nanodaleles į ląstelių organelius: quo vadis? Acc. Chem. Res. 48, 1380–1390 (2015).

Rudra, J. S. ir kt. Moduliuoja adaptyvų imuninį atsaką į peptidų savaiminį susikaupimą. ACS nano 6, 1557–1564 (2012).

Lau, J. L. & Dunn, M. K. Terapiniai peptidai: istorinės perspektyvos, dabartinės plėtros tendencijos ir ateities kryptys. Bioorg. Med. Chem. 26, 2700–2707 (2018).

Zhang, L. ir kt. Bendradarbiaujantis peptidinis nanoterapinis preparatas, reguliuojantis angiopoetino receptorių Tie2 aktyvumą naviko mikroaplinkoje, kad būtų išvengta krūties naviko atkryčio po chemoterapijos. ACS nano 13, 5091–5102 (2019).

Gray, B. P., Li, S. ir Brown, K. C. Nuo fagų rodymo iki nanodalelių pristatymo: liposomų funkcionalizavimas daugiavalentiais peptidais pagerina nukreipimą į vėžio biomarkerį. Biokonjugas. Chem. 24, 85–96 (2013).

Singha, S. ir kt. Peptidų-MHC pagrindu pagaminti nanomedicinai, skirti autoimunitei, veikia kaip T-ląstelių receptorių mikrogrupavimo prietaisai. Nat. Nanotechnologija. 12, 701–710 (2017).

Roberts, S. ir kt. Injekciniai audinių integravimo tinklai iš rekombinantinių polipeptidų su derinama tvarka. Nat. Mater. 17, 1154–1163 (2018).

Mason, T. O. ir kt. Nepusiausvyros supramolekulinių peptidų polimerų sintezė mikrofluidinėje platformoje. J. Am. Chem. Soc. 138, 9589–9596 (2016).

Molino, N. M. & Wang, S. W. Narveliuose laikomos baltymų nanodalelės vaistų tiekimui. Curr. Nuomonė. Biotechnol. 28, 75–82 (2014).

Neek, M., Kim, T. I. ir Wang, S.-W. Baltymų pagrindu pagamintos nanodalelės kuriant vakciną nuo vėžio. Nanomedicina 15, 164–174 (2019).

Zhuang, J. ir kt. Imunostimuliuojančių medžiagų nanodalelių tiekimas vėžio imunoterapijai. Teranostika 9, 7826–7848 (2019).

Edwardson, T. G. W. ir Hilvert, D. Viruso įkvėpta funkcija inžineriniuose baltymų narveliuose. J. Am. Chem. Soc. 141, 9432–9443 (2019).

Cannon, K. A., Ochoa, J. M. ir Yeates, T. O. Aukštos simetrijos baltymų rinkiniai: modeliai ir naujos programos. Curr. Nuomonė. Struktūra. Biol. 55, 77–84 (2019).

Jain, A., Singh, S. K., Arya, S. K., Kundu, S. C. & Kapoor, S. Baltymų nanodalelės: perspektyvios vaistų pristatymo platformos. ACS Biomater. Sci. inž. 4, 3939–3961 (2018).

Yassine, H. M. ir kt. Hemagliutinino kamieno nanodalelės sukuria heterosubtipinę apsaugą nuo gripo. Nat. Med. 21, 1065–1070 (2015).

Kuan, S. L., Bergamini, F. R. G. & Weil, T. Funkcinės baltymų nanostruktūros: cheminių priemonių rinkinys. Chem. Soc. Rev. 47, 9069–9105 (2018).

He, J., Fan, K. & amp Yan, X. Feritino vaistų nešiklis (FDC), skirtas gydyti į naviką. J. Kontrolė. Rel. 311, 288–300 (2019).

Jiang, B., Fang, L., Wu, K., Yan, X. & amp Fan, K. Feritinai kaip natūralūs ir dirbtiniai terapijos nanozimai. Teranostika 10, 687–706 (2020).

Kratz, F. Klinikinis albumino naudojimo kaip narkotikų nešiklio atnaujinimas – komentaras. J. Kontrolė. Rel. 190, 331–336 (2014).

Desai, N., Trieu, V., Damascelli, B. ir Soon-Shiong, P. SPARC ekspresija koreliuoja su naviko atsaku į albuminą surištą paklitakselį galvos ir kaklo vėžiu sergantiems pacientams. Vertimas Oncol. 2, 59–64 (2009).

Hidalgo, M. ir kt. III fazės MPACT tyrimo tiriamojoje analizėje SPARC ekspresija nenumatė nab-paklitakselio ir gemcitabino arba vien gemcitabino veiksmingumo gydant metastazavusią kasos vėžį. Clin. Cancer Res. 21, 4811–4818 (2015).

Lin, T. ir kt. Kraujo ir smegenų barjerą prasiskverbiančios albumino nanodalelės, skirtos biomimetiniams vaistams tiekti per albuminą surišančių baltymų kelius antigliomos gydymui. ACS nano 10, 9999–10012 (2016).

Chung, S. W. ir kt. Albuminus surišantis kaspazės skaidomas provaistas, kuris selektyviai aktyvuojamas radiacijos paveiktame vietiniame navikoje. Biomedžiagos 94, 1–8 (2016).

Sarett, S. M. ir kt. Lipofilinė siRNR nukreipta į albuminą in situ ir skatina biologinį prieinamumą, įsiskverbimą į naviką ir genų nutildymą be nešiklio. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 114, E6490–E6497 (2017).

Choi, S. H. ir kt. Inhaliuojamos savaime surinktos albumino nanodalelės, skirtos vaistams atsparaus plaučių vėžio gydymui. J. Kontrolė. Rel. 197, 199–207 (2015).

Zhu, G. ir kt. Albumino / vakcinos nanokompleksai, kurie surenkami in vivo kombinuotai vėžio imunoterapijai. Nat. Komun. 8, 1954 (2017).

Gradishar, W. J. Su albuminu susijęs paklitakselis: naujos kartos taksanas. Eksperto nuomonė. Pharmacother. 7, 1041–1053 (2006).

Chawla, S. P. ir kt. Pirmos eilės aldoksorubicinas ir doksorubicinas sergant metastazavusia arba lokaliai pažengusia nerezekuojama minkštųjų audinių sarkoma: 2b fazės atsitiktinių imčių klinikinis tyrimas. JAMA Oncol. 1, 1272–1280 (2015).

Cirstea, D. ir kt. Dvigubas rapamicino kelio akt / žinduolių taikinio slopinimas nanodalelėmis su albuminu susietu rapamicinu ir perifozinu sukelia priešnavikinį aktyvumą sergant daugybine mieloma. Mol. Vėžys Ther. 9, 963–975 (2010).

Huang, X. L. ir kt. Hipoksijos-tropinių baltymų nanonarvai, skirti su naviku ir chemoterapija susijusiai hipoksijai moduliuoti. ACS nano 13, 236–247 (2019).

Fan, K. ir kt. Feritino nanonešiklis kerta kraujo smegenų barjerą ir naikina gliomą. ACS nano 12, 4105–4115 (2018).

Lee, E. J. ir kt. Nanokage-terapija, vyraujanti fagocitozė ir imunogeninė ląstelių mirtis, pažadina imunitetą prieš vėžį. Adv. Mater. 30, 11 (2018).

Zhen, Z. ir kt. RGD modifikuotos apoferitino nanodalelės efektyviam vaistų tiekimui į navikus. ACS nano 7, 4830–4837 (2013).

Wang, Z. ir kt. Biomineralizacijos įkvėpta vario sulfido ir feritino nanonarelių sintezė kaip vėžio terapijos priemonė. ACS nano 10, 3453–3460 (2016).

Sun, C. ir kt. Suporuotų aukso grupių surinkimo valdymas apoferitino nanoreaktoriuje, skirtas in vivo nukreipti inkstus ir atlikti biomedicininį vaizdą. J. Am. Chem. Soc. 133, 8617–8624 (2011).

Fan, J. ir kt. Tiesioginiai feritino ir platinos nanodalelių katalazės ir peroksidazės aktyvumo įrodymai. Biomedžiagos 32, 1611–1618 (2011).

Sun, C. ir kt. Tiksliai sureguliuotas h-feritino nanonarvelis su daugybe aukso grupių kaip beveik infraraudonųjų spindulių inkstų specifinis tikslinis nanozondas. Biokonjugas. Chem. 26, 193–196 (2015).

Fan, K. ir kt. In vivo valdantis azotu legiruotą anglies nanozimą naviko katalizinei terapijai. Nat. Komun. 9, 1440 (2018).

Shan, W. J. ir kt. Biologiškai sukurtas nanonarvelis iš HBc baltymo kombinuotai vėžio imunoterapijai. Nano Lett. 19, 1719–1727 (2019).

Chowdhury, S. ir kt. Programuojamos bakterijos sukelia ilgalaikį naviko regresiją ir sisteminį priešnavikinį imunitetą. Nat. Med. 25, 1057–1063 (2019).

Tang, L. ir kt. T-ląstelių terapijos gerinimas per TCR signalus reaguojantį nanodalelių vaistų tiekimą. Nat. Biotechnol. 36, 707–716 (2018).

Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G. & Bachmann, M. F. Pagrindiniai atradimai ir naujausi pažanga į virusines daleles (VLP) pagrįstų vakcinų srityje. Semin. Immunol. 34, 123–132 (2017).

Shukla, S. ir kt. Augalų virusinių nanodalelių pagrindu sukurta HER2 vakcina: imuninis atsakas, kurį įtakoja diferencinis pernešimas, lokalizacija ir kietųjų dalelių nešiotojų sąveika ląstelėse. Biomedžiagos 121, 15–27 (2017).

Lizotte, P. H. ir kt. In situ vakcinacija karvių mozaikos viruso nanodalelėmis slopina metastazavusį vėžį. Nat. Nanotechnologija. 11, 295–303 (2016).

Kemnade, J. O. ir kt. Tabako mozaikos virusas veiksmingai nukreipia į nuolatinės srovės įsisavinimą, aktyvavimą ir antigenui specifines T ląstelių reakcijas in vivo. Vakcina 32, 4228–4233 (2014).

Goldinger, S. M. ir kt. Nanodalelių vakcinacija kartu su TLR-7 ir -9 ligandais sukelia atminties ir efektoriaus CD8(+) T-ląstelių atsaką melanoma sergantiems pacientams. Euras. J. Immunol. 42, 3049–3061 (2012).

Serradell, M. C. ir kt. Veiksminga oralinė vakcinacija bioinžinerijos būdu į virusą panašiomis dalelėmis su pirmuonių paviršiaus baltymais. Nat. Komun. 10, 361 (2019).

Molino, N. M., Neek, M., Tucker, J. A., Nelson, E. L. ir Wang, S. W. Virusą imituojanti baltymų nanodalelių vakcina, skirta priešnavikiniams atsakams sukelti. Biomedžiagos 86, 83–91 (2016).

Neek, M. ir kt. Žmogaus vėžio ir sėklidžių antigenų tiekimas kartu su adjuvantu baltymų nanodalelėse sukelia didesnį ląstelių sukeltą imuninį atsaką. Biomedžiagos 156, 194–203 (2018).

Molino, N. M., Neek, M., Tucker, J. A., Nelson, E. L. & amp Wang, S. W. DNR rodymas nanodalelėse, skirtas nukreipti į antigeną pateikiančias ląsteles. ACS Biomater. Sci. inž. 3, 496–501 (2017).

Molino, N. M., Anderson, A. K., Nelson, E. L. ir Wang, S. W. Biomimetinių baltymų nanodalelės palengvina sustiprintą dendritinių ląstelių aktyvaciją ir kryžminį pateikimą. ACS nano 7, 9743–9752 (2013).

Han, J. A. ir kt. Feritino baltymo narvelio nanodalelės kaip universalios antigeno tiekimo nanoplatformos, skirtos dendritinių ląstelių (DC) vakcinos kūrimui. Nanomedicina 10, 561–569 (2014).

Specht, H. M. ir kt. Šilumos šoko baltymo 70 (Hsp70) peptidu aktyvintos natūralios žudikės (NK) ląstelės, skirtos pacientams, sergantiems nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu (NSCLC) gydyti po radiochemoterapijos (RCTx) – nuo ​​ikiklinikinių tyrimų iki II klinikinės fazės tyrimo. Priekyje. Immunol. 6, 162 (2015).

Crane, C. A. ir kt. Individualus paciento specifinis imunitetas nuo didelio laipsnio gliomos po vakcinacijos autologiniais naviko kilmės peptidais, prijungtais prie 96 KD chaperono baltymo. Clin. Cancer Res. 19, 205–214 (2013).

Kar, U. K. ir kt. Vault nanokapsulės, kaip adjuvantai, teikia pirmenybę ląstelių, o ne antikūnų sukeltam imuniniam atsakui po pelių imunizacijos. PLoS ONE 7, e38553 (2012).

Schwarz, B. ir kt. Simetrija kontroliuojamas, genetinis bioaktyvių baltymų pateikimas ant P22 viruso tipo dalelės naudojant išorinį dekoravimo baltymą. ACS nano 9, 9134–9147 (2015).

van den Heuvel, M. G. L. & Dekker, C. Motor proteins at work for nanotechnology. Mokslas 317, 333–336 (2007).

Chen, H. B. ir kt. Tiksli nanomedicina protingai vėžio terapijai. Sci. China Chem. 61, 1503–1552 (2018).

Kinbara, K. & Aida, T. Išmaniųjų molekulinių mašinų link: nukreipti biologinių ir dirbtinių molekulių ir mazgų judesiai. Chem. Rev. 105, 1377–1400 (2005).

Hayer-Hartl, M., Bracher, A. & amp Hartl, F. U. GroEL-GroES chaperonino mašina: nano narvas baltymams lankstyti. Tendencijos Biochem. Sci. 41, 62–76 (2016).

Ishii, D. ir kt. Chaperonino sukeltas stabilizavimas ir ATP sukeltas puslaidininkinių nanodalelių išsiskyrimas. Gamta 423, 628–632 (2003).

Deaton, J. ir kt. Funkcinis bakteriorodopsinas yra efektyviai tirpinamas ir tiekiamas į membranas chaperonino GroEL. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 101, 2281–2286 (2004).

Biswas, S. ir kt. Biomolekulinė robotika, skirta chemomechaniškai varomam svečių pristatymui, skatinama tarpląstelinio ATP. Nat. Chem. 5, 613–620 (2013).

Yuan, Y. ir kt. „Chaperonin-GroEL“ kaip išmanusis hidrofobinis vaistų tiekimo ir į naviką nukreiptas molekulinis aparatas, skirtas naviko gydymui. Nano Lett. 18, 921–928 (2018).

Kuhlman, B. & Bradley, P. Pažanga baltymų struktūros prognozavimo ir projektavimo srityje. Nat. kun. Mol. Cell Biol. 20, 681–697 (2019).

Frederix, P. W. J. M. ir kt. Tirti sekų erdvę (tri) peptidų savaiminiam surinkimui, siekiant sukurti ir atrasti naujus hidrogelius. Nat. Chem. 7, 30–37 (2015).

Sacha, G. M. & Varona, P. Dirbtinis intelektas nanotechnologijoje. Nanotechnologijos 24, 452002 (2013).

Pietro, M. ir Bernhard Aribo, S. In silico modeliai nanomedicinoje: naujausi pokyčiai. Curr. Med. 25, 4192–4207 (2018).

Puzyn, T. ir kt. Nano-QSAR naudojimas metalo oksido nanodalelių citotoksiškumui prognozuoti. Nat. Nanotechnologija. 6, 175–178 (2011).

Ahn, J. ir kt. Mikrofluidika tiekiant nanodaleles nuo sintezės iki ikiklinikinio patikrinimo. Adv. Narkotikų Deliv. Rev. 128, 29–53 (2018).

He, Z., Ranganathan, N. ir Li, P. Nanomedicinos vertinimas mikrofluidika. Nanotechnologijos 29, 492001 (2018).

Carvalho, M. R. ir kt. Kolorektalinio naviko lusto sistema: 3D įrankis, skirtas tiksliajai onkonanomedicinai. Sci. Adv. 5, eaaw1317 (2019).

Dana, J., Agnus, V., Ouhmich, F. & amp Gallix, B. Multimodalinis vaizdavimas ir dirbtinis intelektas naviko apibūdinimui: dabartinė būklė ir ateities perspektyva. Semin. Nucl. Med. 50, 541–548 (2020).

Sun, R. ir kt. Radiomikos metodas, skirtas įvertinti naviką infiltruojančias CD8 ląsteles ir atsaką į anti-PD-1 arba anti-PD-L1 imunoterapiją: vaizdo biomarkeris, retrospektyvus kelių kohortų tyrimas. Lancet Oncol. 19, 1180–1191 (2018).

Adir, O. ir kt. Dirbtinio intelekto ir nanotechnologijų integravimas tiksliam vėžio gydymui. Adv. Mater. 32, 1901989 (2020).

Hong, M. K. H. ir kt. Prostatos vėžio subkloninio metastazinio išplitimo ištakų ir veiksnių stebėjimas. Nat. Komun. 6, 6605 (2015).

Vignot, S., Besse, B., André, F., Spano, J.-P. ir Soria, J.-C. Pirminio naviko ir metastazių neatitikimai: kliniškai nustatytų biomarkerių literatūros apžvalga. Krit. Kunigas Oncol. Hematolis. 84, 301–313 (2012).

Schroeder, A. ir kt. Metastazavusio vėžio gydymas nanotechnologijomis. Nat. Kunigas Vėžys 12, 39–50 (2012).

Hu, Q. ir kt. Priešvėžinės trombocitus imituojančios nanotransporto priemonės. Adv. Mater. 27, 7043–7050 (2015).

Liang, M. ir kt. H-feritino nanodalelės doksorubicino nanodalelės konkrečiai nukreipia ir naikina navikus su vienos dozės injekcija. Proc. Natl Akad. Sci. JAV 111, 14900–14905 (2014).

Ahn, B. ir kt. Keturis kartus su kanalais įsprausti žmogaus feritino nanonarvai, skirti aktyviam vaistų įkėlimui ir į pH reaguojantį vaistų išsiskyrimą. Angew. Chem. Tarpt. Red. 57, 2909–2913 (2018).

Khatun, Z., Nurunnabi, M., Reeck, G. R., Cho, K. J. & Lee, Y.-K. Geriamojo taurocholio rūgšties heparino ir docetakselio konjugatų tiekimas vėžio gydymui. J. Kontrolė. Rel. 170, 74–82 (2013).

Li, J. ir kt. Savarankiškas DNR nanohidrogelių su valdomu dydžiu ir dirgiklius reaguojančių savybių surinkimas tikslinei genų reguliavimo terapijai. J. Am. Chem. Soc. 137, 1412–1415 (2015).

Cutler, J. I., Auyeung, E. & Mirkin, C. A. Sferinės nukleino rūgštys. J. Am. Chem. Soc. 134, 1376–1391 (2012).

Jiang, Q. ir kt. DNR origami kaip atsparumo vaistams apėjimo nešiklis. J. Am. Chem. Soc. 134, 13396–13403 (2012).

Douglas, S. M. ir kt. Greitas 3D DNR origami formų prototipų kūrimas naudojant caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001–5006 (2009).

Bindewald, E., Grunewald, C., Boyle, B., O'Connor, M. & Shapiro, B. A. RNR nanoskalės struktūrų automatizuoto projektavimo iš statybinių blokų skaičiavimo strategijos naudojant NanoTiler. J. Mol. Grafikas. Modelis. 27, 299–308 (2008).

Donnem, T. ir kt. Neangiogeniniai navikai ir jų įtaka vėžio biologijai. Nat. Kunigas Vėžys 18, 323–336 (2018).

Hida, K., Maishi, N., Torii, C. & Hida, Y. Naviko angiogenezė – naviko endotelio ląstelių charakteristikos. Tarpt. J. Clin. Oncol. 21, 206–212 (2016).

Joyce, J. A. ir Fearon, D. T. T ląstelių išskyrimas, imuninė privilegija ir naviko mikroaplinka. Mokslas 348, 74–80 (2015).

Gay, L. J. ir Felding-Habermann, B. Trombocitų indėlis į naviko metastazes. Nat. Kunigas Vėžys 11, 123–134 (2011).

Tozer, G. M., Kanthou, C. ir Baguley, B. C. Naviko kraujagyslių sutrikdymas. Nat. Kunigas Vėžys 5, 423–435 (2005).

Nam, J. ir kt. Vėžio nanomedicina kombinuotai vėžio imunoterapijai. Nat. kun. Mater. 4, 398–414 (2019).

Gajewskis, T. F., Schreiberis, H. ir Fu, Y.-X. Įgimtos ir adaptyvios imuninės ląstelės naviko mikroaplinkoje. Nat. Immunol. 14, 1014–1022 (2013).

Joshi, M. D., Unger, W. J., Storm, G., van Kooyk, Y. & Mastrobattista, E. Naviko antigenų nukreipimas į dendritines ląsteles naudojant kietųjų dalelių nešiklius. J. Kontrolė. Rel. 161, 25–37 (2012).

Guillerey, C., Huntington, N. D. ir Smyth, M. J. Taikymas natūralioms žudikėms ląstelėms vėžio imunoterapijoje. Nat. Immunol. 17, 1025–1036 (2016).

Ma, Q., Dieterich, L. C. ir Detmar, M. Keli limfinių kraujagyslių vaidmenys auglio progresavime. Curr. Nuomonė. Immunol. 53, 7–12 (2018).

Garnier, L., Gkountidi, A.-O. & Hugues, S. Su naviku susijusių limfinių kraujagyslių ypatybės ir imunomoduliacinės funkcijos. Priekyje. Immunol. 10, 720 (2019).

Laakkonen, P., Porkka, K., Hoffman, J. A. & amp Ruoslahti, E. A naviką sukeliantis peptidas, kurio nukreipimo specifiškumas susijęs su limfagyslėmis. Nat. Med. 8, 751–755 (2002).

Cheng, C. J., Tietjen, G. T., Saucier-Sawyer, J. K. ir Saltzman, W. M. Holistinis požiūris į taikymą į ligas naudojant polimerines nanodaleles. Nat. Drug Discov. 14, 239 (2015).

Yang, Y. ir kt. Poli(amidoamino) dendrimerų dydžio, paviršiaus krūvio ir hidrofobiškumo įtaka jų prasiskverbimui į odą. Biomakromolekulės 13, 2154–2162 (2012).

De Matteis, V. Neorganinių nanodalelių poveikis: patekimo būdai, imuninis atsakas, biologinis pasiskirstymas ir in vitro/in vivo toksiškumo įvertinimas. Toksiškos medžiagos 5, 29 (2017).


Vėžio nanomedicinos iššūkiai

Organizmui skiriamos nanosistemos likimą įtakoja didelis faktorių tinklas. Visų pirma, priešnavikinių nanostruktūrų efektyvumą riboja sunkumai nukreipiant tikslą, dinamiški medžiagų pokyčiai in vivo ir daugybė biologinių barjerų. Šios sudėtingos ir tarpusavyje susijusios kliūtys reikalauja daugiasluoksnių atsakomųjų priemonių, kurias galima pasiekti tik naudojant daugiafunkciškumą.

Vėžio progresavimas yra daugelio patologinių įvykių 14, kurie dažnai nėra būdingi navikui, bet susiję su normaliais fiziologiniais procesais, kuriuos liga iškraipo, rezultatas. Be to, naviko ląstelės yra labai nevienalytės ir turi didelį mutacijų dažnį, todėl atsiranda patologinių skirtumų tarp skirtingų vėžio tipų, individų ir intratumorinių regionų. Siekiant išspręsti šį nevienalytiškumą, tiriama nanostruktūra pagrįsta kombinatorinė arba kelių taikinių terapija. Pavyzdžiui, sujungus į naviko ląsteles nukreiptus metodus su strategijomis, kurios moduliuoja naviko mikroaplinką (TME) (Boxਁ), gydymas gali būti pritaikytas prie skirtingų naviko savybių. Esant stipriai fibroziniams navikams, kartu su vėžinėmis ląstelėmis gali būti taikomi ir su vėžiu susiję fibroblastai (CAF) arba žvaigždžių ląstelės, siekiant slopinti augimo faktorių ir priešuždegiminių citokinų sekreciją bei paskirstyti nanostruktūros teikiamas terapines medžiagas per tankią stromą. 15� . Be to, navikų pasikartojimas po kraujagyslių okliuzijos tikslingai tiekiant trombiną gali būti gerokai sumažintas kartu su doksorubicinu, tikriausiai todėl, kad chemoterapinis preparatas padeda išnaikinti naviko sritis, kuriose kraujagyslės yra mažiau apgyvendintos 18 .

Nors navikui būdingo vaisto kūrimas yra labai sunkus, mažiau specifinio vaisto farmakokinetikos ir biologinio pasiskirstymo optimizavimas gali žymiai padidinti jo veiksmingumą. Iš tiesų, pagrindiniu nanomedicinos privalumu gydant vėžį buvo laikomas į naviką nukreipto pristatymo pajėgumas per pasyvų taikymą, pagrįstą padidintu pralaidumo ir sulaikymo (EPR) efektu, aktyviu nukreipimu arba į dirgiklius reaguojančiu vaistų išsiskyrimu. Tačiau, palyginti su įprastomis vaistų formomis, daugiafunkcinių nanostruktūrų elgesys in vivo ir likimas yra sudėtingesni, todėl jos gali būti ypač linkusios į neatitikimus tarp pacientų ir tarp ikiklinikinių modelių bei klinikinių pritaikymų 19 .

Nanostruktūrų savybės akimirksniu paveikiamos patekus į organizmą sąveikaujant nano𠄻io sąsajoje. Dėl šios sąveikos gali atsirasti nestabilumas, pvz., dalelių agregacija, skilimas, funkcinių vienetų praradimas arba pavojingų rūšių išsiskyrimas, o tai labai veikia tiekimo efektyvumą ir biologinį saugumą20. Sąlytis su fiziologiniais skysčiais taip pat sukelia nanostruktūros uždengimą serumo baltymais (baltymų vainika), galinčiu apsaugoti paviršiaus funkcijas (pvz., nukreipiančius ligandus) ir trukdyti vaistų išsiskyrimui 21 . Siekiant sumažinti nanodalelių�ltymų sąveiką, dažnai taikomos apsaugos nuo apaugimo modifikacijos, pvz., dengimas poli(etilenglikoliu) (PEG).Taip pat buvo pranešta apie alternatyvas, pagrįstas biomolekulėmis, ypač baltymais ir peptidais 22, 23 . Be to, baltymo vainiko trukdžiai paviršiaus funkcijoms priklauso nuo funkcionalizavimo technikos, pavyzdžiui, ant polimerinių nanodalelių iš anksto adsorbuoti antikūnai išlaiko savo nukreipimo gebėjimą geriau nei chemiškai konjuguotos molekulės, galbūt dėl ​​tvirtesnės paviršiaus dangos 24 . Pritaikius nanopaviršiaus modifikacijas, baltymų vainiko sudėtis gali būti manipuliuojama ir naudojama siekiant padidinti cirkuliaciją, sumažinti toksiškumą arba pagerinti nukreipimą 21, 25 . Pavyzdžiui, Onpattro, komerciškai prieinama mažų trukdančių RNR (siRNR) formulė, į kepenis nukreiptą baltymą apolipoproteiną E įdarbina ant cholesterolio turinčių lipidų nanodalelių paviršiaus in vivo 26 . Trumpi peptidai taip pat buvo naudojami manipuliuoti serumo apolipoproteinų prisijungimo prie nanodalelių paviršiaus režimais, kad būtų pagerintas patekimas per kraujo ir smegenų barjerą 27 . Nors nespecifinės adsorbcijos trukdžiai turi būti kruopščiai apibūdinti 28 , šis metodas pasiūlė galimybę tiksliau moduliuoti korona baltymus ir naudoti juos kaip papildomą funkciją.

Kraujyje fagocitai per specifinius receptorius lengvai prilimpa prie baltymais padengtų nanostruktūrų, todėl retikuloendotelinė sistema (RES) nanostruktūras pašalina iš kraujotakos 29 . Taigi, norint pailginti nanostruktūrų cirkuliacijos laiką, dažniausiai naudojamos antifouling dangos, tokios kaip PEG. Nepaisant to, PEG modifikavimas tik iš dalies sumažina imunogeniškumą, o PEG surišančių antikūnų stimuliavimas kelia susirūpinimą dėl saugumo30,31. Aktyvesnės apsaugos nuo užteršimo strategijos apima paviršiaus dekoravimą fragmentais, pagrįstais CD4732,33, ‘self-marker’ baltymu, kuris slopina fagocitozę, arba su išskirtomis kraujo ląstelių membranomis (jų paviršiuje rodomas CD47) 31,34, siekiant padėti nanomedžiagoms išvengti fagocitų klirenso. Pelių modeliuose šie metodai parodė geresnes slaptas savybes, palyginti su PEGilacija 31, 32, 34 . Tačiau koroninis klirensas taip pat gali būti naudingas makrofagų ar AEI organų pristatymui. Pavyzdžiui, tiksliai keičiant katijoninių liposomų krūvį, jos gali būti selektyviai nukreiptos į kepenis ir blužnį, kad būtų tiekiami genai35.

Kad pasiektų naviko audinį, nanosistemos pirmiausia turi išsiskirti iš kraujotakos 1,36 , o tai ilgą laiką buvo manoma, kad tai įgalina nesandari naviko kraujotaka. Tačiau EPR poveikis labai skiriasi tarp navikų ir net skirtinguose to paties naviko regionuose, o jo klinikinė reikšmė tebėra prieštaringa 37�. Daugiafunkcinės nanodalelės gali aktyviai padidinti intratumorinę ekstravazaciją, sukurdamos vietinę hipertenziją, sukeldamos kraujagyslių atsipalaidavimą arba sukeldamos papildomą naviko kraujagyslių pažeidimą. Tokios strategijos gali iš dalies išspręsti EPR nevienalytiškumo problemą 38, 40 , tačiau pacientų stratifikacija ir vaizdų valdoma individualizuota medicina bus būtinos norint pritaikyti nanomedžiagomis pagrįstas gydymo strategijas 1, 2, 41 .

Be to, ekstravazacijos efektyvumui įtakos turi nanomedžiagų savybės, pavyzdžiui, tekančio kraujo sferinės nanodalelės linkusios likti arti kraujagyslės vidurio, o lazdelės arba plokštelės formos struktūros dažniau nuslenka link kraujagyslės sienelių ir išryškėja. stipri sąveika su endotelio ląstelėmis dėl didesnio kontaktinio ploto36,42. Ekstraląstelinių pūslelių paviršiaus minkštumas iš esmės veikia ekstravazaciją ir ląstelių įsisavinimą in vivo 43 . Endotelio adhezija, taigi ir ekstravazacija, gali būti sustiprinta padengiant nanodaleles ląstelių membranomis, gautomis iš leukocitų44. Paprastai manoma, kad ekstravazacija įvyksta dėl tarpląstelinio nutekėjimo, tačiau kiti mechanizmai, tokie kaip aktyvus endotelio ląstelių pernešimas 39, 45 , taip pat vaidina svarbų vaidmenį ir į juos atkreipiamas dėmesys nanosistemų projektavimo ir nukreipimo požiūriu 46, 47 .

Dauguma priešvėžinių nanoformulių yra skirtos vartoti į veną. Pažymėtina, kad iššūkiai, kuriuos sukelia biologinės kliūtys nanodalelių transportavimo metu, yra susiję su vartojimo būdu, pavyzdžiui, daugiafunkcinės strategijos dar neišsprendė į veną švirkščiamų nanomedžiagų kaupimosi kepenyse problemos, kuri gali padėti sumažinti tiekiamų vaistų toksiškumą kitiems audiniams. ir pagerinti bendrą toleranciją 12 , tačiau išlieka efektyvaus vaistų patekimo į naviką problema. Vartojimo būdas nustato vaistų biologinio pasiskirstymo modelį, o į veną leidžiami alternatyvūs būdai su atitinkamomis tikslinėmis strategijomis tiriami esant konkrečioms vėžio formoms (Boxਂ). Pavyzdžiui, intraderminė ir poodinė injekcija gali būti ypač naudinga nukreipiant limfinę sistemą imunizuojant naviką 48 , o per burną vartojamos nanodalelės gali būti nukreiptos į gaubtinės žarnos vėžį 49 .

Navikas ir TME taip pat yra kliūtis nanostruktūros pagrindu veikiančių vaistų tiekimui. Didelis intersticinio skysčio slėgis ir desmoplastinė stroma riboja nanostruktūrų įsiskverbimą 6,36 . Be to, gilesniuose navikų regionuose kraujagyslės yra mažiau apgyvendintos. Be to, nanodaleles gali užfiksuoti su naviku susiję makrofagai (TAM), o ne naviko ląstelės po ekstravazacijos 41 . Šios intratumorinės komplikacijos paskatino kurti TME taikymo strategijas (Boxਁ), išnaudojant galimus taikinius, kurie yra labiau prieinami nei naviko ląstelės. Iš tiesų, su TME susiję taikiniai, tokie kaip fibroblastų aktyvinimo baltymas ant CAF 16 , fibrino & # x02013 fibronektino kompleksas naviko kraujagyslėse 18 arba TAM 50, 51 , jau buvo pritaikyti nanodalelėms tiekti. Terapijoms, kurioms reikalingas intracelulinis tiekimas (pavyzdžiui, genų tiekimas ir antigeno tiekimas), reikalingas ląstelių įsisavinimas ir endosominis pabėgimas. Tačiau, skirtingai nei hidrofobiniai maži vaistai, nanodalelės negali pasyviai pasklisti per plazmos membraną. Todėl ląstelių įsisavinimui skatinti naudojami į membraną nukreipti baltymai ligandai, į ląsteles prasiskverbiantys peptidai arba fuzogeninės medžiagos 5,52 .

1 langelis Daugiafunkcinių nanostruktūrų auglio mikroaplinkos tikslai

Stroma ir fibroblastai

Naviko mikroaplinkoje (TME) ramybės būsenos stromos ląstelės tampa proliferacinės ir labai sekrecinės, todėl susidaro tanki ekstraląstelinė matrica (ECM), kuri veikia kaip intratumorinė kliūtis nuo vaistų įsiskverbimo. Be to, ECM komponentai, citokinai ir chemokinai, kuriuos išskiria aktyvuoti su vėžiu susiję fibroblastai ir mezenchiminės stromos ląstelės, skatina naviko ląstelių proliferaciją, invaziją ir atsparumo vaistams įgijimą 15 . Stromos ląstelių baltymai (pvz., fibroblastų aktyvinimo baltymai α) ir ECM komponentai (ypač ECM fermentai) gali būti naudojami kaip pristatymo arba selektyviojo vaisto atpalaidavimo taikiniai16. Vaistai, nukreipti į stromos anomalijas, gali būti derinami su TME taikymo strategijomis, siekiant pakeisti stromos ląstelių aktyvaciją, slopinti protumorinį signalizavimą arba sumažinti fibrotinių ECM komponentų, tokių kaip hialuronanas ir kolagenas, sintezę ir sekreciją15,17.

Kraujagyslės

Daugelyje (bet ne visuose) 241 kietųjų navikų angiogenezė perkeliama į proangiogeninę būseną, todėl susidaro vingiuotas, pertraukiamas kraujagyslių tinklas, ribojantis vaistų perfuziją. Kraujagyslių endotelio ląstelės, sąlygotos TME, aktyviai dalyvauja T-ląstelių išskyrime arba metastazėse, o koaguliacinė navikų būsena skatina trombocitų aktyvavimą, o tai gali paskatinti naviko invaziją242�. Endotelio receptoriai ir su naviku susiję mikrotrombai gali būti nukreipti, siekiant lokalizuoti nanostruktūras naviko kraujagyslėje40. Vaistai gali būti išleisti į TME, kad būtų galima moduliuoti intratumorinį angiogeninį signalizavimą (pavyzdžiui, kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) kelią) arba neutralizuoti perteklinius proangiogeninius veiksnius, kurie susidaro reaguojant į citotoksinį gydymą 245 .

Imuninės ląstelės

Daugumos į imunines ląsteles nukreiptų nanoterapijų tikslas – sustiprinti priešvėžinį citotoksinį T-ląstelių atsaką. Gydymas, tiesiogiai nukreiptas į T ląsteles, naudojant imuninį kontrolinį tašką (citotoksinis T-limfocitais susietas baltymas 4 (CTLA-4) arba užprogramuotas ląstelių mirties baltymas 1 (PD-1)), buvo žadantis kovoti su karštais navikais, kuriuose aktyvios T ląstelės gali kad įsiskverbtų, bet yra funkciškai blokuojami imuninės kontrolės taško signalizacijos 246 . Sergant peršalimu, T ląstelės nėra aktyvuojamos dėl imunosupresinių imuninių ląstelių, kurios gali būti nukreiptos į T-ląstelių pritraukimą. Nanovakcinos, tiekiančios naviko antigenus ir imunostimuliuojančias medžiagas į dendritines ląsteles, gali pagerinti jų brendimą ir antigenų pateikimą 247 248 . Protumorinių makrofagų perprogramavimas į priešnavikinius fenotipus gali atgaivinti jų priešnavikinį citotoksinį aktyvumą ir sustiprinti T-ląstelių atsaką50,51. Natūralios žudikų (NK) ląstelės spontaniškai atakuoja vėžines ląsteles, nereikalaudamos antigeno jautrinimo. Nukreipimas į NK ląsteles citokinais (pavyzdžiui, IL-15) arba antikūnais, skatinančiais stimuliavimą ir plėtimąsi, yra alternatyva T-ląstelėmis pagrįstai imunoterapijai249.

Limfinės kraujagyslės

Kietiems navikams trūksta funkcinio limfos drenažo, tačiau limfagyslės yra svarbūs vėžinių ląstelių metastazavimo greitkeliai. Iš tiesų, didelis limfangiogenezės lygis navikuose koreliuoja su prastais rezultatais 250 251 . Su naviku susijusios limfinės endotelio ląstelės per daug ekspresuoja imunosupresines molekules, tokias kaip PD-L1, bet taip pat skatina dendritinių ląstelių migraciją į limfmazgius, susijusias su didele naivių T ląstelių infiltracija 250 . Naviko limfangiogenezę galima moduliuoti blokuojant VEGFR3, VEGF-C receptorių, naviko ląstelių išskiriamą limfangiogeninį faktorių 251 . Tačiau limfinių kraujagyslių ligandai išlieka riboti (pavyzdžiui, peptidas LyP-1 252).

2 langelis. Į vėžį nukreiptų nanostruktūrų vartojimo būdai

Vartojimas į veną pasižymi greitu terapiniu atsaku, dideliu vaistų biologiniu prieinamumu ir aukšta vartojimo kontrole. Struktūriškai sudėtingos ir biologiškai nestabilios nanosistemos dažnai nėra tinkamos absorbcijai iš virškinimo trakto arba injekcijoms į raumenis, todėl dažnai pasirenkamas intraveninis injekcijos būdas. Be to, antimetastazių terapijai reikalingas sisteminis vaistų skyrimas. Tačiau intraveninis vartojimas kenčia nuo greito vaisto klirenso, nepageidaujamo pasiskirstymo ir kaupimosi audiniuose ir vėlesnio nepageidaujamo šalutinio poveikio.

Pristatymas per burną yra naudingas dėl gero paciento sutikimo ir gali sudaryti lengvą prieigą prie virškinimo trakto. Tačiau atšiauri ir sudėtinga aplinka virškinimo trakte (didelis pH pokytis, metaboliniai fermentai, gleivių sukeltas klirensas) kelia iššūkių nanostruktūroms. Norint padidinti nanomedžiagų adsorbciją žarnyne ir skverbtis į žarnyną, dažniausiai reikalingi prie gleivių prilipę ir į endotelį prasiskverbiantys elementai.

Įkvėpimas ir intranazalinis vartojimas leisti patekti į kvėpavimo takus (pavyzdžiui, plaučių vėžiui gydyti) ir užtikrinti ilgalaikį bei mažiau invazinį taikymą, palyginti su injekcijomis į veną. Nanostruktūroms taip pat reikalingos gleivių prilipimo funkcijos, kad padidėtų gleivių sukibimas ir prasiskverbimas (kaip ir kitais gleivinės būdais, pvz., įvedimu per makštį) 253 . Tačiau įkvepiami arba į nosį vartojami vaistai taip pat gali būti sistemiškai pasiskirstę, nustatyta, kad į nosį vartojami vaistai kaupiasi centrinėje nervų sistemoje253.

Tiesioginė injekcija ir infuzija į audinius, esančius šalia naviko vietos, yra galimybė, jei navikai yra lengvai prieinami. Vietinis vartojimo būdas apeina daugelį biologinių barjerų (pavyzdžiui, į smegenis įvedami vaistai apeina kraujo ir smegenų barjerą), tačiau vis tiek reikia prasiskverbti į audinius. Nanomedžiagų prasiskverbimo į dermą ir poodinį audinį gerinimo metodai tebėra riboti 254 . Vietoje suleistos mažos dalelės yra linkusios greitai nutekėti limfos nutekėjimą, todėl po oda nanodalelės gali patekti į limfmazgius ir imunines ląsteles, kurios yra limfinėje sistemoje.

Kiekvienas vartojimo būdas lemia skirtingą vaisto pasiskirstymą ir skirtingus nepageidaujamo poveikio modelius. Reikia atsižvelgti į saugos klausimus, susijusius su neintraveniniu būdu, pvz., įkvėpimu ar sąlyčiu su oda255. Bus labai svarbu atlikti sistemingus specifinio poveikio toksiškumo tyrimus vėžio nanomedicinoje.


Informacija apie autorių: Gillooly JF 1 , Gomez JP 2,3 , Mavrodiev EV 4 .

E-pub data: 2017 vasario mėn

Santrauka: Endotermų ir ektotermų aerobinio aktyvumo lygių ribų ir diapazono skirtumai tebėra menkai suprantami, nors tokie skirtumai padeda paaiškinti pagrindinius rūšių gyvenimo būdo skirtumus (pvz., judėjimo modelius, maitinimosi režimus ir sąveikos greitį). Mes lyginame aerobinio aktyvumo ribas ir diapazoną endotermuose (paukščiai ir žinduoliai) ir ektotermai (žuvys, ropliai ir varliagyviai), įvertindami VO2 max priklausomybę nuo kūno masės, aerobinės apimties ir širdies masės filogenetiniame kontekste, remiantis naujai pastatytas stuburinis supermedis. Priešingai nei ankstesniame darbe, rezultatai nerodo reikšmingų skirtumų kūno masės masteliuose, atsižvelgiant į minimalų ir maksimalų deguonies suvartojimą, atsižvelgiant į kūno masę endotermų ar ektotermų ribose. Esant tam tikrai kūno masei, ramybės ir didžiausios normos buvo atitinkamai 24 ir 30 kartų mažesnės ektotermose nei endotermijose. Faktorinė aerobinė apimtis abiejose grupėse svyravo nuo penkių iki aštuonių, o endotermų apimtis rodo nedidelę priklausomybę nuo kūno masės. Galiausiai, maksimalus suvartojimo greitis ir aerobinė apimtis buvo teigiamai koreliuojami su likusia širdies mase. Kartu šie rezultatai kiekybiškai įvertina aerobinio aktyvumo potencialo panašumus ir skirtumus tarp ektotermų ir endotermų iš įvairios aplinkos. Jie suteikia įžvalgų apie modelius ir mechanizmus, kurie gali būti deguonies suvartojimo priklausomybės nuo kūno masės pagrindas.


Autoriaus informacija

Šie autoriai vienodai prisidėjo: Jing Wang, Yiye Li.

Filialai

CAS pagrindinė nanomedžiagų ir nanosaugos biomedicininio poveikio laboratorija, CAS Nanomokslo kompetencijos centras, Nacionalinis nanomokslų ir technologijų centras, Kinija, Pekinas, Kinija

Jing Wang, Yiye Li ir Guangjun Nie

Medžiagų mokslo ir optoelektronikos inžinerijos centras, Kinijos mokslų akademijos universitetas, Pekinas, Kinija

Jing Wang, Yiye Li ir Guangjun Nie

GBA tyrimų inovacijų institutas nanotechnologijoms, Guangdong, Kinija

Henano pažangiųjų technologijų institutas, Džengdžou universitetas, Džengdžou, Kinija


Žiūrėti video įrašą: 적혈구의 재발견. YTN 사이언스 (Gruodis 2022).